PRACTICA DE LABORATORIO # 6 BIOTECNOLOGA VEGETAL "ESTABLECIMIENTO DE EMBRIONES VEGETALES" Preparado por: Alina K. Sigarroa Rieche. Docente UFPS.

OBJETIVOS * Continuar desarrollando habilidades en el trabajo de cultivo de tejidos, especialmente en la diseccin y siembra en rea estril. * Desarrollar la regeneracin de plantas va embriognesis: somtica (Etapa 1) y cigtica. MATERIAL A TRAER AL LABORATORIO Kit bsico de laboratorio* Material Vegetal: Semillas de Tomate, Frijol Fresco y Maz Tierno ( Aprox. 15 de cada especie por cada estudiante)

MATERIALES Gasa Estril (6 fragmentos) Hipoclorito de sodio Probetas de 25 ml, 250 ml Alcohol 70 % Frascos de vidrio estriles (3/grupo) Beakers de 250 ml (2/grupo) Frascos de agua destilada estril (12/grupo) Detergente Medios de Cultivo preparados MD- MH- MS- MZ Instrumentos de diseccin (Pinzas, Escalpelos, agujas, etc.(3 juegos estriles) Estereomicroscopio Enlermeyer de 100 ml Bureta Graduada Pipeta de 1 ml Almidn al 1 % KI Tiosulfato de Sodio al 0.1 N cido actico glacial cido sulfrico al 0.5 N MARCO TERICO Estudiar previamente la anatoma de la semilla sexual. DESARROLLO DE LA PRCTICA FASE PREPARATIVA 1. Se valorar el hipoclorito de sodio por titulacin

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2. Separar semillas por especies. Preparar 15/especie/estudiante) 3. Se preparan las soluciones desinfectantes: (c/u en un beakers de 250 ml) a) Solucin Jabonosa b) 50 ml Alcohol 70 % c) 50 ml Hipoclorito de sodio al 3 % 4. Lleve a cabo el proceso de desinfeccin y siembra como se describe a continuacin: PROCESO DE PREDESINFECCION Y DESINFECCION PARA SEMILLAS DE TOMATE Someter las semillas de tomate a la siguiente secuencia de desinfeccin: AREA NO ESTERIL 5 minutos en la solucin jabonosa Enjuagar 3 veces con agua destilada estril 5 minutos en la solucin de alcohol al 70 % PASAR AL AREA ESTERIL Enjuagar 3 veces con agua destilada estril 10 minutos en la solucin de hipoclorito de Sodio al 2 % PASAR AL FLUJO LAMINAR Enjuague 3 veces con agua destilada estril FASE DE ESTABLECIMIENTO Dentro de la cabina de flujo laminar, coloque las semillas (8) en la caja petri estril con papel filtro y efectu con la ayuda de las pinzas la siembra de las mismas en el medio de cultivo (Sembrar cuatro por frasco) a continuacin cierre el frasco. (Seguir instrucciones para la siembra impartidas por el profesor o asistente) Repita el procedimiento con los siguientes frascos de cultivo. Salga de la cabina y rotule (Nombre, Fecha y Descripcin). Ubique en el cuarto de crecimiento con las condiciones adecuadas para el crecimiento y desarrollo del explante. PROCESO DE PREDESINFECCION Y DESINFECCION PARA EMBRIONES DE FRIJOL Y MAZ Someter los embriones de frijol y maz a la siguiente secuencia de desinfeccin: AREA NO ESTERIL 5 minutos en la solucin jabonosa Enjuagar 3 veces con agua destilada estril 3 minutos en la solucin de alcohol al 70 %

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PASAR AL AREA ESTERIL Enjuagar 3 veces con agua destilada estril 3 minutos en la solucin de hipoclorito de Sodio al 2 % con gotas de Tween 80 PASAR AL FLUJO LAMINAR Enjuague 3 veces con agua destilada estril FASE DE ESTABLECIMIENTO Dentro de la cabina de flujo laminar, efectu con la ayuda del estereomicroscopio y los instrumentos de diseccin, sobre la placa estril, la extraccin del embrin e implante, rpidamente, en el medio de cultivo, (Sembrar cuatro explantes por frasco) a continuacin cierre el frasco. (Seguir instrucciones para la siembra impartidas por el profesor o asistente) Repita el procedimiento con el otro frasco de cultivo. Salga de la cabina y rotule (Nombre, Fecha y Descripcin). Ubique en el cuarto de crecimiento con las condiciones adecuadas para el crecimiento y desarrollo del explante.

CUESTIONARIO 1. Seale la composicin del medio de cultivo utilizado. Justifique por qu se usaron las hormonas usadas. 2. A partir de este tipo de explante que tipo de crecimiento o formacin se deber desarrollar? Justifique su respuesta. 3. Por qu considera usted que se escogi como explante el tejido seleccionado? Se puede considerar este procedimiento como embriognsis somtica? Justifique su respuesta en cada caso. 4. Los individuos resultantes sern libres de patgenos? Justifique su respuesta. 5. Los individuos resultantes sern idnticos genticamente entre si. Justifique su respuesta. 6. Los individuos resultantes sern idnticos genticamente al que le dio origen (planta madre). Justifique su respuesta.