BIOTECNOLOGA DE MICROALGAS INTRODUCCION Las microalgas representan un recurso natural muy diverso an no explotado desde el punto de vista cientfico

e industrial. Son microrganismos fotosintticos que se encuentran como clulas individuales o multicelulares, principalmente en ambientes acuticos. Caractersticas Sus clulas funcionan independientemente realizando todas las funciones vitales. A partir de la biomasa de estas microalgas, es posible obtener molculas simples, sustancias como cidos grasos poliinsaturados, hidrocarburos, pigmentos, marcadores fluorescentes y compuestos como enzimas, promotores de crecimiento, antioxidantes, vitaminas y antibiticos. La biomasa algal se ha aplicado tambin en la alimentacin animal y humana, como suplemento diettico-medicinal, fertilizantes agrcola y en la remocin de contaminantes. La alimentacin, en general es fotosinttica. Tasa de crecimiento muy alto. Las microalgas que constituyen el fitoplancton tienen una innegable importancia, pues son las principales productoras de oxgeno y forman la base de las cadenas alimenticias en los medios acuticos, en la actualidad se estudia su potencial en reas como la acuacultura, farmacologa, gentica , bioqumica y biotecnologa. Responsables de la produccin del 50% del oxigeno y de la fijacin del 50% del carbono en el planeta. La capacidad de las microalgas para fijar el CO2 es de 10 a 50 veces mayor que la de las plantas terretres, por tal motivo, las microalgas consumen la mayor cantidad de CO2 en todo el planeta

MICROALGAS Son microrganismos fotosintticos que se encuentran como clulas individuales o multicelulares, principalmente en ambientes acuticos. Caractersticas: A partir de la biomasa de estas microalgas, es posible obtener molculas simples, sustancias como cidos grasos poliinsaturados, hidrocarburos, pigmentos,compuestos como enzimas, antioxidantes, vitaminas y antibiticos. La alimentacin, en general es fotosinttica. Tasa de crecimiento muy alto.

Las microalgas que constituyen el fitoplancton tienen una innegable importancia, pues son las principales productoras de oxgeno y forman la base de las cadenas alimenticias en los medios acuticos. Responsables de la produccin del 50% del oxigeno y de la fijacin del 50% del carbono en el planeta. La capacidad de las microalgas para fijar el CO2 es de 10 a 50 veces mayor que la de las plantas terretres, por tal motivo, las microalgas consumen la mayor cantidad de CO2 en todo el planeta

BIOTECNOLOGIA Y MICROALGAS La utilizacin de las microalgas dentro de los procesos biotecnolgicos es muy diversa, radica principalmente en la obtencin de bioproductos para la nutricin humana y animal, y en la obtencin de frmacos. En el Centro de Investigaciones de Energa Solar (CIES) se obtienen varios bioproductos a partir de microalgas, como extractos oleosos de betacarotenos a partir de la microalga Dunaliella salina, y algunos resultados de su composicin, como provitamina A; extractos de clorofilas obtenidas de cultivos de Chlorella vulgaris y su utilizacin como antisptico bucal; y fracciones de polisacridos derivados de cultivos de Porphyridium cruentum con propiedades inmunopotenciadoras, entre otros. PASOS PARA CULTIVAR MICROALGAS Toma de muestras Se obtiene a travs de un arrastre horizontal en la superficie del Lago durante cinco minutos para obtener un concentrado del fitoplancton utilizando una red cnica con una abertura de malla de 20 um .Se mantiene in vivo a baja temperatura hasta su traslado al laboratorio para desarrollar su cultivo. Identificacion Se utiliza una pipeta pasteur para colocar la muestra y se observa en el microscopio Cultivar en un medio adecuado Medios de Cultivo para Microalgas Se han desarrollado diferentes medios de cultivo para microalgas cuyas frmulas tienen diferentes usos o propsitos: Enriquecer el agua de mar natural,

Enriquecer el agua dulce natural, Medios artificiales para: Agua de mar Agua dulce Medios especficos para: especies especficas, Medios selectivos para especies seleccionadas.

Los medios artificiales permiten resultados constantes en contraste con, los medios para enriquecer que tienen resultados variables debido a, entre otros factores, que dependen del lugar y las caractersticas del agua donde se colectan y el tiempo de almacenamiento de la misma. El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relacin de las condiciones fisicoqumicas del medio; en trminos generales los macronutrientes son los factores limitantes del crecimiento y dirigen elmetabolismo basal o primario mientras que, los micronutrientes se requieren en cantidades menores y son indispensables para el metabolismo secundario. Los macronutrientes son: el Carbono, Nitrgeno, Fsforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio; en tanto que, los micronutrientes son: Hierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto.

CONSIDERACIONES GENERALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS Muchos factores contribuyen para el desarrollo ptimo de los cultivos de microalgas, algunos de stos afectan las caractersticas del crecimiento. Los recipientes de cultivo ms comnmente usados son de materiales no txicos como las cajas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plstico, madera y concreto son los ms recomendables, incluyendo los estanques rsticos en reas rurales son los sistemas ms econmicos. En cultivos masivos la aereacin es un factor muy importante para la homogenizacin de los nutrientes y para evitar la sedimentacin de las microalgas. Las diatomeas suelen acumularse en lugares donde el agua no se mezcla, sto tambin depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado retarda el crecimiento. Otro factor importante es la penetracin de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz insidente no es suficiente para la fotosntesis, hasta el fondo del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetracin de la luz es ms efectiva, pero se debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a gran escala es recomendable la inyeccin de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosinttico. Para muchas especies de Diatomeas la temperatura ptima oscila entre los 15 y 20C, pocas especies de esta familia crecen a ms de 28C, las cloroficeas pueden soportar altas temperaturas; un ejemplo es el cultivo masivo a la intemperie de Chlorella

saccharophila, cuyas temperaturas oscilan entre 12.5 30C (Hirata et al., 1974, 1975, 1977; Torrentera, 1983). El crecimiento y la divisin celular son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperodo (horas de iluminacin y obscuridad) en relacin tambin a la temperatura, por ejemplo en Diatomees a 20C y 1,000 lux se obtiene un crecimiento favorable CARACTERISTICAS DE ALGUNAS DE LAS ESPECIES DE ALGAS UNICELULARES UTILIZADAS EN ACUACULTURA (COLL-MORALES J., 1983) GENERO CICLO TEMPERATURA DIAMETRO OPTIMA MEDIO 25C 10.4 >20 17.8 5 18.4 10 10.2

Phaeodactylum (diatomea) 10 h Skeletonema (diatomea) Dunaliella (cloroficea) Chlorella (cloroficea) Tetraselmis (cloroficea) Monochrysis (crisoficea) Isochrysis (crisoficea)

13.1 h 18C 24 h 7.7 h 18 h 16C 25C 18C

15.3 h 2025C 30.2 h 20C

Estas especies se han utilizado en acuicultura marina dados su valor nutritivo y digestibilidad, adems de su capacidad para crecer en cultivos masivos. La duracin del ciclo celular como los requerimientos de temperatura son suceptibles de variacin mediante seleccin de variedades.

REQUERIMIENTOS MICROALGAS

PRINCIPALES

DE

LOS

CULTIVOS

DE

REQUERIMIENTOS Fsicos Luz Temperatura Salinidad pH Redox Nutritivos C

COMPUESTOS QUIMICOS

VALORES 2,000 4,000 lux 15 22C 0.37 79

CO2CO3

g/100 ml

O, H N P S Na, K, Ca, Mg Fe, Zn, Mn, B, Br, Si

O2H2O N2NH4+ NO3 PO4 SO4 Sales Sales

g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml g/100 ml mg/100 ml g/100 ml tiamina, g/100 ml

Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Sales Al, et Vitaminas B12, biotina

En esta tabla se exponen los requerimientos principales de los cultivos de microalgas y sus valores aproximados. En cada caso habr que estudiar los reqerimientos particulares de la especie y de la variedad que se vaya a cultivar en las condiciones concretas de cultivo que se van a utilizar, por lo que estos datos son slo orientacin (Kinne, 1979). El fotoperodo es un factor que regula la divisin celular, en diatomeas la reproduccin asexual (divisin) ocurre durante el perodo de luz y ste es acelerado bajo iluminacin continua. En contraste las especies formadoras de auxosporas (sporas sexuales), dan lugar a clulas del mismo tamao y sto ocurre en el perodo de obscuridad. Por lo tanto, el perodo de iluminacin puede ajustarse de acuerdo a los objetivos del cultivo: el fotoperodo continuo (horas de iluminacin prolongada) produce crecimientos rpidos, un fotoperodo con horas de luz y obscuridad semejante al fotoperodo solar mantiene un crecimiente normal y saludable. En la Table 7 se muestran las caractersticas de algunas de las especies de microalgas unicelulares utilizadas en acuacultura para la nutricin de moluscos y crustceos. Adems del control de los parmetros antes mencionados es necesario considerar que para el establecimiento de un sistema de produccin de alimento vivo es importante el dominio de las tcnicas de aislamiento, purificacin y mantenimiento de cepas, as como el conocimiento de la fisiologa, ciclo de vida, bioqumica, etc. de las especies para determinar su factibilidad de cultivo y sobre todo su contenido nutricional para poder llevarse a niveles masivos de produccin para fines acuaculturales. La Tabla 8 muestra algunos de los principales requerimientos de los cultivos de microalgas. MEDIOS DE CULTIVO Se han desarrollado diferentes medios para el cultivo de microalgas que van desde las frmulas para enriquecer el agua de mar natural, hasta el uso de medios artificiales que permitan resultados constantes en contraste con los resultados tan variables que brinda el uso del agua de mar natural que entre otros factores depende del lugar donde se colecta sta, y el tiempo de almacenamiento de la misma.

Los medios artificiales se usan principalmente para fines experimentales, ya que como se ha mencionado, brinda resultados constantes, aunque existen algunas especies que no crecen en medios artificiales por factores desconocidos que afectan su crecimiento, las principales frmulas utilizadas van desde el agua de Miguel, que data de 1910, desarrollada por Allen-Nelson; el medio de End-Schereiber de 1934, hasta frmulas especficas para familias como la frmula del Laboratorio Haskins de Nueva York para diatomeas, Provasoli et al., 1975; Matthiesen & Thorner, 1966; McIachlan, 1973; Guillard F., 1973; Droop, 1975, 1979; Schoene, 1982, etc. Las principales formulaciones de los medios de cultivo, tanto de mantenimiento de cepas como de produccin masiva (minerales, enriquecidos y orgnicos), se describen desde la Tabla 9 hasta la Tabla 16. El fitoplancton se desarrolla y multiplica en relacin de las condiciones fisicoqumicas del medio. En trminos generales son los macronutrientes o factores limitantes del crecimiento el carbono, Nitrgeno, Fsforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio, que se requieren en cantidades relativamente grandes, mientras que los llamados micronutrientes (Fierro, Manganeso, Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto) se necesitan en menores cantidades. Existen otros medios que incluyen en su composicin sustancias orgnicas (vitaminas, aminocidos) necesarios para aquellas especies de microalgas Auxtrofas, es decir que no sintetizan por medio de la fotosntesis este tipo de compuestos y resultan factores que pueden limitar su crecimiento; tal es el caso de Platimonas, Chrysophytas y algunas Bacillariophyceas.

TABLA 9. MEDIO CHU 10 (MODIFICADO POR GERLOFF) (0. UMEBAYASHI, 1975) (Recomendado para aislamiento de microalgas de hbitats oligotrficos y eutrficos) Ca(NO3)2 K2HPO4 Na2CO3 MgSO4.7H2O Na2SiO3 Citrato de Fierro Amoniacal 0.04% 0.01% 0.02% 0.025% 0.025% 0.005%

NOTA: Puede usarse para medio solidificado Agar-Agar 1.0%

TABLA 10. MEDIO ENRIQUECIDO MEDIO MIGUEL (ALLEN-NELSON, 1910) Solucin A: KNO3 20. 2 g

H 2O Solucin B: Na2HPO412H2O CaCl26H2O HCl conc. FeCl3 H 2O

100 ml 4g 4g 2 ml 2 ml 80 ml

Agregar 2 ml de la Solucin A y 1 ml de la Solucin B a un litro de agua de mar natural, y calentar a 70C por 20 minutos. MEDIO ERD-SAHREIBER ENRIQUECIDO (FOYN, 1934a,b) NaNO3 Na2HPO412H2O Extracto de suelo Agua de mar MEDIO ERD-SCHREIBER *Agua de mar Extracto de suelo NaNO3 Na2HPO4.12H2O 1 litro 50 ml 0.2 g 0.03 g 10 mg 2 mg 5 ml 100 ml

* Se recomienda usar el agua filtrada y pasteurizada,y adicionar los ingredientes.

TABLA 11. MEDIO DE YASHIMA (SISFFAA, (Para cultivo masivo de cloroficeas marinas) Sulfato de Amonio (para la agricultura 21%) Superfosfato de Calcio (para la agricultura 21%) Urea (para la agricultura 21%) Clewat 32 Componentes de Clewat 32: FeCl2 (como fuente de Fe) ZnCl2 (como fuente de Zn) MnCl2 (como fuente de Mn) CoCl2 (como fuente de Co) CuSO4 (como fuente de Cu) (NH4)6Mo7O24 (como fuente de Mo) H3 BO3 (como fuente de B) EDTA 0.385% 0.166% 0.775% 0.017% 0.007% 0.632% 2.470% 0.005%

1964a) 100 g/t 15 g/t 15 g/t 3050 g/t

MEDIO DE YASHIMA MODIFICADO (HIRATA, 1975)

Medio de Yashima (en la misma concentracin) Peptona Peptidasa Diaminasa 50 g/t 0.005% 0.005%

TABLA 12. YANASE & IMAI (1968) PARA Monochrysis lutheri, Platymonas sp., Nitzschia closterium, Chaetoceros calcitrans NaCl KC1 NaNO3 MgSO4 . 7H2O Ca (as Cl-) K2HPO4 18 mg 600 mg 500 mg 5g 100 mg 30 mg Metal Mix* Fe (as Cl-) Tris Vit.B12 Na2 SiO3 Vitamin Mix H 2O 30 ml 100 g 1g 3g 80 mg 1 ml 1l

* Mezcla de metales 100 ml, contanido: Na2 EDTA, 100 mg; Fe, 1 mg; Zn, 0.5 mg; Mn, 4 mg;Co, 0.01 mg; Cu, 0.004 mg; B, 20 mg. Mezcla de vitaminas 50 ml, contenido: B12, 10 g; biotina, 50 g; B1, 5 mg TABLA 13. MEDIO DE GUILLARD & RHYTER (PARSONS & STRICKLAND, 1961) A. SOLUCIONES NUTRIENTES 1. Disolver 0.08 gr de clorhidrato de Cobalto CoCl2.6H2O y 0.8 gr de Sulfato de Cobre CuSO4.5H2O; en 100 ml de H2O destilada. 2. Aadir 1 ml de solucin A.1. a aproximadamente 800 ml de H 2O destilada, que previamente se le ha adicionado: 0.2 gr de Tricloruro Frrico FeCl3.6H2O 0.06 gr de Sulfato de Zinc ZnSo4.7H2O 0.12 gr de Sulfato de Manganeso MnSO4.H2O 0.03 gr de Sodio Na2MoO4.2H2O Molibdato de

3. Aadir 1.2 gr de Etilenodiaminotetracetato Disdico (EDTA) diludo a cerca de 900 ml de H2O destilada.

4. Ajustar el pH de la solucin con Hidrxido de Sodio IN-Na(OH), hasta 7.5. 5. Evitar la formacin de precipitado, el cual puede elevar la adicin de mucho alcali. 6. Aadir 10 gr de Nitrato Potsico KNO3 y 1.4 gr de Fosfato Dihidratado de Potasio KH2PO4. 7. Diluir la solucin a 1 litro y en autoclave a menos de 15 libras de presin por 15 minutos. 8. Guardar la solucin en botellas de vidrio en la obscuridad.

TECNICAS DE AISLAMIENTO Y PURIFICACION La aplicacin de los siguientes mtodos para una colecta natural de algas microscpicas produce cultivos monoespecficos (de una sola especie) o axnicos (libre de contaminantes). Aunque tales mtodos son sencillos sin embargo, la preparacin de cultivos axnicos requiere paciencia y perseverancia. A continuacin se brinda una breve descripcin de algunos de los principales mtodos que se utilizan para aislar y purificar microalgas. Entre los mtodos de aislamiento ms usados se nombran: Pipeta capilar (simplificado). Rallado en agar. Diluciones seriadas

Entre los mtodos de purificacin ms conocidos tenemos: Lavado. Antibiticos. Potasio telrico.

1. AISLAMIENTO Pipeteo capilar

Se utiliza para separar microalgas mayores de 10, mediante una pipeta construida con un tubo capilar, a travs del microscopio ptico se pesca las clulas y se separan en pequeas gotas de nutrientes colocados alrededor de una Caja de Petri o en portaobjetos escavados.

Fig. 1) Mtodo de filtracin a travs de una columna empacada con algodn. Rayado de Placas de Agar

Se transfieren pequeas gotas de la muestra(microalga) con una asa de siembra, extendiendo por estras (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara con una solucin nutritiva para microalgas y con una relacin de 1 1.5% w/v de agar disuelto en el medio nutritivo, se incuba la placa bajo iluminacin a 18 20. De este primer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado sembrando por estras o bien, se transfiere a medios lquidos en subcultivos sucesivos para su purificacin, de tal manera que en cada dilucin se reduzca el nmero de organismos en una gota, es recomendable combinar la tcnica de diluciones con la de transferencia en placa de agar o tubo inclinado para obtener cultivos clonales (de una sola colonia o clula) y poder establecer el cultivo monoespecfico. Despus de 10 das, pequeas colonias aparecen sobre la superficie del agar, que se pueden transferir mediante el Mtodo de Hocking o de la micropipeta a medios lquidos.

Fig. 2) Mtodo de aislamiento y purificacin de microalgas en placa de agar. Diluciones seriadas

Esta tcnica es selectiva y se emplea para obtener a las especies predominantes y/o ms competitivas en una muestra ,a su vez por la misma razn se eliminan fcilmente los menos abundantes que podran ser considerados de escaso inters debido a su crecimiento aparentemente inferior. La tcnica consiste en hacer diluciones progresivamente decrecientes de orden de 1:10 a partir de la muestra original. Para este fin se evala primeramente por conteo directo el nmero de cel. /ml de la muestra, haciendo diluciones sucesivas hasta lograr concentraciones tericas de fracciones de clulas en la ltima dilucin.

Fig. 3) Aislamiento y purificacin de microalgas por el mtodo de diluciones sucesivas y subcultivos repetidos. Aislamiento mediante micropipeta

Es una de las tcnicas ms simples para el aislamiento de forma microscpica. Se usan micropipetas para obtener clulas individuales mediante una serie de lavados esteriles.Las micropipetas puedes ser tubos capilares de 3-4 mm de dimetro.El mtodo consiste en tomar una muestra de agua en un frasco transparente y enriquecerlo con nutriente, esperar 1 a 2 das para que crezca, se procede a observar en el microscopio, luego se procede a separar individualmente las microalgas una vez que se certifica que se tiene una sola clula y se procede transferirla en medio de agua de mar esteril,filtrada y enriquecida.

Fig. 4) Aislamiento mediante micropipeta y el uso de microscopio.

2. PURIFICACION Como ya se mencion al describir las tcnicas de aislamiento, estas mismas nos permiten purificar el cultivo a travs de las resiembras clnales sucesivas, pero adems es recomendable entre otros mtodos el uso de antibiticos para eliminar otros microorganismos, generalmente de tipo bacteriano que estn contaminando el cultivo de microalgas de nuestro inters. Tratamiento con antibiticos

Puede usarse un antibitico o una combinacin de stos para eliminar o inhibir el crecimiento de microorganismos que se adhieren a las clulas algales. El presente procedimiento corresponde a uno descrito por J. R. Stein en su texto Handbook of phycological methods: a) Preparar la solucin de antibiticos, disolviendo primero 100 mg de penicilina G y 50 mg de sulfato de estreptomicina juntos en 10 ml de agua destilada. Agregar a este preparado 10 mg de cloranfenicol que ha sido disuelto primero en 1 ml de etanol al 95% y agitar bien. b) Filtrar esta solucin rpidamente con filtro de membrana (0.2 - 0.45 ). c) Colocar 1ml de cultivo algal contaminado en cada uno de los seis Erlenmeyer (fiolas) de 125 ml que contienen 50 ml de medio de cultivo estril. d) Agregar uno de los siguientes volmenes de la solucin de antibitico en cada fiola: 3, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 ml. Esto provee concentraciones de penicilina de aproximadamente 20 a 500 mg/l. y los niveles que corresponden a los otros 2 antibiticos. e)Las fiolas debidamente tapadas son puestos bajo condiciones favorables de crecimiento. f) Despus de 24 - 48 horas aspticamente transfiera algunas unidades algales de cada fiola a tubos de ensayo conteniendo medio de cultivo estril y libre de antibiticos. Hacer esto por triplicado en cada intervalo de tiempo. g) Colocar estos tubos en condiciones favorables de crecimiento. Chequear los tubos y hacer pruebas de contaminacin bacteriolgica despus de 2 y 3 semanas, En ocasiones las algas pueden contaminarse con otras especies algales como las verde azules y estas pueden ser eliminadas usando antibiticos. Medios de cultivo conteniendo 25 ppm. de estreptomicina pueden resultar efectivos.

El uso de antibiticos requiere cuidado en la concentracin de los agentes qumicos y en la duracin del tiempo en que las algas son expuestas al tratamiento.

Fig.5) Purificacin: Secuencia de un tratamiento con Antibiticos Otros antibiticos pueden ser usados para purificacin como las sulfonamidas. Para comprobar la presencia de los contaminantes se puede recurrir a la directa observacin en el microscopio de contraste de fase: 1. Aspticamente tome muestras del cultivo de algas. 2. Colquelas en lminas portaobjetos estriles y si es necesario agregar medios de cultivo estriles a las muestras. 3. Cbralos con laminillas cubreobjetos estriles. 4. Observe al microscopio equipado con iluminacin de contraste de fase. 5. Usando el mayor aumento posible: 20X/10X /40 aumento, buscar la presencia de microorganismos en la muestra. Tabla.1. Antibiticos usados para la Purificacin de Cultivo de Microalgas

Bibliografa Handbook of Phycological Methods, Culture Methods Band Growth Measurements. Janet R. Stein. 1973. Illustration of the Marine Plankton of Japan. Dr. I. Yamaji. Third Edition, July 1984. Tecnologa de Cultivo de Microalgas. Eduardo Uribe T.Universidad Catlica del Norte. Coquimbo, Chile 1992 http://www3.inecol.edu.mx/solabiaa/ARCHIVOS/documentos/relbaa/RELBAA__V2N2.pdf#page=16 http://bioreactorcrc.wordpress.com/2011/05/06/diseo-de-foto-bioreactores-para-elcultivo-micro-algas-oleaginosas-parte-1-teora-y-generalidades/ http://es.slideshare.net/julolisapa/microalgas-2-bach http://www.fao.org/docrep/field/003/ab473s/ab473s02.htm