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32P
Experimento de hibridizao
Hibridizao da membrana com sonda radioativa
Southern Blot:Exemplo
Gel de Agarose 0h
28S
18S
Sonda Gene A
Gel de Agarose 0h
28S
18S
Sonda Gene B
Quantificaes de cidos nuclicos via PCR A quantidade de produto de PCR amplificado de diferentes amostras proporcional a quantidade de acido nuclico presente nesta amostra, devido a isso pode-se utilizar o PCR para quantificao de amostras. No entanto: -Nos ciclos finais do PCR ocorre uma saturao de produto, que passa competir com o primer na renaturao. Devido a isso, neste estagio a quantidade de produto amplificado deixa de ser proporcional a quantidade inicial. -Cada primer possui eficincia diferente portanto comparaes diretas entre amplificaes com diferentes primers no possvel.
PCR Semi-quantitativo
Pode-se utilizar sondas (figura acima) ou molculas que possuem fluorescncia maior quando ligadas a dupla fita do DNA (SYBR green)
Para ser quantitativa a medida deve ser feita no perodo antes da saturao da reao de PCR
Impresses Digitais de DNA por RFLP* e Southern Blot Mais demorado e requer muita amostra Impresses Digitais de DNA atravs de mtodos baseados em PCR Rpido, sensvel, requer pouca quantidade de amostra
SNP = Poliformismo de um nico nucleotdeo RFLP= Restriction Fragment Length Polymorphisms
Doenas genticas que podem ser diagnsticadas por anlise de DNA (PCR/RFLP ou RFLP/Southern)*
Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) Leucemia Mielide Crnica Anemia falciforme Doena de Hunntington (doena neurodegenerativa) Doena cardaca coronariana (formao precoce de placas aterosclerticas) Fibrose Cstica Deteco de mutaes em oncogenes e supressores tumorais
Deteco da mutao no gene da -globina: anemia falciforme RFLP/ Southern Blot Gene normal com stio para MstII
Gene mutante sem stio para MstII poliformismo no stio da enzima restrio
(RFLP= restriction fragment lenght polymorphism)
Testes de identidade via DNA - Verificao de identidade de indivduos atravs da analise da variabilidade gentica
- Indivduos possuem baixo nvel de variabilidade em suas seqncias codificantes para protenas (preservao de funo)
- Existem regies repetitivas no genoma de funo desconhecida na qual existe um maior nvel de variabilidade
Impresses digitais de DNA para comprovao de parentesco (realizado em 1985 por Alec Jeffreys) Andrew filho de Christiana e irmo de David, Joyce e Diana. X= DNA de pessoa no relacionada * No havia amostra do DNA do pai O Southern do DNA digerido com enzimas de restrio hibridizado com sondas multilocus
Impresses digitais de DNA de sete suspeitos e da amostra de sangue recolhida na cena do crime.
O Southern do DNA digerido com enzimas de restrio hibridizado com sondas multilocus
Separao e Deteco dos produtos de PCR: Amostras: sangue, dente, ossos, cabelo, semen, urina, osso, tecidos, lquido amnitico Eletroforese em gel de agarose corado com EtBr ou prata Southern blot e sondas radiativas Eletroforese em gel de poliacrilamida Primers fluorescentes na reao de PCR
AATG ou TCAT
Alelo 1
Alelo 2
Alelo 1
Alelo 2
Identificao de ndividuos com PCR multiplex (alelos STR): at 10 pares de primers com fluorforos distintos em uma nica reao