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tude de la confrontation des souches pathognes et non pathognes de Fusarium oxysporum dans lacquisition de la rsistance contre la fusariose du palmier huile
Louis-Raymond Gbongu1, Skou Diabat2, Edson Lezin Bomisso1, Emmanuel Dick1, Hubert de Franqueville3, Daouda Kon1.
de Physiologie Vgtale, Unit de Formation et de Recherches (UFR) Biosciences, Universit de Cocody 22 BP 582 Abidjan 22, Cte dIvoire. 2Centre National de Recherch Agronomique (CNRA), Laboratoire central de biotechnologies, 01 BP 1740 Abidjan 01, Cte dIvoire. 3Centre de Coopration Internationale en Recherche Agronomique pour le Dveloppement (CIRAD), TA 80/02, Avenue Agropolis F 34398 Montpellier Cedex 5 France. Auteur correspondant e-mail : raylouis.gbongue@yahoo.fr ; Cel : +225 08 67 83 83 Mot cls: palmier huile, Fusarium oxysporum spp., lutte biologique, confrontation, protection croise. Keywords: oil palm, Fusarium oxysporum spp., biological control, , confrontation, cross-protection.
1Laboratoire
1 SUMMARY Les plants sensibles de palmier huile peuvent tre protgs contre la fusariose grce lantagonisme entre les souches de Fusarium oxysporum sp. saprophytes et lagent pathogne F. oxysporum f.sp. elaeidis (Foe). Cet essai vise dterminer la nature de la relation entre ces souches fongiques dans lacquisition de la prmunition chez les plants sensibles de palmier huile. Des plants de palmier huile gs de 2 mois ont t disposs selon un bloc de Fisher randomis 5 rptitions et inoculs au niveau du systme racinaire avec les inocula des souches de Fusarium oxysporum ; Foe (pathogne) et Fot (non pathogne extrait des tissus dun palmier huile sain). Les principaux paramtres valus taient le mode dinoculation (diffr ou simultan) et la confrontation ou non entre les champignons antagonistes. Ces facteurs ont t estims partir du taux de plants malades et de la cintique de la pathologie. Il ressort de cette tude que le taux de plants fusaris a diminue de moiti seulement dans le cas dune inoculation diffre, que les deux souches antagonistes soient en confrontation ou pas. Cependant, ce rsultat est plus marqu lorsquil y a confrontation. En effet, lapparition de la maladie est retarde de 4 semaines lorsque les deux champignons sont en contact et de 2 semaines lorsquils ne le sont pas. Laction antagoniste entre Fusarium oxysporum f.sp. elaeidis et une souche de Fusarium saprophyte du palmier huile, a assur la protection des plants de palmier au stade prppinire sensible contre la fusariose. Cette protection croise repose, en plus de la comptition entre les champignons, sur linduction des mcanismes de dfense. Abstract Sensitive oil palm seedlings can be protected against wilt disease by the antagonism between saprophytic Fusarium oxysporum sp. strains and F. oxysporum f.sp. elaeidis (Foe) 2171
pathogen. This study focused on determining the nature of the relationship between these fungal strains in the acquisition of natural immunity in the sensitive oil palm seedlings. Oil palm seedlings aged two months were set up in a randomized complete block design with 5 replications and inoculated at the root system with Fusarium oxysporum strains; Foe (pathogen) and Fot (not pathogen extracted from tissues of a healthy oil palm). The main parameters evaluated were the mode of inoculation (simultaneous or deferred), with or without confrontation of strains. These factors were estimated from the rate of diseased plants and the kinetics of the pathology. It appears from this study that the rate of infected seedlings was reduced by half compared to the control, in the case of a deferred inoculation of the strains, in an antagonistic confrontation or not. However, this result is pronounced when there is a confrontation. Indeed, the onset is delayed by 4 weeks when the two fungi are in contact and two weeks when they are not. The antagonistic action between Fusarium oxysporum f.sp. elaeidis and a saprophytic Fusarium oil palm strain, has provided protection against wilt disease for the sensitive palm seedlings at the prenursery stage. This cross-protection depends to the competition between the fungi, in addition to induction of defense mechanisms. 2 INTRODUCTION Les maladies fongiques reprsentent chez le palmier huile les pathologies majeures qui, en cas dpidmie, entranent dimportantes pertes (Diabat, 2008) lies, soit la diminution des rendements la rcolte (Figure 1), soit la mort des plantes (Figure 2). De 1964 1976, en Cte dIvoire, les pertes dues Fusarium oxysporum f.sp. elaeidis (Foe), agent pathogne de la fusariose chez le palmier huile, ont t estimes plus de 20 % pour les seules plantations du centre de recherche agronomique Robert Michaud de Dabou (Durant-Gasselin et, al. 2010). Chez cette culture, part la slection de matriel biologique tolrant qui a permis de rduire considrablement limpact de la fusariose, dautres moyens, dont la lutte biochimique (Diabat et, al. 2010) et linduction de la rsistance partir de souches antagonistes Foe (Taquet et, al. 1985), sont tudis. Dans cette dernire mthode, lapport dune souche saprophyte de Fusarium oxysporum extraite des tissus dun palmier huile non atteint de fusariose (Fot) a rduit considrablement le taux de plantes malades (Diabat et, al. 2012) Des tudes antrieures ont montr que la protection croise procure par deux champignons antagonistes, peut rsulter de deux mcanismes que sont la rsistance systmique induite ou la comptition (Diabat et, al. 1990 ; James, 1991 ; Van Peer et, al. 1991 ; Kaur et, al. 2010). Cette tude vise dterminer si la comptition entre Foe et Fot est ncessaire lacquisition et la persistance de la prmunition des plants de palmier huile contre la fusariose.
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Figure 1 : Palmier huile en production atteint de la Fusariose chronique 3 MATRIELS ET MTHODES 3.1 Matriel fongique : Le matriel fongique tait constitu de deux souches antagonistes de Fusarium oxysporum spp. La souche pathogne F. oxysporum f.sp. elaeidis (Foe), agent de la fusariose du palmier huile, a t isole des tissus dun pied prsentant la maladie. La souche non pathogne Fusarium oxysporum sp. (Fot), a t isole de ceux dun palmier huile indemne de la maladie. 3.2 Matriel vegetal: Les essais ont concern lhybride C1901 (D5D AF x L2T AF) de plants de palmier huile sensibles la fusariose, gs de 2 mois et issus du croisement L4156D x L2256D. 3.3 Mthodes 3.3.1 Production dinoculum : Chaque souche de F. oxysporum a dabord t cultive sur milieu pour moisissure (MM) solide. Des prlvements du myclium g de 7 jours ont t utiliss pour ensemencer 75 ml du milieu Amstrong liquide contenu dans des erlenmeyers. Aprs 5 jours dincubation, 2 ml de cette suspension de conidies ont t mis en culture dans des botes de Roux contenant 100 ml du milieu Amstrong. Au terme de 8 jours dincubation, le contenu des botes de Roux a t broy et dilu. Un comptage sur cellule de Malassez a t ralis pour dterminer la densit des suspensions de conidies. Une quantit de 20 ml de ce broyat contenant en moyenne 2,5 x 106 conidies a constitu linoculum. Par ailleurs, la strilisation du matriel, de la verrerie et des milieux a t ralise lautoclave 120 C sous une pression de 1 bar pendant 30 minutes, chaque tape de la manipulation.
Figure 2 : Palmier huile mort cause de la Fusariose typique 3.3.2 Conditionnement du matriel vgtal : Les plants issus de graines germes ont t repiqus individuellement en pots et placs dans la prppinire de la station de recherche Robert Michaux du CNRA situe Dabou, au Sud-est de la Cte dIvoire. La prppinire et les pots ont t priodiquement dsherbs et arross avec de leau. Le matriel de chaque traitement a t reparti en cinq rptitions de 20 plants par traitement dans un bloc de Fisher randomis. Chaque exprience a t rpte 3 fois. 3.3.3 Mthodes dtude : Deux techniques nous ont permis de mettre en vidence la confrontation ou non de Fot avec Foe dans le cadre de cette lutte croise contre la fusariose. Ce sont le rempotage et la sparation en deux du systme racinaire. 3.3.4 Effet du rempotage sur lacquisition et la persistance de la prmunition contre la fusariose chez le palmier huile. : Dans cette tude, lon a considr dune part les plants ayant subi le rempotage, et dautre part ceux qui nont pas t rempots. La souche Fot a, dans un premier temps, t inocule en arrosant avec 20 ml dinoculum les racines des jeunes plantes de palmier huile. Trois jours aprs, les plants ont t rempots ou non, avant dtre inoculs avec la souche Foe comme prcdemment indiqu. Les plants tmoins auxquels ont t compars les plants traits, ont t arross la date T0 avec leau distille strile, puis la date T0 + 3 jours, arross avec la souche Foe (Tableau 1).
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Tableau 2 : Protocole dvaluation de la confrontation des souches Fot (non pathogne) et Foe (pathogne) de F. oxysporum sur la prmunition dans les modes dinoculation diffre et simultane. T0+3jrs Inoculation Confrontation T0 Sachet 1 Sachet 2 Sachet 1 Sachet 2 indirect Fot Foe Eau Foe diffre direct Fot Foe Eau Foe indirect Fot Foe eau Foe simultane direct Fot + Foe Foe Foe : souche pathogne de F. oxysporum. Fot : souche non pathogne de F. oxysporum Pour valuer leffet de la confrontation des souches fongiques Fot (saprophyte du palmier huile) et Foe (agent pathogne de la fusariose chez le palmier huile) lors dune inoculation diffre sur linduction de la protection de cette plante face la fusariose, le protocole suivant a t adopt. Au temps T0, le premier lot a t inocul avec Fot au niveau du sachet 1. Il a ensuite reu linoculum de Foe au temps T0 + 3j dans le sachet 2. Ce traitement correspond linoculation diffre sans confrontation des souches fongiques en prsence (S-C-). Les plants tmoins de ce traitement ont t inoculs par arrosage avec 20 ml deau distille strile T0 dans le sachet 1 et avec la souche Foe T0 + 3j dans le sachet 2. Le deuxime lot caractrisant leffet de la confrontation de la souche non pathogne avec la souche pathogne lors dune inoculation diffre (SC+) a t valu en inoculant le Fot dans le sachet 1 trois jours avant le Foe dans le mme sachet. Pour le tmoin, les plants ont subi le mme procd mais avec de leau la place du Fot. Dans la seconde partie du test, le traitement a t ralis en mettant en vidence la confrontation des
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TPM = Taux de Plants Malades ; NPM = Nombre de Plants Malades ; NTP : Nombre Total de Plants.
Figure 3: Brunissement interne du pseudobulbe dun plant de palmier huile atteint de fusariose volution de la maladie: Lvolution de la maladie a t value en dterminant chaque 2 semaine le nombre de plants prsentant les symptmes externes de la fusariose que sont : le jaunissement et la perforation de feuilles, ainsi que le rabougrissement du plant (Diabat, 2008) pour les modes dinoculation diffre et simultane. 3.4.2 Risolement des champignons: Un explant de fibre a t prlev dans la partie brunie du pseudobulbe des plants prsentant les symptmes de la fusariose et mis en culture sur le milieu pour moisissure (MM) pendant 7 jours. Des observations microscopiques de conidies colores au carmino-vert ont permis didentifier lagent pathogne. Analyse statistique : Les analyses 3.5 statistiques des donnes ont t effectues avec le
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RSULTATS
4.1 Effet du rempotage sur lexpression de la fusariose: Dans cette tude, leffet du rempotage sur lexpression de la fusariose chez des plants non prmunis par la souche non pathogne Fot a t ralis. Ainsi, des plants de palmier huile gs de 2 mois et rempots avant dtre inoculs 3 jours plus tard par la souche pathogne Foe, ont t compars sur la base du taux dinfection, ceux ayant reu
Tableau 3 : Effet du rempotage chez les plants de palmier huile atteints de fusariose Traitements Valeurs transformes du taux de plants infects Inoculation de Foe sans rempotage Rempotage puis inoculation de Foe 1,880,66a 3,190,37b
Foe: souche pathogne de F. oxysporum Fot: souche non pathogne de F. oxysporum Les moyennes affectes dune mme lettre ne sont pas significativement diffrentes au seuil de 5 % selon le test de Newman-keuls 4.2 Effet du rempotage sur lacquisition de la premonition: Ltude de leffet du rempotage sur lacquisition de la prmunition, aprs lanalyse de variance (Tableau 4) a rvl une diffrence significative entre les diffrents traitements et le tmoin (F (1 ; 16) = 88,14 ; p = 0). Les donnes obtenues de plants infects pour les essais ont t significativement basses (0,22) chez les non rempots par rapport aux rempots (0,74). Cette dernire valeur a t statistiquement gale celle des plants tmoins (0,77).
Tableau 4 : Effet du rempotage sur lexpression de la prmunition contre la fusariose chez les plants de palmier huile Traitements Valeurs transformes du taux de plants infects Fot rempotage puis Foe 0,740,14a rempotage puis Foe (tmoin) 0,770,11a Fot sans rempotage puis Foe 0,220.13b Foe : souche pathogne de F. oxysporum Fot : souche non pathogne de F. oxysporum Les moyennes affectes dune mme lettre ne sont pas significativement diffrentes au seuil de 5 % selon le test de Newman 4.3 Impact de la confrontation des souches
diffre avec confrontation (C+S-) des souches Fot et Foe sont prsents sur la figure 4. Une valeur transforme du taux des plants infects gale 0,20 a t enregistre pour ce traitement (C+S-). Celle-ci a t significativement infrieure (F (1 ; 8) = 13,97 ; p
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Figure 4 : Effet de linoculation diffre avec confrontation de Fot et Foe sur la prmunition contre la fusariose des plants de palmier huile Traitement C+ S- : inoculation diffre de Fot et Foe avec confrontation Foe : souche pathogne de F. oxysporum, Fot : souche non pathogne de F. oxysporum. Les moyennes affectes dune mme lettre ne sont pas significativement diffrentes au seuil de 5 % selon le test de Newman-keuls.
Figure 5 : Effet de linoculation diffre sans confrontation de Fot et Foe sur la prmunition contre la fusariose des plants de palmier huile
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Traitement C- S- : inoculation diffre de Fot et Foe sans confrontation Foe : souche pathogne de F. oxysporum, Fot : souche non pathogne de F. oxysporum.Les moyennes affectes dune mme lettre sur les histogrammes ne sont pas significativement diffrentes au seuil de 5 % selon le test de Newman-keuls.
Figure 6 : Cintique de linfection des plants de palmier huile dans le cas dune inoculation diffre avec confrontation de Fot et Foe Traitement C+ S- : inoculation diffre de Fot et Foe avec confrontation Foe : souche pathogne de F. oxysporum, Fot : souche non pathogne de F. oxysporum
Figure 7 : Cintique de linfection des plants de palmier huile dans le cas dune inoculation diffre sans confrontation de Fot et Foe Traitement C- S- : inoculation diffre de Fot et Foe sans confrontation Foe : souche pathogne de F. oxysporum, Fot : souche non pathogne de F. oxysporum 4.3.2 Cas dune inoculation simultane: Les donnes de linoculation simultane sans confrontation (C-S+) des souches fongiques en prsence (Figure 8), rvlent que pour les plants traits, la valeur transforme du taux dinfection a t de 0,31 contre 0,42 pour les tmoins. Ces deux valeurs nont pas t significativement diffrentes (F
(1 ; 8)
= 1,12 ; p = 0,32). Lvaluation de la rsistance contre la fusariose lors de linoculation simultane avec confrontation (C+S+) des champignons (Figure 9) a prsent des valeurs statistiquement gales pour les plants traits et tmoins (F (1 ; 8) = 0,79 ; p = 0,40).
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Figure 8 : Effet de linoculation simultane sans confrontation de Fot et Foe sur la prmunition contre la fusariose des plants de palmier huile Traitement : C- S+ : inoculation simultane de Fot et Foe sans confrontation Foe : souche pathogne de F. oxysporum , Fot : souche non pathogne de F. oxysporum . Les moyennes affectes dune mme lettre sur les histogrammes ne sont pas significativement diffrentes au seuil de 5 % selon le test de Newman-keuls.
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Figure 10 : volution de la fusariose chez les plants de palmier huile dans le cas dune inoculation simultane sans confrontation de Fot et Foe. Traitement C- S+ : inoculation simultane de Fot et Foe sans confrontation. Foe : souche pathogne de F. oxysporum, Fot : souche non pathogne de F. oxysporum
Figure 11 : volution de la fusariose chez les plants de palmier huile dans le cas dune inoculation simultane avec confrontation de Fot et Foe Traitement C+ S+ : inoculation simultane de Fot et Foe avec confrontation Foe : souche pathogne de F. oxysporum, Fot : souche non pathogne de F. oxysporum
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5 DISCUSSION Des traitements visant tudier le type dinteraction entre la souche pathogne de la fusariose du palmier huile, Fusarium oxysporum f.sp. elaeidis (Foe), et la souche saprophyte Fot, ont t effectus. Lefficacit dun traitement favoriser la prmunition est dtermine lorsque le taux de plants de palmier huile ayant subi le dit traitement est infrieur celui du tmoin respectif et/ou dun traitement auquel lon veut le comparer. La prinoculation des souches fongiques antagonistes Fot et Foe, non suivie du rempotage des plants, a protg de faon significative (F (1 ; 8)=15,54 ; p=0,004) le palmier huile du dveloppement de la fusariose, dont le pourcentage de la valeur transforme du taux de plants fusaris est pass de 77 % pour le tmoin 14 % aprs prinoculation du Fot. La prinoculation suivie du rempotage des plants dans un terreau non inocul de la souche non pathogne Fot sest rvle sans effet significatif. Toutefois, le fait davoir dterr les plants pour les rempoter ensuite a pu les avoir fragiliss, de telle sorte que toute induction de la rsistance a pu tre masque par cette opration. Cest ce quont indiqu les rsultats de la seule inoculation de Foe entrainant 32 % de fusariose aprs rempotage, alors quelle nen a provoqu que 19 % sans rempotage. Ce rsultat indiquerait que la confrontation des souches avirulente et pathogne est ncessaire la manifestation du phnomne de protection. Des auteurs ont prcdemment dvelopp ce point de vue (Renard et Franqueville, 1989). Il ressort de leur analyse que, quand la souche non pathogne est spare physiquement de la souche pathogne, la protection croise est plus faible que lorsque les deux souches sont introduites ensemble. Linfluence de la confrontation des souches saprophytes Fot et pathogne Foe dans lacquisition de la prmunition a apport quelques prcisions sur la nature de cette protection. Cette tude nous a montr que les rsultats des essais ont t significatifs seulement en inoculation diffre des champignons (Fot et Foe), avec des taux dinfection environ deux fois plus faible pour les plants traits que pour les tmoins avec ou sans confrontation
des souches. Ainsi, la prinoculation de Fot suivie de sa confrontation directe avec Foe protge mieux les jeunes plantes de palmier huile du dveloppement de la fusariose. Ces rsultats sont en concordance avec ceux de travaux cits plus haut. En effet, il a t montr que, dans leur comptition pour les nutriments du sol, la prsence pralable de la souche non pathogne favorise la germination de ses chlamydiospores et lenvahissement des tissus des racines au dtriment de la souche pathogne, lorsque celle-ci est mise plus tard au contact de la plante (Couteaudier et Alabouvette, 1990). De mme, un grand nombre de sites dinfection sont protgs par une densit croissante de la souche non pathogne, si celle-ci est inocule avant la souche pathogne (Mandeel et Baher, 1995 ; Boa et Lazarivits, 2001). Cependant, lon observe galement un rle prmunisant de la souche Fot sans confrontation ultrieure de celle-ci avec Foe. Bien que cet effet soit moindre que dans le cas de la confrontation, ceci signifie que la protection apporte par Fot repose, au moins en partie, sur sa capacit dclencher les mcanismes de dfense des jeunes plantes, puisque tout phnomne de comptition est exclu par la non-confrontation des souches. Il existe donc une expansion de la prmunition qui permet en outre, de penser que la synthse de composs de dfense ne se fait pas quau seul point de confrontation entre lhte et le pathogne (Billes et Martyn, 1989 ; Diabat et, al. 1990). La comparaison de ces essais suggre fortement que la comptition entre souches est le premier phnomne qui rgit la prmunition, comptition suivie ou non dune licitation des mcanismes de dfense (Diabat et, al. 1990 ; Van Peer et, al. 1991 ; Diabat et, al. 2010). En outre, si effectivement il y a comptition, celle-ci reposerait sur la disponibilit des lments nutritifs, le dveloppement du champignon ou loccupation des sites dinfection (Renard et Franqueville, 1989 ; Billes et Martyn, 1989 ; Mandeel et Baher, 1995). Par ailleurs, les dlais sparant linoculation des organismes non agressifs de celle de lagent pathogne sont, dans le cadre de ces essais, de trois
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