Universidad san Carlos de Guatemala Facultad de Agronoma rea Tecnolgica Subarea de Proteccin de Plantas Laboratorio de Microbiologa Agrcola Martes

Matutino Aux: Salome Vilda Daniel Alejandro Rodrguez Figueroa 200923430

PREPRACTICA No. 6 MEDICION Y CONTEO DE MICROORGANISMOS

Dimensiones de Microoganismos
Las bacterias son los microorganismos de vida libre de menor tamao que existen en la naturaleza, algunas son tan pequeas que se considera que tienen el mnimo tamao posible para ser una forma de vida independiente. El tamao se mide en micrmetros, m, para microorganismos mas pequeos se usa el nanmetro, nm. Las bacterias esfricas se miden por el dimetro, y la gran mayora tienen un dimetro que vara entre 0,2 y 2 m. Las bacterias alargadas se miden por el largo y el ancho y la mayora de ellas tienen un ancho de 0,2 a 2 m por 1 a 15 m de largo. Las bacterias espiraladas se miden por la longitud total, la amplitud de la espira y la profundidad de la misma. Existen bacterias cuyo tamao est en el extremo inferior de la escala, son las rickettsias, clamidias y micoplasmas, su tamao es similar al de los virus ms grandes, los poxvirus. En el otro extremo de la escala, hay algunas bacterias alargadas que tienen una longitud semejante al dimetro de una clula eucariota, por ejemplo, los lactobacilos tienen un largo que puede superar al dimetro de un eritrocito. Algunos tipos de bacterias poseen flagelos con los cuales nadan, al parecer mediante una actividad ondulatoria longitudinal. Los flagelos representan unas estructuras en forma de hilos finos con un espesor que vara entre 0,02 y 0,06 mm y una longitud entre 3 a 12 mm, alcanzando en algunos espirilos hasta 80 y 90 mm. Los flagelos estn constituidos por sustancias proteicas de tipo flagelina, que pertenece a la clase de protenas contrctiles (queratina, miosina y fibringeno), diferencindose considerablemente de las protenas del propio organismo bacteriano. En algunas bacterias estn bien distribuidos por toda la superficie de la clula, y en otras, los flagelos se encuentran relegados a uno o a ambos extremos. Los virus son sistemas

biolgicos ultramicroscpicos (slo se pueden observar con microscopio electrnico) que pueden causar infecciones y que slo se reproducen en clulas husped. Los virus fuera de clulas husped estn en forma inactiva. Los virus se caracterizan por presentar una capa protectora. Su forma puede ser espiral, esfrica o como clulas pequeas, de tamao entre 0.02 y 0.009. Al tener un tamao menor que las bacterias, pueden pasar filtros que permiten la retencin de bacterias. Al contrario que las bacterias y protozoarios parsitos, los virus contienen un solo tipo de cido nucleico (ARN o ADN). No se pueden reproducir por si solas, sino que necesitan el metabolismo de la clula husped para asegurar que el ADN se copia en la clula husped, para su reproduccin. Al contrario que las bacterias, los virus no estn presentes en el ser humano de manera natural. Cuando las personas quedan afectadas por un virus, estos generalmente se eliminan del cuerpo humano mediante secreciones.

Aunque se ha demostrado que existen virus beneficiosos para la salud, la inmensa mayoria son patgenos. Ademas, se han obtenido otros beneficios indirectos de los virus como la debilitacion de bacterias, la creacin de antitoxinas, la utilizacin para librerias genomicas, inyecciones genticas y otras tecnicas. Las infecciones virales slo se redimen erradicando las causas y fortaleciendo el sistema inmunolgico.Los protozoos son considerados como bioindicadores del estado de funcionamiento de las depuradoras de aguas residuales, destacando en la deteccin y prevencin de variaciones en la continuidad de los procesos. Son los principales consumidores de las poblaciones bacterianas en los sistemas acuticos e intervienen en la formacin de cogulos sedimentables. En resumen, son fundamentales en los sistemas de depuracin biolgica de las aguas residuales. Los protozoos son organismos unicelulares que presentan todas las estructuras necesarias para realizar sus funciones vitales. Son de dimensiones microscpicas variables entre las 10 micras y varios milmetros. Su interior celular est diferenciado por el ncleo, donde se aloja el material gentico y el citoplasma.

Mtodos y tcnicas para medir Microorganismos

Micrmetro ocular La forma tradicional de realizar mediciones con el microscopio es usando un micrmetro de ocular; ste consiste en un disco de vidrio que tiene grabada una escala que se coloca en el diafragma del ocular. Los espacios no tienen un valor estndar por lo que deben ser calibrados para cada juego de ocular y objetivo. La calibracin se lleva a cabo con un micrmetro de platina que consiste en un porta objeto que lleva una escala grabada con valores conocidos, generalmente dcimas o centsimas de

milmetro. Micrmetro de platina Para la calibracin de instrumentos de medicin ptica incluyendo todos los microscopios de luz; enmarcados en acero inoxidable para la ms alta precisin y duracin. Estos micrmetros se utilizan para calibracin de rutina de una variedad de instrumentos pticos de medicin, desde microscopios pticos y oculares hasta platinas x-y, y bancos pticos El micrmetro de platina es en realidad utilizado como un "espcimen" para calibrar por ejemplo, una retcula de ocular. Para el usuario profesional del microscopio ptico o para el investigador, estos son los estndares definitivos de

Mtodos de Conteo de Poblaciones

Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente ms diludas de la muestra. 2.- Filtros de membrana: utilizados cuando el nmero de bacterias es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con naranja de acridina que tie especficamente los cidos nucleicos). 3.- Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingls de Direct Epifluorescence Filter Technique (tcnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta tcnica las bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la naranja de acridina) para teir las clulas bacterianas (se somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las clulas somticas). La deteccin de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopa de fluorescencia o por cualquier otro mtodo de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban para producir colonias que son ms fcilmente dtectables.

4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se aade un pequeo volumen de agarcultivo a un porta y se incuba para seguir la formacin de microcolonias al microscopio.

5.- Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solucin madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las colonias en las gotitas tras la incubacin. 6.- Films secos (Petrifilm): Son pelculas deshidratadas de medios de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubacin se hace el recuento. 7.- Mtodo del nmero ms probable: Basado en series de diluciones y clculo estadstico del nmero de bacterias presentes en las diluciones ms altas. Se puede hacer con 3 5 tubos. El mtodo es popular aunque poco excto. 8.- Mtodos basados en la reduccin de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios lquidos (lcteos) 9.- Tubos rodantes: son tubos hermticamente cerrados en los que hacindolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios 10.- Contaje microscpico directo: Usando cmaras de cuenta, se coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias. 2. Mtodos fsicos para la detencin de microorganismos. Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad elctrica y esto vara la impedancia. El mtodo se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos se expresa como funcin del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de impedancia correspondientes a 106 - 107 clulas por ml1. (IDT: Imdepedance Detection Time). Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogneo sin escalones. Microcalorimetria: Estudio de los pequeos cambios de calor producidos como consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetra para poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una composicin definida de azcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias lcticas mediante los termogramas de su metabolizacin de los azcares presentes en el medio. Citometria de flujo: Mtodo basado en hacer pasar una a una las clulas de una suspensin por un sistema de deteccin; este sistema puede contener un detector capaz de medir diferentes parmetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersin de luz, etc.) lo que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.

3. Mtodos qumicos de deteccin de microorganismos. Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicacin. La endonucleasa puede detectarse experimentalmente como un ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina. Lisado de Limulus: Usado para deteccin de endotoxinas (derivadas del lipopolisacrido LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede detectar 300 clulas de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y no-viables. Es muy rpido. Sondas de cidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern. PCR: Mtodo para detectar nmero extremadamente bajos de microorganismos con una cierta rapidez basado de la produccin de copias de genes especficos de un microorganismo en cuestin. Medida de ATP-: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas experimentales que hacen que la tcnica sea controvertida. Radiometria: Medida de la transformacin de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente. Substratos Fluoro y Cromognicos: Se aaden como aditivos a los medios de cultivos para facilitar y acelerar la deteccin de los microorganismos. 4. Mtodos inmunolgicos. Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas mviles de Salmonella y otras bacterias) Anticuerpo fluorescente: Se utiliza anticuerpo marcado con una molcula fluorescente o un segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de aislarlas. El mtodo tambin se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicacin ha sido en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez. Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la deteccin de Salmonella, el antisuero no se aade al alimento sino que se

efecta un paso previo de enriquecimiento del cultivo y de seleccin para evitar falsos positivos. Test 1 - 2 de Salmonella: Sistema con dos cmaras de agar blando. Una de las cmaras (la de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias mviles de este gnero atraviesan la cmara selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo especfico por lo que se forma una banda de aglutinacin cuando entre Salmonella. Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioistopo de un antgeno determinado (toxina producida por una bactera patgena) y su posterior deteccin por anticuerpos especficos fijados sobre un soporte slido. ELISA: El mtodo es similar al radioinmunoensayo: el antgeno se fija en un soporte slido, se trata con el antisuero correspondiente y la interaccin se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestin o a un segundo anticuerpo de revelado. El mtodo se ha usado para deteccin de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli. Difusin en gel: Mtodo de Ouchterlony para deteccin de antgenos.