Prctica # 2 Determinacin cualitativa del derivado sililado del cido ascrbico en jugo por cromatografa de gases acoplada al detector

de masas

Introduccin La cromatografa de gases (GC) es una de las tcnicas de separacin ms usadas para analizar gases, lquidos y slidos. El equipo consiste en un suministro de gas acarreador (fase mvil) de alta pureza e inerte que transporta los compuestos en la columna sin reaccionar con ellos. El inyector (split/splitless) debe tener una temperatura adecuada para vaporizar la muestra e introducirla a la columna. El modo de inyeccin split se usa para muestras concentradas y el splitless para analitos con concentracin a nivel de trazas. La columna capilar se encuentra dentro de un horno y permite separar los componentes de la muestra utilizando un gradiente de temperaturas. Cuando los analitos eluyen de la columna, su presencia se registra en el detector, en forma de una seal elctrica, generando el cromatograma. Uno de los detectores ms utilizados en GC es el espectrmetro de masas (MSD), en l las molculas de los analitos eludos interaccionan con un haz de electrones de alta energa y se fragmentan en iones. Los iones se separan de acuerdo a su relacin masa-carga (m/z) y su intensidad se registra en un detector. El MSD puede operarse en modo SCAN (detecta todos los iones en un intervalo amplio de m/z) y en modo SIM (solo detecta un nmero limitado de iones generalmente tres ). El modo SCAN es til para la identificacin de compuestos, y el SIM para anlisis cuantitativo a nivel de trazas pues disminuye la relacin seal-ruido. En general, la derivatizacin qumica es una etapa de preparacin de muestra que se utiliza en cromatografa para la conversin de compuestos que no pueden analizarse de manera directa, en productos apropiados (derivados). Grupos funcionales con tomos de hidrgeno activos disminuyen la volatilidad de un analito. La derivatizacin permite sustituir dichos tomos del compuesto original por fragmentos covalentemente enlazados que le proporcionan al producto una mayor volatilidad. Adems, la derivatizacin mejora la estabilidad trmica y/o polaridad de los analitos, adicionalmente permite introducir en la molcula un grupo marcador dirigido al detector. En GC hay tres mtodos principales de derivatizacin: acilacin, alquilacin y sililacin. La acilacin es tpicamente utilizada para compuestos con grupos OH, -SH y NH. La alquilacin favorece la sustitucin de hidrgenos de fenoles y cidos carboxlicos por un grupo alquilo. La sililacin permite la sustitucin de los hidrgenos activos de molculas con grupos OH, -COOH y -NH por grupos trimetilsilil.

Objetivo Determinar cualitativamente al derivado sililado del cido ascrbico en una muestra de jugo por cromatografa de gases acoplada a un detector msico.

Materiales Viales, 1.5 mL Insertos, 500 L Tubos falcon de 15 mL Filtros para jeringa (0.45 um) Jeringas (3 mL) Membranas 0.45 m Equipo para filtracin de fase mvil Micropipetas Puntas para micropipetas Equipo Centrfuga Liofilizadora Horno de microondas Cromatgrafo de gases

Sustancias cido L-ascrbico (99.5% de pureza) Mercaptoetanol* Hexametildisilazano (HMDS) Acetonitrilo grado HPLC cido actico Isooctano

Metodologa Tratamiento de la muestra 1. 2. 3. 4. 5. Tomar una alcuota de 10 mL del jugo. Centrifugar a 5000 rpm durante 4 minutos. Filtrar el sobrenadante a travs de filtro de membrana de 0.45 m. Tomar 100 L del filtrado (o de la solucin stock 1 mg/mL) Aadir 100 L de mercaptoetanol* 10 mM con el objeto de reducir todo el cido ascrbico que haya sido oxidado. De esta forma, se determinar el contenido total de cido ascrbico. 6. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Derivatizacin 1. A la muestra liofilizada (para eliminar el agua en la muestra y disminuir la descomposicin del cido ascrbico por efecto del agua y el oxgeno) aadir 500 L de HMDS/acetonitrilo (2:8) para obtener el derivado sililado del cido ascrbico. 2. Introducir al horno de microondas durante 5 min a 180 W de forma que la energa requerida para la reaccin de derivatizacin se dirija ms homogneamente a los enlaces qumicos, asegurando y acelerando el proceso de sililacin, evitando as la posible descomposicin trmica de la muestra por simple calentamiento. 3. Colocar los viales en el auto muestreador

Condiciones cromatogrficas y de deteccin Dimensiones de la columna Fase estacionaria Fase mvil Flujo Modo de inyeccin Temperatura de inyector Volumen de inyeccin Programa de temperatura 30 m x 0.25 ID x 0.25 um 5% diphenyl, 95% dimethyl polysiloxane He 0.8 mL/min Split - con divisin (100:1) 300 0.2 uL Relacin, Valor, Mantener, min C/min C 150 1.96 30C 320 5.88 Masas, modo SCAN y modo SIM * 300 C

Detector Temperatura de la interfase * Para el modo SIM es necesario proporcionar ventanas de tiempo. Una ventana de

tiempo es un intervalo de tiempo durante el cual el detector va a estar buscando los iones de las m/z seleccionados. El criterio para una buena ventana de tiempo generalmente considera 1 min tomando como base el tR del analito o compuesto a determinar. Ejemplo, tR = 10 min, ventana de tiempo: lmite inferior 9 min (10 -1 min), y lmite superior 11 min (10 + 1 min).