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ISBN 978-970-43-0328-0

INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRICOLAS Y PECUARIAS CENTRO DE INVESTIGACION REGIONAL DEL NORESTE CAMPO EXPERIMENTAL SALTILLO

GUIA PARA LA MICROPROPAGACION Y PRODUCCION in vitro DE PLANTAS DE SOTOL (Dasylirion cedrosanum Trel.)

AGRADECIMIENTO
Se agradece al Fondo CONACYT- CONAFOR a travs del proyecto C03-10376, al Gobierno del estado de Coahuila y a la Fundacin Produce Coahuila A.C. por las aportaciones econmicas brindadas para la realizacin del presente trabajo.

Folleto Tcnico Num. 37

Diciembre 2007
Mxico

SECRETARIA DE AGRICULTURA, GANADERIA, DESARROLLO RURAL, PESCA Y ALIMENTACIN LIC. ALBERTO CARDENAS JIMENEZ Secretario ING. FRANCISCO LOPEZ TOSTADO Subsecretario de Agricultura y Ganadera ING. ANTONIO RUIZ GARCIA Subsecretario de Desarrollo Rural ING. JEFREY MAX JONES JONES Subsecretario de Fomento a los Agronegocios C. RAMON CORRAL AVILA Comisionado Nacional de Acuacultura y Pesca LiC. JOSE DE JESS LEVY GARCA Oficial Mayor INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRICOLAS Y PECUARIAS Ph. D. PEDRO BRAJCICH GALLEGOS Director General Ph. D. SALVADOR FERNANDEZ RIVERA Coordinador de Investigacin, Innovacin y Vinculacin Ph. D. ENRIQUE ASTENGO LOPEZ Coordinador de Planeacin y Desarrollo LIC. MARCIAL ALFREDO GARCIA MORTEO Coordinador de Administracin y Sistemas

GOBIERNO DEL ESTADO DE COAHUILA PROFR. HUMBERTO MOREIRA VALDS Gobernador Constitucional del Estado C. HCTOR O. FERNNDEZ AGUIRRE Secretario de Fomento Agropecuario LIC. ELIAS JUAN MARCOS ISSA Subsecretario Agropecuario y de Comercializacin ING. JOS CARLOS DESTENAVE MEJIA Director de Agricultura M. V. Z. ENRIQUE GARCIA PREZ Director de Ganadera Ph. D. HCTOR FRANCO LPEZ Secretario del Medio Ambiente y Recursos Naturales DELEGACION ESTATAL DE SAGARPA ING. EDUARDO VILLARREAL DVILA Delegado en Coahuila ING. JORGE ALBERTO FLORES BERRUETO Subdelegado Agropecuario LIC. REYNOLD MALTOS ROMO Subdelegado de Planeacin LIC. REYNALDO PEREZ-NEGRON Subdelegado de Administracin

FUNDACION PRODUCE COAHUILA, A. C. CENTRO DE INVESTIGACION REGIONAL DEL NORESTE Ph.D. SEBASTIAN ACOSTA NUEZ Director Regional Ph. D. JORGE ELIZONDO BARRON Director de Investigacin, Innovacin y Vinculacin M. C. NICOLAS MALDONADO MORENO Director de Planeacin y Desarrollo M. A. JOSE LUIS CORNEJO ENCISO Director de Administracin M. C. GUSTAVO J. LARA GUAJARDO Director de Coordinacin y Vinculacin en Coahuila ING. BERNABE IRUZUBIETA QUEZADA Presidente ING. JUAN ANTONIO OSUNA CRDENAS Vicepresidente M. Sc. IGNACIO A. GONZLEZ CEPEDA Presidente del Consejo Consultivo Sureste ING. JAVIER GARCA NEZ Tesorero M. C. JORGE MONTAZ DE LEN Gerente

En el proceso editorial de esta publicacin colaboraron: Comit Editorial del Campo Experimental Saltillo: M. C. Gustavo J. Lara Guajardo Dr. Marco A. Arellano Garca M. C. Francisco J. Contreras de la Ree Ing. Eutimio de J. Cuellar Villarreal M. C. Carlos Ros Quiroz M. C. David Castillo Quiroz Supervisin Tcnica: Dr. Jorge Elizondo Barrn Dr. Isidro Humberto Almeyda Len Captura Computacional: M. C. Edith Villavicencio Gutirrez Fotografa: M. C. Edith Villavicencio Gutirrez Edicin: M. C. Antonio Cano Pineda

GUIA PARA LA MICROPROPAGACION Y PRODUCCION in vitro DE PLANTAS DE SOTOL (Dasylirion cedrosanum Trel.)

M. C. Edith Villavicencio Gutirrez


Investigador del Programa de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo

MAYOR INFORMACION INIFAP


Campo Experimental Saltillo Blvd. Vito Alessio Robles No. 2565 Col. Nazario S. Ortiz Garza Saltillo, 25100, Coah. Tel. (01 844) 4 16 20 25 Fax (01 844) 4 39 19 01 E-mail: villavicencio.edith@inifap.gob.mx Direccin de Coordinacin y Vinculacin del INIFAP-Coahuila Blvd. Vito Alessio Robles No. 2565 Col. Nazario S. Ortiz Garza Saltillo, 25100, Coah. Tel /Fax: (01 844) 4 39 24 36 E-mail: lara.gustavo@inifap.gob.mx

M. C. Antonio Cano Pineda


Investigador de Viveros y Plantaciones Forestales del Campo Experimental Saltillo

Ing. Arturo Jurez Santana


Tcnico del Laboratorio de Cultivos Vegetales del Campo Experimental Saltillo

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias Centro de Investigacin Regional del Noreste Campo Experimental Saltillo Mxico Diciembre 2007

GUIA PARA LA MICROPROPAGACION Y PRODUCCION in vitro DE PLANTAS DE SOTOL (Dasylirion cedrosanum Trel.)
No est permitida la reproduccin total o parcial de este folleto, ni la transmisin de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrnico, mecnico, por fotocopia, por registro u otros medios, sin el permiso previo y por escrito de los titulares del derecho de autor. Derechos reservados 2007, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias. Progreso No. 5 Barrio de Santa Catarina Del. Coyoacn 04010 Mxico, D. F. Tel. (55) 38718700 Primera edicin Impreso en Mxico Tiraje: 500 ejemplares No. de Registro INIFAP /CIRNE /F73 ISBN 978-970-43-0328-0 Esta obra se termin de imprimir en Diciembre de 2007 en los talleres de: IMPRESOS GARCER Arteaga No. 820 Zona Centro Saltillo, 25000, Coah. Tel. /fax (844) 4102380 Folleto Tcnico Nm. 37 Diciembre 2007 CAMPO EXPERIMENTAL SALTILLO Blvd. Vito Alessio Robles No. 2565 Col. Nazario S. Ortiz Garza Saltillo, 25100, Coah. Tel. (01 844) 4 16 20 25 Fax (01 844) 4 39 19 01 E-mail: villavicencio.edith@inifap.gob.mx La cita correcta de este folleto es: Villavicencio G., E. E.; A. Cano P. y A. Jurez S. 2007. Gua para la micropropagacion y produccin in vitro de plantas de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.). INIFAP-CIRNE. Campo Experimental Saltillo. Folleto Tcnico Nm 37 Coahuila, Mxico. 29 p.

CONTENIDO Pg.
INTRODUCCIN CARACTERSTICAS cedrosanum Trel.) DEL SOTOL (Dasylirion 1 3 3 4 7 7 8 9 9 10 10 12 14 14 16 17 18 19 23 25 26

APLICACIN DE LA MICROPROPAGACIN EN ESPECIES FORESTALES NO MADERABLES ESQUEMA PARA LA MICROPROPAGACIN DE SOTOL POTENCIAL DE APLICACIN DE LA TCNICA Ventajas de la produccin in vitro de sotol CARACTERSTICAS PARA LA PROPAGACIN CLONAL DE SOTOL POR CULTIVO DE TEJIDOS Tipos de micropropagacin REQUERIMIENTOS PARA LA PRODUCCIN DE PLNTULAS IN VITRO MEDIO NUTRITIVO BASE Procedimiento para la elaboracin del medio nutritivo Vida de anaquel del medio de cultivo PROCESO DE MICROPROPAGACION Etapa 1. ESTABLECIMIENTO DEL INCULO EN UN CULTIVO ASPTICO Protocolo de desinfeccin Germinacin in vitro Velocidad de emergencia Etapa 2. MULTIPLICACIN O INDUCCIN DE BROTES Etapa 3. ENRAIZAMIENTO Etapa 4. ACLIMATACIN BIBLIOGRAFA

NDICE DE FIGURAS Figura 1 2 3


Planta de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) de poblaciones naturales. Esquema para la produccin de vitroplantas de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.). Elaboracin del medio nutritivo para la microprogacin de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP (LACUTEV-CESAL). a.-Contaminacin de semillas de sotol Dasyilirion cedrosanum Trel.) b.- semillas de sotol establecidas en un cultivo asptico en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP. Aspecto del hipocotilo y epicotilo de las semillas de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) a los 28 das de germinadas in vitro en el LACUTEV-CESAL. Velocidad de emergencia de las semillas de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) despus de 20 das de establecidas in vitro en el LACUTEV-CESAL-INIFAP. Establecimiento de explantes en la etapa de multiplicacin para la induccin de brotes de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del CESALINIFAP. Nmero de brotes de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) generados in vitro en los diferentes tratamientos evaluados en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del CESALINIFAP. Produccin de brotes de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) generados en la etapa de multiplicacin in vitro en Laboratorio de Cultivo de Tejidos del CESAL-INIFAP. Nmero y longitud de races de las vitroplantas de sotol generados en el medio de cultivo MBR en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del CESAL-INIFAP.

NDICE DE FIGURAS Pg. 2 6 13 NDICE DE CUADROS 15


Cuadro 1 Pg. Componentes de los medios de cultivo para la produccin de plntulas in vitro (Dasylirion cedrosanum Trel.). Protocolo de desinfestacin para las semillas de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.).

Figura 11
Plantas de sotol producidas en el LACUTEV y aclimatadas en invernadero del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP.

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GUA PARA LA MICROPROPAGACIN Y PRODUCCIN in vitro DE PLANTAS DE SOTOL (Dasylirion cedrosanum Trel.) M. C. Edith Villavicencio Gutirrez 1 . M. C. Antonio Cano Pineda2 Ing. Arturo Jurez Santana3 INTRODUCCIN
El sotol es una planta de la que se utilizan sus tallos denominados pias para elaborar industrialmente la bebida alcohlica llamada sotol (Figura 1). Por ser una bebida con sabor autntico que tradicionalmente se ha elaborado en la regin desrtica de Coahuila, se le otorg a esta entidad junto con los estados de Chihuahua y Durango la denominacin de origen. En esta regin, el aprovechamiento de las poblaciones naturales de sotol est regulado por las normas NOM005-RECNAT-1997, NOM-007-RECNAT-1997 y la NOM-159-SCFI-2004. Desde su denominacin de origen la industria requiere satisfacer un volumen constante y uniforme de pias, mismas que actualmente se extraen de poblaciones naturales y son de calidad heterognea, imponiendo una fuerte presin al recurso. Para evitar el deterioro de las poblaciones naturales y uniformizar la calidad del producto, se requiere de un manejo sustentable en la regin, en donde se promuevan entre otras cosas el establecimiento de plantaciones comerciales que faciliten el aprovechamiento, manejo en campo y
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satisfagan la demanda del producto. El programa de plantaciones requiere del abastecimiento constante de material vegetativo, mismo que puede obtenerse mediante la micropropagacin, en donde de manera intensiva se pueden producir plantas de sotol en cantidades suficientes, permitiendo con esto la programacin de los ciclos de produccin y abastecimiento constante de pias a la industria, tal como se hace en el esquema de produccin del tequila.

Figura 1. Planta de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) de poblaciones naturales.

M. C. Investigador del Programa de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo. CIRNE-INIFAP. 2 M. C. Investigador de Viveros y Plantaciones Forestales del Campo Experimental Saltillo. CIRNE-INIFAP. 3 Ing. Agr. Tcnico del Laboratorio de Cultivos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP.

Las plantaciones comerciales requieren de un volumen grande y constante de plantas uniformes con alta calidad fitosanitaria. En el caso del sotol, la demanda de plantas puede tener dos procedencias va sexual y asexual, esta ltima puede obtenerse mediante la aplicacin de tcnicas modernas para la produccin de plantas como la micropropagacin.

CARACTERSTICAS DEL SOTOL (Dasylirion cedrosanum Trel.)


Esta especie es una planta perenne, policrpica y semicilndrica grande que adquiere esta forma al ir desarrollando sus hojas muy angostas del centro hacia la periferia, produciendo un tallo en forma de pia, que puede alcanzar hasta 3 metros, con un peso de ms de 100 kg. Esta especie es una planta dioica, que desarrolla plantas con flores unisexuales con un solo tipo de gametos; es decir, se pueden encontrar plantas que florean desarrollando estambres (masculinas) y plantas con flores que desarrollan pistilos (femeninas). (Melgosa y Santos, 2004). Estas plantas poseen un escapo floral que puede contener una gran cantidad de estructuras florales, lo que hace suponer que pueden generarse una cantidad considerable de semillas; sin embargo, el polen tiene que transportarse por el viento para llegar a los pistilos de una planta hembra, proceso en el cual se pierden muchas clulas gamticas masculinas, lo que reduce la produccin de semillas (Olhagaray et. al., 2004). Este proceso se complica porque el ciclo reproductivo de esta especie no es anual y se presenta una asincrona de flores masculinas y femeninas en su floracin, lo que limita la reproduccin sexual de esta especie.

El sotol es una especie no maderable del semidesierto que pertenece a la familia de las Agavaceas. Para especies no maderables que se distribuyen en nuestro pas la tcnica de micropropagacin, se ha aplicado con diferentes propsitos, entre ellos; producir genotipos mejorados de nopal (Opuntia sp.) de doble o triple propsito, multiplicar de manera intensiva plantas de agave tequilero (Agave tequilana Weaber), e incrementar especies con estatus de riesgo, lo que demuestra el potencial de aplicacin que tiene esta tcnica en la propagacin de plantas (Escobar, 1985; Binh et. al. 1990; Villavicencio 2004).

ESQUEMA DE MICROPROPAGACIN PARA EL SOTOL


De acuerdo con Litz y Gray (1992), la micropropagacin es una tcnica para multiplicar especies o variedades en un tiempo ms corto comparado con el mtodo de propagacin tradicional (va sexual o asexual), por lo que se ha considerado como una opcin para producir plantas de sotol de manera intensiva en cantidades suficientes, mismas que pueden utilizarse con diferentes propsitos. Las diferentes etapas de la micropropagacin han sido descritas por Pierik (1987) y Margara, (1988), y han sido evaluadas en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP para determinar el esquema de micropropagacin y la tcnica de cultivo de tejidos para el sotol. De los resultados obtenidos se ha determinado que el esquema de micropropagacin abarca cuatro etapas para la produccin de vitroplantas que en conjunto requieren de un perodo de ocho meses.

APLICACIN DE LA MICROPROPAGACIN EN ESPECIES FORESTALES NO MADERABLES


La micropropagacin es parte de la Biotecnologa Agrcola y Forestal que a nivel mundial se ha utilizado ampliamente en especies de inters econmico. Esta tcnica utiliza el cultivo de tejidos vegetales para multiplicar rpida y masivamente una especie de inters, basndose en el concepto de totipotencia vegetal, en el que se promueve el desarrollo de un organismo completo, considerando la diferenciacin celular y potencial gentico del genotipo. 3

La primera etapa es la de establecimiento, en donde las semillas se establecen en un cultivo asptico in vitro. La segunda etapa es la de multiplicacin, en donde se promueve la induccin de brotes a partir de explantes tomados de epicotilos. El enraizamiento y aclimatacin son las etapas siguientes, en donde se promueve la elongacin de los brotes y la induccin de races. Despus que los brotes forman su sistema radical, se ha completado la formacin de las nuevas plantas, las cuales pueden posteriormente aclimatarse en invernadero (Figura 2). En la produccin intensiva de vitroplantas de sotol, se requiere de segmentos de una o ms plantas donadoras, mismas que se utilizan para obtener brotes, los cuales al desarrollarse formarn nuevas plantas. De esta manera se puede continuar con la etapa de multiplicacin, subcultivando los brotes en un medio de cultivo definido para que stos se incrementen y contine su proliferacin. As es como el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo (LACUTEV-CESAL), ofrece a los productores una nueva opcin rentable para impulsar el desarrollo productivo en la regin.

ESTABLECIMIENTO

MULTIPLICACION

ENRAIZAMIENTO

ACLIMATACION

Figura 2. Esquema para la produccin de vitroplantas de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.).

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POTENCIAL DE APLICACION DE LA TCNICA


Esta tecnologa puede aplicarse para producir plantas de sotol de ms de seis especies del gnero Dasylirion sp. que se aprovechan en las reas sotoleras de Chihuahua, Durango y Coahuila. Bajo este esquema de propagacin, el volumen de produccin de plantas puede incrementarse en ms del 500 %, siendo una tcnica rentable y efectiva en comparacin, con las tcnicas convencionales de propagacin. Esta tecnologa puede implementarse en empresas registradas dedicadas a la produccin de plantas bajo el esquema Laboratorio-Invernadero, quedar incluida dentro del rea de desarrollo en las empresas dedicadas a la industrializacin de esta bebida o bien formar parte de un agronegocio como una nueva opcin productiva en apoyo a los productores del semidesierto de esta regin sotolera.

La produccin de plantas in vitro de sotol asegura su condicin fitosanitaria, lo que facilita la adquisicin de permisos para su movilizacin. Garantiza la uniformidad gentica de las plantas producidas. Las plntulas pueden transportarse fcilmente a diferentes invernaderos del pas.

CARACTERISTCAS PARA LA PROPAGACIN CLONAL DE SOTOL POR CULTIVO DE TEJIDOS


La propagacin clonal de plantas por cultivo de tejidos se basa en el principio de que toda clula vegetal tiene la informacin gentica para regenerar un organismo completo. Para que cada clula pueda expresar su potencial gentico es necesario que en todas las etapas de la micropropagacin se le proporcionen condiciones ambientales adecuadas que han sido agrupadas de la forma siguiente: a) Condiciones qumicas o de medio de cultivo: Medios nutritivos de composicin definida, que incluyan compuestos inorgnicos como macro y micronutrientes, compuestos orgnicos como carbohidratos, vitaminas, aminocidos, reguladores del crecimiento, complejos orgnicos y sustancias de soporte fsico como agar. b) Condiciones fsicas y de incubacin: Temperatura, iluminacin, humedad relativa y tipo de recipientes (tubos, frascos, y envases de polipropileno).

Ventajas de la produccin in vitro de sotol


El Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo (LACUTEV-CESAL CESAL) es un laboratorio certificado que apoya la actividad agroindustrial en la regin, desarrollando productos rentables de alto valor agregado. Este laboratorio ofrece a productores interesados el servicio de capacitacin en cultivo de tejidos para la micropropagacin de sotol y la venta de plantas producidas bajo el esquema Laboratorio-Invernadero, considerando los siguientes beneficios. Mediante la micropropagacin pueden multiplicarse grandes cantidades de plantas de sotol en un espacio reducido, a bajo costo en tiempos econmicamente rentables. 7

Tipos de micropropagacin
El sotol pertenece a la familia Agavaceae, en donde el cultivo de tejidos vegetales se ha aplicado en diferentes especies como; Agave victoria-reginae (Martnez et. al., 2003); A. sisalana (Hazra et al., 2002); A. fourcroydes (Robert et. al., 1987) y A. parrasana (Santacruz- Ruvalcaba et. al., 1999), determinndose que existen cuatro mtodos por los que un genotipo puede regenerase in vitro. 1. Induccin de embriones somticos a partir de callos o clulas en suspensin. 2. Induccin de brotes adventicios a partir de callos o clulas en suspensin, para su posterior enraizamiento. 3. Formacin de brotes adventicios directamente del tejido, sin pasar por la etapa de callo. 4. Induccin de brotes a partir de pices o yemas axilares, para su posterior enraizamiento. En sotol la induccin de brotes se realiza mediante organognesis directa, es decir, a partir de tejido somtico sin pasar por la etapa de callo.

MEDIO NUTRITIVO BASE


Existen diferentes medios de cultivo, por lo que su seleccin depende del objetivo que se persiga, ya sea establecimiento in vitro o multiplicacin. Los explantes requieren de un medio que suministre un balance nutricional adecuado, para que a corto plazo se obtenga un crecimiento ptimo y los resultados deseados. El medio base que se utiliz para la produccin de plntulas in vitro de sotol es el de Murashige y Skoog (1962); el cual se complementa con diferentes dosis de fitohormonas, vitaminas y ajustadores osmticos (Cuadro 1).

Procedimiento para la elaboracin del medio nutritivo


1) En un vaso de precipitado o matraz erlenmeyer agregar la cuarta parte de la cantidad de agua destilada que se desea preparar de medio. 2) Disolver la cantidad de sacarosa.

REQUERIMIENTOS PARA LA PRODUCCIN DE PLNTULAS in vitro


Para iniciar la propagacin in vitro de sotol se requieren semillas del genotipo o especie de inters. Para su establecimiento se pueden utilizar tubos o envases de vidrio, en donde se pueden establecer desde uno hasta cinco inculos o explantes. Para la proliferacin de brotes se pueden utilizar envases de vidrio, polipropileno y magentas, para establecer desde cinco hasta 25 explantes.

3) Aadir el volumen correcto de cada una de las soluciones de micro y macroelementos a la mezcla. 4) Agregar el volumen correcto de quelatos, vitaminas y aminocidos. 5) Mezclar estos componentes y aforar con agua destilada a la cantidad que se desea preparar del medio. 6) Aadir las fitohormonas si el medio nutritivo lo requiere.

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Cuadro 1. Componentes de los medios de cultivo para la produccin de plntulas in vitro de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.).
Requerimiento para 1 L de Peso medio Molecular Milimoles Micromoles (g) (mM) (M) Macroelementos 80.40 20.60 101.11 18.80 246.48 1.50 136.09 1.25 236.15 3.00 Microelementos 166.01 1.00 61.83 1.00 228.00 0.10 287.54 0.30 241.95 0.01 249.68 0.001 239.93 0.001 Quelatos 372.24 1.00 278.28 0.90 Vitaminas 123.10 4.06 205.60 2.43 337.30 0.29 180.20 5.54 Aminocidos 75.07 0.26 238.30 0.49 Medio de Cultivo 342.30 87.64

7) Introducir el electrodo del potencimetro en la mezcla, esperar que el aparato tome la lectura y ajustar el pH a 5.7. Para bajarlo aplicar gotas de HCl 1N y para subirlo aplicar gotas de NaOH. 8) Colocar el medio en una parrilla para calentar y agregar el Agar, mezclar hasta diluirlo, antes de ebullicin. 9) Vaciar el medio en los recipientes, ya sean frascos, tubos o envases y esterilizar por 20 minutos en autoclave considerando una temperatura de 120 C y 4 libras de presin. 10) Ya esterilizados, los recipientes con el medio de cultivo se colocan en un lugar limpio (Figura 3).

Composicin

NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H20 KH2PO4 Ca(NO3)2 IK H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuS04.5H2O CoCl.6H2O Na2EDTA FeSO4.7H2O Ac. Nicotnico Piridoxina Tiamina Myoinositol Glicina Ac. Pantotnico Sacarosa Agar (6.0 g/l)

Vida de anaquel del medio de cultivo


Siempre que sea posible se debe utilizar un medio de cultivo fresco de uno o dos das de preparacin, ya que la vida de anaquel del medio de cultivo disminuye conforme aumenta el tiempo de almacenamiento teniendo un efecto en el crecimiento y desarrollo de los explantes. A temperatura ambiente, el medio de cultivo puede almacenarse por un tiempo mximo de una semana. Si se quiere aumentar el tiempo de almacenamiento el medio de cultivo tiene que refrigerarse 5 C. En todos los casos el medio debe quedar almacenado en reas aspticas.

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PROCESO DE MICROPROPAGACION ETAPA 1. ESTABLECIMIENTO DEL INCULO EN UN CULTIVO ASPTICO


El propsito de esta etapa es establecer in vitro un explante estril en un medio de cultivo asptico. Esta es una etapa crtica de gran importancia, dado que en este proceso intervienen factores que determinan su xito como; la contaminacin endgena o exgena causada por bacterias y hongos (Hubstenberger et. al., (1992). Este efecto puede evitarse si se realiza una buena desinfeccin en la que se involucran diferentes tipos y concentraciones de agentes desinfectantes, los cuales no deben ser txicos y pueden seleccionarse en funcin del tipo de explante que vaya a utilizarse. Asimismo, debe evitarse aplicar una alta concentracin de productos, ya que estos pueden inhibir la germinacin, o bien la brotacin de yemas. El protocolo de desinfeccin es muy importante, ya que de l depende el establecimiento in vitro del explante. En esta etapa se utilizaron semillas de sotol como explante, mismas que se desinfectaron obteniendo en la etapa de establecimiento el 1% de contaminacin equivalente a obtener 1 tubo contaminado por bacterias u hongos por cada 100 tubos establecidos, lo que muestra que la desinfeccin realizada fue satisfactoria eliminando las partculas de polvo y microorganismos sin provocar la muerte del tejido vegetal. (Figura 4 a y b). Villegas (1990) y Pques (1991), agregan que adems de eliminar la contaminacin, en esta etapa debe evitarse la sobrehidratacin, malformacin y oxidacin del tejido, ya que esto puede generar plntulas o brotes anormales que difcilmente podrn multiplicarse.

Figura

3.Elaboracin del medio nutritivo para la microprogacin de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP (LACUTEV-CESAL).

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De acuerdo al genotipo y tipo de explante, se han generado para el establecimiento asptico diferentes protocolos de desinfestacin (Gratton y Fay, 1990). En todos estos se ha utilizando agua destilada o bidestilada estril, diferentes concentraciones de etanol, hipoclorito de sodio (ingrediente activo de muchos blanqueadores comerciales) o hipoclorito de calcio ms un surfactante para mejorar el contacto entre el explante y el producto desinfectante.

Protocolo de desinfeccin
Para el establecimiento in vitro de las semillas de sotol es importante considerar el tiempo de inmersin y concentracin de agentes desinfectantes, para lo cual se evaluaron ambos parmetros seleccionando el siguiente protocolo de desinfeccin (Cuadro 2).
Cuadro 2. Protocolo de desinfestacin para las semillas de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.).

Procedimiento Lavar las semillas en agua estril y una solucin de plata coloidal al 0.052 % por 3 min. Sumergirlas en alcohol al 70 % v/v por 5 min. Posteriormente sumergir en Hipoclorito de sodio al 100 %. (6% concentracin comercial) por 3 min. ms unas gotas de tween 20.
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Enjuagar 5 veces con agua destilada estril dentro de la campana de flujo laminar.
Figura 4. a.-Contaminacin de semillas de sotol Dasilirion cedrosanum Trel.), b.- semillas de sotol establecidas en un cultivo asptico en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP (LACUTEV-CESAL).

Establecer las semillas en tubos o frascos con 5 y 15 mL de medio respectivamente.

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Con este protocolo de desinfeccin no se da o quem la testa de las semillas de sotol, tampoco se necros el micrpilo y mat el embrin, permitiendo la emergencia de la radcula durante la germinacin (Figura 4b). Considerando que del xito de esta etapa depende el desarrollo futuro de la micropropagacin, algunos autores como Mauseth (1977), Hernndez (1994) y Villegas (1996) disminuyeron la concentracin de algn reactivo o eliminaron el uso de alguno de estos productos; lo que en todos los casos incluyendo al sotol se logr establecer un cultivo asptico, mostrando que la eficiencia de un protocolo de desinfeccin depende del tipo de tejido vegetal que se maneje y del tiempo de exposicin de los reactivos empleados.

Los resultados mostraron que esta especie no requiere promotores de la germinacin para romper el letargo morfolgico que se presenta cuando las semillas se hacen germinar en invernadero. En condiciones controladas, el medio de cultivo (MBG) que influye en el porcentaje de germinacin de sotol fue preparado con osmoacondicionadores, obteniendo una germinacin mayor al 80%.

Germinacin in vitro
Las semillas de sotol estn formadas por un embrin, material de reserva y tejidos de proteccin, estos tegumentos forman una cubierta protectora llamada testa que en el caso del sotol es cerosa e impermeable al paso del agua. Como ocurre con todas las especies de propagacin sexual la germinacin de esta especie consiste en la reanudacin del crecimiento del embrin, el cual ha permanecido en estado latente. Durante el proceso de germinacin el metabolismo celular de la semilla se incrementa, el embrin activa su crecimiento, la cubierta de la semilla se rompe y emerge la plntula (Caldern, 2004). En el caso del sotol se encontr que bajo condiciones in vitro el 100% de las semillas son quiescentes y viables presentando un embrin vivo con capacidad para germinar (Figura 5).

Figura 5. Aspecto del hipocotilo y epicotilo de las semillas de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) a los 28 das de germinadas in vitro en el LACUTEV-CESAL.

Velocidad de emergencia
La emergencia de las plntulas de sotol obtenida en el LACUTEV-CESAL es ms rpida bajo condiciones aspticas, que en condiciones ex vitro, siendo el tipo de medio y condiciones de incubacin in vitro lo que favorece este proceso, inhibiendo el caracterstico letargo morfolgico que se observa cuando las semillas germinan en condiciones naturales, o cuando stas se hacen germinar en invernadero o vivero. 18

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Del anlisis realizado se determin que la emergencia de las plntulas se registra desde los siete das de establecimiento de las semilla in vitro, observndose un hipocotilo pivotante fuerte, con un epictilo compuesto por dos hojas rudimentarias. En el MBG se requiere en promedio de 20 das para que las semillas completen su proceso de germinacin (Figura 6).

Los nuevos brotes se generan a partir de un determinado tipo de explante y una determinada concentracin de reguladores de crecimiento aplicados a un medio de cultivo base de multiplicacin (MBM). De las condiciones de cultivo se obtiene una tasa de multiplicacin que puede variar dependiendo la especie. En sotol los nuevos brotes se obtuvieron a partir de epicotilos considerados como explante, los cuales se establecieron en un medio de cultivo base (MBM), adicionado con una relacin citocinina-auxina de 10:1, mostrando que la respuesta morfogentica depende de la relacin cinergista de dichas fitohormonas, siendo la interaccin BA-AIB (bencilaminopurina-acido indolbutirico) la que promueve la induccin de brotes de esta especie (Figura 7 y 8). Aunque Palma (2000), utiliz en la etapa de multiplicacin, concentraciones de citocininas y auxinas menores a las utilizadas en el LACUTEV-CESAL este mismo efecto se encontr en el desarrollo de los brotes; es decir, bajas concentraciones de fitohormonas generaron en ambos casos un menor desarrollo y nmero de brotes como se muestra en los primeros tres tratamientos (T1, T2 y T3) de los cinco evaluados con las interacciones BA-AIB, BA-ANA (bencilaminopurinaacido indolbutrico) y KIN-AIB (Kinetina-acido indolbutrico) (Figura 8). Los tratamientos con la interaccin BA-AIB mostraron que el nmero de brotes se incrementa al aumentar los niveles de concentracin de ambas fitohormonas, siendo el MBM adicionado con 1.10 M de BA + 10.36 x 10-1 M de AIB el que promueve la induccin de brotes de sotol, registrando una tasa de multiplicacin de 7 brotes/explante, duplicando de acuerdo a la prueba de medias de Tukey (P 0.05) el nmero de brotes de los tratamientos T1, T2 y T3 (Figuras 8 y 9). 20

Figura 6. Velocidad de emergencia de las semillas de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) despus de 20 das de establecidas in vitro en el LACUTEV-CESALINIFAP.

ETAPA 2. MULTIPLICACIN O INDUCCIN DE BROTES.


En esta etapa se busca producir un rpido incremento de rganos y otras estructuras, las cuales posteriormente pueden dar origen a vitroplantas. El incremento puede ser obtenido por: induccin de rganos adventicios, formacin de embriones o por incremento de brotes axilares. 19

Con este tratamiento se obtiene la mejor respuesta morfogentica para induccin de brotes in vitro de sotol generando brotes con una altura de 88 mm, dimetro basal de 5 mm y 6 hojas en promedio, lo que representa una produccin exponencial de 1:7:7. Esta produccin es semejante a la encontrada en Agave sisalana por Nikan (1997), determinndose que el xito en la produccin de vitroplantas de sotol depende del balance adecuado de los reguladores de crecimiento adicionados al medio de cultivo base de multiplicacin (MBM). Este balance influye en el desarrollo, nmero de brotes generados y velocidad de regeneracin de los mismos, lo que hace que la tcnica de microprogagacin sea una forma viable que puede utilizarse para multiplicar in vitro esta especie, registrando una tasa de multiplicacin altamente significativa, que permite obtener nuevas vitroplantas rapidamente.

Figura 7.Establecimiento de explantes en la etapa de multiplicacin para la induccin de brotes de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del CESAL-INIFAP.

7 TAS A M ULTIP LICACIN (BRO TE S /E X P LANTE ) 6 5 4 3 2 1 0 1

NUMERO DE BROTES SOTOL


BA-AIB BA-ANA KIN-AIB

3 TRATAMIENTOS

Figura

Figura 8. Nmero de brotes de sotol (Dasylirion cedrosanum Trel.) generados in vitro en los diferentes tratamientos evaluados en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del CESAL-INIFAP.

9.Produccin de brotes de sotol Dasylirion cedrosanum Trel.) generados en la etapa de multiplicacin in vitro en Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del CESAL-INIFAP.

Esta tasa de multiplicacin es mayor a la reportada por Palma (2000), quin utiliz yemas axilares 22

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N m e r o d e r a c e s /P la n t a

tomadas de coronas de sotol de campo, mostrando que el tipo de explante tiene un efecto significativo en la micropropagacin de sotol y que la combinacin de fitohormonas inducen mayor respuesta morfogentica expresada por el nmero de brotes/explante, altura, nmero de hojas y dimetro basal de las vitroplantas. Estos nuevos brotes son de calidad uniforme y pueden enraizarse satisfactoriamente en un medio especfico para generar una planta completa.

4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 12.4 Tratamientos 18.6


-1 24.8 x 10 -1 AIB X 10 AIB

87.6 mM 116.8 mM C12H22O11 C12H22011

ETAPA 3. ENRAIZAMIENTO
En esta etapa, los brotes generados en la fase anterior se subcultivaron en un medio de cultivo de enraizamiento (MBR), considerando la interaccin C12H22O11 AIB en donde se seleccion el mejor tratamiento de los ocho evaluados para promover la induccin de races y obtener de este modo una vitroplanta completa. La formacin de races adventicias en los brotes de sotol se obtuvo de manera exgena a las seis semanas de incubacin en un medio MBR, adicionado 116.8 mM de C12H22O11 y 18.6 x 10-1 M de AIB, generando 3.4 races/vitroplanta, mostrando que el nmero de races depende de la relacin cinergista del osmoacondicionador y de las auxinas (Figura 10). De los tratamientos evaluados en esta etapa se encontr que conforme aumenta la concentracin de fitohormona, la longitud de races aumenta sin tener efecto en el nmero de races generado. Esto muestra que las vitroplantas de sotol endgenamente tienen niveles de auxina que ayudan a promover este efecto generando vitroplantas con una longitud de su sistema radicular mayor o igual a 100 mm.

Figura 10.Nmero y longitud de races de las vitroplantas de sotol generados en el medio de cultivo MBR en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos del CESAL-INIFAP.

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ETAPA 4. ACLIMATACIN
Esta es la etapa crtica para todas las especies vegetales que se micropropagan in vitro, que se refiere al paso de las plantas de su condicin hetertrofas in vitro al paso de su condicin auttrofa in vivo; es decir, su transplante a suelo. En este proceso influye la condicin fisiolgica de las nuevas plantas, las condiciones ambientales del invernadero y el tipo de sustrato que se utilice. Dado que las plntulas de sotol obtenidas in vitro, carecen de adaptaciones morfolgicas que les permitan el traspaso directo a las condiciones de campo, stas deben ser mantenidas por tiempo en invernadero para su aclimatacin. En esta etapa se aclimataron exitosamente plantas sanas de sotol con 10 cm de altura foliar, con races bien formadas y por lo menos con tres hojas verdes. Estas fueron establecidas en macetas de 3 con un sustrato estril comercial (Figura 11).

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Figura 11. Plantas de sotol producidas en el LACUTEV y aclimatadas en invernadero del Campo Experimental Saltillo CIRNE-INIFAP.

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