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Carmen Entrala, Dra. En Biologa Laboratorio e ADN !oren"e, De#to. e $e i%ina Legal &ni'er"i a e Grana a, E"#a(a
Indice:
). E'ol*%i+n e la" t,%ni%a" e e"t* io e lo" #olimor!i"mo" e ADN -. An.li"i" #or la rea%%i+n en %a ena e la #olimera"a /0CR1 -.) Generali a e" -.- Com#onente" e la 0CR 2. F*t*ra" te%nologa"3 bio%4i#" 2.) A#li%a%ione" e lo" bio%4i#"
S*mario
La identificacin con ADN o huella gentica se basa en el estudio de una serie de fragmentos de ADN presentes en todos los individuos pero que poseen la caracter stica de ser altamente variables o polimrficos entre los mismos! "l an#lisis de un determinado n$mero de estas secuencias o fragmentos de ADN permite identificar a un individuo con una probabilidad mu% cercana al &''(! Adem#s de ser mu% polimrfico) el ADN que se utili*a para la identificacin en +entica ,orense es un ADN no codificante o no e-presivo) por lo que no revela caracter sticas fenot picas de los individuos. este hecho es de gran importancia a la hora de considerar la creacin de las bases de datos genticas! /ara anali*ar dichos polimorfismos del ADN) los laboratorios de +entica ,orense utili*an una serie de tcnicas que est#n en continua evolucin) consiguiendo que cada ve* la identificacin por medio del ADN sea m#s precisa % r#pida!
combinacin gentica igual o diferente a la del vestigio biolgico hallado en el lugar de los hechos! /ero fue a mediados de siglo cuando gracias al descubrimiento del ADN % de su estructura % al posterior avance en las tcnicas de an#lisis de dicha molcula la 4emogentica ,orense evolucion considerablemente hasta el punto de que ho% en d a puede hablarse de una nueva subespecialidad dentro de la 9edicina ,orense: la Gentica Forense! Dicha ciencia estudia b#sicamente unas regiones del ADN que presentan variabilidad entre los distintos individuos) es decir) estudia regiones polimrficas del ADN! As ) anali*ando un determinado n$mero de regiones polimrficas) la probabilidad de que dos individuos sean genticamente iguales es pr#cticamente nula 7e-cepto en el caso de gemelos univitelinos:! Aunque la 5iencia pose a las herramientas necesarias para el estudio del ADN) su aplicacin en la resolucin de casos 6udiciales no se produ6o hasta &;<=) cuando el 9inisterio del Interior 1rit#nico solicit la a%uda de Alec >! >effre%s) profesor de +entica de la ?niversidad de Leicester! Los primeros casos de 5riminal stica fueron resueltos gracias a la tcnica de los RFL0" 7,ragmentos de 8estriccin de Longitud /olimrfica:! >effre%s descubri la e-istencia de unas regiones minisatlites hipervariables dispersas por el genoma humano que al ser tratadas con en*imas de restriccin generaban fragmentos de longitud variable! "studios posteriores reali*ados el mismo >effre%s demostraron que las diferencias en el tama@o de estos fragmentos se deb an a que estas regiones consist an en un determinado n$mero de repeticiones en t#ndem de una secuencia central) el cual variaba de unos individuos a otros! "l primer locus de ADN polimrfico fu descubierto por A%man % Ahite en &;<' usando una sonda de ADN arbitraria! De esta manera observaron fragmentos de m#s de &= longitudes diferentes en una peque@a muestra de individuos! /osteriormente se encontraron otros loci hipervariables como en la secuencia del gen de la insulina humana) en el oncogen ras) en el pseudogen de la *etaBglobina % en el gen de la mioglobina! "stos loci hipervariables constaban de repeticiones en t#ndem de una secuencia de oligonucletidos 7&& a C' pb:) de manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados depend an del n$mero de dichas repeticiones % se les denomin 5NTR 73ariable Number of Dandem 8epeat:! Dras el descubrimiento de los primeros 3ND8s se vio que stos pod an ser aplicados a la medicina forense % sustituir a los marcadores cl#sicos! "n un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hi*o por medio de la tcnica llamada hibridacin con sondas o Southern blot! "sta tcnica consta b#sicamente de las siguientes etapas: Digestin del ADN con en*imas de restriccin tras conseguir e-traer un ADN de alta molecularidad!
Eeparacin de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis en gel de agarosa! Desnaturalizacin de los fragmentos separados % cortados! Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o n%lon % fi6acin de las mismas por medio de calor 7<'F5:! Prehibridacin con sondas de ADN inespec fico para bloquear los lugares de unin inespec ficos que pudiera haber en la membrana! Marcaje de la sonda con nucletidos radioactivos 7GH / normalmente:! Hibridacin de la sonda marcada % desnaturali*ada con los fragmentos de ADN fi6ados a la membrana) % lavado de la membrana para eliminar el e-ceso de sonda o aquellas que ha%an hibridado mal! Re elado en placa radiogr#fica e inter!retacin de los resultados!
Las sondas multi % monoBlocus presentan una serie de venta6as e inconvenientes con respecto a una serie de par#metros como son:
In!orma%i+n a#orta a: las sondas multiBlocus tienen una ma%or capacidad discriminativa al aparecer m$ltiples bandas! No obstante) las monoBlocus son m#s espec ficas %a que el fragmento de ADN con el que hibridan es de ma%or tama@o! Canti a : %ali a el ADN: cuando se usan sondas multiBlocus se requiere apro-imadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que en el caso de las monoBlocus se necesita menos de &'' ng % este ADN no necesariamente debe estar en perfecto estado) siempre % cuando el fragmento complementario a la sonda est intacto! E"#e%i!i%i a entre e"#e%ie" : las sondas multiBlocus permiten su uso sobre el ADN humano % de cientos de animales superiores) mientras que las monoBlocus son e-clusivas de ADN humano!
A pesar de que el an#lisis EL/ ha sido % es bastante $til en estudios de paternidad no puede decirse lo mismo de su aplicacin a la 5riminal stica %a que presenta una serie de inconvenientes como son:
La %anti a e ADN que se necesita est# entre H' % &'' ng) cantidad dif cil de conseguir en casos de criminal stica en los que los indicios biolgicos encontrados son m nimos! "n cuanto a la %ali a el ADN) en la pr#ctica forense es mu% dif cil encontrar en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se necesita para un an#lisis con sondas monoBlocus! "l tiempo requerido para este tipo de an#lisis es de dos o tres d as! "l hecho de que se requieran cantidades elevadas de ADN hacen que normalmente) con el primer an#lisis se consume la totalidad de la muestra) con lo que se dificultan contrapericias % una posterior revisin del caso! Dodas estas limitaciones fueron superadas gracias a la aplicacin en +entica ,orense de una tcnica) la Rea%%i+n en Ca ena e la 0olimera"a 7/58:) que supuso una revolucin en muchos campos de la 1iolog a % de la 9edicina! "l estudio de indicios biolgicos por /58 ha permitido la resolucin de un gran n$mero de casos en 5riminal stica que hasta entonces eran desestimados por no poseer la suficiente cantidad de muestra para su an#lisis por 8,L/! 5on el uso de la /58 muestras tan m nimas como pueden ser un !elo con ra"z# una min$scula mancha de sangre o semen e incluso cas!a son suficientes en muchos casos para llevar a cabo un an#lisis de identificacin gentica!
para la e-tensin) de esta manera se aumenta el nivel de e-igencia de la reaccin % se reduce la e-tensin de los primers unidos inespec ficamente al ADN!
La rea%%i+n "e lle'a a %abo en *na "erie %*ale" in%l*:e tre" !a"e" o #a"o"3
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D*S+(T,R(-./(&.0+: /ara que comience la reaccin es necesario que el ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla! "sto se consigue aplicando temperaturas de ;' a ;=F5 que producen la rotura de los puentes de hidrgeno intercatenarios % por lo tanto la separacin de ambas cadenas! /ara conseguir la completa separacin de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos! Ei el ADN solo se desnaturali*a parcialmente ste tender# a renaturali*arse r#pidamente) evitando as una eficiente hibridacin de los primers % una posterior e-tensin! H.1R.D(&.0+: "sta fase se denomina tambin fase de annealing o de empare6amiento! ?na ve* que el ADN est# desnaturali*ado se disminu%e la temperatura hasta un rango comprendido entre los L' % los C'F5 para que se pueda producir la unin de los primers a las secuencias flanqueantes del fragmento que se va a amplificar! La temperatura de fusin o annealing 7Dm) melting temperature: depende de varios factores % es relativamente espec fica para cada primer! La longitud de los primers % la secuencia son cr ticas en la designacin de los par#metros de una amplificacin) una frmula simple para calcular la Tm es la siguiente: Tm ; </G=C1 = - /A=T1. No obstante) cada primer e-ige una serie de estudios e-perimentales para determinar su temperatura de annealing espec fica %a que si la temperatura es mu% ba6a la unin se har# de forma inespec fica % si es mu% alta no se producir# una unin completa! *2T*+S.0+3 Durante este paso la Ta' !olimerasa incorpora nucletidos en el e-tremo GM del primer utili*ando como molde la cadena de ADN previamente desnaturali*ada! La temperatura a la que se lleva a cabo este paso suele ser de KHF5 %a que es la temperatura a la que la Ta' !olimerasa alcan*a su m#-ima actividad! Normalmente una e-tensin de H' segundos es suficiente para fragmentos menores de ='' pb) % L' segundos para fragmentos por encima de &!H0b! ?n factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiem#o e ram#a! "ste se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a otra % depende del dise@o % de las caracter sticas del aparato donde se reali*a autom#ticamente este proceso) el termociclador! "n las nuevas generaciones de termocicladores este factor se ha ido optimi*ando para hacerlo m nimo!
34345 1,FF*R D* (MP-.F.&(&.0+ Los buffer de 0CR que se utili*an normalmente contienen >Cl, Tri" : $gCl-! "l $gCl- es el componente que m#s influ%e en la especificidad % rendimiento de la reaccin %a que los iones 9gHN son necesarios para la actividad de la Ta' !olimerasa) es decir) act$an como cofactores de la polimerasa! La concentracin ptima de 9g5l H est# en torno a &!= m9 si se emplean concentraciones de H'' m9 de cada uno de los dND/s! No obstante) a veces es necesario probar con diferentes cantidades de 9g %a que un e-ceso del mismo origina una acumulacin de productos inespec ficos % una cantidad insuficiente hace que disminu%a el rendimiento de la amplificacin! 34343 PR.M*RS A la hora de elegir unos !rimers para amplificar un determinado fragmento de ADN ha% una serie de reglas a seguir: La longitud de cada uno de los !rimers debe estar comprendida entre &< % HL bases %a que se ha comprobado que primers de ma%or longitud 7G'BG= bases: no aumentan el rendimiento % los primers cortos carecen de suficiente especificidad! Ambos primers deben tener una Tm similar 7como mucho la diferencia entre ambas temperatura debe ser de =F5:! La relacin bases !$ricas6 bases !irimid"nicas debe ser &:& 7o como mucho L'B C'(:! La secuencia de los !rimers debe comen*ar % terminar con &BH bases p$ricas! /ara evitar la formacin de d"meros de !rimers es necesario comprobar que los primers no contengan secuencias complementarias entre s ! Los d"meros de !rimers consisten en fragmentos de doble cadena cu%a longitud es mu% pr-ima a la de la suma de los primers % se producen cuando un primer es e-tendido a continuacin del otro! "l mecanismo e-acto por el que se forman estos d meros no est# completamente determinado! La observacin de que primers con los e-tremos GM complementarios favorecen su formacin sugiere que el paso inicial se debe a interacciones transitorias que apro-iman los e-tremos complementarios! Algunas polimerasas) incluida la Daq) han mostrado una dbil actividad polimeri*adora no dirigida por un ADN patrn) la cual puede unir nucletidos adicionales al doble e-tremo apareado! Ei esta actividad puede producirse sobre una hebra sencilla de oligonucletidos) resultar a una buena oportunidad para que la e-tensin formara un corto solapamiento en el e-tremo GM con el otro primer) suficiente para promover la formacin del d mero! 34347 D*S82.+,&-*0T.D8S TR.F8SF(T8S
Las concentraciones de NT0s que suelen usarse est#n en torno a H'' O9 para cada uno de ellos! "n un volumen de reaccin de H= Ol con esta concentracin de dND/s se sinteti*ar an entre CBC!= Og de ADN! La concentracin de dND/s % de 9g5l H va relacionadas %a que el 9g se une a los dND/s con lo que concentraciones elevadas de dND/s inhibir an la reaccin al no tener la Ta' !olimerasa suficiente 9g como para incorporar dND/s! /ara una concentracin de H'' O9 de cada dND/ se suele a@adir 9g5lH a una concentracin de &!= m9! 34349 T(:;P8-.M*R(S( Las cantidades ptimas de Taq polimerasa necesarias para la s ntesis de ADN est#n alrededor de H unidades en H= Ol de volumen final de reaccin! La actividad de este en*ima se ve influenciada por la concentracin de dND/s) de 9g HN % de algunos iones monovalentes de manera que concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad! /or otro lado) peque@as concentraciones de 05l estimulan la actividad sinttica de la Daq en un ='BC'( con un m#-imo aparente cuando su concentracin es de =' m9! "-isten algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos que se emplean antes de la amplificacin % que alteran la actividad de la Daq! /or e6emplo concentraciones &9 de urea estimulan la actividad) el EDE a ba6as concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones ma%ores del &'( de etanol! 3434< (D+ M8-D* 8 =T*MP-(T*? "s el ADN del cual queremos copiar un determinado fragmento) es) por tanto) el ADN que la Daq polimerasa utili*a como molde para la s ntesis de nuevas cadenas polinucleot dicas! La cantidad de ADN necesaria para la /58 depende de varios factores: Del marcador que se va a amplificar: ha% marcadores cu%os primers son m#s espec ficos o bien cu%as condiciones de amplificacin est#n me6or optimi*adas que las de otros! /or esta ra*n puede darse el caso de que cierta cantidad de ADN 7sobre todo cuando 6ugamos con cantidades m nimas: amplifique para unos marcadores pero no para otros! /or ello) cuando en un laboratorio se va a utili*ar un nuevo marcador es necesario hacer un estudio de validacin en l que se inclu%e un estudio de sensibilidad! De dicho estudio de sensibilidad puede sacarse como conclusin cu#l es la m nima cantidad de ADN que amplifica en condiciones est#ndar! De manera general) para casi todos los ED8 utili*ados en +entica ,orense la cantidad ptima de ADN que asegura un rendimiento adecuado est# en torno a los = ng! &alidad del (D+: 5uando se traba6a con ADN cu%a calidad es ptima no suele haber problemas en la amplificacin % cantidades del mismo por encima e incluso por deba6o de los = ng rinden buenos resultados! "l problema aparece cuando la calidad del ADN obtenido no es la idnea) bien porque est degradado o bien porque dicho ADN va%a
ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la actividad de la polimerasa! Ei el ADN est# degradado por la accin de en*imas de restriccin el que obtengamos o no resultado en la amplificacin va a depender de que el fragmento a amplificar ha%a sido da@ado o no! "n el caso en el que tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habr a que intentar diluir al m#-imo la muestra para disminuir dichos contaminantes) pero siempre dentro de un rango de ADN que no est por deba6o del l mite de sensibilidad de la /58! "l problema de las cantidades m nimas de ADN % la presencia de contaminantes o inhibidores de la Daq es un hecho habitual en 5riminal stica % requiere un estudio pormenori*ado de la muestra antes de la amplificacin! AD@&5ANTES DE LA 0CR Eon elementos que me6oran el rendimiento % la especificidad de la /58! Aunque algunos autores han recomendado el uso del D$SO % del gli%erol) el ad%uvante m#s e-tendido % utili*ado es el BSA! A concentraciones por encima de '!< OgPOl el 1EA incrementa la eficiencia de la /58 %a act$a como una prote na captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Daq polimerasa! La /58 ofrece una serie de venta6as) frente al uso de las tcnicas de an#lisis gentico utili*adas con anterioridad) como son: Eu capacidad para obtener resultados en casos en los que la cantidad de ADN es mnima o en casos en los que el ADN est parcialmente egra a o! +enera en un espacio corto de tiempo un ele'a o nAmero e %o#ia" de la secuencia de ADN que es ob6eto de estudio) lo cual permite utili*ar tcnicas de visuali*acin m#s sencillas % r#pidas que el uso de sondas marcadas radioactivamente! /ermite la determinacin % agrupacin allica en %la"e" i"%reta") lo que facilita la elaboracin de bases de datos al ser la estandari*acin inmediata % posibilitar la aplicacin de mtodos bioestad sticos % programas elaborados! "l uso de marcadores microsatlites de peque@o peso molecular aumenta las probabilidades de obtener resultados positivos de amplificacin cuando el ADN se encuentra degradado %a que puede ser que dichos fragmentos no ha%an sido digeridos! "sta venta6a es de gran importancia en 5riminal stica %a que normalmente los indicios biolgicos encontrados han estado sometidos a diversos factores 7calor % humedad: que favorecen el crecimiento bacteriano! Ein embargo) una de las grandes venta6as de la /58 que es su elevada sensibilidad puede) en ocasiones) convertirse en un gran problema %a que se podr a coamplificar un ADN e-tra@o o a6eno al que nos interesa! No obstante) en los laboratorios de +entica ,orense las medidas de precaucin que se toman para evitar problemas de contaminacin por manipulacin son e-tremas!
?na ve* amplificado el ADN) los fragmentos resultantes son separados en funcin de su tama@o por medio de un proceso de ele%tro!ore"i"! A%t*almente "e *tili6an o" ti#o" e ele%tro!ore"i" en lo" laboratorio" e Gen,ti%a Foren"e3 Ele%tro!ore"i" en gele" 'erti%ale" e #olia%rilami a Ele%tro!ore"i" %a#ilar La ele%tro!ore"i" %a#ilar es una tcnica relativamente novedosa en el campo de la +entica ,orense pero que est# poco a poco sustitu%endo a los sistemas de electroforesis vertical! "n este caso el proceso electrofortico es llevado a cabo en un capilar de silica de unas =' mm de di#metro) lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor % que puedan aplicarse volta6es ma%ores! /ara que puedan ser anali*ados por electroforesis capilar los primers o los dideo-inucletidos 7en el caso de la secuenciacin: deben ser marcados fluorescentemente con unas molculas denominadas fluorocromos que emiten fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son e-citados por l#ser! "l equipo en el que se reali*a el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus correspondientes alelos asignados! La electroforesis capilar presenta una serie de venta6as frente a los sistemas de electroforesis vertical como son: Ra#i e6: %a que permite el an#lisis simult#neo de varios loci aunque stos posean alelos con tama@os solapantes! Sen"ibili a : hace posible detectar cantidades mu% peque@as de ADN amplificado! Los resultados se obtienen de manera informati*ada) lo que evita problemas de interpretacin de los resultados % facilita el an#lisis de los mismos a travs de programas inform#ticos!
Los bio%4i#" surgen como consecuencia de una combinacin entre tcnicas microelectrnicas empleadas para la fabricacin de microprocesadores inform#ticos % materiales biolgicos! "n general puede decirse que la principal caracter stica de los chips es su capacidad para generar informacin en mu% poco espacio) %a que posibilitan el procesamiento de multitud de ensa%os simult#neamente! "sta caracter stica es la que hace que los biochips sean probablemente la tecnolog a del futuro en el campo de las investigaciones biomdicas! La fabricacin de los biochips es similar a la de los chips inform#ticos: por medio de la tcnica denominada !otolitogra!a se depositan circuitos microscpicos sobre l#minas de silicio! "n el caso concreto de los biochips) estas l#minas son de vidrio % lo que se deposita en dichas l#minas son cadenas de ADN! Las l#minas de vidrio presentan una serie de venta6as como son: /osibilidad de unir las cadenas de ADN a la superficie del cristal) convenientemente tratada) mediante enlaces covalente! Eu capacidad para aguantar altas temperaturas % lavados de elevada fuer*a inica! Al ser un material no poroso el volumen de hibridacin puede reducirse al m nimo! Eu ba6a fluorescencia evita ruidos de fondo! 4a% compa@ as comerciales que han desarrollado otras estrategias para la fabricacin de biochips! No obstante) los m#s usados actualmente % con ma%or n$mero de aplicaciones son los basados en tcnicas fotolitogr)ficas. "stos chips) como se di6o anteriormente) consisten en una peque@a l#mina de vidrio que posee unos grupos reactivos) a los que posteriormente se unir#n los nucletidos) protegidos mediante una pel cula reali*ada con un agente qu mico fotodegradable! 9ediante una m#scara que se sit$an sobre el chip) se logra enfocar un ha* de lu* hacia unas posiciones % regiones determinadas) degradando al agente qu mico protector en dichas *onas % de6#ndolo intacto en las *onas protegidas por la m#scara! A continuacin se a@ade al chip un medio que contiene uno de los cuatro nucletidos que se unir#) mediante enlace covalente) al cristal con los grupos reactivos que ha%an quedado desprotegidos! 5ada grupo a@adido lleva una molcula receptora fotodegradable! Dodo este proceso se va repitiendo con los diferentes nucletidos % m#scaras hasta generar unos oligonucletidos con las secuencias que nos interesen! "l siguiente esquema muestra el todo el proceso e-plicado anteriormente! 5ada casilla del chip posee una cadena de un oligonucletido de manera que solamente aquel fragmento de ADN que hibride perfectamente con ella permanecer# unido tras los diversos lavados!
/reviamente a la hibridacin) el ADN de la muestra a estudiar debe haber sido amplificado % marcado fluorescentemente en uno de sus e-tremos! ?na ve* marcado se incuba en el recipiente que contiene al chip tras lo cual se lava varias veces para eliminar los fragmentos que no ha%an hibridado % se introduce el chip en un esc#ner en el que se detectan los patrones de hibridacin! "sta deteccin se reali*a en base a la fluorescencia emitida por los fluorocromos de la muestra cuando son e-citados por lu* % en aquellos pocillos en los que la unin ha%a sido completa la fluorescencia ser# ma%or que los que contengan alguna base desapareada! ?n ordenador conectado al esc#ner es el que identifica las secuencias sonda por su posicin el chip! 2.) A#li%a%ione" e lo" bio%4i#" A pesar de ser una tecnolog a mu% reciente % que) por lo tanto) est# a$n en v as de e-perimentacin) actualmente los biochips est#n siendo aplicados en: $onitori6a%i+n e eB#re"i+n g,ni%a: permite determinar cual es el patrn de e-presin gnica % cuantificar el nivel de e-presin de manera simult#nea para un elevado n$mero de genes! "sto permite reali*ar estudios comparativos de activacin de determinados genes en te6idos sanos % enfermos % determinar as la funcin de los mismos! Dete%%i+n e m*ta%ione" : #olimor!i"mo" : /ermite el estudio de todos los posibles polimorfismos % la deteccin de mutaciones en genes comple6os! Se%*en%ia%i+n: 9ientras que se han dise@ando algunos biochips para secuenciacin de fragmentos cortos de ADN) no e-iste a$n en el mercado ning$n biochip que permita secuenciar de novo secuencias largas de ADN! Diagn+"ti%o %lni%o : ete%%i+n e mi%roorgani"mo" : /osibilitan la identificacin r#pida empleando unos marcadores genticos de los patgenos! S%reening : toBi%ologa e !.rma%o": el empleo de los biochips permite el anali*ar los cambios de e-presin gnica que se dan durante la administracin de un f#rmaco de forma r#pida) as como la locali*acin de nuevas posibles dianas teraputicas % los efectos to-icolgicos asociados! Seg*imiento e tera#ia: los biochips permiten valorar rasgos genticos que pueden tener incidencia en la respuesta a una terapia! $e i%ina #re'enti'a: "l conocimiento % posible diagnstico de ciertos caracteres genticos asociados a determinadas patolog as permite una prevencin de las mismas antes de que apare*can los s ntomas!