CAMBIOS PATOLGICOS PRODUCIDOS POR LA INOCULACIN DE UNA CEPA PATGENA DE Clostridium chauvoei EN COBAYOS (Cavia porcellus)

MARITZA AMPARO CRDENAS FIGUEROA

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Bogot D.C. 2006

CAMBIOS PATOLGICOS PRODUCIDOS POR LA INOCULACIN DE UNA CEPA PATGENA DE Clostridium chauvoei EN COBAYOS (Cavia porcellus)

MARITZA AMPARO CRDENAS FIGUEROA Cdigo: 14961037

Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el ttulo de MDICO VETERINARIO

Director Dr. DIEGO ORTZ ORTEGA. MV Codirector Dr. JORGE HUMBERTO OSSA ARISTIZABAL. MV

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA BOGOT 2006

UNIVERSIDAD DE LA SALLE DIRECTIVOS

RECTOR

Hno. FABIO GALLEGO ARIAS

Vice-Rector Acadmico

Hno. CARLOS GABRIEL GMEZ RESTREPO

Vice- Rector de Promocin y Desarrollo Humano

Hno. EDGAR FIGUEROA ABRAJIM

Vice Rector Administrativo

Dr. MAURICIO FERNNDEZ FERNNDEZ

Decano de la Facultad

Dr. PEDRO PABLO MARTNEZ MNDEZ

Secretaria Acadmica

Dra. MARA TERESA URIBE MALLARINO

Director Clnica Veterinaria

Dr. HUMBERTO VASQUZ ROMERO

APROBACIN

DIRECTOR

____________________________________

Dr. DIEGO ORTZ ORTEGA

CODIRECTOR

_____________________________________

Dr. JORGE HUMBERTO OSSA ARISTIZABAL

JURADO

_____________________________________

Dr. CSAR AUGUSTO DAZ ROJAS

JURADO

_____________________________________

Dra. IOVANNA CASTELLANOS LONDOO

SECRETARIA ACADMICA

____________________________________

Dra. MARA TERESA URIBE MALLARINO

COMPROMISO

Los trabajos de grado no deben contener ideas que sean contrarias a la doctrina de la iglesia catlica en asuntos de dogma y moral.

Ni la universidad, ni el asesor, ni el jurado calificador son responsables de las ideas expuestas por el graduando.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Diego Ortiz Ortega por su apoyo y paciencia incondicional, mil agradecimientos; al Dr. Jorge Humberto Ossa Aristizabal, quien aporto su conocimiento durante el desarrollo de este estudio.

Un agradecimiento muy especial a Csar Daz quien fue mi bastn durante estos aos en la universidad, a la Dra. Iovanna Castellanos le agradezco el valioso tiempo que me dedic durante la realizacin de esta investigacin

A la Universidad de La Salle, Corpoica CEISA y a la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios (VECOL S.A.) por su aporte financiero para la elaboracin de esta investigacin.

A todas las personas que me brindaron su apoyo en las diferentes etapas de la carrera y a todas aquellas personas que directa o indirectamente brindaron su ayuda para la culminacin de este trabajo.

DEDICATORIA

Con todo cario a mi mami Amparo Figueroa por apoyarme en cada uno de los pasos que he dado en la vida para lograr cada una de mis metas.

A mi papi Alfredo Crdenas quien anhelaba estar junto a mi en este momento de mi vida.

TABLA DE CONTENIDO

Pg

GLOSARIO RESUMEN ABSTRACT INTRODUCCIN 1. 1.1. 1.1.1. 1.1.2. 1.1.2.1. 1.1.2.1.1 REVISIN LITERARIA HISTORIA Uso del cobayo (Cavia porcellus) en el laboratorio Sangre Morfologa e ndices de las clulas sanguneas perifricas Eritrocitos 1 3 3 5 7 7 7 9 9 11 11 11 12 12 13 14 16 18 19 21 22
i

1.1.2.1.2. Trombocitos 1.1.2.1.3. Leucocitos 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. 1.2.5.1. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7.
ETIOLOGA

Tamao y estructura Estabilidad a la temperatura y pH Relacin con el oxgeno Caracterizacin del Clostridium Toxinas Exotoxinas EPIDEMIOLOGA RESERVORIO PATOGENIA SIGNOS CLNICOS LESIONES

Pg

1.8. 1.9. 1.10. 1.11. 1.11.1 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.3.1. 2.3.1.1.

NECROPSIA DIAGNSTICO TRATAMIENTO PREVENCIN Y CONTROL Estudios realizados con la produccin de vacunas MATERIALES Y MTODOS POBLACIN DISEO EXPERIMENTAL PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Muestras de sangre Examen cuantitativo

23 24 26 26 27 29 29 30 31 31 33 33 34 34 34 34 35 35 36 37 38 38 40 40 40 42 43 44

2.3.1.1.1. Recuento de eritrocitos 2.3.1.1.2. ndices eritrocitarios 2.3.1.1.3. Volumen corpuscular media (VCM) 2.3.1.1.4. Hemoglobina corpuscular media (HCM) 2.3.1.1.5. Concentracin corpuscular media de hemoglobina (CCMH) 2.3.1.1.6. Recuento diferencial de leucocitos 2.4. 2.5. 2.6. 2.7. 2.8. 3. 3.1. 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4. ANLISIS ESTADSTICO EXAMEN MACROSCPICO Inclusin de parafina, coloracin hematoxilina y eosina EXAMEN MICROSCPICO DESECHO DE MATERIAL RESULTADOS Y CONCLUSIONES Muestra de sangre Hematocrito Hemoglobina Hemoglobina corpuscular media Concentracin media de hemoglobina
ii

Pg

3.1.5. 3.1.6. 3.1.7. 3.1.8. 3.1.9. 3.1.10. 3.1.11. 3.1.12. 3.1.13. 3.1.14. 3.2. 3.3. 3.4. 4. 5. 6.

Eritrocitos Protena plasmtica Protena Srica Creatinin kinasa Leucocitos Neutrfilos Linfocitos Eosinfilos Monocitos Clulas Foa Kurloff TEMPERATURA OBSERVACIN MACROSCPICA DE LESIONES OBSERVACIN MICROSCPICA DE LESIONES CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS

45 46 47 48 49 50 52 54 56 58 59 60 62 68 71 80

iii

INDICE DE TABLAS Pg

Tabla 1. Tabla 2.

Parmetros hematolgicos de cobayos (Cavia porcellus). Muestras tomadas en necropsia de los cobayos (Cavia porcellus). Escala subjetiva del grado de lesin producida por Clostridium chauvoei en cobayos (Cavia porcellus) inoculados experimentalmente. Resultados de Hematologa, promedio de datos grupos A, B, C, D, E, F y G, de cobayos (Cavia porcellus). Resultados estadsticos de la calificacin de lesiones histopatolgicas en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa patgena de Clostridium chauvoei.

8 31

Tabla 3.

39

Tabla 4.

41

Tabla 5.

64

iv

INDICEDE FIGURAS Pg

Figura 1. Enrejado del hematocitmetro. Figura 2. Clostridiosis. Lesiones en cavidad torxica y peritoneal de cobayos (Cavia porcellus). Figura 3. Clostridiosis. 18 horas post inoculacin. Figura 4. Clostridiosis. Bacilos de Clostridium chauvoei en msculo estriado esqueltico de cobayo (Cavia porcellus). Figura 5. Clostridiosis. Msculo estriado esqueltico de cobayo (Cavia porcellus). Infiltracin polimorfonucleares y necrosis de coagulacin. Figura 6. Clostridiosis. A) Presencia de bacilos de Clostridium chauvoei, leucocitos polimorfonucleares y neutrfilos en msculo estriado esqueltico. B) Corte longitudinal de msculo estriado esqueltico animal testigo, el cual no presenta cambios patolgicos aparentes.

33 61

61 65

65

66

INDICE DE GRFICAS Pg Grfica 1. Valor promedio inoculacin. del hematocrito por horas post 40

Grfica 2.

Valor promedio de la hemoglobina por horas post inoculacin. Valor promedio de la hemoglobina corpuscular media por horas post inoculacin. Valor promedio la concentracin media de hemoglobina por horas post inoculacin. Valor promedio de eritrocitos por horas post inoculacin. Valor promedio de protena plasmtica por horas post inoculacin. Valor promedio de protena srica por horas post inoculacin. Valor promedio de creatinin kinasa por horas post inoculacin. Valor promedio de leucocitos por horas post inoculacin. Valor promedio de neutrfilos (valor absoluto) por horas post inoculacin. Valor promedio de neutrfilos (valor relativo) por horas post inoculacin. Valor promedio de linfocitos (valor absoluto) por horas post inoculacin. Valor promedio de linfocitos (valor relativo) por horas post inoculacin. Valor promedio de eosinfilos (valor absoluto) por horas post inoculacin.
vi

42

Grfica 3.

43

Grfica 4.

44

Grfica 5. Grfica 6.

45 46

Grfica 7.

47

Grfica 8.

48

Grfica 9. Grfica 10.

49 50

Grfica 11.

51

Grfica 12.

52

Grfica 13.

53

Grfica 14.

54

Pg Grfica 15. Valor promedio de eosinfilos (valor relativo) por horas post inoculacin. Valor promedio de monocitos (valor absoluto) por horas post inoculacin. Valor promedio de monocitos (valor relativo) por horas post inoculacin. Valor promedio de clulas Foa Kurloff (valor absoluto) por horas post inoculacin. Valor promedio inoculacin. de temperatura por horas post 55

Grfica 16.

56

Grfica 17.

57

Grfica 18.

58

Grfica 19.

59

vii

INDICE DE ANEXOS Pg

Anexo 1.

Resultados de Hematologa, grupo A (3 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). Resultados de Hematologa, grupo B (6 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). Resultados de Hematologa, grupo C (9 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). Resultados de Hematologa, grupo D (12 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). Resultados de Hematologa, grupo E (15 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). Resultados de Hematologa, grupo F (18 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus). Resultados de Hematologa, grupo G (Control), cobayos (Cavia porcellus). Resultados estadsticos de la Temperatura de los cobayos (Cavia porcellus), inoculados con la cepa patgena de Clostridium chauvoei. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

80

Anexo 2.

81

Anexo 3.

82

Anexo 4.

83

Anexo 5.

84

Anexo 6.

85

Anexo 7.

86

Anexo 8.

87

Anexo 9.

88

Anexo 10.

89

viii

Pg

Anexo 11.

Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus). Resultados estadsticos de la calificacin de lesiones histopatolgicas en tejido de Cavia porcellus inoculados con la cepa patgena de Clostridium chauvoei

90

Anexo 12.

91

Anexo 13. Anexo 14.

92 93

Anexo 15.

94

Anexo 16.

95

Anexo 17.

96

Anexo 18.

97

Anexo 19.

98

Anexo 20.

99

Anexo 21.

100

ix

GLOSARIO

AGENTE INFECCIOSO: Organismo capaz de producir una infeccin o enfermedad infecciosa.

ANTICUERPOS: Compuesto proteico producido en el organismo, que pertenece al grupo de las globulinas, se origina por exposicin a un antgeno que se ha introducido en el organismo y que es extrao a l.

BACTERIA: Microorganismo del grupo de los protistas inferiores caracterizado por presentar organizacin celular procaritica. Pueden ser inmviles mviles para lo cual necesitan flagelos.

EDEMA: Aumento anormal de la cantidad de lquido intersticial situado en el interior de los tejidos y en la acumulacin de lquido trasudado en las diversas cavidades serosas del organismo.

ENZOTICO: Peculiar de una localizacin, o presente constantemente en ella.

EPIZOTICO: Que ataca a muchos animales en cualquier regin al tiempo; de amplia difusin y rpida extensin.

INFECCIN: Penetracin y desarrollo en un ser vivo de microbios patgenos, que invaden al organismo por va sangunea vertiendo sus toxinas y causando enfermedad.

INOCULACIN:

Introduccin

de

microorganismos
x

patgenos,

material

infectado, suero u otras sustancias en tejidos de organismos vivos o en medios

de cultivo, introduccin de un productor de enfermedad en un animal sano, para producir una forma suave de la enfermedad, seguida por inmunidad.

TOXINA: Sustancias venenosas de tipo diverso que tienen un efecto activo sobre el organismo animal y que en cantidades moderadas pueden provocar su muerte o la presentacin de cuadros patolgicos mas o menos graves.

TOXOIDE: Toxina que ha perdido sus propiedades deletreas por un tratamiento con calor o con un agente qumico pero que conserva su capacidad para estimular la formacin de anticuerpos (antitoxinas) y para unirse a ellos.

xi

RESUMEN

El Clostridium chauvoei causa Pierna Negra carbn sintomtico, una enfermedad fatal en bovinos y ovinos. Se presenta en forma espordica en reas donde el microorganismo esta presente en el suelo. Los animales presentan toxemia, tumefacciones crepitantes en la musculatura y muerte. Los sntomas son confundidos con edema maligno causado por Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi o Clostridium perfringes. Este estudio describe hallazgos histopatolgicos en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con Clostridium chauvoei. Los cobayos fueron inoculados va intramuscular con 0.5 mililitros de una solucin de cloruro de calcio (CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis infectantes de Clostridium chauvoei; y se sacrificaron cada tres horas. Los tejidos fijados en formaldehdo se procesaron por la tcnica de inclusin en parafina, coloreados con Hematoxilina y Eosina. Los cambios severos se observaron en animales de 18 horas post inoculacin, las lesiones fueron tumefacciones crepitantes en musculatura estriada esqueltica, tejidos color rojo, marrn oscuro, con estras negras; algunas reas aparecieron hmedas, desprendieron exudado oscuro mezclado con gases. Se encontr marcada infiltracin de neutrfilos polimorfonucleares y se observ necrosis de coagulacin. La muerte de los cobayos comienza a presentarse entre las 15 y 18 horas post inoculacin. La tcnica de inclusin en parafina, coloreado con Hematoxilina y Eosina permite ver el agente causal y relacionarlo con lesiones anatomopatolgicas, su uso permite un diagnstico econmico para sta enfermedad.

Palabras clave: Clostridium chauvoei; Pierna Negra; Carbn sintomtico; Histopatologa.

xii

ABSTRACT

Clostridium chauvoei causes Blackleg, a fatal disease of bovine and ovine species. It appears in a sporadic form in areas where the microorganism is present in the soil. The animals present toxemia, crepitant swellings in the muscle and died. The symptoms are confused with malignant edema caused by Clostridium chauvoei, Clostridium septicum, Clostridium novyi o Clostridium perfringes. The present study describes histopathologic findings in Guinea pigs (Cavia porcellus) tissues inoculated with the bacterium Clostridium chauvoei. The Guinea pigs were inoculated intramuscular with 0.05 millilitres of solution of calcium Chloride (CaCl2) to 5% content 100 infecting doses of Clostridium chauvoei followed by sacrifice every three hours. The tissues were fixed in formaldehyde and processed by the paraffin inclusion technique, colored with Eosin and Hematoxylyn. Severe changes were observed in animals after 18 hours post inoculation, the lesions were crepitant swellings in skeletal muscle, coloured spotted tissues from dark red to brown along with black grooves; a dark exudation mixed with gas was also released in some areas. Neutrophilic infiltration was marked. And coagulation necrosis was observed. The death of the Guinea pigs begins to appear between the 15 and 18 hours post inoculation. The paraffin inclusion technique, colored with Eosin and Hematoxylyn allows to see the causal agent and to relate it to anatomopathologycs, injuries, its use allows an economic diagnostic for this one disease.

Keys words: Clostridium chauvoei, black leg, gas gangrene, histopathology.

xiii

INTRODUCCIN

Esta investigacin se realiz con el fin de describir los cambios secunciales hematolgicos, anatomopatolgicos e histopatolgicos producidos por la inoculacin experimental en cobayos (Cavia porcellus) por la cepa de Clostridium chauvoei (ATCC), para determinar que tipo de tejido es el ms afectado y relacionar dichos hallazgos con los valores hematolgicos correspondientes, para clasificar que tipos de tejidos se podran utilizar en otras tcnicas diagnsticas.

En 1865 Feser observ el germen por primera vez en el tejido conjuntivo subcutneo de un bvido enfermo. Lo describi con el nombre Bacillus sarcophysematos. El carbunco sintomtico fue separado por vez primera etiolgicamente por Bollinger (1875) y Feser (1876) del carbunco bacteridiano, constituyendo una enfermedad independiente. Arloing y col. aclararon la etiologa de manera incontrovertible en los aos 1879 1884, desarrollando ya un procedimiento de vacunacin preventiva. Roux (1887) cultiv el bacilo sobre medios nutricios artificiales. Entre el gran nmero de cientficos que estudiaron el germen y la enfermedad hay que mencionar en especial a Foth, Kitasato, Kilt y Zeissler 1 .

El Clostridium chauvoei es una bacteria anaerobia esporulada, que produce una enfermedad fatal en rumiantes y es conocida como carbunco sintomtico o

BEER, Joachim. 1981. Enfermedades infecciosas de los animales domsticos. Tomo II. Enfermedades producidas por bacterias y hongos e intoxicaciones. p. 194.

pierna negra 2 ; es de distribucin mundial, ataca con preferencia a bvidos jvenes menores de 3 aos y bien alimentados 3 .

Se considera que esta enfermedad genera un desequilibrio econmico al ganadero y por consiguiente al pas 4 , debido al costo de los tratamientos que se deben instaurar para su control y finalmente con la prdida de los animales 5 , por esta razn lo que se desea es que el ganadero y las personas que estn directamente relacionadas con bovinos, ovinos y cerdos conozcan los sntomas, los cambios macroscpicos y microscpicos que presentan los animales afectados con esta patologa.

CHANDLER, H.M. HAMILTON, R.C. 1975. Protective antigenicity of protoplasts and sphaeroplasts of a highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General Microbiology. p. 179. 3 BIBERSTEIN, E. 1994. Tratado de microbiologa veterinaria. p. 345. 4 CARABALLO, Luis Carlos. 1973. Identificacin y clasificacin de cepas de Clostridium. p. 46. 5 PORTILLA, Guillermo; FRANCO, Orlando. Carbn sintomtico una enfermedad que mata!. ICA Instituto Colombiano Agropecuario. p. 2.

1. MARCO TERICO

1.1. HISTORIA El Clostridium comienza a estudiarse cuando Koch, le demuestra a los amigos de Davaine, los errores en las experiencias de Jaillard y Leplat, quienes en realidad habran inoculado conejos "con otro virus", arremete contra Signol, asfixiando caballos sanos y recuperando de sus cadveres ese "otro virus", largo, translcido, flexuoso y mvil, era un "vibrin sptico", probablemente el Clostridium septicum o el Clostridium chauvoei 6 . Feser observ en 1865 el germen por primera vez en el tejido conjuntivo subcutneo de un bvido enfermo. Lo describi con el nombre Bacillus sarcophysematos 7 . El carbunco sintomtico fue diferenciado del bacteridiano por Charbert a base de sntomas y lesiones. Bollinger (1875), fue el primero en demostrar que el carbunco bacteridiano y el sintomtico tenan agentes etiolgicos distintos. Est conclusin fue confirmada por Feser en 1876. Arloing, Cornevin y Thomas, en 1887, realizaron aportaciones interesantes sobre el carbunco sintomtico, lo que explica que con frecuencia hayan sido considerados como los descubridores del germen. Aunque han contribuido considerablemente al conocimiento de la enfermedad, su causa e inmunidad, el primero en cultivar el germen en medios artificiales fue Roux, en 1887. Kitasato aport nuevos perfeccionamientos a la tcnica del cultivo de Clostridium chauvoei en 1889 8 .

6 7

BULLOCH, W. 1930. Bacillus anthracis. I: 6 BEER, Joachim. Op. cit., p. 194. 8 MERCHANT, I; PACKER, R. 1980. Bacteriologa y virologa veterinaria. p. 411.

A partir de 1885, empiezan las clases del doctor Claude Vericel. Entre los alumnos que conformaran la primera promocin de egresados con el ttulo de Maestro en veterinaria, se cuenta a Federico Lleras Acosta, quien fue su discpulo preferido y a su lado vio los primeros microbios. Lleras Acosta, se dedic a la prctica de laboratorio aplicado a la clnica y fund el primer laboratorio de diagnstico privado en Bogot 9 . En 1905, aparece en el pas el carbn sintomtico. El doctor Claude Vericel hace el estudio clnico y anatomopatolgico y su discpulo Federico Lleras Acosta asla el agente causal y prepara la primera vacuna contra la enfermedad 10 . El diagnstico bacteriolgico de los Clostridium se estableci teniendo en cuenta: forma de crecimiento y aspecto de las colonias segn Zeissler, reaccin bioqumica sobre azcares, accin proteoltica en la leche, inoculacin en cur y observacin de lesiones diferenciales. Las especies caracterizadas fueron los Clostridium chauvoei, septicum, perfringens, novyi, y haemolyticum 11 . Histricamente, la inoculacin en animales de laboratorio se ha empleado como ayuda diagnstica en muchas enfermedades causadas por Clostridios. La tipificacin de las toxinas que dichas bacterias producen producto de su metabolismo se realiza mediante neutralizacin de los efectos letales de la toxina en cobayos y ratones utilizando antisueros especficos para cada tipo de clostridio. Este mtodo no es aceptado ya en muchos pases por biotica y

GARCA, Henry; PARRA, Luis Guillermo. 2002. Medicina veterinaria y zootecnia en Colombia. Trayectoria durante el siglo XX y perspectivas para el siglo XXI. p. 256. 10 En: www.veterinaria.unal.edu.co/historia_mv.html 11 GARCA, Henry; PARRA, Luis Guillermo. Op. cit., p. 255.

no todos los laboratorios de diagnstico estn equipados o preparados para realizar estas pruebas 12 .

1.1.1. Uso del cobayo (Cavia porcellus) en el laboratorio Los aspectos ms importantes de uso que se le da a este animal en el laboratorio dada su economa, sensibilidad y fcil manejo son: En la preparacin de sueros hiperinmunes. En la preparacin de reactivos para serologa. En el diagnstico de enfermedades (infecciones virales, infecciones bacteriales o por protozoarios). En el control de calidad de productos biolgicos de uso humano y veterinario 13 . Kerrin (1934) comprob que el Clostridium chauvoei en condiciones adecuadas puede producir toxina que, a dosis de 0.025 0.5 ml intravenosa, al ratn le produce sntomas respiratorios y la muerte en unos minutos. La inyeccin subcutnea de la toxina a cobayos y ratones no es mortal, pero produce edema. Es bastante admisible la produccin de exotoxina por este germen, aunque no sea tan potente como la de otras especies del grupo del edema gaseoso, como Clostridium septicum, Clostridium perfringens y Clostridium novyi 14 . Ryff y Lee observaron que el hmster es ms receptivo al Clostridium chauvoei que el cobayo y muere con la quinta parte de la dosis mortal precisada por ste. La inoculacin de cultivos puros a los animales de laboratorio produce la
RASDOSTITS, O; et al. 2002. Medicina Veterinaria, Tratado de las enfermedades del Ganado bovino, ovino, porcino, caprino y equino. Vol I. p. 894. 13 PARRA, Danilo; CORREDOR, Hugo. 1970. Estudio del cur (Cavia cobaya). Contribucin al estudio del cur como animal de laboratorio en Colombia. p. 16. 14 MERCHANT, I; PACKER, R. Op cit., p. 412.
12

muerte con muchos de los sntomas caractersticos del carbunco sintomtico. Los cobayos, conejos, ratones blancos y ratas albinas pueden ser infectados, siendo el cobayo el animal ms susceptible, emplendose corrientemente como animal de experimentacin para este germen 15 . Entre otros estudios encontramos las observaciones halladas por Ernesto Senz, en el cual realiza inoculaciones para hallar diagnsticos sospechosos de carbn sintomtico; por ejemplo, un cur recibe 1 centmetro cbico de cultivo Tarozzi de 24 horas por va intramuscular, y muere en 24 horas. Al realizar la necropsia se observa un extenso edema sero-hemorrgico de pierna y abdomen. Los rganos internos permanecen normales. Los frotis de la superficie de hgado muestran un bacilo corto y delgado, gram positivo, sin esporos. El agente se recupera del hgado y de la sangre del corazn, reproduciendo en la superficie de agar sangre los mismos caracteres culturales de los cultivos primitivos. Despus otros dos curies, con inoculaciones de 0.5 cc IM y de 1 centmetro cbico (la mitad por va IM y la mitad por va intraperitoneal) reaccionan de idntica manera al anterior, recobrndose de su sangre cardaca y del hgado el mismo bacilo 16 . Aparte de la diferenciacin del Clostridium septicum con las reacciones de los azcares, la inoculacin del Clostridium chauvoei en el cobayo no muestra largos filamentos en la superficie del peritoneo o el hgado, que es una prueba diagnstica cuando se inocula con Clostridium septicum 17 . En la superficie del hgado de cobayas que murieron tras el contagio con Clostridium chauvoei, el germen aparece por lo regular aislado y en cadenas cortas 18 .
15

Ibid., p. 413. SENZ, Ernesto. 1944. Consideraciones e identificacin de los principales anaerobios del gnero Clostridium patgenos para los animales domsticos. Tesis, Universidad Nacional de Colombia. p. 66. 17 BAKER, F.J.; BREACH, M.R. 1990. Manual de tcnicas de microbiologa medica. p. 214. 18 BEER, Joachim. Op. cit., p. 195.
16

Aunque en muchos casos la identificacin final de los clostridios patgenos no recae en la inoculacin de animales es, sin embargo, imprescindible para otros tales como el Clostridium botulinum. Se efecta la inoculacin de los cultivos lquidos en los cobayos uno de los cuales se ha protegido con la antitoxina especfica. Se aconseja la adicin de cloruro clcico al cultivo antes de la inyeccin para que acte como agente necrosante, de esta manera se facilita la multiplicacin de los grmenes y la subsiguiente produccin de toxina. Mtodo: inocular por va IM 0.2 ml de un cultivo en caldo glucosado del da anterior en los cobayos, uno protegido por antitoxina. La muerte del no protegido tiene lugar en uno o dos das 19 .

1.1.2. Sangre

1.1.2.1. Morfologa e ndices de las clulas sanguneas perifricas Los valores hematolgicos de cobayos (Cavia porcellus) reportados, se encuentran en la tabla 1.

1.1.2.1.1. Eritrocitos Los eritrocitos del Cavia porcellus, tienen una moderada anisocitosis, con un dimetro entre los 6.6 7.9 m 20 , algunos microcitos, cuando estn presentes pueden tener un dimetro de 3.5 m, los eritrocitos de los cobayos son clulas sanguneas rojas largas, comparadas con otras especies comunes de laboratorio 21 , los eritrocitos policromticos pueden estar alrededor del 25% de
19 20

BAKER, F.J.; BREACH, M.R. Op. cit., p. 214. SCHERMER, S. 1967. The blood morphology of laboratory animals. p. 23 21 JAIN, N.C. 1986. Schalms veterinary hematology. 4 ed. Philadelphia: Lea de Febiger. p. 18.

los eritrocitos circulantes en neonatos, 4.5% en los jvenes, y 1.5% en adultos 22 . Los ndices eritrocitarios en los cobayos (i.e, nmero de eritrocitos, hemoglobina y volumen de clulas empaquetadas. Tabla 1), son relativamente mas bajas comparados con valores observados en otras especies de roedores de laboratorio 23 . Tabla 1. Parmetros hematolgicos de cobayos (Cavia porcellus)
1 RBC (x 106/mm3) Rango PCV (%) Rango Hb (g/dL) Rango MCV (3) Rango MCH (g) Rango MCHC (%) Rango WBC (x 103/mm3) Rango Neutrfilos (%) Rango Linfocitos (%) Rango Eosinfilos (%) Rango Basofilos (%) Rango Monocitos (%) Rango 4,2 - 7,0 37 - 48 11 - 15 7 - 18 28 - 44 39 - 72 1-5 0-3 3 - 12 2 4,5 - 7,0 37 - 48 11 - 15 7 - 18 28 - 44 39 - 72 1-5 0-3 3 - 12 3 3,2 - 8,0 32 - 50 10 - 17,2 71 - 96 23 - 27 26 - 39 5.5 17.5 22 48 39 - 72 07 0 2.7 1 - 10

Harkness, J.E.1995. 2 Johnson Delaney, C.A. 1996. 3 Hillyer, E.V.1996.

22 23

ALBRITTON, A.B. 1958. Standard values in blood. p. 30. MANNING, P.J; WAGNER, J.E; HARNESS, J.E. 1984. Biology and diseases of guinea pigs. p. 54

1.1.2.1.2. Trombocitos Las plaquetas de los cobayos tienen una forma ovalada irregular (2 3 m de longitud), y la periferia del citoplasma es plida en comparacin con la coloracin intensa dentro de la clula Los rangos numricos observados de plaquetas circulantes reportadas en algunas referencias: 120 132 x103 /mm3
24

, 161 368 x103 /mm3 25 , 530 +/- 149 x103 /mm3 26 , 250 850 x103 /mm3 27 ,

250 850 x103 /mm3 28 , y 260 740 x103 /mm3 29 .

1.1.2.1.3. Leucocitos Los neutrfilos de los cobayos tienen aproximadamente de 10 12 m de dimetro, son picnticos, tienen un ncleo segmentado (con un numero de 5 mas segmentos), los grnulos eosinofilicos dentro del citoplasma, pareciendo en algunos casos seudoesinofilia un Drumstick lbulo de cromatina sexual puede estar presente en el ncleo de los neutrfilos de los cobayos hembras, los eosinfilos son mas largos que los neutrfilos (alrededor de 10 15 m en dimetro). Los basfilos son raramente encontrados, son del mismo tamao de losa neutrfilos o ser ms largos, el ncleo tiene una coloracin prpura, y en el citoplasma se encuentran grnulos violetas de diferentes tamaos 30 . Los linfocitos son los leucocitos predominantes (Tabla 1), y los linfocitos pequeos estn presentes en mayor cantidad, tienen forma alargada, no son ms largos
SCHERMER, S. Op. cit., p. 24. MITRUKA, B.J; RAWNSLEY, H.M. 1977. Clinical biochemical and haematological reference values in normal experimental animals and normal humans. p. 33. 26 BENIRSCHKE, K; GARNER, F.M; JONES, T.C. 1978. pathology of laboratory animals. New York: Springer Verlag. N 1. p. 45. 27 HARKNESS, J.E; WAGNER, J.E. Op. cit., p. 89 28 JOHNSON DELANEY C.A. 1996. Exotic companion medicine handbook. Lake Worth, FL: Wingers Publishing. P. 43 29 HILLYER, E.V; QUESENBERRY, K.E; DONNELLY, T.M. 1996. Biology, husbandry, and clinical techniques (of guinea pigs and chinchillas). In: Hillyer E.V., Quesenberry K.E, eds. Ferrets, rabbits, and rodents clinical medicine and surgery. Philadelphia: WB Saunders. p. 58 30 SCHERMER, S. Op. cit., p. 25
25 24

que los eritrocitos. Los linfocitos pequeos de los cobayos son redondos, de ncleo picntico, rodeado por una banda en el citoplasma. Los linfocitos pueden ser dos veces mas largos con menos picnosis, con un ncleo mas ovalado y brillante y una zona extensa del citoplasma que en algunos casos puede contener pequeos y largos grnulos azuroflicos, los monocitos de los cobayos son usualmente mas largos que los linfocitos, tienen un ncleo ovalado con una pequea cantidad de cromatina y tiene un citoplasma azulgrisceo. Ocasionalmente las clulas Foa-Kurloff (KC cells), las cuales son especificas de los cobayos, pueden ser observadas en la circulacin en una proporcin mayor del 3 4% del conteo diferencial de los leucocitos 31 . No hay una diferencia significativa en el nmero de KC en machos y hembras despus de los 2 a 3 meses de edad. Las clulas KC, son leucocitos especializados y contienen un cuerpo de inclusin intracitoplasmtico formado por un mucopolisacrido, este tipo de clulas pueden ser encontradas en sangre perifrica y en la glndula del timo, se encuentran en mayor proporcin en pulmn, bazo y placenta bajo estimulacin estrognica y preez 32 . El origen exacto y funcin de estas clulas es desconocida, sin embargo se especula que pueden tener una funcin de clulas asesinas en la circulacin general o como protector de antgenos fetales en la placenta 33 .

JAIN, N.C. 1986. Op. cit., p. 1110. IZARD, J; BARRELLIER, M.T; QUILLEC, M. 1976. The Kurloff cell its differentiation in the blood and lymphatic system. Cell Tissue Res 173: p 237. 33 MARSHALL, A.H.E; SWETTENHAM, K.V; VERNON ROBERTS, B; REVELL, P.A. 1971. Studies on the function of de Kurloff cell. Int Arch Allergy Appl Immunol. 40: p. 137.
32

31

10

1.2. ETIOLOGA

El Clostridium chauvoei es una bacteria anaerobia en forma de bacilo, mvil gram positivo, agente causal del carbn sintomtico 34 .

1.2.1. Tamao y estructura Esta bacteria es encapsulada (cpsula de cido D poliglutmico), tiene un dimetro de 1 m y de 3 a 6 m de largo, se encuentra en forma de esporas en el suelo, siendo muy resistente. La presentacin de la enfermedad, se produce por la toxina 35 . Necesita medios ricos en cisteina y en vitaminas hidrosolubles. Sus colonias son redondas con contorno liso y en dos das alcanzan un tamao de incluso de 4 m. La hemlisis es variable. A diferencia de Clostridium septicum, fermenta la sacarosa, pero no la salicina y no crece a 44 C 36 .

1.2.2. Estabilidad a la temperatura y pH

Son microorganismos mesfilos su intervalo de crecimiento esta comprendido entre 15 y 45C, aproximadamente, y su temperatura ptima de crecimiento entre 25 y 40C.

KOJIMA, A. et al. 2000. Clonacin y expresin de un gen que codifica la flagelina de Clostridium chauvoei. Veterinary Microbiology. 76, p. 359. 35 DI GENARO, M. et al. Clostridium chauvoei: Inmunological characterization of antigenic preparations. Anaerobe. 5, 1999. p. 301. 36 BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 345.

34

11

El pH del medio afecta al crecimiento microbiano; por tanto, cada organismo tiene un rango de pH que hace posible su crecimiento. Este intervalo, para la mayora de las bacterias, est entre 4 y 9, y el pH ptimo alrededor de 7 37 .

1.2.3. Relacin con el oxgeno Los microorganismos varan en cuanto a sus necesidades o tolerancia al oxgeno libre. Entre los microorganismos que no toleran en absoluto el oxgeno e incluso mueren en su presencia se encuentra el gnero Clostridium. La razn de la anaerobiosis estricta es la carencia, por parte de esos microorganismos, de enzimas como la superxido dismutasa y catalasa, que estn implicadas en la destruccin de los radicales txicos, derivados de la reduccin metablica del oxgeno (radicales superxido, hidrfilo y perxido de hidrogeno) 38 .

1.2.4. Caracterizacin del Clostridium En 1880, Prazmowski agrup las bacterias anaerobias capaces de producir fermentacin y esporular en el gnero Clostridium, Actualmente en el gnero Clostridium se agrupan ms de 100 especies, de las cuales aproximadamente 20 son patgenas y se asocian a infecciones en el hombre y en los animales. El resto de las especies son inocuas, y algunas presentan aplicaciones de inters en la industria. La clasificacin de los microorganismos pertenecientes a este gnero se ha establecido, tradicionalmente, de acuerdo con las caractersticas morfolgicas, culturales y bioqumicas, asociacin a determinadas enfermedades, patogenicidad, toxigenicidad y propiedades serolgicas. En los ltimos tiempos esta clasificacin se basa en las homologas existentes en la secuencia del ADN y
37

38

VADILLO, S; PINZ, S; MATEOS, S. 2002. Manual de microbiologa veterinaria. p. 75. Ibid., p. 76.

12

del ARN ribosmico 16 S. La amplia diversidad en el porcentaje de guanina, citosina (G+C) de las especies del gnero Clostridium sugiere que ste podra dividirse al menos en dos gneros: las especies con un contenido en G+C del 22 al 34 %, en un gnero, y las especies que tienen de un 40 a un 55 %, en otro. Recientemente, el gnero Clostridium ha sido incluido en la seccin XX, del volumen 3 (bacterias grampositivas con bajo contenido en G+C), de la 2 edicin del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, dentro de la familia Clostridiaceae 39 . Estas secuencias tambin pueden servir para: Averiguar condiciones de cultivos de los organismos, Sntesis de oligonucletidos para la identificacin de su crecimiento en lugares donde no estn aislados o para monitorizar su distribucin en la naturaleza, Identificar los orgenes de esos genes, Comprender la diversidad y la filogenia de manera rpida y fcil. La mayora de los Clostridium son saprofitos inocuos, pero algunos tienen carcter patgeno para el hombre y los animales causando patologas muy graves 40 .

1.2.5. Toxinas

Las toxinas son quienes invaden e ingieren el tejido 41 . El Clostridium chauvoei produce cuatro toxinas:
VADILLO, S; PINZ, S; MATEOS, S. Op. cit., p. 467. JOHNSON, J.L; and FRANCIS, B.S. 1974. Taxonomy of the Clostridia: Ribosomal Ribonucleic Acid Homologies among the Species. Journal of General Microbiology. p. 229. 41 GARCIA, Antonio. 2005. MV. Bogot D.C. Comunicacin personal.
40 39

13

 hemolisina necrotoxina desoxirribonucleasa hialorunidasa hemolisina

De estas 4 toxinas la ms letal es la y de ah radica su poder patgeno. Esta bacteria resiste a los desinfectantes tipo amonio cuaternario pero no es resistente a la formalina ni al hipoclorito de sodio, es por eso que la vacuna para "la pierna negra" se inactiva a base de formol 42 . El peso molecular de estas toxinas oscila entre 22 y 600 kDA. Desde el punto de vista mdico es importante la determinacin de la capacidad de producir toxinas de un clostridio aislado de una muestra clnica, as como la caracterizacin de las toxinas producidas. Las pruebas clsicas que ponen de manifiesto e identifican las toxinas son la prueba de letalidad en el ratn y la neutralizacin con sueros especficos. Actualmente, se han desarrollado pruebas inmunoenzimticas (ELISA, ltex, etc.) y genticas (hibridacin ADN/ADN, amplificacin de ADN por PCR) que resultan mas rpidas y eficaces para la identificacin de dichas toxinas 43 .

1.2.5.1 Exotoxinas

Los clostridios invasores producen durante su multiplicacin activa exotoxinas con propiedades necrosantes (histolticas), hemolticas o letales. Adems, enzimas tales como la colagenasa, proteinasa, desoxirribonucleasa y
VEGA, Marco. Carbunco sintomtico. 2000. En: <http//www.portalveterinaria.com/sections.php?op=viewarticle&artid=8>. 43 JOHNSON, J.L; and FRANCIS, B.S. Op cit., p. 243.
42

14

hialuronidasa, elaboradas por microorganismos en crecimiento, causan una acumulacin de productos de degradacin toxica en los tejidos 44 . Las exotoxinas son protenas que se secretan al medio exterior durante el crecimiento del microorganismo o la lisis de la bacteria. En general, las exotoxinas son producidas tanto por bacterias grampositivas como gramnegativas. Por su naturaleza proteica, son muy inmungenas e inducen la formacin de anticuerpos especficos capaces de neutralizar su efecto. La mayora de las exotoxinas son muy sensibles al calor, a las condiciones cidas y a las enzimas proteolticas. En algunas ocasiones, la prdida de su actividad txica por accin del calor, formol, etc; proporciona una protena que mantiene intactas las propiedades antignicas de la toxina, que se denomina toxoide. Este hecho permite la utilizacin del toxoide en la inmunizacin contra las enfermedades cuya sintomatologa se basa en la accin de la exotoxina 45 . La accin producida por las exotoxinas es muy especfica a nivel celular, pudiendo actuar, sin embargo, sobre varios tipos de clulas (citotoxinas), o producir un efecto en un determinado sistema, rgano o tipo celular, como, por ejemplo, el sistema nervioso (neurotoxinas), el tracto gastrointestinal (enterotoxinas), las clulas hepticas (hepatotoxinas), etc. Una clasificacin ms completa resulta difcil, ya que dentro de las exotoxinas se agrupan un conjunto muy heterogneo de protenas con diferente actividad biolgica en las clulas. No obstante, en funcin de su estructura molecular y su mecanismo de accin, se distinguen varios tipos distintos de exoprotenas, entre los que destacan: las toxinas A-B, las toxinas que disgregan la membrana celular, las neurotoxinas y los superantgenos 46 .

DAVIS, Bernard; DULBECCO, Renato; EISEN, Hermar; GINSBERG, Harold. 1984. Tratado de microbiologa. p. 584. 45 VADILLO, S. PINZ, S. MATEOS, S. Op. cit., p. 225. 46 Ibid., p. 225.

44

15

1.3. EPIDEMIOLOGA

El carbn sintomtico es casi siempre mortal, con 1 a 3 das de duracin, infeccioso pero no contagioso; de presentacin enzotica o epizotica 47 , como en zonas de inundacin 48 .

Todava se debate la puerta de entrada por la que penetra la bacteria al organismo. Se supone, sin embargo, que dicha puerta de entrada se encuentra en la mucosa del aparato digestivo despus de la ingestin de alimento contaminado a partir de heces infectadas y de cadveres descompuestos de animales muertos por la enfermedad. Aparece carbunco sintomtico verdadero cuando las esporas que no se alojan en los tejidos proliferan por mecanismos que no han sido todava identificados 49

En el campo aparece esta enfermedad con ms frecuencia en bvidos que crecen con rapidez por estar sometidos a un plan intensivo de nutricin. La mejora del estado nutricional de las ovejas al aumentar la ingestin de protenas en su alimentacin incrementa tambin su susceptibilidad a esta enfermedad. En ovejas no se observa restriccin en cuanto a edad. Se sospecha que los esfuerzos, magulladuras o las indigestiones agudas desencadenan los hechos 50 .

El Clostridium chauvoei habita en el intestino, en el hgado de perros y bvidos aparentemente sanos y en otros tejidos normales de las distintas especies en el animal adulto, tanto sensibles como resistentes. Se encontr Clostridium
47
48

BLAHA, Thomas. 1995. Epidemiologa especial veterinaria. p. 483. VEGA, Marco. Op. cit. 49 Ibid. 50 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. 1985. Patologa de los animales domsticos. Tomo I. p. 223.

16

chauvoei, en el bazo e hgado del 20% de vacunos normales. No se conocen las vas de infeccin; se admite la infeccin endgena y la infeccin adquirida a partir del suelo por ingestin o a travs de heridas. El microorganismo del carbunco sintomtico vive en el suelo donde puede permanecer viable durante muchos aos, siendo este el reservorio del agente causal, pero no se sabe si all se multiplica o slo vive en la forma esporulada y se multiplica en el tubo intestinal de los animales 51

La eliminacin de la bacteria es constante por la va digestiva de animales infectados, que por ser un anaerobio estricto esporula para mantenerse vigente en el medio ambiente, es una infeccin transmitida por el suelo, pudiendo infectar el agua de los bebederos y los pastos 52 . La multiplicacin de las bacterias y la produccin de toxinas, provocan la formacin de lesiones que se caracterizan por edema, hemorragia, y necrosis de las miofibrillas musculares. Tambin puede llegar a la sangre a travs de algunas heridas en la mucosa de los animales y de all diseminarse por va hematgena a distintos tejidos del cuerpo, y causar la muerte rpidamente 53 .

El carbunco sintomtico de los bvidos tiene incidencia estacional y se registra el mayor nmero de casos durante los meses clidos del ao 54 .

En ovejas, la enfermedad depende casi siempre de la infeccin de una herida. En efecto, la infeccin de las heridas cutneas durante el esquileo, castracin o amputacin del rabo o del ombligo al nacimiento puede propiciar la aparicin de lesiones locales. A veces, es causa de brotes graves, la infeccin de la vulva y de la vagina en la oveja durante el parto; la enfermedad puede aparecer en
51 52

VEGA, Marco. Op.cit. WALTER, Wiliam; McBEE, Richard; TEMPLE, Kenneth. 1980. microbiologa. p. 323. 53 VEGA, Marco. Op. cit. 54 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op.cit., p. 223.

Introduccin a la

17

grupos de corderos y carneros jvenes hasta de un ao de edad, casi siempre como consecuencia de infeccin de las heridas cutneas que se producen entre ellos al pelear 55 .

1.4. RESERVORIO Los clostridios patgenos habitualmente estn presentes en suelos ricos en humus y pueden multiplicarse en el suelo en pocas clidas, despus de perodos de lluvias intensas 56 . Las esporas pueden vivir en el suelo por mucho tiempo y se han visto rebrotes de la enfermedad en terrenos donde la tierra fue removida recientemente 57 .

Tambin se localizan en el contenido intestinal de animales sanos y solo causan enfermedad en circunstancias especiales. El carcter ubicuo de estos microorganismos hace que la erradicacin de las enfermedades por clostridios sea prcticamente imposible y necesite un control mediante medidas profilcticas 58 ; en el perro se puede ver Clostridium chauvoei en el hgado, msculos e intestinos de este animal sin causar alteraciones aparentes.

Se han visto casos de Clostridium chauvoei en combinacin Clostridium septicum o Clostridium novyi, pero para que clasifique como pierna negra propiamente dicha debe estar presente nicamente el Clostridium chauvoei; sino clasifica como un caso de edema maligno 59 .

55 56

OCDIZ, J. 1990. Epidemiologa en animales domsticos. Control de enfermedades. p. 107. DAVIES, R; WRAY, C. 1996. Clostridium chauvoei. Journal Veterinary Medicine. 43, p. 119. 57 VEGA, Marco. Op. cit. 58 DAVIES, R; WRAY, C. Op.cit., p. 119. 59 VEGA, Marco. Op. cit.

18

1.5. PATOGENIA Entre los estudios de laboratorio realizados por Antonio Garca en el Zooprofilctico de la ciudad de Bogot y en el Colegio Mayor de Cundinamarca, encontramos que utilizaba cobayos (Cavia porcellus) a los cuales inoculaba con cepas de Clostridium chauvoei para observar los cambios que produca la bacteria en los diferentes rganos del animal. La dosis del inculo variaba entre medio centmetro y un centmetro, debido a la virulencia de la cepa, en estos estudios no se utilizaba ninguna clase de potencializador. En el proceso se les tomaba la temperatura, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria y pulso. Los cobayos moran entre las 10 a las 18 horas post-inoculacin, esto dependa de la susceptibilidad y edad del animal, como tambin de la virulencia de la cepa que se utilizaba 60 .

Esta enfermedad ataca a los rumiantes, aunque se ha reportado casos en cerdos 61 . En los vacunos, la bacteria puede ser endgena y provocar la enfermedad de esta manera, pero en los ovinos la infeccin siempre es exgena y la espora es llevada al organismo por inyeccin o infeccin de una herida previa. La eliminacin de la bacteria es constante por la va digestiva de animales infectados y esta al salir, por ser un anaerobio estricto esporula para mantenerse vigente en el medio ambiente, se queda en la tierra y el suelo pudiendo infectar el agua de los bebederos y los pastos 62 .

Tambin puede llegar a la sangre a travs de algunas heridas predispuestas en la mucosa de los animales por ejemplo en la poca de la denticin de los

60 61

GARCA, Antonio. 2005. MV. Bogot D.C. Comunicacin personal. OCDIZ, J. Op. cit., p. 107. 62 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op. cit., p. 221.

19

terneros y de all diseminarse por va hematgena a distintos tejidos del cuerpo 63 .

Para que se produzca la enfermedad tiene que existir un ambiente propicio para el desarrollo de la bacteria en el organismo, este ambiente propicio que desencadena la enfermedad se da por magulladura del msculo, ejercicio excesivo, indigestin aguda o cualquier proceso que desvitalice al tejido. La bacteria necesita de un medio rico en glucgeno como fuente de su energa, esto con una previa gluclisis anaerbica producida en el msculo. Esto adems tiene que estar acompaado de anaerobiosis y pH alcalino; este ambiente perfecto para el desarrollo de la bacteria determina primariamente la forma vegetativa de este germen donde por actuacin de toxinas que ya se estn produciendo, propician el desarrollo de la enfermedad y sus consecuencias 64 .

Una vez que el ambiente es adecuado para el desarrollo de la bacteria, se comienzan a producir toxinas y enzimas, cada una con un fin especfico, por ejemplo la (beta) que atacan exclusivamente al ADN celular y, las (gamma) que se encargan de separar el intersticio celular. Estas toxinas provocan una reaccin tisular y se desencadena una inflamacin del msculo comprometido, hemorragia y edemas gaseosos que es til para hacer el diagnstico de esta enfermedad, el rea es crepitante, y finalmente ocasiona necrosis del msculo comprometido, adems de presentar fiebre entre 40C por que las toxinas liberadas por las bacterias son inductoras de liberacin de linfoquinas que elevan la temperatura 65 .

63 64

Ibid., p. 222. Ibid., p. 223. 65 VEGA, Marco. Op. cit.

20

Finalmente hay una bacteriemia que se da nicamente en la fase final de la enfermedad y que conlleva a la muerte del animal por intoxicacin sistmica. La muerte se da 1 a 3 das desde que aparecen los signos clnicos.

En ovinos, la espora ingresa conjuntamente con otros Clostridium en heridas abiertas, esto lleva a una necrosis del tejido afectado produciendo el cuadro de gangrena enfisematosa 66 .

En un estudio realizado se encontraron los valores de las concentraciones de enzimas plasmticas (Aldosa, deshidrogenasa lctica (LHD), glutamil oxalactico transaminasa (GOT), glutamil piruvato transaminasa (GPT)) asociadas con el msculo esqueltico incrementadas en el ganado infectado de Clostridium chauvoei y la concentracin de enzimas (LDH y GOT) asociadas al dao cardico tambin aumentadas. Los valores del potasio del ganado que muri aument, pero el valor de sodio fue normal. Los datos indicaron que el volumen sanguneo disminuy en los animales que murieron. En resumen hubo cambios en enzimas plasmticas, valores qumicos de sangre y valores hematolgicos 67 .

1.6. SIGNOS CLNICOS

Normalmente la afeccin comienza sbitamente pudiendo encontrarse algunos animales muertos sin haberse observado signos clnicos, como cuando las lesiones ocurren solamente en el miocardio y el diafragma.

Ibid. PEMBERTON, J. et al. 1974. Changes in clinical values of cattle infected with Clostridium chauvoei: Clinical relationships during infection. Am. J. Vet. Res, Vol 35, N 98. p. 1043.
67

66

21

Es comn la cojera aguda y la depresin notable, inicialmente hay fiebre (hasta 42C) pero cuando los signos clnicos se hacen obvios, la temperatura puede ser normal o subnormal 68 .

Aparecen tumefacciones edematosas y crepitantes caractersticas en la cadera hombro, pecho, lomo, cuello o en otros sitios muy musculares del cuerpo. Inicialmente, la tumefaccin es pequea, caliente y dolorosa. Conforme la enfermedad progresa rpidamente, la tumefaccin crece, hay crepitacin a la palpacin y la piel est seca, agrietada, fra e insensible a medida que el abastecimiento sanguneo local disminuye. Los signos generales incluyen postracin y temblores. La muerte ocurre en 12 a 48 horas si el animal no ha sido tratado; llama la atencin el olor a cido butrico 69 .

En los bvidos se presenta xtasis del rumen y de 100 - 120 pulsaciones minuto. En las ovejas hay una marcha rgida (pierna). No es frecuente el edema subcutneo; la lesin es local, donde la infeccin penetr 70 .

1.7. LESIONES Las lesiones se caracterizan por edema, hemorragia y necrosis de las miofibrillas musculares. La parte central de las lesiones se seca, se oscurece y se convierte en enfisematosa como consecuencia de la fermentacin bacteriana, mientras que su periferia es edematosa y hemorrgica. Los animales afectados presentan inflamaciones crepitantes en la musculatura,

68 69

RASDOSTITS, O. et al. Op. cit., p. 902. Ibid., p. 903. 70 Ibid., p. 903.

22

particularmente en las extremidades, con una extensin rgida caracterstica de los miembros 71 .

Dependiendo del momento de la muerte del animal y de la temperatura ambiental, las tumefacciones pueden estar muy distendidas y con gas. Los msculos afectados aparecen de marrn o rojo obscuro, con rayas negras. Con frecuencia se encuentran lesiones similares en el corazn y ocasionalmente en la lengua. Los tejidos subcutneos de la zona infectada presentan un exudado teido de sangre que contiene grandes depsitos de burbujas de gas 72 .

1.8. NECROPSIA Al realizar las necropsias de los cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa de Clostridium chauvoei por Garca, presentaban exudado desde el miembro posterior hasta la zona pectoral, inflamacin desde el muslo hasta la parte anterior del cuerpo (axila), se observaba una sustancia gelatinosa y solo se hallaba necrosis en el sitio vecino a la inoculacin 73 . En el cadver de un bovino se encuentra al animal con el miembro afectado extendido y rgido, se produce putrefaccin y meteorismo post mortem rpidamente y se puede ver un exudado espumoso que sale del ano y la nariz, los msculos afectados se ven edematosos y con el centro ennegrecido por la destruccin, degeneracin y necrosis del tejido. En las cavidades se encuentra siempre abundante lquido que coagula con facilidad por la gran presencia de fibrina, adems se nota un olor rancio como de cido butrico y se puede notar la produccin de gas en el hgado. Cuando un feto es afectado se puede notar
71 72

GZQUEZ, Antonio. 1991. Patologa veterinaria. p. 358. Ibid., p. 359. 73 GARCIA, Antonio. 2005. MV. Bogot D.C.

23

la distensin del abdomen de la madre posiblemente por la edematizacin del feto, el feto puede o no presentar las lesiones tpicas de la infeccin 74

Microscpicamente, se encuentran cambios degenerativos en las fibras musculares se observan rotas por el edema, enfisema y hemorragia. La infiltracin de leucocitos es poco importante 75 .

1.9. DIAGNSTICO En casos tpicos puede formularse un diagnstico basndose en los signos clnicos y en los hallazgos de necropsia. Es dudoso por no encontrarse lesiones tpicas en ocasiones 76 . En los frotis de tejidos infectados se pueden descubrir bacilos grampositivos, esporulados e identificarlos con reactivos inmunofluorescentes (wellcome) 77 . Cuando se sospecha de muerte por Clostridiosis, se debe confirmar el

diagnstico por medio de muestras de los tejidos mas afectados para histopatologa, esto debe hacerse en la mayor brevedad, para as evitar una contaminacin con otras bacterias que normalmente estn presentes en el animal 78 .

74

RASDOSTITS, O. et al. Op. cit., p. 906. BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 345. 76 OCDIZ, J. Op. cit., p. 108. 77 BIBERSTEIN, E. Op. cit., p. 346. 78 JUBB, K; KENNEDY, P; PALMER. Op. cit., p. 223.
75

24

Diagnstico diferencial: por electrocucin por rayo (causa dolor), carbunco bacteriano (diferencia la lesin esplnica), saturnismo agudo y tetania de la lactacin, este ltimo produce muerte sbita 79 .

Entre los diferentes trabajos realizados con la bacteria Clostridium chauvoei encontramos un estudio donde se examinaron 238 muestras de material patolgico de Clostridium, procedente de animales de diferentes especies y por cada caso se procede a la clasificacin del clostridio responsable, por medio del estudio de sus caracteres morfolgicos, culturales, bioqumicos y biolgicos. El Clostridium chauvoei es el tercero mas frecuente despus del Clostridium perfringes y el Clostridium septicum, se encontraron nicamente en los bvidos, mostrando su mxima incidencia en los terneros, este clostridio fue encontrado nicamente en msculo y mdula sea 80 .

La Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR) detect especficamente secuencias de DNA de Clostridium chauvoei en muestras de msculo y exudado obtenidos de ratones luego de 12 horas post-inoculacin. En pruebas usando muestras de msculo e hgado, el lmite de deteccin fue cerca de 200 organismos por reaccin. Estos resultados sugieren que el sistema de un paso de PCR puede ser til para la deteccin e identificacin directa de Clostridium chauvoei en especmenes clnicos 81 .

79 80

VEGA, Marco. Op. cit. SENZ, Ernesto. Op. cit., p. 2. 81 KOJIMA, A. et al. 2001. Op. cit., 78. p. 363.

25

1.10. TRATAMIENTO

La administracin de penicilina a los animales afectados se considera la teraputica lgica, si el animal no est moribundo, pero los resultados suelen ser mediocres dada la gran extensin de las lesiones. Deben administrarse grandes dosis (10.000 unidades/kg de peso corporal), comenzando con penicilina cristalina por va intravenosa para administrar despus preparados de accin prolongada, algunos de los cuales se administrarn en los mismos tejidos afectados, si estos son accesibles. Es probable que el antisuero del carbunco sintomtico no posea gran valor, a menos que se administren dosis masivas 82 . Otras medidas son separar los animales enfermos y movilizar el resto del lote fuera de los potreros contaminados; enterrar los cadveres 83 .

1.11. PREVENCIN Y CONTROL

En zonas donde la enfermedad es endmica, debe hacerse vacunaciones anuales 84 . Los bvidos se vacunan de 3 a 6 meses de edad y despus cada ao. La vacunacin se debe realizar por lo menos dos semanas antes de que tenga lugar la exposicin. Durante un brote de enfermedad, se vacuna a todos lo bvidos y se les administra penicilina de accin retardada. Cuando se presenta la infeccin, las ovejas preadas se vacunan tres semanas antes del parto. Es posible que los corderos tengan que ser vacunados durante su

VEGA, Marco. Op. cit. QUIROS, Joaqun; LPEZ, Gustavo. 1991. Curso sobre sanidad animal. p. 127. 84 URBINA, Mairo; RODRIGUEZ, Germn. 1978. sistema de vigilancia epidemiolgica de enfermedades transmisibles. ICA. p. 53.
83

82

26

primer ao de vida. Cuando se observan animales enfermos, es aconsejable cambiarles de pastos 85 .

1.11.1. Estudios realizados con la produccin de vacunas El flagelo de Clostridium chauvoei presenta un antgeno protectivo 86 , este

antgeno protector es termolbil, el cual estimula la proteccin de no aglutinacin de anticuerpos 87 . Se ha demostrado previamente que la protena del flagelo de Clostridium chauvoei es importante para el desarrollo de inmunidad protectiva en ratn: flagelos purificados provocan un efecto protectivo, mientras mutantes de la bacteria sin flagelo causan una inmunidad 100 veces menor que la de una cepa madre que s posee flagelo 88 . Una variedad de exmenes de laboratorio diagnstico y pruebas realizados con especimenes de ganado vacunado con bacterinas de Clostridium chauvoei y expuestos luego a inculos del mismo, muestran que si hubo cambios, Barnes 1974, reporta que hubo algunos pequeos cambios en los valores clnicos, una parte de la investigacin fue experimental y se realiz para evaluar la inmunidad eficaz en un experimento severo que contuviera la bacteria de Clostridium chauvoei. El ganado se vacun con seis diferentes potencias que fueron determinadas con cobayos. A este ganado se le consider que tena una resistencia variable a la infeccin con el Clostridium chauvoei, y que presentaba una respuesta similar a la expuesta por los cobayos. Como mayor logro se podra decir que la prueba clnica fue determinada cuando el ganado

85 86

BIBERSTEIN, E. op. cit., p. 347. TAMURA, Y; MINAMOTO, N; TANAKA, S. 1984. Demonstration of protective antigen carried by flagella of Clostridium chauvoei. p. 1325. 87 CHANDLER, H.M. HAMILTON, R.C. 1975. The preparation of inmunogenic cell walls from a highly protective strain of Clostridium chauvoei. Journal of General Microbiology 88. p. 27 88 KOJIMA, A. et al. 2000. Op. cit., 76, p. 359.

27

reacciono a los cambios expuestos y esto se define como interrelaciones y cambios de varios valores clnicos durante la infeccin 89 . Los anticuerpos monoclonales fueron obtenidos del flagelo del Clostridium chauvoei por la fusin de clulas mieloma de roedores y de las clulas del bazo de ratones inmunizados con un flagelo purificado parcial que fueron estudiados y analizados, mostraron que el flagelo de Clostridium chauvoei tiene tres epitopes. Los tres anticuerpos monoclonales flagelares (1 inmunoglobulina G y 2 M) demostraron los efectos pasivos protectores en ratones. Estos resultados sugieren que el flagelo de Clostridium chauvoei es importante para la inmunidad protectora en ratones 90 . Se observ una clara relacin entre la disminucin de inmunogenicidad y la prdida total de la capacidad protectora de clulas en la fase estacionaria tarda 91 . Evidencias sugieren que el flagelo de Clostridium chauvoei es altamente inmunognico, la cepa CH3, puede ser importante para estimular la inmunidad protectiva, fue estudiada preparando una suspensin flagelar pura de un organismo y comparando su antigenicidad protectiva de la suspensin flagelar y las clulas desflageladas. La antigenicidad protectiva de la cepa CH3 no fue de origen flagelar, pero si debido a la termolabilidad, pH sensitivo, y antgenos somticos no aglutinognicos 92 .
PEMBERTON, John. BATES, Fern. et al. 1974. a. Changes in clinical values of cattle infected with Clostridium chauvoei. p. 1037. 90 TANAKA, M. HIRAYAMA, N. TAMURA, Y. 1987. Production, characterization, and protective effect of monoclonal antibodies to Clostridium chauvoei flagella. Infection ans Inmunity. Aug. Vol. 55, N 8. p. 1779 91 MATTAR, M.A. CORTIAS, T.I. STEFANINI, A.M. 2002. Inmunogenic protein variations of Clostridium chauvoei cellular antigens associated with the culture growth phase. Vol. 33. Issue 1, 25 march p. 9. 92 CHANDLER, H.M. and GULASEKHARAM, J. 1974. The protective antigen a highly inmunogenic strain of Clostridium chauovoei including an evaluation of its flagella as a protective antigen. Journal of General Microbiology. 84. p. 128.
89

28

2.

MATERIALES Y MTODOS

2.1.

POBLACIN

Las muestras utilizadas en el presente estudio provienen de tejidos de cobayos (Cavia porcellus), por ser este animal el modelo biolgico mas empleado en el mundo para trabajar con bacterias del gnero Clostridium spp 93 . El criterio de seleccin de los animales fue definido como hembras en una edad promedio de 40 das, en buena condicin corporal, que no present cuadros febriles o alteraciones clnico patolgicas; estos animales provenan del bioterio de la Empresa Colombiana de Productos Veterinarios (VECOL S.A.) Para el estudio se seleccionaron 18 cobayos (Cavia porcellus) los cuales se mantuvieron en observacin durante un mes, en las unidades de aislamiento del Programa de Investigacin en Salud Animal de la Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria Corpoica CEISA de Bogot, para una mejor adaptacin se dispusieron dos jaulas donde se ubicaron 9 animales en cada una de ellas, y as minimizar conductas de estrs o tensin, el ambiente se adecuo para los animales, teniendo en cuenta el control del ruido siendo considerado como un plan de bienestar para los animales 94 asimismo se manejo la luz 95 ya que poda afectar la fisiologa 96 , morfologa 97 , y conducta de

93

RAMIREZ, Sergio. 2002. En: http://www.tdx.cesca.es/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX0613101-121559//mgp4de5.pdf 94 PEKRUL, D. 1991. Handbook of Facilities Planning. Laboratory Animal Facilities. p. 166. 95 BRAINARD; VAUGHAN, and REITER. 1986. Effect of light irradiance and wavelength on the Syrian hamster reproductive system. Endocrinol. 119(2):648. 96 ERKERT, and GROBER. 1986. Direct modulation of activity and body temperature of owl monkeys by low light intensities. Folia Primatol. 47(4):171. 97 NEWBOLD; CHAPIN; ZINN, and TUCKER. 1991. Effects of photoperiod on mammary development and concentration of hormones in serum of pregnant dairy heifers. J. Dairy Sci. 74(1):100.

29

varios animales 98 . Diariamente se le llevaba a cada animal la historia clnica, donde se monitoreaba frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria, peso y temperatura corporal. A la unidad de aislamiento donde se encontraban los animales se le realizaba dos veces al da, manejo de excrementos, limpieza y desinfeccin, adems, los animales se beneficiaban de un fcil acceso a la comida y el agua, la temperatura de la unidad se regulaba con calentadores.

2.2. DISEO EXPERIMENTAL Los 18 cobayos (Cavia porcellus) se distribuyeron al azar en seis grupos de tres animales. Doce de estos animales se inocularon con la cepa de Clostridium chauvoei 4408, suministrada por el laboratorio Vecol S.A. los animales se inocularon va intramuscular con 0.5 mililitros de una solucin de cloruro de calcio (CaCl2) al 5% conteniendo 100 dosis infectantes de Clostridium chauvoei, y los 6 animales restantes se inocularon solamente con CaCl2; En cada grupo haban dos animales inoculados con la cepa de Clostridium chauvoei, y un animal como testigo el cual fue inoculado solamente con CaCl2; Cada tres horas se sacrificaba un grupo de animales. Antes de realizar el sacrificio de cada animal, se les tom una muestra de sangre por el mtodo de puncin de la vena cava anterior con vacutainer 99 . La eutanasia se realiz de acuerdo con los protocolos de biotica vigentes en la legislacin colombiana (LEY 84 de 1989), utilizando anestsicos voltiles para

TUCKER; PETITCLERC, and ZINN. 1984. The influence of photoperiod on body weight gain, body composition, nutrient intake and hormone secretion. J. Anim. Sci. 59(6):1610.
99

98

En: http://www.proclave.com/servet/tomamuestras/agujas.htm 30

evitar el dolor 100 .

Una vez sacrificados los cobayos se realizaban las

necropsias donde se obtenan muestras de diferentes tejidos 101 (ver tabla 2) Tabla 2. Muestras tomadas en necropsia de los cobayos (Cavia porcellus). MUESTRAS Bazo Msculo estriado cardiaco Msculo estriado esqueltico Duodeno Hgado Pncreas Pulmn Rin Cerebro Adrenal

2.3. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

2.3.1. Muestras De Sangre Al realizar la recoleccin de sangre del Cavia porcellus, se tuvo en cuenta el volumen de sangre para el anlisis, la seleccin del vaso sanguneo y el mtodo requerido para que no afecte el bienestar del animal. Siempre se obtuvo sangre por puncin del corazn 102 .
1986. Report of the AVMA panel de euthanasia. JAVMA, vol 188, N 3, February 1, p. 253. ALUJA, Aline; CONSTANTINO, Fernando. 2002. Tcnicas de necropsia en animales domsticos. p. 21. 102 DESJARDINS, C. 1986. Indwelling vascular cannulas for remote blood sampling, infusin, and long-term instrumentation of small laboratory animals. p. 32.
101

100

31

El volumen de sangre de un cobayo adulto es aproximadamente de 69 75 ml/kg de peso corporal 103 , y aproximadamente el 7 al 10% del volumen de sangre (0.5 0.7 ml por cada 100 gr de peso corporal), pueden ser extrados con seguridad, sin provocar anemia 104 . A cada cobayo (Cavia porcellus) se le tom una muestra de sangre obtenida por el mtodo de puncin del corazn con vacutainer, la sangre se recogi en un tubo de EDTA y en un tubo sin anticoagulante. Las muestras se procesaron de inmediato y se les realiz un cuadro hemtico compuesto por 105 : Un examen cuantitativo, que incluye el valor hematocrito, hemoglobina, el recuento total de eritrocitos, el recuento total de leucocitos, el recuento diferencial de leucocitos, el recuento de plaquetas, el volumen corpuscular medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM), la concentracin corpuscular media de hemoglobina (CCMH) y la concentracin plasmtica de protenas totales. Un examen cualitativo de los frotis sanguneos para detectar alteraciones en la morfologa celular 106 . Luego se realiz la qumica sangunea (Creatinin kinasa CK 107 ).

103

HARKNESS, J.E; WAGNER, J.E. 1995. The biology and medicine of rabbits and rodents. p.

68 HILLYER, E.V; QUESENBERRY, K.E; DONNELLY, T.M. 1996. Op. cit., p. 102 BENJAMIN, Maxine M. 1991. Manual de patologa clnica en veterinaria. p. 33. 106 DAVIDSON, Malcom. 2000. Manual patologa clnica en pequeos animales p. 46. 107 Auto-Creatinin kinasa liquicolor. Reaccin de Jaff. Prueba fotomtrica para mediciones cinticas de creatinin kinasa. Germany. Human.
105 104

32

2.3.1.1. Examen Cuantitativo La sangre con anticoagulante se centrifug en tubos capilares (tubos de microhematcrito) durante 5 minutos a (12.500 15.000 rpm). Los eritrocitos se concentraron en el fondo del tubo. Los leucocitos forman una capa gris crema por encima de los eritrocitos. Las plaquetas quedan en la parte alta distinguindose como una capa delgada de color crema, y el plasma aparece por encima de aquellas. El valor de hematocrito se calcul dividiendo la longitud de la capa de eritrocitos entre la longitud total, que esta constituida por la capa de eritrocitos, el buffy coat y el plasma. Un examen superficial del plasma permite detectar la existencia de ictericia, hemlisis y lipemia 108 .

2.3.1.1.1. Recuento de eritrocitos. Los recuentos celulares se realizaron utilizando un hematocitmetro de Neubauer, ver figura 1.

Figura 1. Enrejado del hematocitmetro. Los cuadros marcados con una W se utilizan para estimar el nmero total de leucocitos; los marcados con una R se usan para los recuentos de eritrocitos.

108

DAVIDSON, Malcom. Op. cit., p. 47.

33

2.3.1.1.2. ndices eritrocitarios Se determinaron, la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la concentracin corpuscular media de hemoglobina (CCMH) para evaluar si los animales presentaban anemia 109 .

2.3.1.1.3. Volumen corpuscular medio (VCM) Indic el tamao medio de los glbulos rojos. Las clulas normocticas se determinaron con un VCM normal, las macrocticas tenan un VCM elevado, y las microcticas lo tenan bajo. El VCM se calcul de la siguiente forma Hematocrito % VCM = ------------------------------ x 10 = fentolitros N de eritrocitos ()

2.3.1.1.4. Hemoglobina corpuscular media (HCM)

Indic la cantidad (en

peso) de hemoglobina que haba en un eritrocito medio. Dependi del tamao de los eritrocitos y de su concentracin media de hemoglobina. Una disminucin en la HCM indic deficiencia de hierro. La HCM se calcul de la siguiente manera 110 . Hemoglobina gr/dl HCM = ------------------------------ x 107 = picogramos N de eritrocitos ()

2.3.1.1.5. Concentracin corpuscular media de hemoglobina (CCMH) Indico la concentracin media de hemoglobina que haba en cada eritrocito. La hipocromasia nos indic que la CCMH es baja. Se calcul de la siguiente manera 111
109 110

DAVIDSON, Malcom. Op. cit., p. 47. Ibid., p. 48. 111 Ibid., p. 49.

34

Hemoglobina gr/dl CCMH = ----------------------------- x 100 = % porcentaje Hematocrito %

2.3.1.1.6. Recuento diferencial de leucocitos Se realiz contando 200 leucocitos en un frotis sanguneo.

2.4. ANLISIS ESTADSTICO El anlisis de la informacin recolectada en los hemogramas consisti en categorizar las variables (Hematocrito; recuento total de glbulos rojos, glbulos blancos, recuento absoluto y recuentos relativos entre otros), los cuales se analizaron por medio de listados, frecuencias y tablas estadsticas. Los listados se utilizaron para depurar inicialmente la informacin. Una vez se obtuvo la base de datos depurada se realiz un anlisis de frecuencia en el cual se cont cada categora para una variable especificada y se obtuvieron los resultados absolutos y frecuencias relativas para cada una. Se presenta tambin la suma, promedio y desviacin estndar. Con los resultados obtenidos se realizaron las tablas y los grficos 112 . Las variables cuantitativas se evaluaron con la prueba de Barlett para determinar si las varianzas eran homogneas. Si esto era cierto, se proceda a realizar el anlisis de varianza paramtrico tradicional (prueba f de Fisher); utilizando una prueba de t de Student para comparar promedios adyacentes. En el caso de que no existiera homogeneidad entre las varianzas, se utiliz la

112

DEAN, A.; DEAN, J.; BURTON, A. & DICKER, R. 1992. Epi Info, versin 5. Epidemiologa con microordenadores. p. 243.

35

prueba de Kruskal-Wallis (prueba no paramtrica), comparando en este caso no los promedios, sino las medianas de cada grupo. Posteriormente se utiliz la prueba de Mann-Whitney/Wilcoxon (prueba de Kruskal-Wallis para dos grupos), para determinar la diferencia entre medianas adyacentes 113 . Se le realiz estadstica descriptiva basada en promedio y desviacin estndar a cada una de estas variables hematocrito, hemoglobina, hemoglobina corpuscular media, concentracin media de hemoglobina, eritrocitos, protena plasmtica, protena srica, creatinin kinasa, leucocitos, neutrfilos, linfocitos, eosinfilos, monocitos, clulas Foa Kurloff y de la temperatura de los grupos experimentales (A, B, C, D, E, F, G). Los tiempos de anlisis incluyen, el grupo A animales sacrificados a las 3 horas post inoculacin, el grupo B animales sacrificados a las 6 horas post inoculacin, el grupo C animales sacrificados a las 9 horas post inoculacin, el grupo D animales sacrificados a las 12 horas post inoculacin, el grupo E animales sacrificados a las 15 horas post inoculacin, el grupo F animales sacrificados a las 18 horas post inoculacin, y el grupo G es el grupo de animales control, cada uno de los seis animales que pertenece a este grupo va a hacer parte de los grupos anteriormente descritos.

2.5. EXAMEN MACROSCPICO Primero se revis la historia clnica de cada cobayo, la cual inclua variables como especie, edad, grupo, n de animal, sexo, peso, hora de inoculacin, hora del sacrificio y los sntomas que present antes de morir; se continu con un examen externo (pelaje, uas, ojos, orejas, piel, etc) 114 luego se prosigui con una descripcin concisa, ordenada y precisa de la necropsia describiendo profundamente las lesiones. Se llev una secuencia sobre los diferentes

MARTNEZ, R; MARTNEZ, N. 1997. Diseo de experimentos. Anlisis de datos estndar y no estndar. p. 13. 114 ALUJA, Aline; CONSTANTINO, Fernando. 2002. Tcnicas de necropsia en animales domsticos. p. 23.

113

36

sistemas del cuerpo y se hizo la descripcin en el sitio correspondiente, las necropsias se comenzaron realizando una incisin longitudinal ventromedial desde el extremo anterior de la mandbula hasta el ano, en el siguiente orden (se removi la lengua, laringe, traquea, esfago y vsceras, se desprendi el bazo, se examin el pncreas, se hizo una incisin en el estmago a lo largo de la curvatura menor, se desprendi el hgado, los riones y las glndulas adrenales, por ltimo se realiz la extraccin del sistema nervioso central) 115 . Los tejidos obtenidos en necropsia se fijaron en solucin de formaldehdo (Formaldehyde solucin al 37% (CH2O). SIGMA, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.) tamponado al 3.7% para histopatologa 116 .

2.6. Inclusin de parafina, coloracin hematoxilina y eosina Los tejidos se sometieron al proceso de deshidratacin con alcohol etlico (Alcohol Etlico. SIGMA, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.) en concentraciones crecientes y se aclararon con xilol (Xylenes. C6H4(CH3)2) Fischer Scientific Company, New Jersey, U.S.A.) Posteriormente se incluyeron en parafina a una temperatura de 60C. Los cortes se realizaron en micrtomo de rotacin con un espesor de 4 m. Se montaron en lminas portaobjeto y se desparafinaron se realiz luego el proceso inverso y se colore con hematoxilina (Hematoxylyn (C16H14O6). SIGMA, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.) y eosina 117 (Eosin (C20H6N2O9Br2Na2). SIGMA, Chemical Company, St. Louis, U.S.A.). Este proceso se realiz en el laboratorio del Centro de Investigacin en Salud Animal, Corpoica CEISA, de la ciudad de Bogot.

VILLAFAE, Fdo; PEA Nstor. 1978. Manual de tcnicas del program patologa toxicologa. p. 5. 116 LUNA, L. 1968. Manual of histologic stainig methods of the armed forces institute of pathology. p. 258. 117 BANKS, William J. 1996. Histologa veterinaria aplicada. p. 6.

115

37

2.7. EXAMEN MICROSCPICO Los tejidos coloreados con hematoxilina y eosina se estudiaron en detalle para detectar lesiones que pudieran relacionarse con la presencia de Clostridium chauvoei, para facilitar el anlisis de los hallazgos, se diseo una escala subjetiva del grado de lesin, dependiendo de la severidad de la misma. La escala incluy (ver tabla 3).

2.8.

DESECHO DE MATERIAL

Al terminar el trabajo con los cobayos, se utilizaron bolsas rojas para el desecho de residuos patolgicos, entendindose por esto a todo elemento o material en estado slido, semislido, lquido o gaseoso que presente caractersticas de toxicidad y actividad biolgica que puedan afectar directa o indirectamente a los seres vivos. Estas bolsas se incineraron en el horno crematorio de la Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria Corpoica CEISA; donde se realiz el protocolo vigente de las normas de bioseguridad 118 .

Tabla 3. Escala subjetiva del grado de lesin producida por Clostridium chauvoei en cobayos (Cavia porcellus) inoculados experimentalmente.

118

http://www.icronline.com/sitio/pacientes/seguridad.asp

38

VALOR 0 1 2

CARACTERSTICA DE LA LESIN Sin Cambios Patolgicos Aparentes, No se encontraron cambios patolgicos aparentes, el tejido es normal Lesiones Leves, Lesiones ligeras que incluyen cambios congestivos, hemorrgicos, deplecin linfoidea, edema ligero Lesiones Moderadas, Incluyen cambios congestivos, hemorrgicos, deplecin linfoidea, edema moderado, infiltrados inflamatorios. Lesiones Severas, Incluyen daos tisulares como necrosis de coagulacin, infiltrado inflamatorio polimorfonuclear y mononuclear, zonas de hemorragia y congestin con edema abundante.

3. RESULTADOS Y DISCUSIN

39

3.1. Muestra de sangre Los resultados del hemograma se indican a continuacin, analizando cada variable en forma independiente y finalmente correlacionando los valores.

3.1.1. Hematocrito El hematocrito de los grupos experimentales tuvo un promedio de 43.64% (LC 95% 41,40 45,88) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre las horas (p = 0.20). Valores similares son referenciados por Harkness, 1995; quien reporta para esta especie un valor de (37 48% 119 ). Todos los grupos se encontraron entre los parmetros de referencia.

HEMATOCRITO

60 50 40 30 20 10 0

12

15

HORAS

Grfica 1. Valor promedio del hematocrito por horas post inoculacin.

MOORE, David. 2000. Hematology of the Guinea pig (Cavia porcellus) In: Schalm`s Veterinary hematology. p. 1108.

119

40

1 Co 8 nt ro l

Tabla 4. Resultados de Hematologa, valor promedio por horas 3, 6, 9, 12, 15 y G (grupo control) de cobayos (Cavia porcellus).
n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos L Protena Plasmtica Protena Srica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrfilos B. Relativo Neutrfilos B. Absoluto Neutrfilos S. Relativo Neutrfilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinfilos Relativo Eosinfilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 Promedio Desv. estndar 43,64 4,85 13,94 2,41 25,97 11,32 32,04 4,68 5958611 1722810 5,33 0,62 4,96 0,45 4014,14 1114,36 6985 3775 3,11 4,23 264,83 441,98 51,06 14,49 3798,87 3039,87 41,22 14,61 2667,77 1329,4 1,22 1,22 94,2 158,72 2,94 2,9 222,47 260,82 0,33 0,97 21,58 70,57 Mediana 43,75 14,3 20,73 33,06 6270000 5,25 4,9 4323,52 5425 1 61,5 51 2512 41 2270,5 1 48,75 2 115,45 0 0 EE 1,14 0,57 2,67 1,1 406070 0,15 0,11 262,66 890 1 104,18 3,42 716,5 3,44 313,34 0,29 37,41 0,68 61,47 0,23 16,63 LCI 95% 41,4 12,83 20,74 29,88 5162713 5,05 4,75 3499,33 5241 1,16 60,65 44,36 2394,52 34,47 2053,62 0,66 20,88 1,6 101,98 -0,11 -11,02 LCS 95% 45,88 15,06 31,2 34,2 6754509 5,62 25,75 4528,95 8729 5,06 469,02 57,75 5203,22 47,97 3281,92 1,78 167,52 4,28 342,96 0,78 54,18

P 0,2 0,2 0,31 0,65 0,06 0,8 0,23 0,12 0,15 0,02 0,24 0,32 0,33 0,25 0,02 0,36 0,07 0,1 0,29 0,26

41

3.1.2. Hemoglobina

La hemoglobina de los grupos experimentales tuvo un promedio de 13.94 g/dL (LC 95% 13.83 15.06) de acuerdo a la tabla 4, no se encontraron diferencias significativas entre las horas (p = 0.20). Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Wagner, 1995; quien reporta para esta especie un valor de (11 15g/dL 120 ). Todos los grupos se encontraron entre los parmetros de referencia.

HEMOGLOBINA
20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 17,55 13,95 15 15,4 12,9 12,1 12,87

g/dL

HORAS

Grfica 2. Valor promedio de la hemoglobina por horas post inoculacin.

120

MOORE, David. 2000. Op. cit., citado por Wagner J.E. p. 1110.

42

18 C on tr ol

12

15

3.1.3. Hemoglobina corpuscular media

La hemoglobina corpuscular media de los grupos experimentales tuvo un promedio de 25.97 g (LC 95% 20.74 31.20) De acuerdo a la tabla 4, no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposicin (p = 0.31). Al comparar los resultados con los referenciados por Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (23 27 g
121

), se encuentran entre los

valores normales. Sin embargo al evaluar las horas individualmente se encontr que a las 3, 9 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los lmites inferiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre las horas, clnicamente el descenso de este valor indica deficiencia de hierro en los animales posiblemente estrs post inoculacin.

HEMOGLOBINA CORPUSCULAR MEDIA

PICOGRAMOS
50 40 30 20 10 0

12

15

HORAS

Grfica 3. Valor promedio de la hemoglobina corpuscular media por horas post inoculacin.

121

MOORE, David. 2000. Op. cit., p. 1108.

43

Co 18 nt ro l

3.1.4. Concentracin media de hemoglobina

La concentracin media de hemoglobina de los grupos experimentales tuvo un promedio de 32.04% (LC 95% 29.88 34.20) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposicin (p = 0.65). Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (26 39% los grupos se encontraron entre los parmetros de referencia.
122

). Todos

CONCENTRACIN MEDIA DE HEMOGLOBINA

40 35 30 25 20 15 10 5 0

HORAS

Grfica 4. Valor promedio la concentracin media de hemoglobina por horas post inoculacin.

122

Ibid., p. 1108.

44

C 18 on tr ol

12

15

3.1.5. Eritrocitos Los eritrocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 5`9 x106/mm3 (LC 95% 5`1 6`7) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas (p = 0.06). Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (3`2 8`0 x106/mm3 encontraron entre los parmetros de referencia.
123

). Todos los grupos se

ERITROCITOS

10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0

mm3

12 15

HORAS

Grfica 5. Valor promedio de eritrocitos por horas post inoculacin.

123

MOORE, David. 2000. Op. cit., citado por Quesenberry. p. 1108.

45

C 18 on tr ol

3.1.6. Protena plasmtica

La protena plasmtica de los grupos experimentales tuvo un promedio de 5.33 g/dL (LC 95% 5.05 5.82) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.80). Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Rawnsley, 2004; quien reporta para esta especie un valor de (4.6 6.2 g/dL encontraron entre los parmetros de referencia.
124

). Todos los grupos se

PROTENA PLASMTICA

6 4 2 0

g/dL

12

15

HORAS

Grfica 6. Valor promedio de protena plasmtica por horas post inoculacin.

124

RAWNSLEY H.M. En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf 46

1 Co 8 nt ro l

3.1.7. Protena Srica

La protena srica de los grupos experimentales tuvo un promedio de 4.96 g/dL (LC 95% 4.75 5.17) De acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.23). Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Rawnsley, 2004; quien reporta para esta especie un valor de (4.6 6.2 g/dL entre los parmetro de referencia.
125

). Todos los grupos se encontraron

PROTENA SRICA

5,5 5 4,5 4 3,5

g/dL

HORAS

Grfica 7. Valor promedio de protena srica por horas post inoculacin.

125

Op. cit.., En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf

47

C 18 on tr ol

12

15

3.1.8. Creatinin kinasa

En qumica sangunea, la creatinin kinasa de los grupos experimentales tuvo un promedio de 4014.14 UI/L (LC 95% 3499.33 4528.95) Al observar la tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.12). Comparativamente estos resultados no se encuentran entre los rangos de referencia dados por Kaspareit, 2004; quien reporta (48 340 U/L
126

). El

valor de todas las muestras extradas de CK, presentaron niveles elevados, debido a la inflamacin muscular causada por el trauma de la inoculacin.

CREATININ KINASA

5000 4000 3000 2000 1000 0

UI/L

12

15

18

HORAS

Grfica 8. Valor promedio de creatinin kinasa por horas post inoculacin.

126

KASPAREIT, J. 2004. En: http://cvm.es/analitica/vetscan/rangos.htm

48

Co nt

ro l

3.1.9. Leucocitos Los leucocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 6.9 x103/mm3 (LC 95% 5.2 8.7) Al estudiar la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.15). Comparativamente estos resultados no se encuentra entre los parmetros normales, segn referencia dada por Donnelly, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (5.5 17.5 x103/mm3
127

). Al evaluar los grupos individualmente se encontr que a las 12 y

18 horas se presentaron valores por debajo de los lmites inferiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre las horas; clnicamente el descenso de estos valores indican leucopenia, es decir que uno o la totalidad de los tipos de clulas blancas, puede estar afectado, debido a las fases iniciales de infecciones agudas.

LEUCOCITOS

15000 10000 5000 0

mm3

15

HORAS

Grfica 9. Valor promedio de leucocitos por horas post inoculacin.

127

MOORE, David. Op. cit., p. 1109.

49

C 18 on tr ol

12

3.1.10. Neutrfilos

El valor absoluto de los neutrfilos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 3798.87 (LC 95% 2394.52 5203.22) estudiando la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposicin (p = 0.33). Comparativamente estos resultados se encuentran entre los parmetros normales, segn referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (1210 8400
128

), Al evaluar las horas individualmente

se encontr que a las 3 horas se presenta el valor por encima de los lmites superiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre los grupos, clnicamente el ascenso de estos valores indican que los animales a las 3 primeras horas de inoculacin presentaban neutrofilia, debido al estrs.

NEUTRFILOS (Valor Absoluto)

10000 8000 6000 4000 2000 0

mm3

HORAS

Grfica 10. inoculacin.

Valor promedio de neutrfilos (valor absoluto) por horas post

128

Ibid., p. 1109.

50

C on

tr ol

12

15

18

El valor relativo de los neutrfilos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 51.06% (LC 95% 44.36 57.75) de acuerdo a la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas (p = 0.32).

Comparativamente estos resultados no se encuentran entre los parmetros normales, segn referencia dada por Quesenberry, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (22 48%
129

), Al evaluar los grupos individualmente

se encontr que a las 3, 6, 12, 15 y 18 horas se presentaron valores por encima de los lmites superiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre los grupos, clnicamente el ascenso de estos valores indican proceso bacteriano debido al avance progresivo de la infeccin.

NEUTRFILOS (Valor Relativo)

80 60 40 20 0

12

15

HORAS

Grfica 11. inoculacin.

Valor promedio de neutrfilos (valor relativo) por horas post

129

Ibid., p. 1109.

51

18 C on tr ol

3.1.11. Linfocitos

El valor absoluto de los linfocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 2667.77 (LC 95% 2053.62 3281.92) en la tabla 4 observamos que se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.02). Comparando los resultados que se encontraron, frente a la referencia dada por Johnson, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (2145 12600
130

).

A las 12, 15 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los lmites inferiores, esto indica linfopenia producida por el estrs de los animales.

LINFOCITOS (Valor Absoluto)

6000 4000 2000 0

mm3

b
3 6 9 Co 18 nt ro l 12 15

HORAS

Grfica 12. inoculacin.

Valor promedio de linfocitos (valor absoluto) por horas post

130

Ibid., p. 1109.

52

El valor relativo de los linfocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 41.22% (LC 95% 34.47 47.97) de acuerdo a la tabla 4 no presentaron diferencias significativas entre las horas de exposicin (p = 0.25).
131

Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Johnson, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (39 72% ). Sin

embargo al evaluar los grupos individualmente se encontr que a las 3, 15 y 18 horas se presentaron valores por debajo de los lmites inferiores, a pesar de no existir diferencias significativas entre los grupos, clnicamente el descenso de estos valores indican linfopenia, producida a las 3 primeras horas por estrs de los animales.

LINFOCITOS (Valor Relativo)

60 50 40 30 20 10 0

b
18 C on tr ol

Grfica 13. inoculacin.

Valor promedio de linfocitos (valor relativo) por horas post

3.1.12. Eosinfilos
131

Ibid., p. 1109.

12

HORAS

53

15

El valor absoluto de los eosinfilos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 94.20 (LC 95% 20.88 167.52) al observar la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposicin (p = 0.07). Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Delaney, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (0 1225 Todos los grupos se encontraron entre los parmetros de referencia.
132

).

EOSINFILOS (Valor Absoluto)

500 400 300 200 100 0

mm3

HORAS

Grfica 14. inoculacin.

Valor promedio de eosinfilos (valor absoluto) por horas post

132

Ibid., p. 1109.

54

C 18 on tr ol

12

15

El valor relativo de los eosinfilos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 1.22% (LC 95% 0.66 1.78) en la tabla 4 no se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposicin (p =
133

0.36).

Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Delaney, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (0 7% los grupos se encontraron entre los parmetros de referencia. ). Todos

EOSINFILOS (Valor Relativo)

3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0

12

HORAS

Grfica 15. inoculacin.

Valor promedio de eosinfilos (valor relativo) por horas post

133

Ibid., p. 1109.

55

1 Co 8 nt ro l

15

3.1.13. Monocitos

El valor absoluto de los monocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 222.47 (LC 95% 101.98 342.96) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.10). Comparando los resultados que se encontraron, frente a la referencia dada por Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (55 1750 134 ). A las 18 horas post inoculacin se presentaron valores por debajo de los lmites inferiores.

MONOCITOS (Valor Absoluto)

1000 800 600 400 200 0

mm3

15

HORAS

Grfica 16. inoculacin.

Valor promedio de monocitos (valor absoluto) por horas post

134

Ibid., p. 1109.

56

C 18 on tr ol

12

El valor relativo de los monocitos de los grupos experimentales tuvo un promedio de 2.94% (LC 95% 1.60 4.28) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.10). Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Hillyer, 1996; quien reporta para esta especie un valor de (1 10% entre los parmetros de referencia.
135

). Todos los grupos se encontraron

MONOCITOS (Valor Relativo)

10 8 6 4 2 0

HORAS

Grfica 17. inoculacin.

Valor promedio de monocitos (valor relativo) por horas post

135

Ibid., p. 1109.

57

18 C on tr ol

12

15

3.1.14. Clulas Foa Kurloff

El valor absoluto de las clulas Foa Kurloff (KC cells) de los grupos experimentales tuvo un promedio de 21.58 (LC 95% -11.02 54.18) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.26).

El valor relativo de las clulas Foa Kurloff (KC cells) de los grupos experimentales tuvo un promedio de 0,33% (LC 95%- 0,11 0,78) ver tabla 4. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0,29). Comparativamente estos resultados son normales, segn referencia dada por Jain, 1986; quien reporta para esta especie un valor de (3 4% animales con una edad aproximada hasta de 4 meses.
136

), en

Clulas Foa - Kurloff (Valor Absoluto)

200 150 100 50 0

mm3

12

HORAS

Grfica 18. Valor promedio de clulas Foa Kurloff (valor absoluto) por horas post inoculacin.

136

Ibid., p. 1109.

58

Co 18 nt ro l

15

Correlacionando los valores hematolgicos de los cobayos (Cavia porcellus) inoculados con una cepa de Clostridium chauvoei podemos observar que la mayora de los cambios hematolgicos se hicieron evidentes a partir de las 9 horas post inoculacin, el hematocrito indica un leve aumento de las tres primeras horas a las 12 horas, observndose un descenso de este entre las 15 y 18 horas, igualmente la hemoglobina comienza un ascenso de las 3 a las 12 horas para disminuir de las 15 a las 18 horas, estos cambios encontrados estn entre los parmetros de referencia.

Al evaluar por horas la hemoglobina corpuscular media se encuentra que a las 3, 9 y 18 horas post inoculacin los valores disminuyeron, a causa del estrs que presentaban los animales al ser manipulados.

La concentracin media de hemoglobina, los eritrocitos, la protena plasmtica y la protena srica se mantuvieron estables durante las horas de exposicin a la cepa patgena.

Aunque no se encontraron diferencias significativas en los resultados de creatinin kinasa, se observ que los niveles son elevados obviamente a causa del trauma de la inoculacin.

Los leucocitos presentaron a las 12 y 18 horas un descenso en los valores, esto indica leucopenia, queriendo decir que una clase de clulas blancas esta afectada debido a la fase inicial de una infeccin aguda.

El valor de las clulas Foa Kurloff se encontr bajo en comparacin con lo referenciado por Jain, 1986 quien reporta un parmetro de (3 4%) del conteo diferencial de leucocitos y en el estudio nos dio un promedio de (0.33%), claro que estas clulas son especificas de los cobayos menores de 2 a 3 meses de edad.
59

3.2. TEMPERATURA

La temperatura de los grupos experimentales tuvo un promedio de 35,54C (LC 95% 32,42 38,66) Al evaluar la temperatura de los cobayos en el anexo 8 se encontraron diferencias significativas entre las horas de exposicin (p = 0,0008). Al comparar los resultados con los referenciados por Rawnsley, 2004; quien reporta para esta especie una temperatura de (37.2 39.5C grupos se encontraron fuera de los parmetros de referencia.
137

), los

Al observar los tiempos individualmente vemos que a las 3, 6 y 9 horas post inoculacin los cobayos encontraban entre el rango normal de temperatura, a las 12 horas tuvo un valor superior, debido al proceso bacteriano que presentaron los animales; a las 15 y 18 horas mostraron valores por debajo de los limites inferiores.

TEMPERATURA

50 40 30 20 10 0

HORAS

Grfica 19. Valor promedio de temperatura por horas post inoculacin.

137

RAWNSLEY H.M. Op. cit., En: http://academic.csupomona.edu/research/pdfDocuments/acuHandbook_rev02final.pdf 60

18 C on tr ol

12

15

3.3. OBSERVACIN MACROSCPICA DE LESIONES

Los cobayos presentaron lesiones aparentes a partir de las 6 horas postinoculacin; se observ ligera tumefaccin del rea inoculada, lesin que no se present en los animales testigos. Despus de las 9 horas se acenta la tumefaccin del miembro posterior con crepitacin a la palpacin e hinchazn moderada, que produce en los animales cojera inicial y despus de las 15 horas por la severidad, postracin; uno de los animales inoculados muri entre las 15 y 18 horas con lesiones anteriormente descritas pero ms severas en el msculo afectado y en la regin inguinal.

Los hallazgos de necropsia permitieron observar cambios discretos en las primeras horas, donde se observ ligero edema en la zona de inoculacin; despus de las 6 horas esta lesin comenz a ser mas notoria, con presencia de reas oscuras (rojo negruzco) y de un lquido sanguinolento que paso de ligero a severo despus de las 15 horas y continu hasta las 18 horas postinoculacin, presentndose en estos ltimos casos un aspecto mucoide, que se distribua por todo el miembro y el tejido subcutneo del abdomen en su regin inguinal.

A nivel general se observ congestin ligera desde las 3 horas de inoculacin en rganos como pulmn, cerebro, bazo, hgado y rin, pasando a moderada despus de las 6 horas y severa a partir de las 15 horas, cuando el animal presentaba las lesiones vasculares ms severas. La crepitacin y la presencia de gas fueron notorias a partir de las 12 horas (Figura 2) en todos los animales inoculados.

Las lesiones principales en los animales de 18 horas fueron tumefacciones crepitantes en la musculatura estriada esqueltica, tejidos de color rojo o

marrn oscuro con estras negras; algunas reas aparecan hmedas y

61

desprendan exudado oscuro mezclado con gases que le daban un particular olor dulzn (Figura 2 y 3).

Figura 2. Clostridiosis. Lesiones en cavidad torxica y peritoneal de cobayos (Cavia porcellus) a. Abundante produccin de gases en intestino, cuadro congestivo y hemorrgico, 15 horas post inoculacin.

Figura 3. Clostridiosis. 18 horas post inoculacin. a. Tumefacciones crepitantes en la musculatura estriada esqueltica, tejidos de color rojo o marrn oscuro con estras negras; b. Algunas reas aparecen hmedas y desprenden exudado oscuro mezclado con gases.
62

3.4. OBSERVACIN MICROSCPICA DE LESIONES En la tabla 4, se muestra que las lesiones ms importantes ocurrieron en el msculo estriado esqueltico (MEE), nica variable que result significativa (p = 0,0005) demostrando que si hay diferencia entre los grupos experimentales. En los grupos control se inyect nicamente con cloruro de calcio (CaCl2). Estos animales presentaron un ligero edema, el cual se evidenci por la separacin de las fibras musculares, las lesiones se valoraron entre 0 y 1(Tabla 3); A este grupo se le inyect solamente cloruro de calcio presentando ligero edema, el cual se evidenci por la separacin de las fibras musculares. Los cobayos despus de 3 a 15 horas de la inoculacin con Clostridium chauvoei y luego sacrificados mostraron lesiones leves a moderadas como sigue: A partir de las 3 horas se encontr una ligera necrosis coagulativa, infiltrado de neutrfilos polimorfonucleares y ligero edema; despus de las 6 horas se hizo notoria la separacin de fibras musculares, congestin con hemorragias ligeras y se observa infiltracin polimorfonuclear, se present una variacin moderada; a las 9 y 12 horas se observ necrosis de coagulacin. La necrosis y el infiltrado polimorfonuclear fueron ms severos a las 18 horas, al igual que la presencia de formas bacilares en cantidades abundantes (Figura 4). El grupo que demostr los cambios severos fue el grupo experimental de 18 horas de inoculadas y no fue necesario sacrificar algunos cobayos, sino que murieron por s solos. Las lesiones principales fueron gangrena gaseosa con marcada necrosis de coagulacin y de licuefaccin con olor ftido. Se encontr una marcada infiltracin polimorfonuclear de tipo neutrfilo (Figura 5 y 6).

En rganos como el bazo se observ deplesin linfoide desde las primeras 3 horas de inoculacin en todos los cobayos, al igual que congestin desde las 9 horas sin tener una tendencia especfica, sin embargo en el cobayo que muri repentinamente, fue severa la congestin con hemorragias.
63

Se observaron cambios vasculares como congestin en: pulmn, hgado, msculo estriado, msculo cardiaco y rin (corteza y mdula), desde las 3 horas de inoculacin con Clostridium chauvoei.

En el cobayo que muri entre las 15 y 18 horas post inoculacin, se observ hemorragia muy severa.

Las lminas de tejidos coloreadas con hematoxilina y eosina permiten observar lesiones anatomopatolgicas generales que hacen pensar en una clostridiosis.

64

Tabla 5. Resultados estadsticos de la calificacin de lesiones histopatolgicas en tejidos de cobayos (Cavia porcellus) inoculados con cepa patgena de Clostridium chauvoei.

No.

Hora sacrificio

BAZO

MEC

MEE

DUODENO

HIGADO

PANCREAS

PULMON

RION

CEREBRO

ADRENAL

01/01/2004 01/02/2004 01/03/2004 02/01/2004 02/02/2004 02/03/2004 03/01/2004 03/02/2004 03/03/2004 04/01/2004 04/02/2004 04/03/2004 05/01/2004 05/02/2004 05/03/2004 06/01/2004 06/02/2004 06/03/2004
p

3 3 3 6 6 6 9 9 9 12 12 12 15 15 15 18 18 18

1 1 1 1 0 1 3 1 1 1 0 1 1 1 1 2 2 1
0,059

0 0 0 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 0 2 2 0
0,0945

1ab 1ab 1a 1abc 2abc 1a 2abc 2abc 1a 2bc 3bc 1a 2abc 2abc 0a 3c 3c 1a
0,0005

0 0 0 2 2 0 2 0 1 1 1 1 1 1 1 2 1 0
0,0769

0 0 0 1 1 2 2 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1
0,1876

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 2 1 2 1 1 3 2 3 3 2 3 2 2 2 2 2 1
0,8084

1 0 0 2 1 1 1 1 2 1 3 0 2 1 1 2 1 1
0,4803

1 0 0 2 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 |
0,4038

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0
0,2284

MEC: Msculo estriado cardiaco; MEE: Msculo estriado esqueltico = Grupos control inoculados con Cloruro de Calcio p= nivel de significancia

65

Figura 4. Clostridiosis. a. Bacilos de Clostridium chauvoei en msculo estriado esqueltico de cobayo (Cavia porcellus) despus de 18 horas de inoculacin. H.E. 100X (A) y 400X (B).

Figura 5. Clostridiosis. Msculo estriado esqueltico de cobayo (Cavia porcellus), 18 horas post inoculacin. Se observa infiltracin polimorfonucleares y necrosis de coagulacin. H.E. 100X (A) 400X (B).

66

Figura 6. Clostridiosis. A) Presencia de bacilos de Clostridium chauvoei y leucocitos polimorfonucleares neutrfilos en msculo estriado esqueltico, 18 horas post inoculacin. H.E. 1000X). B) Corte longitudinal de msculo estriado esqueltico de cobayo (Cavia porcellus) testigo, el cual no presenta cambios patolgicos aparentes. H.E. 400X).

Los cambios patolgicos mas importantes se observaron en el msculo estriado esqueltico, y se encontraron alteraciones a partir de 3 horas post inoculacin que incluyen desde ligero edema hasta gangrena gaseosa severa que se produce despus de las 15 horas, por la accin de las toxinas alfa y gamma, necrotizante e hidrolizante respectivamente que destruyen la matriz del tejido conectivo, resultados que concuerdan con lo encontrado por Hateway, 1990 y Titball et al. 2003. esto indica que el msculo estriado esqueltico resulta ser el adecuado para el diagnostico de carbn sintomtico.

67

4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

La temperatura se increment levemente a las 12 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei, a las 15 horas disminuy a 28.8C, para continuar bajando a las 18 horas a 21C, como lo referencia Pemberton, 1974.

La protena srica y plasmtica se encontr entre los valores normales, en el animal que muri no se encontraron diferencias significativas.

No se encontr cambios hematolgicos significativos en los cobayos, tan solo algunos grupos presentaron en las primeras horas post inoculacin una leucopenia, debido a las fases iniciales de infeccin aguda.

La neutrofilia se observ en todos los grupos inoculados con Clostridium chauvoei, su valor nunca retorno al normal, debido a la agudeza de la infeccin.

No se hallaron diferencias significativas en sangre debido a la rapidez con la cual se desarrolla la enfermedad.

La enzima asociada con el dao de msculo esqueltico Creatinin Kinasa, increment su valor por encima de los lmites superiores, debido a la inflamacin muscular causada por el trauma de la inoculacin. La actividad de Gamma glutamil transferasa GGT; Alanina aminotransferasa ALAT - GPT; Aspartato aminotransferasa AST GOT, no se determin ya que los datos fueron insuficientes para dar conclusiones validas.

Los cambios patolgicos mas importantes se observaron en el msculo estriado esqueltico y se encontraron alteraciones leves a partir de las 3 horas post - inoculacin
68

El msculo esqueltico estriado es el nico tejido que presento cambios significativos en esta investigacin, debido a que la bacteria de Clostridium chauvoei afecta especficamente a este tejido.

El tejido muscular estriado esqueltico resulta ser el adecuado para el diagnstico de carbn sintomtico, este resultado concuerda con Assis et al. (2005).

Los cobayos inoculados con Clostridium chauvoei mueren entre las 15 y 18 horas post inoculacin, presentando las lesiones mas severas.

Importante tomar muestras del animal recin muerto, teniendo en cuenta el protocolo de recoleccin de tejidos para histopatologa y as evitar que estos tejidos sean contaminados con otras bacterias que normalmente estn presentes en el animal y no poder hallar un diagnstico certero.

La fijacin del tejido en formaldehdo permiti su uso posterior a la toma de la muestra, sin presentar cambios que alteren el diagnstico.

La utilizacin de tejidos fijados en formol bufferado al 10%, es una buena opcin ya que se pueden enviar muestras desde reas remotas del pas y tambin estas muestras pueden ser almacenadas por el tiempo necesario sin alterar los resultados de la tcnica.

De acuerdo con los resultados obtenidos, la tcnica de hematoxilina y eosina permite observar lesiones anatomopatolgicas generales que nos hacen pensar en una clostridiosis, pero no permiten confirmar el tipo de Clostridium involucrado tal como lo indicaron Ortiz y Benavides (2002)

69

Evitar enterrar animales presuntamente muertos por Clostridiosis, para evitar que las esporas del Clostridium despus salgan al medio ambiente y contamine agua, pienso a otros animales.

Darle a conocer al ganadero la importancia de enviar muestras de los animales muertos para tener un diagnstico real del agente causal de la enfermedad.

Este trabajo es importante como soporte para nuevos estudios en el rea de bacterias anaerobias en Colombia

70

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6. ANEXOS Anexo 1. Resultados de Hematologa, grupo A (3 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).

n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos L Protena Plasmtica Protena Srica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrfilos B. Relativo Neutrfilos B. Absoluto Neutrfilos S. Relativo Neutrfilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinfilos Relativo Eosinfilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

Promedio 40,5 13,95 18,75 34,37 7475000 5,45 5,1 4293,31 12975 1 895 64,5 8791,5 29 3279,75 3 429,5 2,5 384,75 0 0

des. estndar 3,54 1,91 0,94 1,71 1393000 0,35 0,57 880,25 5692 1,41 1265,72 14,85 5598,16 16,97 551,19 1,41 354,26 2,12 417,55 0 0

Mediana 40,5 13,95 18,75 34,37 7475000 5,45 5,1 4293,31 12975 1 895 64,5 8791,5 29 3279,75 3 429,5 2,5 384,75 0 0

EE 2,5 1,35 0,66 1,21 985000 0,25 0,4 622,43 4025 1 895 10,5 3958,5 12 389,75 1 250,5 1,5 295,25 0 0

LCI 95% 35,6 11,3 17,45 31,99 5544400 4,96 4,32 3073,35 5086 -0,96 -859,2 43,92 1032,84 5,48 2515,84 1,04 -61,48 -0,44 -193,94 0 0

LCS 95% 45,4 16,6 20,05 36,74 9405600 5,94 5,88 5513,27 20864 2,96 2649,2 85,08 16550,16 52,52 4043,66 4,96 920,48 5,44 963,44 0 0

80

Anexo 2. Resultados de Hematologa, grupo B (6 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).
n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos L Protena Plasmtica Protena Srica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrfilos B. Relativo Neutrfilos B. Absoluto Neutrfilos S. Relativo Neutrfilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinfilos Relativo Eosinfilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio 45,25 15 25,9 33,23 6075000 5,65 4,65 4727,29 5900 2 110,5 55,5 3330,75 39 2263,5 0,5 33,25 3 162 0 0 des. estndar 5,3 1,13 8,89 1,39 1647559 1,2 0,21 500,41 1061 1,41 62,23 10,61 1214,46 7,07 3,54 0,71 47,02 2,83 135,06 0 0 Mediana 45,25 15 25,9 33,23 6075000 5,65 4,65 4727,29 5900 2 110,5 55,5 3330,75 39 2263,5 0,5 33,25 3 162 0 0 EE 3,75 0,8 6,28 0,99 1165000 0,85 0,15 353,84 750 1 44 7,5 858,75 5 2,5 0,5 33,25 2 95,5 0 0 LCI 95% 37,9 13,43 13,58 31,3 3791600 3,98 4,36 4033,76 4430 0,04 24,26 40,8 1647,6 29,2 2258,6 -0,48 -31,92 -0,92 -25,18 0 0 LCS 95% 52,6 16,57 38,21 35,16 8358400 7,32 4,94 5420,82 7370 3,96 196,74 70,2 2897,61 58,47 2268,4 1,48 98,42 6,92 349,18 0 0

81

Anexo 3. Resultados de Hematologa, grupo C (9 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).
n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos L Protena Plasmtica Protena Srica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrfilos B. Relativo Neutrfilos B. Absoluto Neutrfilos S. Relativo Neutrfilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinfilos Relativo Eosinfilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio 46 15,4 19,29 33,45 8000000 5,55 5,05 4139,05 9750 1 96 33,5 3282 55,5 5398,5 0,5 49,5 8 780 1,50 144 des. estndar 1,41 1,41 2,45 2,05 282843 0,21 0,07 366,84 212,13 1,41 135,76 14,85 1518,87 12,02 1054,3 0,71 70 0 16,97 2,12 203,65 Mediana 46 15,4 19,29 33,45 8000000 5,55 5,05 4139,05 9750 1 96 33,5 3282 55,5 5398,5 0,5 49,5 8 780 1,50 144 EE 1 1 1,73 1,45 200000 0,15 0,05 259,39 150 1 96 10,5 1074 8,5 745,5 0,5 49,5 0 12 144 LCI 95% 44,04 13,44 15,9 30,61 7608000 5,26 4,95 3630,63 9456 -0,96 -92,16 12,92 1176,96 38,84 3937,32 -0,48 -47,52 8 756,48 -138,24 LCS 95% 47,96 17,36 22,69 36,28 8392000 5,84 5,15 4647,46 10044 2,96 284,16 54,08 5387,04 72,16 6859,68 1,48 146,52 8 803,52 426,24

82

Anexo 4. Resultados de Hematologa, grupo D (12 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).
n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos L Protena Plasmtica Protena Srica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrfilos B. Relativo Neutrfilos B. Absoluto Neutrfilos S. Relativo Neutrfilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinfilos Relativo Eosinfilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio des. estndar 50,5 4,95 17,55 0,78 35,89 3,27 34,84 1,88 4920000 664680 5 0,28 4,4 0,14 4003,9 1767,15 3875 742 1 0 38,75 7,42 54,5 4,95 2130,25 596,44 42 4,24 1611,75 147,43 0,5 0,71 22 31,11 0,5 0,71 22 31,11 1,50 2,12 50,25 71,06 Mediana 50,5 17,55 35,89 34,84 4920000 5 4,4 4003,9 3875 1 38,75 54,5 2130,25 42 1611,75 0,5 22 0,5 22 1,50 50,25 EE 3,5 0,55 2,31 1,33 470000 0,2 0,1 1249,57 525 0 5,25 3,5 421,75 3 104,25 0,5 22 0,5 22 1,5 50,25 LCI 95% 43,64 16,47 31,36 32,25 3998800 4,61 4,2 1554,75 2846 1 28,46 47,64 1303,62 36,12 1407,42 -0,48 -21,12 -0,48 -21,12 -1,44 -48,24 LCS 95% 57,36 18,63 40,42 37,44 5841200 5,39 4,6 6453,04 4904 1 49,04 61,36 2956,88 47,88 1816,08 1,48 65,12 1,48 65,12 4,44 148,74

83

Anexo 5. Resultados de Hematologa, grupo E (15 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).
n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos L Protena Plasmtica Protena Srica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrfilos B. Relativo Neutrfilos B. Absoluto Neutrfilos S. Relativo Neutrfilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinfilos Relativo Eosinfilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio des. estndar 42,25 1,06 12,90 4,67 39,67 27,21 30,68 11,82 3725000 1378858 4,70 0,42 4,75 0,21 4473,55 1293,67 7850 3677 8,50 7,78 524,25 298,05 62,00 8,49 5023,00 2945,81 25,00 1,41 1988,50 1030,25 1,00 1,41 52,50 74,25 3,50 0,71 261,75 73,19 0 0 0 0 Mediana 42,25 12,9 39,67 30,68 3725000 4,7 4,75 4473,55 7850 8,5 524,25 62 5023 25 1988,5 1 52,5 3,5 261,75 0 0 EE 0,75 3,30 19,24 8,36 975000 0,30 0,15 914,76 2600 5,50 210,75 6,00 2083 1,00 728,50 1,00 52,50 0,5 51,75 0 0 LCI 95% 40,78 6,43 1,95 14,30 1814000 4,11 4,46 2680,62 2754 -2,28 111,18 50,24 940,32 23,04 560,64 -0,96 -50,40 2,52 160,32 0 0 LCS 95% 43,72 19,37 77,38 47,06 5636000 5,29 5,04 6266,48 15057 19,28 937,32 73,76 9105,68 26,96 3416,36 2,96 155,40 4,48 363,18 0 0

84

Anexo 6. Resultados de Hematologa, grupo F (18 horas post inoculacin con Clostridium chauvoei), cobayos (Cavia porcellus).
n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos L Protena Plasmtica Protena Srica g/dL CK (UI/L) Leucocitos x mm3 Neutrfilos B. Relativo Neutrfilos B. Absoluto Neutrfilos S. Relativo Neutrfilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinfilos Relativo Eosinfilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Promedio des. estndar 46 0 12,10 1,84 16,84 4,98 26,30 4,00 7345000 1081873 5,45 1,34 4,85 0,49 1821,28 87,43 5075 742 10,50 2,12 540,75 185,62 54,00 19,80 2814,00 1405,73 34,50 21,92 1669,50 856,31 1 0 50,75 7,42 0 0 0 0 0 0 0 0 Mediana 46 12,1 16,84 26,30 7345000 5,45 4,85 1821,28 5075 10,5 540,75 54 2814 34,5 1669,5 1 50,75 0 0 0 0 EE 0 1,30 3,52 2,83 765000 0,95 0,35 61,82 525 1,50 131,25 14,00 994 15,50 605,50 0 5,25 0 0 0 0 LCI 95% 46 9,55 9,93 20,77 5845600 3,59 4,16 1700,10 4046 7,56 283,5 26,56 865,76 4,12 482,72 1 40,46 0 0 0 0 LCS 95% 46 14,65 23,75 31,84 8844400 7,31 5,54 1942,45 6104 13,44 798 81,44 4762,24 64,88 2856,28 1 61,04 0 0 0 0

85

Anexo 7. Resultados de Hematologa, grupo G (Control), cobayos (Cavia porcellus).

n Hto % Hb g/dL HCM Picogramos CCMH % Eritrocitos L Protena Plasmtica Protena Srica g/dL CK (UI/L) Leucocitos mm3 Neutrfilos B. Relativo Neutrfilos B. Absoluto Neutrfilos S. Relativo Neutrfilos S. Absoluto Linfocitos Relativo Linfocitos Absoluto Eosinfilos Relativo Eosinfilos Absoluto Monocitos Relativo Monocitos Absoluto KC cells Relativo KC cells Absoluto 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Promedio des. estndar 40,75 5,21 12,87 1,89 25,80 8,75 31,82 4,50 5362500 1492427 5,40 0,55 5,28 0,48 4222,97 853,35 5813 3695 1,33 1,86 59,42 80,04 45,17 14,30 2939,45 3006,67 48,67 13,98 2599,47 1062,86 1,50 1,38 70,10 79,59 3,00 3,10 130,57 92,13 0 0 0 0 Mediana 42,75 13,05 22,11 32,80 5710000 5,35 5,3 4469,86 4750 1 42,5 42 1816,25 51 2601,65 1 47,5 2 115,45 0 0 EE 2,13 0,77 3,57 1,84 609281 0,23 0,20 348,38 1509 0,76 32,67 5,84 1227,47 5,71 433,91 0,56 32,49 1,26 37,61 0 0 LCI 95% 36,58 11,36 18,80 28,22 4168310 4,96 4,90 3540,15 2857 -0,16 -4,62 33,72 533,61 37,48 1749,00 0,40 6,42 0,52 56,85 0 0 LCS 95% 44,92 14,38 32,81 35,43 6556690 5,84 5,67 4905,79 8770 2,82 123,46 56,61 5345,29 59,85 3449,93 2,60 133,78 5,48 204,29 0 0

86

Anexo 8. Resultados estadsticos de la Temperatura de los cobayos (Cavia porcellus), inoculados con la cepa patgena de Clostridium chauvoei.
Temperatura C n Promedio Des. estndar Mediana EE LCI 95% LCS 95% p 18 35,54 6,75 38,2 1,59 32,42 38,66 0,0008 A 2 38 0 38 0 38 38 B 2 38,85 0,35 38,85 0,25 38,36 39,34 C 2 38,45 0,78 38,45 0,55 37,37 39,53 D 2 39,85 0,21 39,85 0,15 39,56 40,14 E 2 28,8 11,03 28,8 7,8 13,51 44,09 F 2 21 1,41 21 1 19,04 22,96 G Control 6 38,3 0,58 38,3 0,24 37,84 38,76

87

Anexo 9. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei MSCULO GRUPO BAZO DUODENO HGADO PNCREAS PULMN ESTRIADO CARDIACO Congestin, rea de Deplesin linfoide Infiltrado mononuclear consolidacin con SCPA SCPA engrosamiento de septos alveolares. Neumona intersticial Infiltrado mononuclear perivascular

DENTIFICACIN

01/01/2004

Infiltrado Deplesin linfoide Infiltrado mononuclear mononuclear periportal, degeneracin centrolobulillar SCPA

Engrosamiento septos alveolares, infiltrado mononuclear, congestin, neumona intersticial. Infiltrado mononuclear perivascular

01/02/2004

Congestin, 01/03/2004 3 G deplesin linfoidea

Infiltrado mononuclear

Congestin, SCPA SCPA engrosamiento septos alveolares SCPA

88

Anexo 10. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei GRUPO MSCULO ESTRIADO ESQUELTICO RIN CEREBRO ADRENAL

IDENTIFICACIN

Necrosis, congestin, infiltrado 01/01/2004 3 A polimorfonuclear, separacin fibras, edema

Congestin cortical y medular

Congestin, edema perivascular

SCPA

Necrosis de coagulacin, infiltrado 01/02/2004 3 A polimorfonuclear, separacin fibras, edema, hemorragia SCPA SCPA SCPA

01/03/2004

Separacin de fibras por edema

SCPA

SCPA

SCPA

89

Anexo 11. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei MSCULO GRUPO BAZO DUODENO HGADO PNCREAS PULMN ESTRIADO CARDIACO Congestin, Infiltrado mononuclear infiltrado mononuclear periportal SCPA Engrosamiento septos alveolares, congestin, hemorragia Congestin, infiltrado mononuclear perivascular

IDENTIFICACIN

Deplesin 02/01/2004 6 B linfoide, congestin

Congestin, 02/02/2004 6 B SCPA Infiltrado eosinfilos infiltrado mononuclear periportal SCPA

Focos, Engrosamiento de septos alveolares

Infiltrado mononuclear perivascular

Congestin, 02/03/2004 6 G deplesin linfoidea ligera SCPA

Focos, Congestin moderada SCPA Engrosamiento de septos alveolares, ligera Congestin moderada

90

Anexo 12. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei

IDENTIFICACIN

GRUPO

MSCULO ESTRIADO ESQUELTICO

RIN

CEREBRO

ADRENAL

Hemorragia, separacin de fibras por 02/01/2004 6 B edema, necrosis de coagulacin, infiltrado polimorfonuclear

Congestin, degeneracin vacuolar tubular

Edema perivascular, infiltrado de mononucleares en meninges, congestin SCPA

Congestin, separacin de fibras por 02/02/2004 6 B edema, necrosis de coagulacin, hemorragia, infiltrado polimorfonuclear, precipitacin de calcio Congestin corticomedular Congestin, edema perivascular SCPA

Separacin de fibras por edema, 02/03/2004 6 G infiltrado polimorfonuclear ligero, precipitacin de calcio

Congestin corticomedular ligera

Congestin ligera

SCPA

91

Anexo 13. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei MSCULO ESTRIADO CARDIACO

IDENTIFICACIN

GRUPO

BAZO

DUODENO

HGADO

PNCREAS

PULMN

03/01/2004

Congestin leve

Infiltrado mononucleares, leve

Engrosamiento septos Congestin moderada SCPA alveolares con infiltracin mononucleares, congestin Infiltrado mononuclear perivascular leve

Engrosamiento septos 03/02/2004 9 C Deplesin linfoidea leve Infiltrado mononuclear Congestin leve SCPA alveolares moderado con infiltrado mononuclear y congestin moderada

Congestin, infiltrado mononuclear perivascular, leve

Congestin, 03/03/2004 9 G deplesin linfoidea ligera

Infiltrado mononuclear ligero

Congestin ligera, infiltrado mononuclear periportal ligero SCPA

Engrosamiento generalizado de septos alveolares con focos de infiltrado mononuclear

Congestin moderada e infiltrado perivascular mononuclear ligero

92

Anexo 14. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei MSCULO ESTRIADO ESQUELTICO

IDENTIFICACIN

GRUPO

RIN

CEREBRO

ADRENAL

Separacin de fibras por edema, 03/01/2004 9 C necrosis coagulativa moderada, hemorragia leve, infiltrado polimorfonuclear moderado Congestin cortical y medular leve Edema perivascular, congestin SCPA

Hemorragia, separacin de fibras por 03/02/2004 9 C edema, necrosis de coagulacin, infiltrado polimorfonuclear, presencia de bacterias bacilares basfilas

Congestin corticomedular, foco de infiltrado mononuclear en mdula

Congestin, edema perivascular ligero

SCPA

Necrosis, congestin, infiltrado 03/03/2004 9 G polimorfonuclear, separacin fibras, edema, ligero

Congestin cortical y medular moderada

SCPA

SCPA

93

Anexo 15. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei MSCULO ESTRIADO CARDIACO

IDENTIFICACIN

GRUPO

BAZO

DUODENO

HGADO

PNCREAS

PULMN

04/01/2004

12

Deplesin linfoidea ligera

Infiltrado mononucleares, leve

Congestin ligera, infiltrado mononuclear periportal ligero SCPA

Congestin, rea de consolidacin con engrosamiento de septos alveolares. Neumona intersticial Congestin leve

Infiltrado 04/02/2004 12 D SCPA mononuclear ligero

Congestin moderada

Focos de consolidacin , SCPA engrosamiento de septos alveolares Congestin ligera

Engrosamiento Deplesin 04/03/2004 12 G linfoidea, congestin Infiltrado mononuclear ligero Congestin leve SCPA generalizado de septos alveolares con focos de infiltrado mononuclear, congestin moderada Congestin leve

94

Anexo 16. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei MSCULO ESTRIADO ESQUELTICO Separacin de fibras por edema, necrosis coagulativa moderada, Congestin cortical y medular leve, infiltrado mononuclear subepitelial en pelvis Congestin ligera SCPA

IDENTIFICACIN

GRUPO

RIN

CEREBRO

ADRENAL

04/01/2004

12

congestin moderada, infiltrado polimorfonuclear severo con presencia de abundantes bacterias y reas de precipitados de calcio

Congestin moderad y hemorragia ligera. Infiltrado polimorfonucleares 04/02/2004 12 D con presencia de bacterias, separacin de fibras y necrosis coagulativa Congestin corticomedular, severa Congestin moderada con edema perivascular ligero SCPA

Necrosis, congestin, infiltrado 04/03/2004 12 G polimorfonuclear, separacin fibras, edema, ligero SCPA Congestin ligera SCPA

95

Anexo 17. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m.

Clostridium chauvoei MSCULO GRUPO BAZO DUODENO HGADO PNCREAS PULMN ESTRIADO CARDIACO Congestin, rea de Congestin ligera consolidacin con Infiltrado mononuclear Congestin moderada SCPA engrosamiento de septos alveolares. Neumona intersticial, moderado Infiltrado Congestin ligera Infiltrado mononuclear ligero periportal mononuclear ligero y Congestin ligera Engrosamiento Infiltrado Infiltrado mononuclear periportal, ligero SCPA generalizado de septos alveolares con focos de infiltrado mononuclear, congestin moderada SCPA SCPA engrosamiento de septos alveolares Congestin ligera infiltrados mononucleares perivasculares ligeros Congestin moderada e infiltrado perivascular mononuclear ligero

IDENTIFICACIN

HORA DE SACRIFICIO

05/01/2004

15

y presencia de hemosiderfagos

05/02/2004

15

y presencia de hemosiderfagos

05/03/2004

15

Deplesin linfoidea

mononuclear en submucosa ligero

96

Anexo 18. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei MSCULO ESTRIADO ESQUELTICO

IDENTIFICACIN

GRUPO

RIN

CEREBRO

ADRENAL

Separacin de fibras por edema, 05/01/2004 15 E necrosis de coagulacin, infiltrado polimorfonuclear, mononucleares

Congestin cortical y medular moderada, infiltrado mononuclear perivascular Edema perivascular ligero, rea gliosis SCPA

Congestin modera, Infiltrado 05/02/2004 15 E polimorfonucleares con presencia de bacterias, separacin de fibras y necrosis coagulativa Congestin corticomedular, ligera

Congestin ligera, edema perivascular ligero

Hemorragia severa

05/03/2004

15

Necrosis coagulacin

Congestin ligera

Congestin ligera

SCPA

97

Anexo 19. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei MSCULO GRUPO BAZO DUODENO HGADO PNCREAS PULMN ESTRIADO CARDIACO

IDENTIFICACIN

Congestin 06/01/2004 18 F moderada, deplesin linfoide severa Infiltrado mononuclear

Infiltrado mononuclear periportal ligero y congestin ligera SCPA

Congestin, rea de consolidacin con engrosamiento de septos alveolares. Edema ligero

Congestin ligera e infiltrado perivascular mononuclear ligero

Congestin moderada, 06/02/2004 18 F deplesin linfoide moderada Infiltrado mononuclear y polimorfonuclear

Congestin, infiltrado mononuclear periportal SCPA

Congestin, rea de consolidacin con engrosamiento de septos alveolares. Edema ligero

Congestin moderada e infiltrado perivascular mononuclear ligero

Deplesin 06/03/2004 18 G linfoidea ligera, congestin ligera

Infiltrado mononuclear en submucosa ligero

Infiltrado mononuclear periportal, congestin ligera SCPA

Engrosamiento generalizado de septos alveolares con focos de infiltrado mononuclear, congestin moderada SCPA

98

Anexo 20. Resultados de histopatologa de los tejidos de cobayos (Cavia porcellus).

Marzo 11 de 2004

Hora inculo: 8:00 a.m. HORA DE SACRIFICIO

Clostridium chauvoei MSCULO ESTRIADO ESQUELTICO

IDENTIFICACIN

GRUPO

RIN

CEREBRO

ADRENAL

Separacin de fibras por edema, 06/01/2004 18 F necrosis de coagulacin, infiltrado polimorfonuclear, mononucleares, bacterias bacilares basfilas, severo

Congestin cortical y medular moderada, degeneracin vacuolar de tbulos ligera Congestin SCPA

Separacin de fibras por edema, 06/02/2004 18 F necrosis de coagulacin, infiltrado polimorfonuclear, mononucleares, bacterias bacilares basfilas, severo Congestin cortical y medular ligera

Congestin ligera, infiltrado mononuclear en meninges SCPA

06/03/2004

18

Ligero infiltrado polimorfonuclear

Congestin corticomedular ligera

Congestin ligera

SCPA

99

Anexo 21. Resultados estadsticos de la calificacin de lesiones histopatolgicas en tejido de Cavia porcellus inoculados con la cepa patgena de Clostridium chauvoei
Tejido Bazo Duodeno Hgado Pncreas Pulmn MEC MEE Rin Cerebro Adrenal Mean 1,11 0,89 1,06 0,00 2,00 0,94 1,61 1,17 0,89 0,11 Std. dev. 0,68 0,76 0,64 0,00 0,69 0,73 0,85 0,79 0,47 0,47 1 0 0 0 0 0 3 2 3 3 2 2 0,81 0,09 0,00 0,48 0,40 0,23 Min 0 0 0 Max 3 2 2 p 0,06 0,08 0,19

P = Nivel de significanca; MEC: Msculo estriado cardiaco; MEE: Msculo estriado esqueltico; = Grupos testigo inoculados con Cloruro de Calcio.

100