Identificacin del antgeno de superficie K en cepas de Campylobacter fetus subs.

venerealis, intermedio y fetus del Uruguay

MILTON CATTANEO Enfermedades Infecciosas Facultad de Veterinaria A RESUMEN La vibriosis genital bovina es una enfermedad del ganado caracterizada por producir infertilidad temporaria y abortos. El agente etiolgico de la vibriosis bovina es el Campylobacter fetus. Dentro del gnero existen tres variedades patgenas venerialis, intermedius y fetus. Se transmite en forma venrea y se localizan en el aparato reproductor del macho y la hembra. Un estudio realizado por el DILAVE en el ao 2001esta enfermedad tiene una prevalencia para nuestro pas en toros de un 28.05 % y por establecimientos de un 37 %. Poseen antgenos termoestables (O), flagelares (H) y un antgeno superficial termolbil (K), denominado S-layer, que cubre al antgeno O. El antgeno K fue reconocido como factor en la generacin de inmunidad y tener propiedades antifagociticas. Existen variaciones de este antgeno durante la infeccin lo que hace necesario saber las diferentes cepas que existen en nuestro pas as como sus antigenos K para su utilizacin en la produccin de biolgicos. El objetivo de este trabajo es la identificacin de la microcpsula en cepas de Campylobacter fetus subs. venerealis, intermedio y fetus. Los resultados muestran la presencia de antgenos capsulares de superficie K en las cepas estudiadas B FUNDAMENTOS Y ANTECEDENTES La vibriosis genital bovina es una enfermedad del ganado caracterizada por producir infertilidad temporaria y abortos principalmente entre el quinto y sexto mes de gestacin. El signo clnico en un rodeo es un bajo porcentaje de preez, ms acentuado en aquellos animales que no han tenido contacto previo con la enfermedad. Ha sido diagnosticado en humanos asociado a abortos, vaginosis y cuadros de gastroenteritis con diarrea. Fue diagnosticada por primera vez por Mc Fadyean & Stockman en el Reino Unido en 1913. Curiosamente el primer diagnstico se llev a cabo en un caso de abortos en ovinos. Theobald Smith en 1918 reconoci la presencia de este germen en Amrica y observ que era responsable de abortos e infertilidad en bovinos y lo reconoci tambin en los ovinos. En nuestro pas el primer diagnstico fue realizado en 1967 por el Dr. Stella, utilizando tcnicas de mucoaglutinacin. El primer aislamiento del agente causal, se realiz a partir de mucus crvico-vaginal y lavado prepucial en 1969, habindose diagnosticado en el periodo 1969-70 la presencia de la enfermedad en 29 establecimientos lecheros. (Stella 1971) Durante el ao 1971 se realizaron los dos primeros diagnsticos en ganado de carne (Stella 1971) Hasta el ao 1973 se continu realizando l diagnostico de la enfermedad poniendo nfasis en el anlisis muco vaginal de hembras con problemas reproductivos.
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A partir del ao 1974 la tcnica de diagnostico empleada fue el raspado y medio de transporte, la cual permite remitir material de cualquier zona del pas. Entre los aos 1974-75 se realizaron 115 visitas obteniendo 42 diagnostico positivos y 73 negativos, siendo el porcentaje de positivos de 36.52. Hay que destacar que los datos obtenidos fueron casi en su totalidad, logrados sobre la base de una sola visita, cuando lo aconsejable es realizar cuatro visitas consecutivas con una semana de intervalo, para descartar la presencia de la enfermedad. (Tedesco, 1976) Los mtodos reconocidos de la lucha contra la enfermedad son cuatro: creacin del doble rodeo, tratamientos del toro, vacunacin e inseminacin artificial, siendo este ltimo mtodo el nico que permite erradicar la enfermedad (Del Baglivi, L. 1977) Un relevamiento realizado en rodeos lecheros de la colonia Antonio Rubio de Salto en los aos 1996-1997 arrojo que un 8.6 % de los toros se encontraban afectados de Vibriosis. (Irigoyen, J. 1997) En un estudio realizado por el DILAVE sobre prevalencia de enfermedades reproductivas que afectan al ganado de carne en el Uruguay, la vibriosis tiene una incidencia por inmunofluorescencia directa estimada en toros para todo el Uruguay de un 28.05 %. La prevalencia estimada para los establecimientos es de 37 %. Siendo la prevalencia estimada por aislamiento en toros de 3.7 %. (Repiso, M y col. 2001) En Argentina, Villar & Spina en 1982 en un estudio de 15 aos comprendiendo los aos de 1966-1981, detectaron una prevalencia de la infeccin de un 22 %, de un total de 11.300 toros testados por la tcnica de inmunofluorescencia. Akhtar et al en 1990 en otro estudio en 3 establecimientos de California, EEUU, comprendiendo 400 hembras detectaron una prevalencia del 47 % de la enfermedad a travs de la tcnica de ELISA. En Brasil los datos obtenidos en el mbito nacional se remontan a la dcada del 60-70, hoy en da existe una falta de actualizacin sobre incidencia y comportamiento de esta enfermedad. D'Apice en 1956, en So Paulo, aisl por primera vez al agente etiolgico del abomaso de un feto bovino abortado. Castro en 1971, detecta una incidencia del 14.4 % de un total de 1068 muestras de muco vaginal extradas de bovinos del Estado de San Pablo, Minas Gerais y Paran. Ramos & Guida en 1978 examinaron por mucoaglutinacin, 4.092 bovinos por extraccin de muco vaginal, localizadas en el Estado de Ro de Janeiro, dando reaccin positiva en 12.95 %. En Ro Grande do Sul, Mies Filho en 1960, utiliz la prueba de mucoaglutinacin en muestras pertenecientes a 311 bovinos de leche, teniendo como positivo a un 27 %. Andrade en 1986, en Gois, determinaron un 22.37 % de prevalencia, atravs de la tcnica de mucoaglutinacin, de un total de 1685 muestras provenientes de bovinos lecheros Genovez en el 1986 en So Paulo, examinaron 46 toros, identificando 11 (23.9 %) animales positivos. (Gomez y Fernndez 2001) El agente etiolgico de la vibriosis bovina es el Campylobacter fetus. Dentro del gnero existen tres variedades patgenas (venerialis, intermedius y fetus) y un sapfrito (C. spotorum susp. bubulus). La diseminacin de esta entidad es venrea en forma directa por el servicio o indirectamente por la inseminacin con semen contaminado. Tambin existe la forma oral de que los animales alcancen la infeccin y se provoque el aborto (fetus biotipo fetus).

Se han postulado varias teoras basndose en el mecanismo de accin de Campylobacter fetus, pero hoy predominan dos efectos fundamentales, su actividad espermicida y los cambios en la mucosa uterina para impedir el avance de la gestacin. Tambin la infeccin del embrin resulta an una teora aceptada El toro es portador asintomtico de la enfermedad. El nmero de microorganismos presentes en el prepucio en variable. Los toros adultos son ms susceptibles a la infeccin debido a un mayor desarrollo de las criptas prepuciales, tanto en nmero como en dimensiones con respecto a los jvenes. El toro joven puede recuperarse de la infeccin en forma espontnea. El genero Campylobacter esta compuesto por organismos cortos, curvados, simples o unidos en forma de espiral. Cuando fueron descritos por primera vez fueron clasificados como Vibrio dada su forma curvada y su motilidad. El nombre del genero fue Vibrio por muchos aos hasta que Sedal y Veron (1963) encontraron que muchos miembros de la especie eran suficientemente diferentes como para ameritar un genero separado llamndolo Campylobacter. El termino Vibriosis es an aplicado a la enfermedad causada por las especies patgenas de este genero. Campylobacter es encontrado en el tracto reproductor y alimentario de humanos y animales. Bioqumicamente, las especies de Campylobacter son prcticamente inactivas, pero todas son Oxidasa positiva y la mayora produce catalasa. Las especies patgenas de Campylobacter han sido clasificadas por su habilidad a crecer entre 25 y 45 grados centgrados. Tienen forma de coma o S siendo, siendo este gnero Gram negativo. Los cuerpos con forma de coma tienen un solo flagelo polar mientras que los con forma de S tienen flagelos bipolares. Las especies catalasa positiva forman espirales cuando las formas en S permanecen unidas. Las clulas en cultivos viejos forman cuerpos cocoides o esfericos. El crecimiento es microaerfilo a anaerobio, requiriendo una atmsfera de 10 a 20 % de CO2 y las concentraciones de O2 deben ser reducidas a 5% o menos. El optimo crecimiento se obtiene a 37 grados con suero, agar sangre o thiol agar. Antibiticos como novobiocina y bacitracina pueden ser adicionados a los medios de cultivo para inhibir el crecimiento de los contaminantes. (Plastridge et al. 1964) Las colonias son usualmente visibles a los 2 das de incubacin, son redondeadas, de forma regular y consistencia butrica. Pueden ser traslucidas al inicio pero se vuelven opacas y su dimetro es de 1 a 3 mm. Ambas subespecies poseen antgenos termoestables (O), flagelares (H) y un antgeno superficial termolbil (K), denominado S-layer, que cubre al antgeno O. Los antgenos O en C. fetos sub. venerialis son A-1 y A sub-1. Al menos tres antgenos estn asociados con el flagelo (McCoy et al 1975) pero no son usados en la tipificacin de rutina. El antgeno superficial exhibe variaciones durante la infeccin (Corbeil et al 1975) pero la bioqumica de esta variacin recin se ha logrado descifrar, siendo este un cambio en los tres aminos terminales de la microcpsula (Dubreuil et al 1990) El antgeno K (microcpsula) fue reconocido por Berg, Jutila & Firehammer (1971) como un importante factor en la inmunidad del tracto genital bovino en la infeccin por C. fetos sub. Venerialis. Tiene las propiedades de ser antifagocitica (McCoy et al. 1975) y le confiere al microorganismo resistencia a la fagocitosis en el tracto genital. Solo posteriormente a la unin de anticuerpos especficos opsonizantes el microorganismo puede ser fagocitado. La microcpsula cubre al antgeno somtico (O) al cual se encuentra unida por 2 iones Ca++ (Berger et al 1971), microorganismos con microcpsula no son aglutinados por anticuerpos O especficos (Border et al 1974; Ristic 1957). Esta microcpsula es una glicoproteina
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(Winter 1978) y es destruida a 121 por 120 minutos (Berg 1971). Antisueros producidos a partir de microorganismos tratados con calor solo producen anticuerpos anti O y no causan aglutinacin de clulas con microcpsula. La enfermedad en las hembras va acompaada de una respuesta inmune local (Veron 1973). Las vacas convalecientes resultan protegidas transitoriamente contra infertilidad caracterstica de esta enfermedad pero frecuentemente no resultan libres de la infeccin en el rea crvico-vaginal.( Vandesplassche et al 1963) Animales inmunizados sistemticamente con organismos inactivados en adyuvante completo de Freund, tambin resultan protegidos contra la enfermedad (Wilkie et al 1971). El mucus crvico-vaginal de las vacas convalecientes contienen anticuerpos de clase Ig A, mientras que los animales sistemticamente inmunizados los anticuerpos detectados a este nivel son del tipo IgG. (Corbeil et al 1974). Ha sido demostrado que la actividad biolgica de varias clases de inmunoglobulinas a Campylobacter es variada, los anticuerpos del tipo IgA pueden inmovilizar pero no opsonizar C. fetus mientras que el tipo IgG pueden realizar ambas funciones. Debido a que durante la infeccin existen variaciones a nivel del antgeno de superficie, es de destacar la importancia de saber que tipos de estos antgenos se encuentran en las cepas aisladas en nuestro pas, para as utilizarlas en la elaboracin de biolgicos o como control de las cepas que se utilizan en la produccin de vacunas extranjeras de venta en nuestra plaza. Nuestro equipo de trabajo quiere poner a punto esta tcnica y colocarla a disposicin de todos los interesados para aplicarla en el material que va a ser destinado para la fabricacin de biolgicos, como as tambin tener una herramienta para poder analizar y controlar el material utilizado en la produccin de vacunas destinadas a controlar y erradicar a esta enfermedad que afecta a nuestros ganados. C OBJETIVO GENERAL Identificacin del antgeno de superficie K en cepas de Campylobacter fetus subs. venerealis, intermedio y fetus.

OBJETIVOS PARTICULARES Creacin de un cepario de Campylobacter spp. para posteriores estudios genticos (PCR, ELISA, Inmunoblot) Seleccin de cepas con microcpsulas para el desarrollo de inmungenos. Puesta a punto de una tcnica de aglutinacin para titulacin de Ac. en animales vacunados.

D - MATERIALES Y METODOS Se estudiaron 4 cepas vacinales de Campylobacter fetus spp., 2 subs. venerealis, 1 subs. Fetus y 1 subs. Intermedio que se utilizan en la elaboracin de vacunas de Laboratorios SANTA ELENA. Se identifico a la bacteria por medio de la tcnica de Gram, IFD, MEB y MET.

Produccin de Antgenos: las cepas fueron cultivadas en agar sangre triptosa por 48 hs a 37 C en condiciones de micreaerofilia. El crecimiento de las placas fue suspendido en formol salino 1 % y lavado 3 veces por centrifugacin por 10 minutos. Antgeno tratado con calor: El crecimiento de las placas fue suspendido en 0.1M fosfato salino bufferado (PBS), ph 7.2 y autoclavado a 121 C por 2 hs. Las clulas fueron lavadas 3 veces por centrifugacin 10 minutos. Ambos antgenos para inmunizacin de los animales utilizados fueron concentrados a una densidad ptica de 1 a 420 nm en espectrofotmetro y fueron conservados a 4 C hasta el momento de la inoculacin. Antgeno de test de aglutinacin: El antgeno sin tratar fue usado para el test de aglutinacin. El antgeno fue ajustado a una densidad ptica de 0.6 a 420 nm en espectrofotmetro. Produccin de antisuero: Se utilizaron dos conejos por cepa, un animal fue inoculado con el antgeno tratado con calor y el otro con el antgeno suspendido en formol ambos emulsionados en adyuvante oleoso (Adyuvac). La inoculacin fue en forma subcutanea y con 2 revacunaciones con intervalo de 20 das. El sangrado del animal se realizo a los 20 das de la ultima inoculacin. Prueba de aglutinacin: Alcuotas de 50 ul de suero fueron colocadas por pocillo en placas de microaglutinacion, con diluciones a la 1/ 2. Se agrego 50 ul de antgeno a cada pocillo, se mezcl y se incub la placa por 24 hs a 37 C. Una reaccin positiva es la formacin de un botn ntido en el fondo de la placa y el sobrenadante limpio. El ttulo del suero es la dilucin mas alta que de una aglutinacin completa. Antisueros producidos contra los antgenos tratados con calor y no tratado de cada cepa fueron testados contra antgenos sin tratamiento trmico.

E - RESULTADOS

VF VP IF IP FF FP VF VP

PURO 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

F - DISCUSION Los antgenos utilizados a una similar concentracin de densidad ptica responden en forma diferente, presentando menor titulo los animales inmunizados con los antigenos tratados con calor que los sin tratar. Lo que hace pensar que este menor ttulo se debe a la no presencia de los Ag capsulares los cuales son destruidos por calor, lo que demuestra un vez mas la termolabilidad de los mismos. Los resultados obtenidos concuerdan con la bibliografa consultada (Van Der Walt, 1987), quien realiz un estudio similar utilizando solamente cepas de Campylobacter fetus subs. Venerealis; a diferencia de nuestro trabajo que adems estudio las subs. Intermedio y fetus. Se comprueba que la metodologa es til para determinar la presencia de microcpsulas (Ag. K) en las diferentes subs. de Campylobacter, adems de ser fcil de realizar y econmica. Se estima que la utilizacin de esta metodologa puede ser empleada en la seleccin de cepas para produccin de vacunas; as como para evaluar su conservacin ya que pasaje seriados en medio de cultivo pueden inducir a la prdida del antgeno capsular pasando estas cepas a ser no inmunogenicas. La tcnica microaglutinacion resulto ser de fcil utilizacin y patronizacion demostrando que puede ser til para la titilacin de anticuerpos en animales vacunados. G - CONCLUSIONES Se observa la presencia de antgenos capsulares de superficie en las cepas estudiadas. Resultados que se deben de esperar en cepas que se utilizan en la produccin de vacunas. Resultados similares fueron obtenidos por Van Der Walt, Martha L., 1987; Ristic, M., 1957 Se determina que la metodologa utilizada es viable para la deteccin de antgenos capsulares de superficie, siendo esta de bajo costo y sencilla

H - AGRADECIMIENTOS Dr. Julin Bermdez Dr. Esteban Guerra Dr. Martn Breijo rea de Inmunologia - FV rea de Inmunologia - Facultad de Veterinaria Laboratorio Santa Elena Eduardo Rolon Laboratorio Santa Elena Eduardo Duran Laboratorio Santa Elena Br. Alejandro Britos Nutricin Animal -FV Nutricin Animal Facultad de Veterinaria Danilo Fila - Histologa Facultad de Veterinaria Br. Enrique Nogueira Comisin de CIDEC MEB Facultad de Ciencias MET Facultad de Ciencias Departamento de Gentica Facultad de Ciencias

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