PRACTICA No.

3: EXTRACCIN DE ARN

1. INTRODUCCIN En los organismos celulares el ARN es la molcula encargada de dirigir la sntesis de protenas, pues aunque el ADN es el que contiene la informacin que determina la estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta informacin y producir las protenas necesarias para el desarrollo y actividades de la clula. La mayor dificultad en la extraccin del ARN es evitar la contaminacin con RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores para su funcin. Por lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-pirocarbonato (DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificacin covalente

2. OBJETIVOS Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extraccin de ARN Adquirir conocimiento bsico para el manejo y cuidado de ARN extrado Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtencin de ARN

3. MARCO TEORICO La mayora de protocolos para extraccin de ARN estn basados en el mtodo descrito por Chomezynski y Sacchi (1), el cual se basa en el aislamiento de este cido nucleico empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante el procedimiento debe realizarse una etapa de homogenizacin de la muestra con el (los) reactivo (s) que contengan la solucin fenol-isotiocianato, donde este ltimo se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras rompe las clulas y disuelve sus componentes, la adicin posterior de cloroformo separa la solucin en fase acuosa y orgnica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar por precipitacin el ARN. La metodologa que se va a utilizar en esta prctica, permite recuperar el ARN de la fase acuosa como ya se mencion, igualmente el ADN y las protenas pueden ser recuperados de la fase orgnica por precipitacin secuencia, as con etanol se logra precipitar el ADN de la interfase y con una precipitacin adicional pueden recuperarse las protenas de la fase orgnica.

Esta tcnica permite obtener ARN a partir de pequeas cantidades de tejido y clulas en cultivo o suspensin de origen humano, vegetal, animal o bacteriano. As mismo el ARN obtenido si se realiza el procedimiento con precaucin est libre de contaminacin con ADN y protenas y finalmente puede ser utilizado en diferentes procedimientos como Northern blot, Dot blot, Transcripcin reversa, ensayos de proteccin de RNAsas PCR y clonaje molecular PRE-LABORATORIO 1. Durante la extraccin de RNA se emplea sales de guanidinium. Cul es su funcin y que tipo de sales son las ms utilizadas? 2. Cul es la funcin del dietilpirocarbonato (DEPC) durante la extraccin del RNA? 3. Mediante el mtodo de TRIzol se puede aislar simultneamente DNA, RNA y protenas? 4. Se obtiene la misma cantidad de RNA que de DNA en la extraccin? 5. Qu tipo de RNA se obtiene en este tipo de extraccin? 6. Porque se requiere agua milli Q, ultrapura o tipo I en este procedimiento? 4. PRECAUCIONES Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente durante el procedimiento de manipulacin del ARN para obtener la segunda cadena o cadena complementaria, por lo cual deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos cuando se trabaja con ARN: - Siempre deben utilizarse guantes de ltex, ya que la piel contiene algunas bacterias que poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer. - Utilizar pipetas y micro pipetas estriles, reservadas para trabajo de ARN, evitando as contaminaciones cruzadas. - Utilizar material tratado con inhibidores de RNAsas (libre de RNAsas) -El reactivo bromuro de etidio es altamente peligroso por lo que siempre deben utilizarse elementos de proteccin como guantes y gafas, evitando completamente el contacto con piel y ropa, as como evitando inhalar el reactivo o los vapores de este. Otras precauciones son: - Utilizar siempre tubos de polipropileno - Utilizar material resistente al cloroformo centrifugacin

altas

velocidades

de

Equilibrar los tubos previos a la centrifugacin Tapar o sellar correctamente los tubos durante la centrifugacin y durante la incubacin para evitar la evaporacin.

5. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos Vacutainer con EDTA, heparina o citrato Reactivo TRIzol (Gibco Eppendorf estriles de 1.5 mL Micro pipetas Puntas estriles Centrfuga y micro centrfuga Guantes Agua desionizada estril Cloroformo Agua libre de RNasas Isopropanol Etanol al 75% en agua libre se RNAsas

6.

PREPARACIN DE REACTIVOS

NaCl al 0.9% -Agua libre de RNAsas 1mL de Dietil-pirocarbonato (DEPC) 1L de agua destilada estril Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizar completamente el DEPC con el agua (durante 12 horas aproximadamente). Esto debe hacerse en cabina de extraccin y con todas las medidas de bioseguridad conocidas. Autoclavar 2 veces y almacenar a temperatura ambiente - Etanol al 75% 100mL de agua libre de RNAsas Etanol grado biologa molecular Mezclar cuidadosamente 75mL de etanol con 15mL de agua libre de RNAsas en un frasco estril hasta homogenizar completamente No autoclavar y almacenar a temperatura ambiente.

6. PROCEDIMIENTO Esta prctica se realizar en dos clases. En la primera se recolectara la muestra a partir de leucocitos humanos, obtenidos por gradiente de centrifugacin isopicnica Ficoll Hypaque y se dejara hasta el paso de homogenizacin.

TECNICA DE TRIzol PARA EXTRACCIN DE ARN 1. HOMOGENIZACIN - En un tubo Eppendorf de 1.5 mL, homogenizar el pellet de clulas blancas (obtenidas previo sometimiento de sangre total a gradiente de FicollHypaque para obtencin de PBL- leucocitos de sangre perifrica) con 1 mL de reactivo TRIzol. - Mezclar suavemente por pipeteo con micro pipeta 2. FASE DE SEPARACIN - Incubar la muestra homogenizada durante 5 minutos a temperatura ambiente, permitiendo as la completa disociacin de los complejos de nucleoprotenas - Adicional 200ul de cloroformo, tapar perfectamente el tubo - Agitar fuertemente durante 15 Homogenizar pellet de clulas segundos blancas con TRIzol - Incubar por 2 a 3 minutos a temperatura ambiente y en Mezclar e incubar posicin vertical - Centrifugar las muestras a 10000rpm (o 12000g) por 10 Adicionar cloroformo minutos preferiblemente a temperatura de 2 a 8C Agitar e incubar - Luego de centrifugar, la mezcla se separa en una fase inferior roja, fase de fenol cloroformo, en Separacin de fases una interfase y en una fase incolora superior, la cual contiene Tomar la fase acuosa y exclusivamente el ARN
Adicionar isopropanol

3. FASE DE PRECIPITACIN - Transferir la fase acuosa cuidadosamente a un tubo Eppendorf nuevo (aqu puede separarse igualmente la fase orgnica para posterior purificacin de ADN o protenas)

Descartar el sobrenadante Adicionar etanol al 75% al pellet. Mezclar

Eliminar el sobrenadante

Dejar secar a T ambiente Adicionar agua libre de RNAsas y homogenizar

Adicional 0.5 mL de isopropanol para precipitar el ARN de la fase acuosa Incubar el tubo por 10 minutos a temperatura ambiente y en posicin vertical Centrifugar a 10000rpm (o 12000g) por 10 minutos, preferiblemente a temperatura de 2 a 8C El ARN debe verse precipitado antes de la centrifugacin como un pellet parecido a un gel.

4. -

FASE DE LAVADO Remover el sobrenadante cuidadosamente y eliminarlo Adicionar 1 mL de etanol al 75% al pellet para lavarlo Mezclar por agitacin Centrifugar a 6000rpm por 5 minutos preferiblemente a 2- 8 C Eliminar cuidadosamente el sobrenadante

5. FASE DE DISOLUCIN Secar a temperatura ambiente, colocando el Eppendorf con el ARN sobre una toalla de papel estril Adicionar 30ul de agua libre de RNAsas Disolver el RNA por pipeteo suave, opcionalmente puede incubarse 10 minutos a 55-60C para lograr una completa disolucin

7. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS A qu factores puede deberse la obtencin de baja cantidad o prdida total del ARN extrado con esta metodologa? Qu otras tcnicas comerciales existen para extraer ARN? El ARN obtenido aqu puede utilizarse directamente para realizar una determinacin especfica a travs de PCR? Por qu? A partir de que otras muestras puede realizarse la extraccin de ARN y con qu objetivo se realiza en estas muestras la extraccin? Qu inhibidores de nucleasas existen y en que procedimientos deben utilizarse?

8. BIBLIOGRAFIA Revista Nature Protocolos Aos 2009-2013 - Almonacid, C Pinilla G. Introduccin al anlisis Bioqumico y a sus mtodos de separacin. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca . 2008 - Chomczynski P. and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162:156 - Chomczynski P. and Sacchi. 1993. Biotechniques. 15:532

Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2 nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York David, L.G. dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986 Catlogos de TRIzol casa comercial GIBCO.

9. AUTOEVALUACION.
NUMERO DE LA PRACTICA LOGRO (Objetivos cumplidos) SI NO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD

ANEXO COMPLEMENTARIO A LA PRCTICA No. 3 OBTENCION DE ADNc

1. INTRODUCCIN Cuando el ARN mensajero es obtenido, se puede llevar a cabo una amplia variedad de aplicaciones: elusin del ARNm, cuantificacin del ARNm y sntesis de ADNc (ADN complementario) el cual puede ser utilizado para: amplificacin, deteccin de la expresin de genes especficos o almacenaje de ADNc. Para obtener el ADNc se utiliza una tcnica denominada RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction; Transcripcin Reversa - Reaccin en Cadena de la Polimerasa), que nos permite la amplificacin de una cantidad pequea de molculas de ARN (tanto ARNm como RNA total) con gran especificidad, mediante la Transcripcin reversa del RNA a ADNc, que es posteriormente amplificado.

2. OBJETIVOS Identificar los reactivos, funcionamiento y orden de adicin de los reactivos necesarios en la obtencin de ADNc in Vitro. Adquirir conocimiento bsico para el manejo y funcionamiento de la obtencin de cadenas complementarias de ADN Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtencin de ADNc

3. MARCO TEORICO Esta tcnica permite obtener ADNc a partir de pequeas cantidades de ARN de origen humano, vegetal, animal o bacteriano. As mismo el ADNc obtenido por este mtodo, si se realiza el procedimiento con precaucin, est libre de contaminacin con DNAsas y protenas. Adems el ADN contaminante, tanto en las muestras, como en los reactivos, debe ser evitado con el fin de impedir la aparicin de productos inespecficos Hay dos partes bien diferenciadas en cualquier RT-PCR: la transcripcin reversa y la amplificacin. La transcripcin reversa, utilizando RNA total como ARNm, es la etapa clave en una RT-PCR. Existen varios factores que influencian la eficiencia del proceso, tales como: la enzima que va a llevar a cabo esta reaccin, la presencia de estructuras secundarias en el ARN, etc.

Las reverso transcriptasas virales, tales como M-MLV y AMV, han sido las enzimas de eleccin durante muchos aos. Estas enzimas, sin embargo, son termolbiles, y no pueden llevar a cabo la transcripcin reversa cuando existen estructuras secundarias en el ARN. En este caso, se suelen utilizar transcriptasas reversas termoestables, que pueden llevar a cabo la reaccin a 55-70C, permitiendo la desnaturalizacin de las estructuras secundarias, y aumentando la eficiencia global de la reaccin. 4. PRECAUCIONES Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente durante el procedimiento de manipulacin del ARN para obtener la segunda cadena o cadena complementaria, por lo cual debe utilizarse durante todo el procedimiento guantes de ltex, ya que la piel contiene algunas bacterias que poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer; utilizar todo el material necesario para el trabajo de ARN (pipetas, micro pipetas, entre otros) estril y con inhibidores de RNAsas evitando as contaminaciones cruzadas. Se deben tener en cuenta otras precauciones enunciadas en la prctica de extraccin de ARN PRE- LABORATORIO Dependiendo las condiciones experimentales puede darse la necesidad de usar ADNc, para lo cual se realiza primero la extraccin de ARN que ms tarde ser sintetizado a ADNc. Para ello, la ciencia se ha valido de un truco viral: los virus que no poseen ADN propio tienen que transformar su ARN a ADN dentro la clula husped y para ello estn equipados con una ADN polimerasa especial, al igual que otras polimerasas es dependiente de ARN, est se denomina transcriptasa reversa. La ms conocida comercialmente es la MMLV (Molones Murine Leucemia Virus) que aade nucletidos al poli nucletido naciente en direccin 5' 3'. MMLV utiliza ARNm como molde, pero requiere de un cebador. Teniendo en cuenta el enunciado anterior. Responda las siguientes preguntas: 1. Cul es la diferencia entre ADNc y ADN genmico? 2. Actualmente en el mercado se cuenta con otro tipo de retrotranscriptasas, mencione alguna de ellas? Cules son las diferencias entre cada una de ellas? 3. La retrotranscriptasas utilizan ARNm como molde, pero requiere de un cebador. Los cebadores ms comunes son un oligo dT (TTTTTTTT), primers degenerados (generalmente hexmeros) especficos anti sentido o sentido. En qu condiciones se deben emplear cada uno de ellos?

5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS ARN obtenido con anterioridad

Micro pipetas Puntas estriles Vortex Centrfuga con rotor para tubos de 15ml y Micro centrifuga para viales de 1.5 ml Guantes Agua des ionizada estril Tris Acetato EDTA SDS Bromuro de etidio Agarosa Reactivos comerciales para transcripcin reversa Cmara de electroforesis

6. PREPARACION DE REACTIVOS Agua libre de RNAsas 1mL de Dietil pirocarbonato (DEPC) 1L de agua destilada estril Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizacin completa del DEPC con el agua (durante 12 horas aproximadamente), adicionando el DEPC en cabina de extraccin y con todas las medidas de bioseguridad conocidas. Autoclavar 2 veces y Almacenar a temperatura ambiente

7. PROCEDIMIENTO TECNICA DE ADNc DE PROMEGA

Luego de la extraccin de ARN, cada muestra se procesa para la obtencin de cadena complementaria o ADNc por medio de una reaccin la cual contiene la enzima Transcriptasa Reversa MMLV-RT, buffer para la enzima, dNTPs, RNAsin y Random Primers u Oligo DT (Promega). El procedimiento utilizado es: 1. En un tubo Eppendorf, colocar 10 l de RNA (200ng aproximadamente) 2. Adicionar 5ul de agua libre de RNAsas 6ul de buffer para RT, 1ul de RNAsin, 1.5ul de dNTP (mezcla de 10mM), 3 l de Oligo DT o Random Primers y 1.5ul de enzima MMLV-RT. 3. Incubar a 37C durante 1 hora. 4. El ADNc obtenido se puede guardar a -20C hasta su futuro uso. 5. Puede observarse la calidad del ADNc visualizndolo en gel de agarosa al 1% preparado en buffer de corrido TAE (tris-acetato-EDTA) y teido con bromuro de etidio.

6.

El corrido se hace a 100V durante 30 minutos aproximadamente

8. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS Cmo acta o funciona la MMLV-RT en la transcripcin reversa? Qu otras transcriptasas reversas existen, de que origen y que caractersticas tienen? La enzima para la transcripcin reversa en que paso del procedimiento debera adicionarse y porque? El ADNc obtenido en que procedimiento o para que finalidades puede utilizarse? Qu inhibidores de RNAsas existen y cmo actan?

8. BIBLIOGRAFIA
-Revista Nature Protocols aos 2009- 2012 1..Catlogos y fichas tcnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad, Biologend, Bioline, Roche, etc. 2.Chomczynski P and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162: 156. 1. David, L.G. Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basic methods in molecular biology. Elsiever Science publishing Co. Ind. NY. 1986. 2. Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 3. Catlogos de PROMEGA para obtencion de caderna complementaria de DNA.

4. Fundamentos moleculares en medicina. Fernando Lizcano Losada.Manual Moderno. Universidad de la Sabana. 2005. 5. Biologa molecular e ingenieria genetica. Texto ilustrado de biologa molecular e ingenieria genetica. Luque jose et l. Primera edicion. 2001.

9. AUTOEVALUACION.
NUMERO DE LA PRACTICA LOGRO (Objetivos cumplidos) SI NO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS A CADA DEBILIDAD