TALLER DE ENSAYOS ENZIMTICOS 5 Emplee papel milimetrado para hacer grficos Grupo 1

1.- La Alcohol Deshidrogenasa (ADH) es una deshidrogenasa piridn (Niacina) dependiente que participa en la etapa final de la fermentacin alcohlica, en la reaccin:

Acetaldehdo + NADH + H+

Etanol + NAD+

Si se establecen las condiciones necesarias in vitro para que la reaccin tenga lugar en el sentido inverso la reduccin enzimtica del NAD + va acompaada de la aparicin de un mximo de absorcin a 340 nm. El incremento refleja la reduccin del anillo aromtico de la porcin de niacinamida. La medicin de la absorcin a 340 nm se emplea para seguir el curso de las reacciones catalizadas por las deshidrogenasas piridn dependientes de manera continua. Para determinar la Actividad Enzimtica de la ADH, en una cubeta se adicionaron las siguientes cantidades de reactivos: Buffer pirofosfato 0.06 mol/L pH 5.7 Etanol NAD+ 1.5 mL 0.05 mL 0.1 mL

Finalmente se aadieron 0,025 mL de una solucin de ADH diluida 1:100 respecto al preparado enzimtico original, se agit suavemente y se realizaron lecturas a 340 nm cada 15 segundos. Los resultados fueron: DO 340 nm 0.021 0.051 0.079 0.109 0.140 0.168 t(s) 15 30 45 60 75 90

M1cm1 340nm ,NADH = 6,2

PREGUNTAS: 1) Cul es el espectro de absorcin para NAD/NADH + H? 2) Qu significa la pendiente de la curva DO versus tiempo? 3) Haga una curva de micromoles (uM) o milimoles (mM) de NADH versus tiempo 4) Determine la Actividad Enzimtica del preparado inicial de ADH. 5) Si el preparado enzimtico original tena 10 mg de la enzima. Cul ser la actividad especfica y la actividad total en un ml de la enzima original, sin diluir?

Grupo 2
2.-La determinacin de la actividad enzimtica (AE) de la proteasa tripsina se lleva a cabo usando una tcnica discontinua: el mtodo de Anson (1938). El principio del mismo es la cuantificacin de los pptidos producidos por la accin de la enzima sobre un sustrato proteico (casena) mediante la reaccin con el reactivo de Folin-Ciocalteau. En esta reaccin los aminocidos aromticos forman un complejo coloreado que absorbe a 650 nm. Como ya se mencion el Mtodo de Anson es una tcnica discontinua que requiere de la interrupcin de la reaccin a diferentes tiempos. En este caso particular, la detencin se logra adicionando a la mezcla de reaccin cido tricloroactico (TCA) el cual precipita tanto al sustrato aun sin degradar como a la enzima, mientras que los pptidos resultantes de la protelisis se mantienen estables en la solucin. Para la determinacin de la actividad de un preparado se aadi a diferentes tubos, que contena 500 l de Casena al 1 %, 100 l de de enzima diluda 7 veces y se agit ligeramente. La reaccin en cada tubo se detuvo a diferentes tiempos adicionando 1 mL de TCA al 5 % y agitando vigorosamente. Luego se filtr separando fsicamente el precipitado de los productos de la reaccin. Para el desarrollo del color se tomaron 0,5 mL de cada filtrado a los cuales se les adicion 1 mL de NaOH y 0,3 mL de reactivo Folin-Ciocalteau. Finalmente se determin la absorbancia a 650 nm. t(min) 5 10 15 25 DO650nm 0.2 0.38 0.6 0.77

Los productos de la reaccin se expresan de forma arbitraria como moles de tirosina, para lo cual se realiza una curva de calibracin con concentraciones conocidas de este aminocido siguiendo exactamente el mismo procedimiento colorimtrico. A partir del grfico de DO650nm vs moles de tirosina se determina la cotangente que se utiliza en la determinacin. PREGUNTAS 1) En qu consiste el metodo de Folin Ciocalteau: 2) Haga la curva de calibracin de la Tirosina y determine su pendiente

moles Tyr

D.O. de la Tyr

5 10 15

0,25 0,50 0,75

20 25 30

1.00 1.25 1.50

3) Un micromol de Tirosina corresponde a X de D.O.

4) Qu necesitara para hacer la curva Michaelis Menten y Lineweaver-Burk 5) Determine la AE del preparado enzimtico inicial. 6) El valor correcto de la AE de la tripsina mediante este mtodo puede determinarse usando un solo juego de datos, o sea deteniendo la reaccin a un solo tiempo fijo. Cul Ud. cree que pueda ser el tiempo seleccionado para ello? Por qu?

Grupo 3
3.- La Actividad Enzimtica de la tripsina puede medirse utilizando un pH stat. En un ensayo tipo en la celda se aadieron 1,5 mL de NaCl 0,1 mol/L, pH 8 y 0,5 mL del preparado enzimtico crudo diluido 1/10. Para comenzar la reaccin se aadieron 2 mL de BAEE 1x10-3 mol/L ajustados previamente a pH 8 y se registro la adicin de NaOH 1x10-2 mol/L en el tiempo. El volumen total de la jeringuilla de inyeccin con NaOH es de 0,25 mL, lo que corresponde a 25 cm del papel registrador (en el eje y). El papel avanza a una velocidad de 1 cm/min. X(cm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PREGUNTAS : 1) Haga el grfico de X versus Y 2) Determine el tiempo de la reaccin 3) Determine el volumen de NaOH empleado 3) Determine la conc. de NaOH empleado 4) Determine la conc. versus tiempo de NaOH 5) Calcule la AE y exprese sus unidades. 6) Calcule la Actividad Especifica (Aesp) teniendo en cuenta que utilizando 0,8 mL del preparado enzimtico, diluido 10 veces, en el mtodo de Lowry se registro una DO 650nm de 0,2. (cot = 375 g/DO). Y(cm) 1.2 2.3 3.5 4.7 6.0 7.2 8.0 8.2 8.25

Leer para resolver pregunta anterior: Enzymatic Assay of PROTEASE INSOLUBLE PRINCIPLE: BAEE + H2O Protease > Na-Benzoyl-L-Arginine + Ethanol Abbreviation used: BAEE = Na-Benzoyl-L-Arginine Ethyl Ester CONDITIONS: T = 30C, pH 7.0 METHOD: Titrimetric REAGENTS: A. 1 M Potassium Chloride Solution (KCl) (Prepare 15 ml in deionized water using Potassium Chloride, Sigma Prod. No. P-4504.) B. 500 mM Na-Benzoyl-Arginine Ethyl Ester (BAEE) (Prepare 15 ml in deionized water using Na-Benzoyl- LArginine Ethyl Ester, Hydrochloride, Sigma Prod. No. B-4500. Adjust to pH 7.0 at 30C with 1 M NaOH.)

C. 100 mM Sodium Hydroxide Titrant, Standardized (NaOH) (Prepare 50 ml in deionized water using Sodium Hydroxide, Anhydrous, Sigma Stock No. 505-8. Standardize according to the ACS Reagent Procedure. 1) D. Protease Insoluble Enzyme Solution (Insol Enz) (Immediately before use, prepare a suspension containing approximately 20 mg of Protease, Insoluble Enzyme, 8 ml of deionized water and 1 ml of Reagent A. Mix by swirling. Filter on Whatman #50 filter paper and remove any soluble protease by vacuum filtration. Stop the vacuum filtration before the gel becomes dry or begins to crack. It should be moist.) Revised: 07/20/95 Page 2 of 3 Enzymatic Assay of PROTEASE INSOLUBLE PROCEDURE: Using a suitable pH meter in conjunction with a magnetic stirrer, pipette (in milliliters) the following reagents into a suitable titration vessel: Test Deionized Water 8.00 ml Reagent A (KCl) 1.00 Reagent B (BAEE) 1.00 Mix by swirling and equilibrate to 30C. Adjust to pH 7.0 by the addition of Reagent C (NaOH). Then add: Reagent D (Insol Enz) 20 mg Start a timer when the pH reaches 7.0. Run the reaction for 2 - 10 minutes. Maintain the pH of the reaction mix at pH 7.0 by the addition of small volumes (0.05 ml) of Reagent C (NaOH). Record the volume of Reagent C (NaOH used to maintain the pH at 7.0) and the time (in minutes) required to consume the added Reagent C (NaOH). CALCULATIONS: (Molarity of NaOH)(NaOH)(1000) Units/g solid = (T)(mg of insoluble enzyme) NaOH = Volume (in microliters) of Reagent C (NaOH) 1000 = Conversion factor from mg to g

T = Time required (in minutes) to consume the added Reagent C (NaOH) while maintaining the pH at 7.0 UNIT DEFINITION: One unit will hydrolyze 1.0 mole of BAEE per minute at pH 7.0 at 30C. FINAL ASSAY CONCENTRATIONS: In a 10.00 ml reaction mix, the final concentrations are 100 mM potassium chloride, 50 mM Na-benzoyl-L-arginine ethyl ester, and 20 mg of protease insoluble enzyme. Revised: 07/20/95 Page 3 of 3

Grupo 4
4.- La Peroxidasa (POX) es una hemoprotena, cuya funcin fundamental es capturar los radicales libres producidos en el metabolismo de los organismos aerobios. La reaccin que cataliza se puede representar segn:

Donador + H2O2

Donador Oxidado + 2H2O

La enzima cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y dioxgeno. Este ltimo oxida al sustrato donador de electrones. Con el objetivo de determinar la actividad enzimtica de la POX en el laboratorio se utilizan como sustratos reductores al guayacol, la o-dianisidina u otros compuestos fenlicos. La aparicin del donador oxidado en el tiempo se puede seguir dadas las propiedades de cromforo que presentan estos compuestos, contando de esta forma con un mtodo continuo de determinacin de actividad enzimtica. En un experimento de esta naturaleza se mezclaron los siguientes reactivos: Componentes Tris-HCl 0.01 mmol/L pH7 Guayacol 100 mmol/L H2O2 0,25 umol/L Enzima Cantidad 1mL 0.75 mL 0.05 mL 0.1 mL 5.57

guayacol (ox), 1 mol/mL, 470 nm =

Se determin la DO a 470 nm cada 1 minuto y a disitntas concentraciones de sustrato H2O2. Los resultados fueron: Tiempo (min) 1 2 3 4 5 0,25 umol Sust. H2O2 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100 0,50 umol Sust. H2O2 0,040 0,080 0,120 0,160 0,200 0,75umol Sust. H2O2 0,060 0,120 0,180 0,240 0,300 1,0 umol Sust. H2O2 0,080 0,160 0,240 0,320 0,400 1,25umol Sust. H2O2 0,090 0,180 0,270 0,360 0,450 1,50umol Sust. H2O2 0,095 0,190 0,285 0,380 0,475

Preguntas:

1) Cul es la estructura oxidada y reducida del Guayacol y la O-Dianisidina 2) Cmo se acoplan ambas reacciones? 3) Determine la actividad de la enzima 4) Exprese los valores en umoles/min/ml de guayacol 5) Calcule Km y Vmx mediante Lineweaver-Burk

OTROS PROBLEMAS 5.- La Glucosa oxidasa ( -D-glucosa: oxgeno oxidorreductasa) es una flavoprotena que cataliza la oxidacin de la -D-glucosa en cido glucnico utilizando al oxgeno como aceptor de los electrones con la consiguiente formacin de H2O2.

-D-Glucosa + O2

D-glucono-1,4 lactona + H2O2

Con el objetivo de determinar la actividad de esta enzima se emplea un mtodo acoplado que se basa en acoplar la reaccin de la glucosa oxidasa con la reaccin que cataliza la peroxidasa:

H2O2 + O-dianisidina(red)

H2O + O-dianisidina(ox)

Esta segunda reaccin da como resultado un producto coloreado que permite seguir su curso temporal. De esta forma contamos con el seguimiento de un parmetro que es representativo de la aparicin de uno de los productos de la reaccin de inters, en este caso, la catalizada por la glucosa oxidasa. Para determinar la actividad enzimtica de la glucosa oxidasa, en una cubeta se adicionaron las siguientes cantidades de reactivos: Componentes Buffer fosfato 0,2 mol/L pH ,57 Peroxidasa -D-glucosa 10% O-dianisidina Solucin de enzima (1:10) Cantidad 1mL 50 L 50 L 50 L 50 L

Despus de aadir la solucin de enzima se agit y se hicieron lecturas a 436 nm cada 15 segundos. Los resultados obtenidos se muestra a continuacin: Tiempo (segundos) 15 30 45 60 75 90 DO436nm 0.07 0.14 0.22 0.28 0.33 0.37 El coeficiente de extincion de la o-dianisidina oxidada a 436 nm referido a una concentracin de 1micromol/mL es 8,3.

a) Determine la actividad enzimtica del preparado inicial. b) Qu caractersticas debe tener la segunda reaccin para interactuar con la primera? 6.- Se midi la actividad enzimtica de un preparado enzimtico puro de fosfolipasa A 2 utilizando una tcnica radioqumica. Se emplearon en el ensayo 800 nmoles de fosfatidilcolina marcada en el cido grado que esterifica el carbono 2 en buffer pH 9 (4.0 ml). Despus de la adicin de 0.8 ml de enzima (1:100) la mezcla se incub a 37 C y se tomaron alcuotas de 0.6 ml a tiempo 0 y luego cada 10 minutos. A dichas alcuotas se

les extrajo el material lipdico y una vez concluido el tiempo total de la reaccin (60 minutos) se cromatografiaron en placa delgada junto con un control del sustrato no hidrolizado y un patrn de cidos grasos. Para el control del sustrato no hidrolizado se prepar una mezcla con 0.5 ml de Fosfatidilcolina marcada (100 nmoles) y 100 microlitros del tampn donde fue diluida la enzima y se procedi de igual forma que con las alcuotas correspondientes al ensayo enzimatico. Despus del revelado de la placa cromatogrfica las manchas correspondientes a la fraccin de cidos grasos se evaluaron en un contador de centelleo lquido. Adicionalmente se prepar un control de radioactividad total con 100 nmoles de fosfatidilcolina marcada. Los resultados obtenidos fueron: Curva tpica: tiempo (minutos) 0 10 20 30 40 50 60 cpm 228 2902 5577 8247 10921 13597 16269

La mancha de Acidos grasos correspondiente al control del sustrato no hidrolizado (100 nmoles) present una radioactividad baja pero cuantificable de 225 cpm. El control de radioactividad total de la fosfatidilcolina marcada (100 nmoles) arroj un conteo de 50325 cpm Calcule la Actividad Enzimtica y la Actividad Molecular del preparado original de la enzima Datos: Peso Molecular de la fosfolipasa 30 kD DO280nm(1:500) = 0.3

k fosfolipasa=15
1%,280nm

7. La actividad de la pepsina se ensay siguiendo el curso de la reaccin por el incremento de la intensidad de la fluorescencia del producto de hidrlisis del sustrato sinttico Ala-Ala-phe-Phe antranoil p-nitroanilina. La excitacin a X nm del producto de hidrlisis provoca su emisin fluorescente y el espectro de emisin presenta un mximo a Y nm. En el ensayo de Actividad enzimtica se aadieron a la cubeta de medicin 1.2 ml de sustrato y 10 l de enzima. Calcule la actividad enzimtica de la solucin original de pepsina en g de sustrato transformado x min -1 x ml-1 si para su determinacin la enzima se diluy 20 veces. Los valores de fluorescencia obtenidos a intervalos de 10 segundos fueron: tiempo (segundos) 0 10 20 30 40 50 60 Fluorescencia (Unidades Arbitrarias) 22 35 48 62 74 84 90

El espectro de fluorescencia de 25 g del sustrato no hidrolizado registrado en las mismas condiciones en que se realiz el ensayo enzimtico present un discreto mximo a Y nm de 20 unidades arbitrarias. Mientras que el mximo de igual cantidad de sustrato completamente hidrolizado fue de 100 unidades arbitrarias.