Modélisation Flavonoides

AVERTISSEMENT
Ce document est le fruit dun long travail approuv par le jury de

soutenance et mis disposition de lensemble de la communaut
universitaire largie.
Il est soumis la proprit intellectuelle de lauteur au mme titre que sa
version papier. Ceci implique une obligation de citation et de
rfrencement lors de lutilisation de ce document.
Dautre part, toute contrefaon, plagiat, reproduction illicite entrane une
poursuite pnale.

Contact SCD INPL : scdinpl@inpl-nancy.fr

LIENS

Code de la proprit intellectuelle. Articles L 122.4
Code de la proprit intellectuelle. Articles L 335.2 L 335.10
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http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm

INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Suprieure dAgronomie et des Industries Alimentaires
Ecole Doctorale Ressources Procds Produits Environnement
Laboratoire Biocatalyse Bioprocds

THESE

Prsente lINPL par

Julie ANTHONI

En vue dobtenir le grade de

DOCTEUR DE LINSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE

Spcialit : Procds Biotechnologiques et Alimentaires

Synthse enzymatique, modlisation molculaire et caractrisation doligomres de
flavonodes

Soutenue publiquement le 10 Dcembre 2007 devant la commission dexamen

Rapporteurs : Mr S. Kermasha Professeur lUniversit Mc Gill, Canada
Mr S. Lamare Professeur lUniversit de La Rochelle

Examinateurs : Mme E.R. Maa Professeur lUniversit de Brasilia, Brsil
Mr J.M. Engasser Professeur lENSAIA-INPL, Nancy
Mr M. Ghoul Professeur lENSAIA-INPL, Nancy
Mme C. Humeau-Virot M. de Confrences lENSAIA-INPL, Nancy

Invits : Mr J.M. Wieruszeski Ingnieur de Recherche CNRS, Universit de Lille
Mr F. Lionneton Ingnieur de Recherche CNRS, UHP, Nancy

REMERCIEMENTS

Les travaux prsents dans cette thse ont t mens essentiellement au Laboratoire de
Biocatalyse et Bioprocds (LBB) Nancy. Je tiens exprimer ma gratitude Monsieur Jean-
Marc Engasser, professeur lINPL et directeur du LBB, de mavoir accueilli dans son quipe
et pour ses conseils et remarques pertinents. Cest un grand plaisir pour moi quil ait accept
e La Rochelle
ent et

u cours de mon travail de thse, jai eu lhonneur de ctoyer des personnes, qui mont
ai eu loccasion de
onnatre Monsieur Frdric Lionneton, qui bien plus quun spcialiste MALDI-TOF, ma
s laide de Monsieur
ent pour son accueil
e remercie Monsieur Christian Sanchez, Professeur au LBB, prcdemment mon encadrant
olculaire. Merci de tes conseils, de ton soutien et de ta joie de vivre qui ont su nous
heures passes avec
de prsider le jury de thse.

Jadresse mes sincres remerciements Monsieur Selim Kermasha, professeur luniversit
c Gill, Montral et Monsieur Sylvain Lamare professeur luniversit d M
pour mavoir fait lhonneur de juger mon travail en tant que rapporteurs.

Je remercie Monsieur Mohamed Ghoul, qui ma encadr, conseill et soutenu durant ces 3
annes de thse. Toujours disponible, quelque fois contrariant et souvent de bons conseils, je
uis honore davoir pu mener ce travail sous sa direction. Sa comptence, son acharnem s
ses larges connaissances mont permis dapprendre beaucoup ses cts.

Je remercie Madame Catherine Humeau, Matre de confrence lENSAIA, au cours de ces 3
ns de thse, elle a su mpauler, me soutenir et me conseiller. Mdiatrice lors des runions de a
travail, je noublie pas quelle a toujours su mcouter et mencourager. Merci pour tout.

A
permis dapprocher leur domaine de comptence.

Je remercie Monsieur Magdalou professeur lUHP et lensemble de la plateforme IFR111
qui mont permis dutiliser le MALDI-TOF. Au cours de mes travaux, j
c
conseill et soutenu tout au long des mandres de ce travail. Merci Fred !

Je remercie Monsieur Mutzenhardt professeur lUHP qui ma initi la RMN et la
diffusion et Monsieur Olivier Fabre du LCPM qui ma fait dcouvrir la HRMAS. Mais ma
dcouverte du monde des RMNistes naurait pas t complte san
ieruszeski de luniversit de Lille, que je remercie tout particulirem W
chaleureux, ses nombreuses explorations et ses innombrables conseils.

J
de DEA, pour ses encouragements et ses conseils en rhologie et en infra-rouge.

Je remercie tout particulirement Elane Maa professeur luniversit de Brasilia pour avoir
accept dexaminer ce travail et surtout pour mavoir initi au monde de la modlisation
m
motiver plonger corps perdu dans la modlisation molculaire.

Merci ceux qui mont paul dans mon activit de tous les jours, merci Monsieur Brice,
livier, Adrien, et surtout Evelyne. Je noublie pas les nombreuses O
Elane et Evelyne devant lordinateur pour installer Discovery studio.

Mes remerciements vont toutes les personnes des diffrents labo qui mont accompagn
durant ces 3 ans : Madame Marchal, Marie-Nol, Cdric, Guillaume, Nizar, Fadi, Delphine,
ionel, Monsieur Rovel, Madame Maucourt, les Caroles, Anne, Sylvia, Sandrine, Reine, Ilef,
ont support au quotidien et qui mont soutenu jour aprs jour.
erci tout particulier Cline et Latifa, qui mont aid, soutenu, rconfort et accompagn
s journes seraient bien moins
tillantes : merci Nicolas, Fayal, Nama et Eduardo. Et un grand merci Jennifer qui
es amis qui mont cout et soutenu, merci Seb, Caro,
lima, Nicolas qui chaque pose midi taient l et aux autres Benot, Thomas, David,
premier soutien et sans qui je nen
erais pas l aujourdhui. Merci maman de mavoir soutenu, merci Anne et Denis pour vos
erci tout particulier Pierre qui en premire ligne du me supporter et me soutenir tout au
ette thse ma permis de connatre dinnombrables personnes qui mont appris
mainement, merci vous tous davoir t l !!!
e ddie ce travail mon pre !

L
Nidhal, Nidal, Aude, Karima et bien dautres.

Je noublie pas ceux qui m
M
tout au long de ce travail.

Je remercie galement les bout en train du labo sans qui le
p
gaie nos journes de sa joie de vivre et de sa bonne humeur.

Je tient galement remercier m
A
Christophe, Chon, Anne-Lise,

Merci tous les membres de ma famille qui ont t mon
s
encouragements quand le moral ntait pas au beau fixe.

M
long de ses 3 ans, merci ma moiti.

C
scientifiquement mais surtout hu

J

LISTE DES ABRVIATIONS

n
M
Masse molculaire moyenne en nombre
w

M
Masse molculaire moyenne en poids
5SCA
A
Acide 5-chlorosalycilique
9N 9-nitroanthracene
A

Aire superficielle ()
thiazoline-6-sulfonique ABTS 3-ethylbenzo
ACN Actonitrile
AM1
TR
Austin Model 1
tale attnue A Cristal rflexion to
B
0
Champ magntique
Bond Dissociation Energy, variation denthalpie entre le radical phenoxy (ArO BDE
) et la
) (kcal/mol) molcule parent (ArOH
C* Concentration critique
CLHP

Chromatographie liquide haute performance
1
/ COSY Correlated spectroscopy, RMN 2D H
rmation gel
1
H, couplage scalaire
CPG Chromatographie par pe
CFF Consistent Force Field
enzoique DHB Acide 2,5-dihydroxyb
DMF Dimthylformamide
e de diffusion DOSY

Spectroscopie RMN par ordr
DPPH
C
1-diphenyl-2-picrylhydraxyl
g Calorimetry DS Differential Scannin
me E
0
Energie du syst
E
TA
Potentiel redox
min aAcetique ED
g
Acide EthyleneDia eTetr
E Diffrence entre E
HOMO
et E
LUMO
E
HOMO
Energie de lorbitale molculaire la plus haute occupe
e de lorbitale molculaire la plus basse vacante

E
LUMO
Energi
F
IR
Farad
ge transforme de Fourier FT Spectroscopie infra-rou
H Oprateur hamiltonien
e HABA Acide 2-(4-hydroxyphenylazo)benzoqu
HCCA Acide 4-hydroxy-R-cyanocinnamique
on : 2D HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Correlati
1
H/
13
C, couplage scalaire
HOMO
AS
Orbitale molculaire la plus haute occupe
du solide HRM High resolution magic angle sepctroscopy, RMN
ydase de raifort HRP Horseradish peroxydase : perox
IAA Acide trans-3-indoleacrylique
de lactivit dtecte IC50
DA
Concentration aboutissant 50%
I Acide trans-3-indoleacrylique
I
m
Indice de masse molculaire moyenne en poids
Potentiel dionisation, variation denthalpie entre le radical cation (ArOH IP
+
) et la
cal/mol) molcule parent (ArOH) (k
IR Rayonnement infra-rouge
J Constante de couplage en RMN
Log P
O
Coefficient de partition octanol/eau
s basse vacante LUM Orbitale molculaire la plu
m/z
DI
Rapport masse sur charge
esorption Ionization, technique de spectromtrie de masse MAL Matrix Assisted Laser D
MM Masse molaire (g/mol)
e NPT Ensemble isobare-isotherm
ique NVE
VT
Ensemble microcanon
canonique N Ensemble

P Pression
PBC Periodic bond chain, systme priodique utilis en modlisation molculaire
tante dilectrique ()
molculaire (a.u.)
PR ative structure-property relationship, relation structure-proprit
ire
lage dipolaire
S
) : solubilit de la rutine dans leau)
C chromatography, chromatographie par exclusion de taille
acetophenone monohydrate
sparation selon la masse
H (BDE) radical phenoxy et la molcule parent (kcal/mol)
(F/m)
Eletrongativit (eV)

PDI Polydisperist
pF/m Picofarad/mtre, unit de la cons
POL Polarisabilit
PS Polystyrne
QOn Charge partielle sur loxygne n
QSAR Quantitative structure-activity relationship, relation structure-activit
QS Quantit
R Rayon
RMN Rsonance magntique nucla
RMSD Root Mean Square Distance
ROESY Rotating frame Overhauser Effect spectroscopy Y: 2D
1
H/
1
H coup
RO Reactive Oxygen Species, espce radicalaire porte par loxygne
S Solubilit (S
rutine
(eau
SA Acide sinapinique
SBP Soybean peroxydase : peroxydase de soja
SE Size exclusion
T Temprature
TFA Acide trifluoroactique
THAP 2,4,6-trihydroxy
THF Ttrahydrofurane
TOF Time of flight, technique de
VOL Volume molculaire (
3
)
Variation denthalpie entre le
Constante dilectrique
Moment dipolaire

SOMMAIRE GNRAL

INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................ 1
Chapitre I. Etude bibliographique ......................................................................................... 4
Chapitre II. Matriels et Mthodes ...................................................................................... 71
Chapitre III. Mise au point des techniques analytiques ................................................... 102
Chapitre IV. Oligomrisation enzymatique....................................................................... 118
Chapitre IV.1. Oligomrisation de la rutine........................................................................... 118
Chapitre IV.2. Oligomrisation de lesculine......................................................................... 144
Chapitre V. Modlisation molculaire ............................................................................... 165
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES............................................................................. 208
ANNEXES............................................................................................................................. 223

INTRODUCTION GNRALE

Introduction Gnrale
INTRODUCTION GENERALE

Les constituants majeurs de notre organisme (lipides, protines, ADN) peuvent tre
oxyds par les espces ractives de loxygne (ROS) incluant des radicaux libres (ROO , RO ,
O2 , HO ). Les ROS sont produits continuellement partir de loxygne que nous respirons.
Les dommages oxydatifs provoqus par les ROS portent le nom de Stress Oxydant, qui est
responsable de nombreuses maladies dgnratives. Dans les conditions physiologiques
normales, nos cellules sont quipes de systmes de dfense antioxydante, qui leur permettent
de neutraliser les ROS pour les maintenir un faible taux dans les cellules et par consquent,
empcher le dclenchement dun stress oxydant. La premire barrire de dfense est
synthtise par les cellules. Cest le cas des enzymes antioxydantes (superoxyde dismutase,
catalase, glutathion peroxydase) mais galement du glutathion, de lacide urique, de lacide
lipoque, du coenzyme Q10, de la mlatonine, de la bilirubine, de lalbumine.

-
La seconde
barrire de dfense nous est apporte par notre alimentation, par lapport de molcules
antioxydantes. Cet apport alimentaire est variable selon lindividu et le mode dalimentation.
Afin dapporter une dose journalire suffisante quel que soient le rgime alimentaire et
la nature des ingrdients consomms, des complments alimentaires ont t dvelopps ces
dernires annes. Ces supplmentations en antioxydant, issus de plantes ou synthtiss, se
font par lintermdiaire de glules ou directement par lenrichissement de certains aliments.
Les principaux antioxydants vgtaux sont au nombre de quatre : la vitamine C ou acide
L-ascorbique, la vitamine E, les carotnodes et les polyphnols. Les polyphenols et en
particulier les flavonodes sont de plus en plus utiliss dans la prparation des complments
alimentaires. En effet, ces composs sont utiliss dans de nombreux domaines agroalimentaire
(antioxydant, colorant, astringent), pharmaceutique (anti-inflammatoire, anti-cancer, anti-HIV,
traitement amincissant) et cosmtique (contre le vieillissement cutan, dpigmentation de la
peau, anti-acnique, anti-UV). Mais leur utilisation se heurte leur faible solubilit dans les
milieux de formulation (aqueux, solvants), et leur grande instabilit la lumire et la
chaleur. Plusieurs mthodes de fonctionnalisation ont t dcrites pour palier ces
inconvnients tout en conservant ou en amliorant leurs proprits antioxydantes. Lacylation,
lhydroxylation, la glycosylation et la polymrisation sont quelques unes des voies de
fonctionnalisation utilises.
1
Introduction Gnrale
La polymrisation est une voie qui se dveloppe de plus en plus. Cette technique
consiste en linitiation dune chane radicalaire qui en se propageant va permettre la
polymrisation dunits monomriques. Cette voie de fonctionnalisation peut tre ralise par
voie chimique ou enzymatique. La voie enzymatique prsente les avantages dapporter une
certaine rgio- et nantio-slectivit, dtre effectue en conditions douces de pH et de
temprature tout en conservant le label de chimie verte .
La polymrisation des composs phnoliques affecte leurs proprits biologiques et
structurales. Les premires tudes sur le sujet ont montr de grande variabilit dimpact de
loligomrisation, notamment sur les proprits antioxydantes, la solubilit et la stabilit
thermique. Selon le substrat, le type denzyme, le mode de synthse et les conditions
ractionnelles, les proprits des polymres seront accrues, identiques ou diminues par
rapport aux proprits du monomre. Ces effets antagonistes de la polymrisation sont dus
la complexit de la raction. En effet, la polymrisation se dcompose en trois tapes :
linitiation, llongation et la terminaison. Les diffrents paramtres de la raction (enzyme,
substrat, pH, temprature, solvant, ) vont agir spcifiquement sur chacune des ces tapes.
Chaque paramtre ractionnel est susceptible dinfluencer le mcanisme de polymrisation et
ainsi davoir un impact sur la structure des polymres forms. Cest cette structure qui va
gouverner les proprits des polymres. Ainsi pour matriser ces ractions de polymrisation
enzymatique, et synthtiser des biomolcules avec des proprits recherches, il savre
ncessaire didentifier et de quantifier les effets des facteurs ractionnels, de prciser leurs
effets sur les structures des oligomres synthtiss (taille, type de pontage, ) et de
dterminer la relation structure-activit des oligomres obtenus.
Dans un premier temps, compte tenu de la complexit de la raction de polymrisation
enzymatique et du grand nombre de facteurs impliqus dans son contrle, nous avons mis au
point une plateforme de synthse automatise. Cette plateforme comprend un plateau de
plusieurs racteurs de synthse en parallle et permet le dpt sur cible MALDI
(dtermination des masses absolues) ainsi que linjection en ligne sur SEC (dtermination des
masses relatives).
Dans un second temps, nous avons quantifi les effets des conditions opratoires
(concentration denzyme et de substrat, pH, temprature, nature et pourcentage de solvant) sur
les cintiques de consommation de substrat et de formation des produits, sur la polydispersit,
la masse moyenne en poids et la masse absolue des polymres synthtiss.
2
Introduction Gnrale
Puis, nous avons valu les structures des biomolcules synthtises. Le nombre, le type
et la localisation du pontage reliant les units monomriques ont t analyss par UV, FTIR,
MALDI-TOF et RMN. Lapproche exprimentale a t corrle lapproche par modlisation
molculaire afin dexpliquer le mcanisme ractionnel permettant daboutir aux pontages
observs.
Enfin, nous avons dtermin exprimentalement la solubilit, les activits
antiradicalaires et dinhibition de la xanthine oxydase. Ces proprits ont t corrles la
structure ainsi quaux descripteurs molculaires des polymres dfinis par modlisation
molculaire.
Ces axes dtudes vont permettre de comprendre et de relier les mcanismes
ractionnels la structure et aux proprits des polymres, tout en valuant le rle jou par la
modulation des conditions ractionnelles.
Deux substrats, la rutine et lesculine ont t utiliss comme modle dtude dans ce
travail. La rutine est un flavonode issu de la famille des flavonols glycosyls, comportant un
glucose et un rhamnose. Alors que lesculine est une coumarine glycosyle, comportant un
glucose. La laccase de Trametes versicolor a t utilise comme biocatalyseur.
3

CHAPITRE I.

TUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre I Etude Bibliographique

Chapitre I : Etude Bibliographique

1. STRUCTURE ET ORIGINE DES FLAVONODES................................................................................4
1.1. LES FLAVONODES ................................................................................................................................ 4
1.2. LES COUMARINES ................................................................................................................................. 7
2. PROPRITS ET ACTIVITS DES FLAVONODES ET DE LEURS OLIGOMRES...................8
2.1. PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES......................................................................................................... 9
2.1.1. Solubilit des flavonodes................................................................................................................ 9
2.1.2. Absorption dans le domaine UV-visible........................................................................................ 10
2.1.3. Stabilit des flavonodes................................................................................................................ 12
2.2. ACTIVITES BIOLOGIQUES .................................................................................................................... 14
2.2.1. Proprits antioxydantes et antiradicalaires ................................................................................ 14
2.2.2. Proprits complexantes ............................................................................................................... 17
2.2.3. Inhibition denzymes ..................................................................................................................... 18
2.2.4. Activit de photoprotection ........................................................................................................... 20
2.2.5. Toxicit.......................................................................................................................................... 21
3. PROPRITS ET ACTIVITS DES COUMARINES..........................................................................21
3.1. PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES....................................................................................................... 21
3.2. ACTIVITES BIOLOGIQUES .................................................................................................................... 22
4. POLYMRISATION ENZYMATIQUE DES FLAVONODES ET DES COUMARINES...............23
4.1. LES OXYDOREDUCTASES .................................................................................................................... 23
4.2. MECANISMES DE POLYMERISATION.................................................................................................... 26
4.2.1. Mcanisme radicalaire.................................................................................................................. 26
4.2.2. Type de pontage mis en jeu ........................................................................................................... 27
4.3. PROCEDES DE POLYMERISATION......................................................................................................... 30
4.4. INCIDENCE DU MODE PONTAGE ET DU DEGRE DE POLYMERISATION SUR LES PROPRIETES................... 62
5. LA MODLISATION MOLCULAIRE APPLIQUE AUX FLAVONODES ................................63
5.1. ETUDE CONFORMATIONNELLE............................................................................................................ 63
5.2. RELATION STRUCTURE-ACTIVITE ANTIOXYDANTE.............................................................................. 64
5.3. RELATION STRUCTURE-ACTIVITE PRO-OXYDANTE.............................................................................. 66
5.4. RELATION STRUCTURE-ACTIVITE INHIBITRICE DENZYMES ................................................................ 69

Tableaux

Tableau I.1. Absorption UV des flavonodes dans le mthanol ........................................... 11
Tableau I.2. Effet de la structure sur les activits antioxydantes des flavonodes ............... 17
Tableau I.3. Absorption UV des coumarines dans lthanol................................................ 22
Tableau I.4. Effet de la structure sur les activits antioxydantes, inhibitrice denzyme et
cytotoxique des coumarines ............................................................................................. 22
Tableau I.5. Modes de pontage rpertoris dans la littrature.............................................. 29
Tableau I.6. Elments structuraux ncessaires une bonne activit antioxydante dans le cas
des deux mcanismes par transfert dhydrogne et dlectron ........................................ 66
Tableau I.7. Exemple de relation structure-activit cytotoxique.......................................... 68
Tableau I.8. Exemples de relation structure activit inhibitrice de la xanthine oxydase ... 70

Figures

Figure I.1. Squelette de base et numrotation adopte ........................................................ 4
Figure I.2. Schma de biosynthse des flavonodes et des coumarines............................... 5
Figure I.3. Les diffrentes classes de flavonodes ............................................................... 6
Figure I.4. Structure de la rutine .......................................................................................... 7
Figure I.5. Exemples des diffrentes classes de coumarines ............................................... 8
Figure I.6. Structure de lesculine........................................................................................ 8
Figure I.7. Domaine dabsorption dans le domaine UV-visible ........................................ 11
Figure I.8. Exemples dauto-oxydation de flavonodes ..................................................... 13
Figure I.9. Principaux lments structuraux ncessaires lactivit antioxydante des
flavonodes ....................................................................................................................... 16
Figure I.10. Chlation des mtaux par les flavonoles .......................................................... 18
Figure I.11. Structure dun monomre de la laccase de Trametes versicolor18
Figure I.12. Mcanisme ractionnel de la laccase utilise comme dtecteur biologique .... 25
Figure I.13. Pontage observ dans le cas de loligomrisation de la catchine par HRP .... 27
Figure I.14. Simple et double pontage de polyflavane ........................................................ 28
Figure I.15. Clivage oxydatif et polymrisation de la querctine........................................ 30
Figure I.16. Pontage par photodimrisation de coumarine .................................................. 30
Figure I.17. Structures optimises dnergie minimale de la rutine .................................... 64


Chapitre I. Etude bibliographique

1. Structure et origine des flavonodes
Les flavonodes

Les flavonodes, except les chalcones, les aurones et les isoflavones, ont une origine
biosynthtique commune et comportent un mme lment structural de base form par quinze
atomes de carbone appartenant deux cycles en C6 (A et B) relis par une chane en C3
(noyau 2-phnyl-1-benzopyrane) (Figure I.1).

O
2
3
4 5
8
1
7
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
A C B

Figure I.1. Squelette de base et numrotation adopte [1]

Les flavonodes drivent de la voie de lacide shikimique. Le prcurseur de ces
molcules est le 4-hydroxycinnamate-coenzyme A synthtis partir de la phnylalanine. La
voie biosynthtique de ces polyphnols est prsente Figure I.2.
4

R
HO
R2
R3
O
SCoA
R1
R
HO
HO
HO SCoA
O O
O
O
HO
OH
R
1
R2
R3
CHS
IFS
O
HO
HO O
CHI
O
H
O
R
1
R
2
R
3
HO
OH
O
R
1
R
2
R
3
HO
OH
FHT
O
H
O
OH
H
R
1
R
2
R
3
HO
OH
AS
O
H
OH
H
R
1
R
2
R
3
HO
OH
H
HO
DFR
O
OH
OH
HO
R
1
R
2
R
3
O
H
OH
H
R
1
R
2
R
3
HO
OH
O
O
R
1
R
3
R
2
OH
HO
O
O
R
1
R2
R3
HO
OH
O
O
OH
HO
OH
R
1
R
2
R
3
3 +
R1, R2, R3 : H, OH
R1, R3 : H
R2 : OH
R : COOH ou CO-SCoA
acide p-coumarique
acide cafique
coumarine
chalcones
aurones
flavanones
flavones
FNSI / FNSII
dihydroflavonols
isoflavones
flavonols
FLS
flavonols glycosyls
glycosylation, mthylation
(transferase)
flavan-3,4-diols
LCR
LDOX
flavanols
polymrisation
proanthocyanidines
+
anthocyanines
glycosylation, mthylation
(transferase)
anthocyanidines
Figure I.2. Schma de biosynthse des flavonodes et des coumarines (adaptes de [2-4].
AS : aurone synthase, CHI : chalcone isomrase, CHS : chalcone synthase, DFR :
dihydroflavonol-4-rductase, FHT : flavanone-3-hydrolase, FLS : flavonol synthase,
FNSI/FNSII : flavone synthase, IFS : isoflavone synthase, LDOX : lkeucothocynidin
dioxygenase, LCR : leucoanthocyanidin reductase
5
Les flavonodes sont subdiviss, comme indiqu en Figure I.3., en diffrentes classes en
fonction du degr doxydation et dinsaturation du cycle C. Les composs appartenant la
mme classe diffrent entre eux par leur degr et la position dhydroxylation, la prsence de
substituant sur la gnine et le degr de polymrisation. Les modifications les plus couramment
rencontres sont lhydroxylation, lalkylation (mthylation ou prnylation), la glycosylation et
lacylation, soit directement par un groupement phnolique, soit sur un groupe hydroxyle dun
ose.

Substitution
Flavonoide
3 5 7 3 4 5
Pelargonidine OH OH OH OH
Cyanidine OH OH OH OH OH
Delphinidine OH OH OH OH OH OH

Substitution
Flavonoide
5 6 7 3 4 5
Daidzeine OH OH
Gnisteine OH OH OH

Substitution
Flavonoide
5 6 7 3 4 5
Catchine OH OH OH OH
Gallocatchine OH OH OH OH OH

O
O
Isoflavones
O
Anthocyanes
OH
+
O
Flavanols
OH
5
5 5
5'
5' 5'
4'
4'
4'
3' 3'
3'
7
7
7

Substitution
Flavonoide
5 6 7 3 4 5
Taxifoline OH OH OH OH
Fusetine OH OH OH

Substitution
Flavonoide
5 6 7 3 4 5
Apignine OH OH OH
Chrysine OH
Lutoline OH OH OH OH

Substitution
Flavonoide
5 6 7 3 4 5
Kamphrole OH OH OH
Myrictine OH OH OH OH OH
Querctine OH OH OH OH

O
H
O
O
O
O
O
OH
H
Dihydroflavonols Flavones Flavonols
OH
5
5
5
7
7
3'
7
3'
4'
3'
4'
4'
5' 5'
5'

Substitution
Flavonoide
2 3 4 5 6 4
Davidignine OH OH OH
Asebognine OH OMe OH OH

Substitution
Flavonoide
5 6 7 3 4 5
Eriodictyol OH OH OH OH
Hesperitine OH OH OH OMe
Naringnine OH OH OH

Substitution
Flavonoide
4 6 7 3 4 5
Leptosidine OH OMe OH OH
Maritimtine OH OH OH OH

O
Chalcones
O
O
Aurones
O
H
O
Flavanones
2'
2'
5
6
2'
2
2
4'
4
3
4'
4'
2
5
7
Figure I.3. Les diffrentes classes de flavonodes [5, 6]
6
Dans cette tude, nous nous sommes intress la rutine (Figure I.4.). Il sagit dun
disaccharide naturel de la querctine (3-[6-O-(-L-rhamnopyranosyl)--D-glucosyl]
querctine) prsent dans de nombreuses plantes (sarrasin, fleur de Sophora, agrumes, feuille
deucalyptus, tomate, ).

O
O
O
HO
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH OH
CH
3
O
1''
1''' 4'''
3''
2
3
4
5
7
1'
3'
4'
Structure de la rutine

La rutine comme les autres flavonodes a de nombreux effets bnfiques sur la sant
humaine. Il a t tabli que la rutine prsente des activits de vasorelaxation [7, 8], anti-
inflammatoire [9, 10], hpatoprotecteur [11] et possde, entre autres, des proprits
antioxydantes, de pigeage de radicaux [12, 13], de complexation des mtaux [14] et de
protection contre les dommages de lADN [15].

Les coumarines

Plus de 1300 coumarines ont t identifies comme mtabolites secondaires dans les
plantes, mais aussi dans les champignons et les bactries. Ces composs sont utiliss
principalement dans les produits agro-alimentaires et cosmtiques comme agent fixant et
exhausteur de parfums.
Il existe trois classes principales de coumarines (Figure I.5) :
- les hydroxycoumarines (umblliferone, escultine) et leurs drivs glycosyls
sont trouvs dans les vgtaux suprieurs,
- les furanocoumarines (anglicine),
- les pyranocoumarines (decursinole).
7
Les composs de la premire classe sont synthtiss par les vgtaux suprieurs, alors
que ceux appartenant aux deux dernires classes sont produits par les Umbelliferae et les
Rutaceae.

Exemples des diffrentes classes de coumarines

es coumarines possdent de nombreuses proprits biochimiques et pharmaceutiques.
Leurs activits dpendent de la structure et de la nature des substituants. On peut citer par
exem le, des activits de rduction doedmes, de vasorelaxation, anti-inflammatoire,
dinhibition denzyme, rits antioxydantes
6, 17].
O O
HO
HO
escultine
O O O
H
H
3
C
HO
H
3
C
decursinole
O O
O
angelicine

L
p
antimicrobienne, antivirale, anticancer et des prop
[1
Dans ce travail, lesculine (6-glucopyranosyl escultine) (Figure I.6.) a t retenue
comme modle dtude. Ce compos est un monosaccharide de lescultine. Il est extrait des
corces de Hippocastanaceae, Rosaceae, Oleaceae (Fraxinus, Aesculus hippocastanum,
Crataegus oxyacantha) et des feuilles de Pittosporaceae et lon en retrouve dans les fruits du
Kiwi.
O HO O
O
3
4 O
OH
OH
OH
HO
6'
5'
3'

Structure de lesculine

2. Proprits et activits des flavonodes et de leurs oligomres
physico-chimiques des flavonodes sont variables selon leurs structures. Dans cette tude

Comme il a t mentionn prcdemment, les activits biologiques et les proprits
8
biblio
2.1. Proprits physico-chimiques

S diffrentes interactions peuvent se dvelopper en
rsence dun solvant [18]:
phatiques en prsence des solvants apolaires;
flavonode ;
Cep da
solu s hydrogne avec le solvant.
nodes
non g
leau 20 C sont
respe
graphique, nous nous sommes principalement intresss leur solubilit, leur absorption
UV-visible, leur stabilit et aux activits antioxydantes, dinhibition denzyme et de
photoprotection.

2.1.1. Solubilit des flavonodes
elon la structure du flavonode,
p
- des interactions hydrophobes au niveau des cycles aromatiques (A et B) et des
substituants carbons ali
- des interactions dipolaires entre les solvants polaires et les groupes
fonctionnels des flavonodes (carbonyle, ther, ester, hydroxyle) ;
- des liaisons hydrogne entre le solvant (eau, alcool, amine) et les divers
groupes donneurs ou accepteurs de ce type de liaison prsent sur le
- des interactions de type lectrostatique entre les groupes hydroxyles et
carboxyliques ou pour les anthocyanes certain pH.
en nt, Saidman et al. [19] ont rapport que le facteur principal influenant la
bilit de la flavone est sa capacit former des liaison
Les diffrences structurales au sein dune mme famille sont tellement importantes quil
est difficile de prdire la solubilit dun compos dans un solvant. Toutefois, les flavo
lycosyls sont en gnral solubles dans des solvants apolaires ou de faibles polarits tels
que lther thylique, les solvants halogns, lhexane. En revanche, les htrosides sont
plutt solubles dans des solvants polaires (actone, alcools) et dans leau.
La solubilit dans leau et dans des solvants trs apolaires est faible et dpendante du pH
[20]. La solubilit de la rutine, de la naringine et de la querctine dans
ctivement de lordre de 125 mg/L, 0,5 g/L et < 10 mg/L [21, 22]. Benavente-Garcia et al.
[23] ont valu la solubilit de la nohespridine dihydrochalcone dans diffrents mlanges
eau/thanol. Ils ont rapport que la solubilit de ce compos 20 C dans leau, lthanol et le
mlange eau/thanol (1/1) est respectivement de 0,4 g/L, 12 g/L et 123 g/L.
9
Cette faible solubilit dans des phases aqueuses et lipophiles, c'est--dire dans un milieu
biologique, pose des problmes dune part, de biodisponibilit du produit in vivo et donc de
son e
ement
ilit respectivement
dans

rothermophilus, a permis laugmentation de sa solubilit
dans

bilit des milieux hydrophiles diffrents pH [27].

maine UV-visible
L en partie de leur effet filtre et de leur
rte absorption dans le domaine UV [30, 31]. Les spectres UV des flavonodes exhibent deux
band
fficacit et dautre part, de formamilit du produit et donc de son administration. La
mtabolisation (hydrolyse de la partie glycosyle, sulfatation, glucuronisation) de ces
composs par les cellules de lintestin permettent leur absorption par lorganisme [24].
Diffrentes techniques ont t utilises pour pallier ces problmes :
Lacylation par des acides gras ou aliphatiques substitus avec un group
polaire (sucre, phosphate, carboxylate) a permis damliorer la solub
des phases lipophiles ou en milieu aqueux. Le (2-phosphono-myo-inositol)
succinate de querctine [22], lactate de querctine et le propionate de querctine [25]
ont une solubilit dans leau respectivement 15 000 fois, 500 fois et 12 fois plus
importante que la querctine.
La glycosylation de la naringine par du maltotriose, en prsence de lamylase
maltogenique de Bacillus stea
leau de 250 fois [26].
La complexation de la naringenine et de lhsperitine avec de la cyclodextrine a
permis daugmenter leur solu
La polymrisation de la rutine et de la catchine a permis daugmenter leur
solubilit dans leau [28, 29].
2.1.2. Absorption dans le do

action des flavonodes dans les plantes rsulte
fo
es dabsorption principales dans la rgion 240-400 nm (Figure I.7). La bande I (300-395
nm) est considre comme tant associe labsorption de la partie cinnamoyle (noyau B) du
flavonode et la bande II (240-280 nm) celle de la partie benzoyle comme lindique le
schma suivant :
10
O
O
A
B
chromophore cinnamoyle
chromophore benzoyle
3
5
7
2'
6'
4'
300-380 nm 240-280 nm

Domaine dabsorption dans le domaine UV-visible

Plusieurs facteurs peuvent affecter le spectre dabsorption et le coefficient dextinction
des flavonodes comme la nature du solvant, le pH, la nature des substituants (hydroxylation,
mthylation, glycosylation, acylation) et leur position, et la prsence dinteraction intra et/ou
inter-molculaire (-stacking, liaison hydrogne). La prsence et le nombre dhydroxyle sur la
gnine provoquent un dplacement bathochrome des bandes dabsorption (Tableau I.1).

Tableau I.1. Absorption UV des flavonodes dans le mthanol [32, 33]

absorption UV-visible max
classe des flavonodes
Bande II (nm) Bande I (nm)
Flavone 250-280 310-350
Chrysine 247s, 268 313
Apignine 267, 296s 336
Flavonol 250-280 330-385
Querctine 255, 269s 301s, 370
querctine 3-O-glucoside 257, 269s 299s, 362
flavanone et dihydroflavanol 275-295 300-330
Hespretine 288 300s
Taxifoline 290 327s
Chalcone 230-270 340-390
4-hydroxychalcone 328
2, 4, 4-trihydroxychalcone 367
Aurone 230-270 380-430
4-hydroxyaurone 389
6, 3, 4-trihydroxyaurone-6-glucoside 405
Anthocyane 270-280 465-560
cyanidin-3-glucoside 274 523
pelargonidine 3,7-diglucoside 279 498
Isoflavone 245-275 310-330
Daidzein 238s, 249 260s, 303s
Genistein 261 328s
Flavanol 270-280 -

En absence dhydroxyle en position 4, cas des flavones, la longueur donde de la bande I
est plus courte de 20 30 nm. La mthylation comme la glycosylation, en particulier sur les
hydroxyles en position 3, 5, 7 et 4 provoquent un dplacement hypsochrome vers les
11
longueurs dondes plus courtes. Toutefois, la nature du sucre na gnralement pas deffet
[32].
La polymrisation des flavonodes aboutit des bandes dabsorption plus larges dues
un phnomne de conjugaison entre monomre [28] et un dplacement hypsochrome de 20
nm de la bande I [34].

2.1.3. Stabilit des flavonodes

Les flavonodes tant des molcules trs ractives, sont plus ou moins sensibles
certains facteurs selon leur structure.
Paramtres affectant la stabilit des flavonodes
La lumire [27, 35], le pH [36, 37], la temprature [38, 39], la nature du solvant [27, 40],
la prsence denzyme [41, 42], dion mtallique [37, 43] et doxydant [40, 41] ont t dcrits
comme des paramtres influenant la stabilit des flavonodes.
Ainsi, une lvation de la temprature et du pH, la prsence dions mtalliques
favorisent la dgradation des flavonodes. La stabilit est plus faible des pH basiques en
raison dune augmentation de loxydation de ces molcules due soit une dprotonation de
ces composs (diminution du potentiel doxydation), soit une stabilisation de loxydant
(anion superoxyde). La nature du solvant affecte le mcanisme de dgradation des flavonodes.
En effet, lors de ltude de la dgradation de la querctine par le DPPH, Fargeix [40] a
observ la formation de produits diffrents en milieu protique et aprotique. De mme,
Tommasini et al. [27] ont rapport, lors de ltude de la photostabilit du 3-hydroxyflavone,
des voies de dgradation diffrentes selon la nature du solvant avec une amlioration de la
stabilit en prsence de cyclodextrines.
Autoxydation des flavonodes
Lauto-oxydation de flavonodes a t dcrite par Barhaes et al., Fargeix et al., Balogh-
Hergovich et Speier, Mochizuki et al., Ramos-Tejada et al. ainsi que par Duran et al. [37, 40,
44-46]. Ces auteurs se sont principalement intresss aux cintiques et aux mcanismes
doxydation de divers flavonodes. Mochizuki et al.[37], quant eux, ont montr en tudiant
lauto-oxydation de la catchine en milieu aqueux que la raction est affecte par le pH, la
12
prsence dion mtallique et de borate. Les produits forms au cours de lauto-oxydation sont
trs variables mettant en vidence des voies de dgradation diffrentes selon la nature du
flavonode et des conditions de conservation (Figure I.8).

O
O
OH
OH
OH
HO
OH
O
O
OH
O
O
-
HO
OH O
2
O
O
OH
R
HO
OH
CO
2
H
O
R
HO
OH
O
O
O
O
-
O
-
-
O
O
-
O
-
O
O
O
-
O
-
-
O
O
-
O
O
2
CO
2
H
OH
O
O
O
O
-
-
O
O
-
O
-
OH
O
O
OH
O
O
HO
OH
CO
2
H
R
OH
HO
R'
OH
OH HO
R'
ox
O
2
-.
polymre
O
2
DMSO/eau (1/1)
+
O
2
-.
eau pH 12
+
R' = COOH, COCOOH
Figure I.4. Exemples dauto-oxydation de flavonodes [37, 40, 44]
Effet de la structure du flavonode sur la stabilit
La stabilit des flavonodes est affecte par leur structure et la prsence de substituant
(glycosylation, acylation, polymre). En effet, Friedman et Jurgensen [36] ont observ que la
stabilit des flavonodes et de certains acides aromatiques, vis--vis du pH, est plus leve que
dans le cas dautres composs phnoliques en raison dune stabilisation accrue par rsonance
des intermdiaires de type phnoxy et quinoque. Il a t aussi report que la stabilit des
flavones la lumire est plus importante que celle des flavonols [47]. Ainsi, labsence dun
groupe hydroxyle libre en position 3 sur les flavones a un effet positif sur la stabilit en
particulier la lumire. Les flavones et les flavonols glycosyls en position 3 sont donc moins
ractifs.
En ce qui concerne lhydroxylation, Makris et Rossiter [41] nont pas observ deffet sur
la stabilit en comparant les mcanismes de dgradation de la querctine et de la morine. Par
contre, les mcanismes de dgradation la temprature de la gnisteine et de la daidzeine sont
diffrents [39].
13
Smith et al. [47] et Makris et Rossiter [41] ont compar des molcules aglycones des
glycosyles et ils ont report respectivement que la quercetine-3-galactoside et la rutine ont
une photostabilit et une thermorsistance plus leve que la querctine.
Leffet de la polymrisation sur la stabilit de lpicatchine a t dcrit par Zhu et al.
[48]. Ils ont rapport que les dimres dpicatchine sont plus sensibles au pH que le
monomre. Cette instabilit est dautant plus importante que le pH est lev.

2.2. Activits biologiques

Pour les flavonodes, de nombreuses activits biologiques ont t dcrites dans la
littrature. Elles seraient la consquence des proprits antioxydantes, dinhibition denzyme
et de complexation des mtaux.

2.2.1. Proprits antioxydantes et antiradicalaires

Linteraction des flavonodes avec de nombreux radicaux a t employe dans plusieurs
tudes, afin de dterminer les lments majeurs de lactivit antioxydante. Grce leurs
faibles potentiels redox [49], les flavonodes (Fl-OH) sont thermodynamiquement capables de
rduire les radicaux libres oxydants comme le superoxyde, le peroxyle, lalkoxyle et
lhydroxyle par transfert dhydrogne.
Mcanismes daction
Plusieurs modes daction de lactivit antioxydante des flavonodes ont t dcrits :
le pigeage direct des radicaux libres
Les flavonodes sont capables de piger les radicaux libres oxygns (X) par transfert
dun lectron ou dun hydrogne :
X ArOH
X ArOH
X
XH ArO
ArOH + +

Le radical aryloxyle form est stabilis par rsonance. Llectron non appari peut se
dlocaliser sur lensemble du cycle aromatique. Mais, il peut continuer voluer selon
+ +
.
.
.
14
plusieurs processus (dimrisation, dismutation, recombinaison avec dautres radicaux,
rduction en molcule parent, oxydation en quinone) en ragissant soit avec des radicaux ou
daut
avec le potentiel doxydation des flavonodes
[50].
ux
de tra
tion peut amliorer
leur pouvoir oxyd potentiel doxydation [50, 51].
ires (lipoxygnase, cyclo-
oxygnase, monoxygnase, xanthine
turaux
impliqus es structuraux sont:
ocalisation de llectron non appari et de la formation dune liaison
hydrogne
bonyle en C4 permet une
dlocalisat
res antioxydants, soit avec des biomolcules.
Lactivit antiradicalaire a t corrle
chlation des ions mtalliques (Fe
3+
, Cu
+
)
Le pouvoir antioxydant des flavonodes peut sexercer par la complexation des mta
nsition. En effet, ces derniers acclrent la formation despces oxygnes ractives.
Par ailleurs, la complexation des flavonodes par des mtaux de transi
anti ant en diminuant leur
inhibition denzyme
Les flavonodes sont des inhibiteurs denzyme, notamment des oxydorductases qui font
intervenir au cours de leur cycle catalytique des espces radicala
oxydase, protine kinase).
Relation structure-activit antioxydante des flavonodes
Leffet de la structure sur lactivit antioxydante a t valu et les lments struc
dans cette activit ont t dfinis (Figure I.9.). Ces critr
La prsence dune fonction catchol sur le cycle B
La configuration des hydroxyles du noyau B est le paramtre structural le plus
significatif de lactivit antioxydante. Les radicaux phnoxy sont stabiliss par la prsence
dun hydroxyle en ortho de celui qui a cd son atome dhydrogne. En effet, cette stabilit
rsulte de la dl
[50].
La prsence dun motif none dans le cycle C
La double liaison entre C2 et C3 et la fonction car
ion lectronique stabilisante du radical phnoxy [52].
La prsence de groupement hydroxyle en position 3
La glycosylation ou la mthylation de lhydroxyle en position 3 des flavonols conduit
une diminution importante de lactivit antioxydante. Cet effet est moins marqu lorsque les
15
autres groupements phnoliques sont substitus. La prsence dun groupement hydroxyle en
position 3 renforce donc les proprits antioxydantes dans le cas o le cycle C est insatur. La
prsence dun groupe hydroxyle en position 5 peut aussi contribuer leffet antioxydant dans
le cas des i
ons hydroxyles sur le cycle B et permettre le maintien de lactivit
ntioxydante [54].

Principaux lments structuraux ncessaires lactivit antioxydante des flavonodes
ne
jusquau trimre, puis une chute de lactivit pour les degrs de polymrisation suprieurs.
des
taux, dinhibition de la proxydation des lipides et dinhibition de la xanthine oxydase.

soflavones [53].
La prsence de groupement hydroxyle sur le cycle A
La prsence de groupements hydroxyles sur la partie catchole peut compenser
labsence de foncti
a
O
OH
OH
OH
4'
3'
3
5
7
4
O

De plus, la nature des substituants influe sur les activits ; ainsi, plus le degr
dhydroxylation est important, plus le pouvoir antioxydant est lev [55]. La glycosylation
des flavonodes fait diminuer lactivit antioxydante, mais leffet est modul par la position de
la glycosylation, la nature du sucre et leur nombre [53, 56]. Leffet de la polymrisation de
flavonode sur lactivit antiradicalaire est controvers; certains auteurs ont rapport une
augmentation de cette activit [57, 58], dautres une diminution [59] du pouvoir
antiradicalaire. Il apparatrait, en outre, que la masse des polymres ait une incidence sur le
pouvoir antioxydant ; ainsi le dimre de catchine prsente un pouvoir antioxydant plus faible
par rapport celui de polymres de plus hautes masses [60]. Williamson [61] quant lui,
voque une augmentation du pouvoir antioxydant des oligomres de catchine-picatchi

En fonction du mcanisme de lactivit antiradicalaire tudie, quelques diffrences
dans les relations structure-activit ont t observes. Le Tableau I.2. rsume leffet des
lments structuraux des flavonodes sur les activits antiradicalaires, de complexation
m
16
Tableau I.2. Effet de la structure sur les activits antioxydantes des flavonodes [49, 50, 53,
55, 56, 62-64]

Activit Facteurs accroissant le pouvoir antioxydant
Antiradicalaire nombre de groupements OH libres
la prsence C4-OH
les flavanones possdant une double liaison C2-C3 et un seul OH en position 4
fonction catchol sur le cycle B.
la mthylation a des effets variables et son effet est difficile quantifier.
Complexation
mtallique
la prsence dune fonction carbonyle en C
4
et de groupe hydroxyle en C
5
et/ou C
3

la partie catchol
la prsence dun sucre a peu deffet
Inhibition de la
proxydation des
lipides
la prsence dune fonction catchol
le groupement carbonyle en position 4 du cycle C
la prsence de groupement hydroxyle en position C5, C7, C3, C4, C3
Inhibition de la
xanthine oxydase
une structure plane (double liaison en C2-C3)
la prsence dun groupement carbonyle en C4
la prsence de groupement hydroxyle en C5, C7
un angle de torsion entre le cycle B et C entre 26 et 27

2.2.2. Proprits complexantes

2 types de complexation sont envisageables : rversible ou irrversible.

Complexation rversible
Les flavonodes sont capables dinteragir et/ou de complexer un grand nombre de
molcules et biomolcules telles que les phnols (phnomne de copigmentation), les
protines (comme lalbumine de srum, [65]), les polysaccharides (en particulier les
cyclodextrines [27, 66] ou lADN [67]. Cette complexation peut avoir lieu dune part, par les
groupements phnoliques via des liaisons hydrogne, des interactions lectrostatiques et
dautre part, par les noyaux aromatiques via des interactions de van der Waals et des effets
hydrophobes [68, 69].
Les flavonodes forment aussi des complexes stables avec des mtaux de transition (Fe
3+
,
Al
3+
, Cu
2+
, Zn
2+
), la stoechiomtrie du complexe et le site de chlation dpendent de la nature
du flavonode [70] et du pH [71, 72]. De plus, ce phnomne de chlation saccompagne
parfois de loxydation du flavonode (Cu
2+
, Fe
3+
). Les positions gnralement complexes
font intervenir les groupes hydroxyles en position 3 et 4 sur le cycle B, lhydroxyle en 3 et le
groupe carbonyle en 4, lhydroxyle en 5 et le groupe carbonyle en 4 (Figure 1.10.).
17

Figure I.5. Chlation des mtaux par les flavonoles [73]

La capacit des flavonodes complexer les protines et les mtaux est probablement
lorigine de leur inhibition de nombreuses enzymes.
Complexation irrversible
Des phnomnes de complexation irrversibles avec les protines ont t aussi dcrits.
Loxydation des flavonodes conduit gnralement la formation de quinone ou de radicaux
phnoxy qui ragissent rapidement avec des fonctions amines et thiols prsentes dans les
acides amins des protines pour former un complexe polyphnol/protine li de faon
covalente [74].

2.2.3. Inhibition denzymes

De nombreuses enzymes sont inhibes par les flavonodes telles que les hydrolases, les
oxydorductases, ADN synthtases, ARN polymrases, phosphatases, protine kinases,
oxygnases, amino acide oxydases [75]. Dans le cas des oxygnases, plusieurs mcanismes
dinhibition ont t proposs :
- le pigeage des radicaux libres gnrs au cours du mcanisme ractionnel de
lenzyme (lactivit anti-radicalaire des flavonodes)
- le flavonode peut remplacer le co-facteur et empcher son recyclage en raison de leur
analogie structurale
- la complexation de Fe
2+
et Cu
2+
par les flavonodes. Ces ions mtalliques sont
essentiels lactivit catalytique de lenzyme.

18
Inhibition des lipooxygnases
Afin de prciser le mcanisme daction de lactivit inhibitrice des flavonodes, Sadik et
al. [76] ont tudi loxydation de lacide linolique par une lipooxygnase en prsence de
querctine. Leurs rsultats suggrent que le mcanisme dinhibition des lipooxygnases par la
querctine ne serait pas d une complexation ou une oxydation du Fe
2+
, mais plutt une
inhibition irrversible rsultant de liaisons covalentes entre lenzyme et les drivs oxyds de
la querctine (quinone ou radical phnoxy).
Comme pour lactivit antioxydante, certains lments structuraux (dj cits Tableau
I.2.) accentuent lactivit inhibitrice [76-78]. Les substituants ont par contre des effets
variables. Ainsi, la glycosylation diminue svrement leffet inhibiteur alors que la prsence
de groupes alkyles en position C
6
ou C
8
semble favoriser ce phnomne.

Inhibition de la xanthine oxydase
La xanthine oxydase (E.C. 1.1.3.22) catalyse loxydation de lhypoxanthine et xanthine
en acide urique, qui joue un rle important dans la maladie de la goutte et est responsable des
dommages oxydatifs des tissus. Durant la roxydation de la xanthine oxydase, il y a formation
dun radical superoxyde et dun hydrogne peroxyde :

Cette enzyme est donc considre comme une source biologique importante de radical
superoxyde. Il apparat que la structure planaire des flavonodes, due la double liaison C2-
C3, leur confre leur activit inhibitrice [79]. De plus, la prsence dun groupement carbonyle
en C4 ainsi que de groupement hydroxyle en C5, C7 permet linteraction lectrostatique au
sein du site actif amliorant lactivit inhibitrice. La haute affinit de certains flavonodes est
probablement due au grand nombre dinteractions stables se formant dans le site actif : les
groupements O , OH en positions 5 et 7 stabilisent lensemble dans le site actif. En revanche,
la glycosylation ou la m
9
thylation dun groupement hydroxyle diminue lactivit inhibitrice
[79-81].
Le mode dinhibition est variable selon le type de flavonodes, une inhibition
incomptitive en prsence de baicaleine et comptitive en prsence de querctine, apigenine,
myricetine, isovitexine, genisteine, allpurinol [63, 82, 83], alors que la morine et la galagine
montrent une inhibition de type mixte (ce qui explique la faible concordance entre la
19
prdiction et lIC50 exprimental) [82]. Iio et al. et Nagao et al. [84, 85] suggrent dans
lensemble un mcanisme mixte, une inhibition comptitive au niveau du site actif, mais ils
sugg
de flavonodes semble accrotre leur capacit dinhibition de lactivit
xanthine oxydase [86].

2.2.4. Activit de photoprotection
vets ont revendiqu lutilisation des flavonodes dans des
prpa
ffet aux proprits de pigeage des radicaux et de
filtre
toire ou
munitaire de cellules de kratinocyte exposes aux radiations UV par le silymarin.

rent que les flavonodes se fixent galement en dehors du site actif.
La polymrisation

Lexposition chronique de la peau aux radiations solaires est la principale cause de
mlanomes cutans. Les radiations UV solaires affectant la peau sont limites aux UVA (320-
400 nm) et aux UVB (280-300 nm). Alors que les UVB natteignent que lpiderme et les
couches superficielles du derme, les UVA pntrent plus profondment. La rponse
biologique ce stress peut tre immdiate et passagre (inflammation, brlure), retarde et
chronique (vieillissement de la peau, cancer). Ce stress oxydant induit entre autre une
augmentation des radicaux libres, qui dgradent les composants cellulaires : lipides, protines,
bases nucliques. Lutilisation des antioxydants, comme les flavonodes, peut prvenir ou
diminuer les dommages de la peau induits par les stress oxydants en particulier ceux des
radiations UV [87], en modulant la rponse cellulaire et en pigeant les espces radicalaires
oxygnes. En effet, plusieurs bre
rations anti-UV [25, 88-90].
Ainsi, Bonina et al. [88] ont tudi leffet protecteur des flavonodes (querctine,
hespritine, naringnine) contre la peroxydation des liposomes induite par des radiations UV.
Lefficacit des produits tests a t classe de la manire suivante : querctine > hespritine
> naringnine. Les auteurs ont attribu cet e
dans le domaine UV des flavonodes.
Saliou et al. [89] ont rapport linhibition de lactivation de la rponse inflamma
im
20
2.2.5. Toxicit

Les flavonodes sont largement dcrits dans les traitements cancreux. Nanmoins, leur
activ
ie
de sy
et al.
[28] observent qu 400 M la rutine induit une cytotoxicit fatale aux cellules alors qu la
me concentration, loligom contre le stress oxydatif.
3. P
arines sont le plus souvent englobes dans ltude des flavonodes. Nanmoins,
elle succinctement abordes dans cette partie.

3
Les coumarines prsentent une couleur bleu-vert dans le spectre visible. Peu de
publications f b
it pro-oxydante et leur habilit induire un disfonctionnement mitochondrial peuvent
engendrer une toxicit.
La notion de toxicit est controverse. Ainsi, il apparat que la querctine haute dose
induit la formation de tumeur chez le rat aprs un traitement de 2 ans [91], mais une autre
tude long terme nobserve aucun effet [92]. Au contraire, plusieurs tudes mettent en avant
lactivit antimutagne de la querctine in vivo [93-97]. A faible concentration (nM-M), les
flavanols de type picatchine agissent comme antioxydants et interviennent dans la voie des
protines kinases, mais hautes doses, les flavonodes maintiennent lactivation de cette vo
nthse induisant une apoptose [98]. La principale cause de cet effet est la capacit des
flavonodes se fixer aux sites ATP des enzymes diminuant la spcificit enzymatique.
Les polymres de querctine montrent une activit pro-oxydante au-del de 180 g/ml
[59]. En revanche, les polymres de rutine ne montrent pas dactivits pro-oxydantes (en
dessous de 300 M) alors que la rutine prsente une activit pro-oxydante 100 M [28]. Le
mme constat a t ralis sur les oligomres de catchine et la catchine [99]. Kurisawa
m re agit comme un protecteur

roprits et activits des coumarines

Les coum
s peuvent prsenter certaines spcificits
.1. Proprits physico-chimiques

ont tat des a sorbances UV des coumarines (Tableau I.3.).

21
Tableau I.3. Absorption UV des coum

Sub absorption U sible max
arines dans lthanol [100]
stitution V-vi
5-Me 315
6-Cl 321
7,8-diOH 335
6,7-DiOH 354
6-NH
2
370

3.2. Activits biologiques
st--dire la 1,2-pyrone, affecte peu lactivit
antioxydante de ces molcules. Par contre, la prsence dune fonction catchole a un rle
im

Tableau I.4. Effet de la structure sur les activits antioxydantes, inhibitrice denzyme et
cytotoxique des coum
teurs accroissant lactivit

Les modes daction des coumarines sont similaires ceux rapports pour les flavonodes,
toutefois limpact structural sur leurs activits peut varier (Tableau I.4.).
Kaneko et al. [101] et Zhang et Wang [102] ont tudi en particulier linfluence de la
structure des coumarines sur leur activit antiradicalaire. Ils ont mis en vidence que la
structure caractristique des coumarines, c'e
portant pour les proprits antiradicalaires.
arines [101, 103-105]

Activit Fac
Antiradicalaire nombre de groupements OH libres
la prsence dune partie catchol
inhibition de la
ase -C3
la petite taille des groupements substituants la position C4
xanthine oxyd
Absence de groupement en C5
Prsence de la double liaison C4
groupement OH libres en C7, C6
Cytotoxique prsence dune partie catchol
2 groupements phnoliques en positions 6,7 ou en 6,8

Les coumarines ont un potentiel cytotoxique pouvant savrer intressant dans le cas de
traitement anticancer [106]. En effet, il est apparu que la cytotoxicit des coumarines est
dpendante de la cellule cible. De part leur proprit chlatante, antioxydante et
antic gulante, les coumarines apparaissent comme des molcules potentiellement
cytotoxiques intrts thrapeutiques [106].

oa
22
4. Polymrisation enzymatique des flavonodes et des coumarines
4.1. Les oxydorductases

Une diffrence est observe dans la structure des polymres phnoliques selon quils
sont issus de la voie chimique ou enzymatique ; la voie enzymatique permet la synthse de
polymres conjugus en continu, alors que la synthse par catalyseur acide/base ou
inorganique entrane des pontages (mthylne ; CH3 ou ther ; O) entre les rsidus [107]. En
outre, la catalyse enzymatique se ralise en conditions douces de pH et de temprature, tout en
permettant une certaine regio-, chemo- et enantio-slctivit [108-110]. Les enzymes
impliques peuvent tre classifies en six groupes [110]: transfrases, hydrolases notamment
les lipases qui sont largement tudies [111], lyases, isomrases, ligases et les
oxydorductases. Parmi ces dernires, on compte notamment les peroxydases (HRP :
horseradish peroxydase, SBP : soybean peroxydase), les tyrosinases, les laccases et les
bilirubine oxydases [109, 112]. Les peroxydases utilisant comme accepteur dlectron lH
2
O
2
,
notre intrt se portera sur les laccases utilisant lO
2
(benzenediol oxygen oxidoreductase, EC
1.10.3.2). Cette enzyme fait partie des polyphnols oxydases tout comme les tyrosinases et les
catcholases (ces dernires se diffrencient par des valences de cuivre diffrentes
respectivement Cu
+
et Cu
2+
).

Les laccases peuvent tre dorigine fongique ou vgtale [113]. La laccase est une
oxydase bleue site cuivrique multiple [114, 115]. Cest une phnol oxydase denviron 70
KDa [116], de structure dimrique ou ttramrique comptant quatre atomes de cuivre par
monomre (Figure I.11.).
Les quatre atomes de cuivre sont classs selon leur caractristique spectroscopique, type
1 (610 nm, ou bleu, paramagntique), type 2 (non bleu, paramagntique) et type 3 (330nm
(ox.) dimagntique). Le phnomne doxydation se dveloppe partir du cuivre 1 [114], cest
galement ltape limitante du processus. Le Km est gnralement de 1-10 mM, ce qui
suggre une faible spcificit, loxydation se ferait donc par lintermdiaire dune sphre
externe. Ces observations sont corrler avec la thorie de Marcus pour laquelle, le stade
dterminant serait la rduction du substrat via le site T1 par une raction de sphre externe
dans laquelle, le taux de transfert des lectrons augmente avec la diffrence de potentiel entre
le potentiel redox du substrat donneur et celui du site T1 accepteur [117-119]. On diffrencie
les laccases faible (500 mV par rapport une lectrode hydrogne normale) et hauts
23
(700-800 mV) E
0
. Les laccases catalysent loxydation de complexes mtalliques organiques
ou non, aniline, thiols, et spcialement les phnols (mono- ou di-phnols), pourvu que leur
potentiel redox soit suffisamment bas [113, 118]. Elles prsentent en revanche une prfrence
marque pour lO
2
comme substrat oxyd [113, 114, 120]. La poche de fixation du substrat
rduit est peu profonde entranant une simple limitation strique de la taille du phnol reconnu
[118]. Ce spectre dactivit peut encore tre largi par lutilisation dun mdiateur.

Figure I.6. Structure dun monomre de la laccase de Trametes versicolor [116]. Les 4
cuivres sont reprsents par des sphres bleues : un cuivre de type 1 12.5 du cluster T2/T3
compos de 1 cuivre de type 2 et de 2 cuivres de type 3.

Inhibiteurs

Les tolrances et inhibitions varient dune laccase une autre [113]. De petites
molcules exognes (telles que O
2
, H
2
O, OH
-
ou F
-
) sont capables de se fixer T2 et ainsi
dinhiber lactivit enzymatique en rgulant le transfert interne d lectrons de T1 au cluster
T2/T3 [121, 122]. Lordre dinhibition par les ions halognes F
-
>Cl
-
>Br
-
est attribu la
limitation de laccessibilit des atomes de cuivre T2/T3 [118]. Linhibition dpend de la taille
du canal aboutissant T2/T3, il y a donc une variation dune laccase lautre. Leffet
inhibiteur a lieu si le diamtre du canal un seuil de coupure infrieur au diamtre des
inhibiteurs potentiels. Notons que lion halogne I
-
ne rentre pas dans la catgorie des
inhibiteurs, puisquil ragit avec le site T1 servant de substrat la laccase [123].
24
Dautres inhibiteurs rpertoris par Gianfreda et al. [113] peuvent tre envisags, tels
que les ions mtalliques (tels que Hg
2+
), acides gras, Ces inhibiteurs provoquent des
modifications des acides-amins, des chlations du cuivre ou des changements
conformationnels. Lensemble des effets des conditions ractionnelles sur lactivit laccasique
sera dcrit dans la partie procds de polymrisation .

Applications

Les laccases sont largement tudies dans le cadre de la dpollution des eaux uses
[124-129], de la dlignification [130] ainsi que dans le blanchiment [131-134], mais aussi
dans dautres domaines :
- Elle est utilise en tant que dtecteur biologique. La laccase peut tre adsorbe sur un
support solide et ainsi crer une lectrode ampromtrique dtectant les composs
phnoliques ou dautres composs en prsence de mdiateurs spcifiques [135-138].
Cette dtection repose sur la variation de potentiel entre lespce phnolique oxyde et
lespce rduite (Figure I.12.)

Fig ccase utilise comme dtecteur biologique [135,
139]
- on, la laccase est utilise comme immuno-
dtecteur (Figure I.12.) [139].
-
ure I.7. Mcanisme ractionnel de la la
Suivant le mme principe de dtecti
La laccase est utilise dans le cadre de la clarification du vin [140].
- La laccase est galement utilise dans le cadre de synthse, notamment de colorants
[141, 142].
25
4.2. M

Loxydation
la solution, o ils res [143].
tapes :
M
molcule forme par linitiation est
que deux radicaux se couplent pour
form
ent de transfert : ~CH
2
C
HX + CH
2
=CHX ~ CH
2
CH
2
X +
CH
2
=
utre, un phnomne de transfert par le solvant peut avoir lieu. Il a t tabli que plus
ce type de transfert est favoris, plus le mcanisme de terminaison sera prpondrant [144].
Ainsi, le contrle dune raction radicalaire ncessite une dure damorage des chanes
radical la propagation et des ractions de terminaison
rtement minimises [145].
canismes de polymrisation
4.2.1. Mcanisme radicalaire
enzymatique gnre des radicaux qui diffuseront du site actif de lenzyme
pourront interagir avec dautres monomres, formant des polym
Les ractions radicalaires se dcomposent en 3
M

: Linitiation ou lamorage consiste en la formation des radicaux partir dune
espce qui nen possde pas, mais qui peut en gnrer facilement. Dans ces
travaux, linitiation est catalyse par la laccase. Cest la premire tape de la
chane cintique.
M
+ M MM
: La propagation est une tape rapide. La

porteuse dun centre actif et est donc capable dattaquer une nouvelle
molcule de monomre, et ainsi de suite. La chane cintique se poursuit
par un grand nombre de ractions de cette nature.
M
+ M
MM ; MM

+ MM
MMMM:
La raction de terminaison consiste en la destruction du centre actif qui est localis
lextrmit de la chane en croissance. Dans leur grande majorit les ractions de terminaison
se font par combinaison ou par couplage, cest--dire
er une seule molcule. Dans certains cas, un mcanisme par dismutation peut avoir lieu
ainsi : CH
2
C
HX + XC
HCH
2
CH=CHX + XCH
2
CH
2
.
En marge de ces 3 tapes, des ractions de transfert peuvent avoir lieu. Une raction de
transfert implique que le centre actif de lextrmit de la chane soit transfr sur un autre
compos, qui est dit alors ag
C
X. Le plus souvent, cette raction provoque lactivation de lagent de transfert, qui

peut alors amorcer la croissance dune autre chane. La raction de transfert arrte la
croissance de la chane initiale, ce qui affecte la masse molaire moyenne du polymre. Plus il
y aura de transferts, plus la masse molaire sera limite.
En o
aire courte par rapport celle de
fo
26
Dans le cas dune polymrisation radicalaire, la principale difficult pour maintenir la
propagation est de contrler la trs grande ractivit des radicaux vis--vis du transfert et,
surto
res synthtiques elles sont de lordre de 10
6

10
8
s
-1
.

4.2.2. Type de pontage mis en jeu

Diffrents types de pontage ont t dcrits dans la littrature dans le cadre de
polymrisation enzymatique despces phnoliques, de type C-O, C-C mais aussi C-N [146].
Ainsi, loligomrisation de la catchine par la HRP aboutit un dimre form par un
pontage C5-C8 ou C2-C8 (Figure I.13.) [147].
ut, vis--vis de la terminaison. En effet, les constantes de vitesses des ractions de
terminaison sont leves ; dans le cas des polym

Figure I.8. Pontage observ dans le cas de loligomrisation de la catchine par HRP [147]

A ltat naturel, dans le cas de loligomrisation de la catchine, un simple et un double
pontage ont t dcrit [148-150] (Figure I.14.).
27

Figure I.9.

Sim
res forms par catalyse
enzym tique, mais la majorit dentre eux ne font que formuler des hypothses (Tableau I.5.).
Ainsi
r HRP et SBP.

ple et double pontage de polyflavane [150]
Certains auteurs dmontrent la structure des oligom
a
Pinelo et al. [151] proposent un pontage de la querctine de type C5-C8 dans le cas
dune polymrisation sans catalyse enzymatique (Figure I.15.), Mejias et al. [34] observent
une bande infra-rouge vers 1158 cm
-1
correspondant un pontage ther, puis sappuient sur
les dlocalisations lectroniques pour supposer un pontage de type C-O au niveau du cycle B
lors de loligomrisation de la rutine pa
28
Tableau I.5. Modes de pontage rpertoris dans la littrature

Enzyme Substrat pH Pontage
(technique analytique)
Rfrence
Laccase R.vernificera Hydroquinone 7.4 C-C (RMN) [147]
Laccase Picnoporus
coccineous
2,6-
dimethylphenols
5.0 C-O (IR) [152]
Aucune Querctine 6.7-6.5 C-C suppos [151]
HRP, SBP Querctine 7.0 C-O (FTIR) [34]
Laccase Myceliophtora Rutine 5.0 Aucune bande en IR [28]
Laccase Myceliophtora Catchine 5.0 C-C (FTIR) [99]
Laccase Trametes villosa Bisphenol A 6.0 C-C (RMN) [153]
Laccase T. versicolor -naphtol 5.0 C-O (FTIR) [143]
Laccase picnoporus
coccineous
Acide syringique 5.0 C-O (RMN) [154]
accase picnoporus
coccin
Phnols 5.0 C-O suggr (FTIR) [155]
C observs sur le
res (RMN)
[156]
accase Pycnoporus
coccineu
Phnols 5.0 C-O et C-C (FTIR, mthode
de titrage des liaisons ther)
[155]
L
eous
Laccase Trametes pubescens Totarol 5.0 C-O et C-
dim
L
s
HRP : x

Le type de pontage peut tre modifi selon les conditions de synthse, ainsi un pH acide
favorisera un pontage C-C, alors que le C-O sera favoris pH basique [157]. La nature du
olvant organique influe sur la localisation du pontage [158], ainsi que sur le type de pontage
[155,
Horseradish pero ydase, SBP : Soybean peroxydase
s
156]. Cet aspect de contrle du mode de pontage sera abord plus largement dans la
partie procds de polymrisation .
29

Figure I.10. Clivage oxydatif et polymrisation de la querctine [151]

La synthse doligocoumarines a t trs peu tudie ; nanmoins, des dimres obtenus
par photodimrisation ont t rpertoris [159, 160] (Figure I.16.).

Figure I.11. Pontage par photodimrisation de coumarine [159, 160]

4.3. Procds de polymrisation

Cette partie a fait lobjet dun projet de revue intitule: Process of enzymatic
polymerization of phenolic compounds by oxidoreductases.
30
Chapitre I. Etude Bibliographique
PROCEDES DE POLYMERISATION ENZYMATIQUE DE COMPOSES PHENOLIQUES PAR DES
OXYDOREDUCTASES

Julie Anthoni, Jean-Marc Engasser, Catherine Humeau, Mohamed Ghoul *
Laboratoire Biocatalyse Bioprocds, ENSAIA-INPL, Vandoeuvre les Nancy, France

author for correspondence E-mail : mohamed.ghoul@ensaia.inpl-nancy.fr,
fax : 0033383595778

Rsum
La poly sation enzymatique de composs phnoliques suscite de plus en plus dintrt dans mri
les do
prop anti
polym
en nt
struc s p
structure et don
procds utiliss et les facteurs clefs (temprature, solvant, origine de lenzyme, structure du substrat,
architecture du racteur, ) qui contrlent la polymrisation enzymatique despces phnoliques par
les oxydorductases, pour obtenir des polymres avec des caractristiques et des proprits voulues.

Mots clefs : procds, polymrisation, enzyme, oxydorductases, phnols.
maines alimentaire, cosmtique et pharmaceutique. Lutilisation de ces composs pour leurs
rits oxydantes est limite par leurs faibles solubilits et stabilit thermique. Leur
risation permet damliorer leur solubilit et/ou leur stabilit thermique, tout en augmentant ou
cra de nouvelles proprits. Ces proprits sont dpendantes de la masse molculaire et de la
ture de olymres. Le rendement de la raction, la polydispersit, la masse molculaire, la
c les proprits des polymres synthtiss peuvent tre contrls par le mode de
conduite de la raction et par les conditions ractionnelles. Dans cette revue, nous analysons les
31
INTRODUCTION................................................................................................................................................33
1. MCANISME DE LA POLYMRISATION ENZYMATIQUE PAR DES OXYDORDUCTASES
...33
2. DIFF

RENTS SYSTMES DE POLYMRISATION..........................................................................34
2.1. SYSTME MONOPHASIQUE.................................................................................................................. 36
2.2. SYSTME BIPHASIQUE......................................................................................................................... 36
2.3. EFFETS DES CONDITIONS OPERATOIRES .............................................................................................. 39
2.3.1. Effet de lenzyme....................................................................................................................... 47
2.3.1.1. Forme libre..................................................................................................................................... 48
2.3.1.2. Forme immobilse.......................................................................................................................... 48
2.3.2. Effet du substrat........................................................................................................................ 50
2.3.3. Effet du pH................................................................................................................................ 51
2.3.4. Effet des espces ioniques......................................................................................................... 52
2.3.5. Effet de la temperature ............................................................................................................. 53
2.3.6. Effet du solvant ......................................................................................................................... 53
2.4. EFFET DU MODE DE CONDUITE DE LA REACTION. ................................................................................ 54
2.4.1. Ajout du peroxyde dhydrogne ............................................................................................... 55
2.4.2. Les diffrents modes de conduite de la raction....................................................................... 55
CONCLUSION ....................................................................................................................................................56
32
Introduction

Ces dernires annes les composs polyphnoliques ont suscit un vif intrt pour des
applications alimentaires, pharmaceutiques et cosmtiques. Cet intrt est d principalement
leur activit antioxydante. Cependant, leur faible solubilit et stabilit thermique limitent leur
utilisation. Pour contourner ces difficults, la polymrisation de ces composs a t prsente
comme une alternative prometteuse. La polymrisation permet l'obtention de nouveaux
drivs avec des proprits physiques et biologiques amliores. En effet, les polymres
obten
transfrases, les hydrolases, les
lyase
er les procds utiliss et les principaux facteurs
contrlant les ractions de polymrisation enzymatique des polyphnols par des
oxydorductases.
1. M
paux groupes de phnoloxydases utiliss dans le procd de
polymrisation des composs phnoliques sont les laccases (E.C. 1.10.13.2) et les
polyphnoloxydases (E.C. 1.14.18.1). La diffrence principale entre ces deux groupes rside
dans la nature du co-substrat utilis: de l'oxygne pour les laccases et du H
2
O
2
pour les
polyphnoloxydases.
Les laccases sont produites soit par des champignons (Trametes versicolor,
Myceliophotore, Pycnoporus,) soit par des plantes (Rhus vernicifera, pinus taeda,) [12,
us ont une solubilit [1-4], stabilit thermique [4-7] et activit antioxydante amliores
[1, 8, 9] par comparaison au monomre. La polymrisation peut tre obtenue par voies
chimiques [10, 11] ou enzymatiques. La voie enzymatique est plus attrayante, parce qu'elle se
droule dans des conditions plus douces de pH et de temprature et permet l'obtention de
polymres avec des structures plus contrles grce la rgio-, chemo-, et l'nantio-
slctivit des enzymes. Diffrentes classes d'enzyme peuvent tre utilises pour catalyser une
polymrisation enzymatique comme les oxydorductases, les
s ou les isomrases. De mme, plusieurs procds peuvent tre mis en application pour
effectuer ces ractions. Les conditions de fonctionnement de la raction et le procd utilis
affectent la polydispersit (PDI), la masse molculaire et les activits biologiques des
polymres synthtiss.
Dans cet article, nous allons analys

canisme de la polymrisation enzymatique par des oxydorductases

Les deux princi
33
34
13]. Quatre cuivres de type T1, T2 et T3 font partie du site actif de ses oxydases, d equel,
le substrat est oxyd pour produire des espces radicalaires, qui initieront la raction de
polym n. dation t c e par rence de potentiel redox entre le substrat
rducteur et le cuivre de type 1 [14]. Deux types de laccases existent, les lacca
potentiel redox faible (500 mV) et les laccases avec un potentiel redox lev (700-800 mV).
Les laccases ont une forte spcificit pour leur co-substrat (loxygne) mais une faible
spcificit ur le substrat. Le spe e large e substrats ptibles par
les laccases fer ine, anilines, tion
dun mdiateur tel que lABTS (3-et
L' les plantes e c,
peroxydase d'
lactoperoxydase,...)[17]. Les peroxy ent distribue
utilises sont celles issues du raifort (HRP) et du soja (SBP). Ce
compos d
substrat en prsence de peroxyde d'hyd gne, l rant deux m d'
espce radicalaire qui initialise la raction de polymrisation.
es laccases roxyd s sont lorigine de linitiation des ractions de
polymrisation de diffrentes e e icaux n'
en dcrit avec ion a t tabli que les conditions opratoires de ise en oeuvre de
ces ractions affectent le degr de polymrisation, la masse molculaire, la polydisp t le
type de liaisons entre monom res
2. Diffrents systmes d

atique mres phnoliques ont t dcrits :
systme m op e, sy e biphasique, systm r m elle inverse et par balance de
Langm
ans l
ses avec un
utilisa
mant une
est pas
ersit e
risatio L'oxy es ontrl la diff
po
(
ascorbate de plante
un he
ur
yanid
e-protinique avec une porphyr
ctr
phnols.), peut de surcrot tre la
hylbenzothiazoline-6-
micro-organism
dases sont largem
ro
d
ine ferrique. Elles catalysent loxydation du
ib
susce
(peroxydase de cytochrom
aux (m
s dans la nature, les plus
s peroxydases ont un site actif
olcules
d'tre rduit
rgie par l'
yeloperoxydase,
eau et for
roc
m
sulfonique) [15, 16].
es, et les anim
activit peroxydasique a t identifie dans
,), les
L
core

Quatre systm
et les
prcis
pe
espces phnoliques.
, il
ase
Mm si le transfert d s rad
m
[18
e p
].
olymrisation
es de synthse enzym
iqu
des poly
e pa on has stm

ic
uir (Tableau 1).
35
Tableau 1. Different systems ma lic compounds
System Solvent/phase e
of enzy tic polymerization of pheno
Enzyme Substrat Observations Refer nces
1,4dioxane, DMF or methano her yield: 1,4 dio 9] l with water HRP phenol Hig xane 20-60 %, DMF 20 or 40 % at
30 C, 4h
[1
Dioxane/acetate buff Activity of en 0] er HRP phenol zyme up to 95 % of solvent [2
Tert-butanol, Ionic liquid: [(4-
[(BMIM)PF
6
]
2-
l,
er yield of anth
MBP)BF
4
] comp
pre
1] MBP)BF
4
], Laccase C, HRP, SBP Syringaldazine,
methoxypheno
anthracene
High racene oxidation by laccase C in [(4-
ared at Tert-butanol medium, in
sence of mediator
[2
Ionic liquid: [bmim][Tf
2
N], [
[omim][PF
6
]
Microp ol Higher a 2] bmim][PF
6
], eroxidase-11 2-methoxyphen ctivity in [bmim][Tf
2
N] [2
Succinate buffer/1, Glucose igher yield: 1,4 3] 4 dioxane oxidase/HRP phenol H dioxane/succinate buffer (15/10) [2
Monophasic
system
Phosphate buffer/DMF (8 ri-enzy
inver
oxi
The three enzy
microfluidic channe
identical to SBP ca
4] 0/20 %) T matic system:
tase/glucose
dase/SBP
p-cresol, sucrose mes are immobilized on glass
ls, the kinetic properties are nearly
talysis in solution
[2
Isooctane/buffer l Good monomer 5] HRP p-ethylpheno conversion, fair polymer yield [2
Biphasic
system
Sodium acetate buffer/solv
Solvent: AcOEt, CHCl
3
, meth
ether, t-amyl alcohol or
Lacca
p
The reaction were 6] ent (v:v)
yl tert-butyl
toluene
se Trametes
ubescens
totarol observed to proceed very slowly [2
AOT/isooctane
AOT/isooctane/CH
l Higher y
Higher M
w
: i
]
Cl
3
HRP p-ethylpheno ield: 100 % isooctane
sooctane/ CHCl
3
(25/75 %)
[5
Reversed
micelle AOT/isooctane Laccase hosted in th
high catalytic activit
laccase did not ex
7] laccase o-chlorophenol e AOT reversed micelle exhibited
y in isooctane, whereas lyophilized
hibit catalytic activity in organic
solvents.
[2
Langmuir
Blodgett
HEPES buffer l The polymers are
stability and significa
8] HRP Aniline, pheno ordered and have a good thermal
nt optical and electronic properties.
[2
DMF: dimethylformamide, HRP: Horseradish p ybean succinate, [bmim][Tf
2
N]: 1bu e, [bmim][PF
6
]:
hexafluorophophates of 1-octyl-3methylimidaz ]: hex midazolium, [(4-MBP)BF
4
] : F
6
] : 1-butyl-3-
methylimdizaolium, HEPES: 4-(2-Hydroxyethyl) esulfo
eroxidase, SBP: So
olium, [omim][PF
peroxidase, AOT: dioctylsodiumsulfo
afluorophophates of 1-octyl-3methyli
nic acid
tyl-3-methylimidazolium bis(trifluoromethylsulfonyl)imid
4-methyl-N-butylpyridiniul tetrafluoroborate, [(BMIM)P
6
piperazine-1-ethan
2.1. Systme Monophasique

Dans c raction est affecte par plusieurs facteurs comm
pourcentage de solvant organique, le pH, la temprature, les concentrations d'enzyme et de
Pour les composs phnoliques simples, les polymres obtenus prcipitent
facilement, c 20] tandis qu ur de olcules phnoliques
plus complex ynth s peuvent tre hydrosolubles.
IM) PF6, (BMIM) Tf2N, (OMIM)
PF6)) sont stme [29-31]. Ils offrent les avantages d'tre non-
nt stables, faciles sparer et
composs phnoliques sont solubles dans ces solvants et les enzymes y prservent leur

asique

e comme illustr dans le
Tableau 2 [5, 25, 33, 34].
Ces travaux rapportent notamment que la masse moyenne en poids (Mw) et le
rendement de conversion sont dpendants des phases utilises, et que les vitesses de ces
ractions sont souvent faibles du la limitation du transfert de matire entre les phases [35].

e systme, la e la nature et le
substrat.
e qui facilite leur extraction [19, e po s m
es comme les flavonodes, les polymres s tis
En plus des solvants organiques, les liquides ioniques ((BM
galement utiliss dans ce sy
volatiles, non-inflammables, thermiqueme rutilisables [32]. Les
activit.
2.2. Systme biph
Ce systme est fait de deux phases non-miscibles comme le tampon HEPES et eau-
isooctane ou eau-chloroforme. Ces deux phases sont disperses par agitation pour former une
micromulsion o l H
2
O
2
est ajout graduellement pour initier la raction de polymrisation
par les peroxydases. Ce systme vite la contamination bactrienne et l'utilisation
dmulsifiant [25]. Il vite galement l'inhibition de l'enzyme par le substrat et sa dnaturation
par les solvants organiques. Plusieurs travaux ont tudi ce systm
36
Tableau 2. Effect of solvent composition on polymerization by Horseradish peroxidase in
biphasic system.
Substrate Synthesis medium M
w
Monomer
conversion
(%)
Polymer
yield (%)
References
85/15 dioxane/water 3000 80
a
15
b
AOT reversed micelle in 100% isooctane (w
0
:15) 2500 100
a
100
b
AOT reversed micelle in 100% isooctane (w
0
:9) 2500 90
a
100
b
p-ethylphenol
AOT reversed micelle in 100% CHCl
3
(w
0
:7; phase separation) 1000 20
a
10
b
[5]
p-ethylphenol Isooctane/buffer biphasic system 1700 [25]
80/20 dioxane/phosphate buffer 18 Catechol
AOT reversed micelle in 100% isooctane 36
[33]
85/15 dioxane/water 95 ~20 Ethylphenol
AOT reversed micelle in isooctane (w
0
:15) ~ 95 ~95
[34]
AOT: dioctylsodiumsulfosuccinate , W
0
: molar ratio of water to surfactant, a: monomer converted/ monomer added initially, b: ratio of the
amount of polymer recovered as an insoluble fraction in isooctane to the amount of monomer converted

Micelles inverses:
Le systme le plus utilis en micelle inverse se compose d'isooctane/eau/sodium
dioctylsulfosuccinate (Figure 1) [5, 25, 33, 36]. Cependant, d'autres agents tensio-actifs
peuvent tre utiliss comme le bromure ctylique et le bromure d'thyle poly(thylne imine)
[37]. Les micelles inverses nanostructures induisent une activit enzymatique leve dans les
solvants organiques, car dans ces systmes les enzymes maintiennent leur structure
tridimensionnelle grce l'eau renferme dans les micelles. Ainsi, l'activit des peroxydases
est plus de 20 fois plus leve dans ce systme que dans leau [38].
37

Figure 1. Type of association used for the enzymatic polymerization of phenolic
compounds.
No structuration
Langmuir Blodgett film balance

Enzyme
surfactant
monomer
Aqueous phase
Organic phase
Buffer and
enzyme
Air
Monomer
Polymer layer
HRP alternate with
polyanions
Polyanions
Melamine formaldehyde
Polyelectrolyte
negatively
charged
- -
-
-
- -
+
+
+ +
+ +
+
+
Monomer
Reversed micelle
Template association
Association by Layer-by-Layer
38
39
Les rendements de conversion sont identiques ou accrus par rapport ceux obtenus dans
un milieu dioxane/eau (Tableau 2). Ils sont affects par le rapport molaire eau/agent tensio-
actif [5] et par la prsence de certains tion complte
de l'agrgation. Cependant, la prsence de LiBr faible concentration perm
Mw de polymres [5].

Balance de Langmuir
sels comme LiBr qui entrane une dissocia
et le contrle de la

et l'orientation des m phiphiles inte me
air-eau pour obtenir des structures en m
type de liaison m onomres et formation des struc para.-para.
Elle limite galem nt des polymres [28,
39, 40]. Ce systm et daccrotre la stabil ique et les pr rits lectroniques
des polymres synthtiss [28].
. Effets des conditions opratoires
e de maintenir lactiv
dassurer la solubilit du substrat. L milie aturel de lenzyme est l u alors que les
su ats phnoliques sont plutt solubles dans les solvants organiques. Il apparat donc
ncessaire de chercher un com i
an et synthtis les effets de lorigine de lenzyme, de la nature du bstrat et des
co ions op oir sur la raction de polym iqu dan e Tab 3.

Cette technique perm

2.3

Les conditions de synthse doivent perm
bstr
alys
ndit
olcules am
vite
roises et de branchem
it therm
l'
sation perm
e
op
rface du syst
et de contrler le
tures
onocouches. Cette organi
is en jeu entre m
ent le phnom
e perm
la
ne de liaisons c
ettr it de lenzyme et
ea e u n
deux critres. Dans cette partie, nous avons prom s entre ces

es
su
s l rat risation comme ind leau
Tabl odifica mpacts o s of e poly erization eau 3. M tions and i f reaction condition nzymatic m of phenolic compounds.

Factors Catalyst Substrate
er (pH) Co-factor Time
rences
Solvents (%) Buff Temperature
Note refe
Laccase (TP) (3
U/ml)
Totarol (0.5 g/l) onitrile,
, CHCl
3
,
butyl ether, t-
amyl alcohol, toluene
sodium
acetate buffer
Under air 20-30-40-50 24 h [26] Methanol, acet
acetone, AcOEt
methyl tert-
(50)
(4-7)
Optimal: pH 4.5-5, 30 C, acetone
Laccase (TP) (0.6
U/ml)
8-hydroxyquinolin Sodium
acetate (5)
Under air 20-30-40-50-65 Up to 72 h [41] e Acetone (8) Optimal: 30 C
Laccase (TV)
(0-275U/L)

pyrogallol (0-3g/l) Tampon
sodium acetate
(3-7)
O
2
(0-
20mg/l)
25-55 60 min Optimal : pH 4,5, 45C and 18 mg/l dissolved oxygen [42]
Laccase (TV)

-naphtol (23-13636
g.m
-3
)
acetone (0-80) sodium-
acetate buffer
(3-5)
sodium
phosphate
buffer (6-8)
O
2
(12-20
g.m
-3
)
24-50C Up to
stabilization
Optimal: 50 %acetone, pH 5, 3409gm
-3
monomer,
20.3gm
-3
in dissolved O
2
, 0.173U/cm
-3
Average molecular weight 4920 Da
[43]
Laccase (TV)
(25U/L)
Catechol (0.3 g/l) Tampon
sodium-acetate
(4,5- 5,5)
O
2
35-45 60 min Optimum conditions estimate by RSM at 43,5 C, pH
4,87, 13,5 % acetone, 300 mg/ml catechol and 0,025
U/ml to obtain 0,128 mg DO/min L for initial oxidation
[44] acetone (10-20)
rate
Lac
(0-30
case (TV)
U/L)
(0.025-10 g/l) acetone (0-70)
ate
r (6-8)

O
2
(250; 10
mg/l)
250 min l initial rate : 10 %acetone, pH 5, 25 C, 0,02 [45] catechol sodium-
acetate buffer
(3-5)
sodium
phosph
buffe
25-60 Maxima
U/ml, 250 mg/L S, 10mg/l dissolved oxygen
40
Laccase (MYL)
(1.45 10
-3
; 5.5 10
-
3
; 14.5 10
-3
U/L)
Rutin (10 g/l)
derivate of rutin
ol
(30;50;70;100)
phosphate
buffer(7)
acetate buffer
Under air Room
temperature
24 h Higher yield (81 %) with pH 5, 30%MeOH, 5.5*10
-3
U/L
Higher M
n
(11.10
-3
) with pH 5, 100%buffer, 5.5*10
-3
U/L
[1] Methan
(5)
Laccase (MYL)
(1.2 10
3
;2.0 10
3

2.8 10
3
;3.6 10
3

U/L)
g/l) Acetone (3-20)
3-20)
5)
buffer
(5)
er air
temperature
24 h
e)
e)
[9] Catechin (
Ethanol (5)
Methanol (
Isopropanol (
Acetate Und Room Higher yield: 95% (80% acetate buffer pH5, 20%
aceton
Higher M
n
: Mn:7000-8000 (93% acetate buffer pH5, 7%
aceton
Laccase (PCL)
(2.95mg)
Syringic acid (20 g/l)
Acetonitrile 50
0
methyl ethyl ketone 50
THF 50
Acetone 40
acetone
/chloroform/buffer
acetone/chloroform/buffe
r 25/37.5/37.5
Acetate buffer
(5)
Room
temperature
24 h yield: 86% (50% 1,4-dioxane, 50% acetate buffer
form,
tate buffer pH5)
[46] Acetone 50
1,4-dioxane5
ethanol 50
methanol 50
33/17/50
Under air Higher
pH5)
Higher M
w
: 18000 (25% acetone, 37,5% chloro
37,5% ace
Laccase (PCL)
50l
Phenol
m-cresol
bisphenol A
4-TBP
(30g/l)
Methanol fer
an
e
solvent and
buffer
Room
mperature
24h 50:50):
100 %
[47]
2-propanol
1-propanol
ethylene glycol
1,4-dioxane
Acetate buf
(5) in
equivolum
mixture
te
Higher conversion with 4-TBP in acetone/buffer (
Higher Mn with bisphenol A in 2-propanol/buffer (Mn:
21300)
41
acetone
50
Laccase (PCL)
2.95 mg HRP
2,6-dimethylphenol
(12.4 g/l)
0-
ne 60
Methanol 60
Acetate buffer
(3-12)
Laccase: under
air
Peroxidases:H
2
O
2
is added to
the mixture
every 15 min
for 10 min
Under air
Room
temperature
24 h Laccase:
Higher yield: 61% (40% 1,4-dioxane, 60% acetate buffer
cetate buffer
HRP:
Higher yield: 33% (40%acetone, 60% acetate buffer)
Higher M
w
: 6290 (40% ethanol, 60% acetate buffer)
[48]
10mg, SBP
Acetone 2 90
1,4-dioxa
Ethanol 60
pH5)
Higher M
w
: 8140 (40% acetonitrile, 60% a
pH5)
PCL 2.95 mg,
HRP, SBP 10mg
ybenzoic acid
/l)
Methanol 40
1,4-dioxane 40
2) 5
mM)is added
to the mixture
every 15 min
for 10 min
Under air
Room
temperature
4 h

buffer pH5)
HRP:
Higher yield: 79% (40% acetone, 60% acetate buffer
pH5)
Higher Mw: 15100 (40% acetone, 60% acetate buffer
pH7)

4-hydrox
derivatives (16.8g
Acetone 40 Acetate buffer
(3-1
H
2
O
2
(30 %,
28l, 0.2
2 Laccase:
Higher yield: 86% (50% 1,4 dioxane, 50% acetate buffer
pH5)
Higher Mw: 7700 (40%acetone, 60% acetate
[49]
1,4-dioxane (60;80)

Acetate buffer
(5)
buffer (5,5)
Phosphate
buffer (7)
The ratio of DMF-soluble part of polymers dependent on
the polymerization condition, mainly the mixed ratio of
xane, in air atmosphere. Higher yield
(78 %) with pH 5.5, 60 % 1,4-dioxane in oxygen.
Succinate 1,4-dioxane and a buffer. The higher Mn (14700) with
pH 5, 80 % 1,4-dio
HRP (10mg)
Acetonitrile (15/10)
10)
(15/10)
10)
(15/10)
Succinate
H
2
O
2
formed
in-situ by

or
Room
temperature
48h
Higher yield 78% (60% methanol, 40% succinate buffer
[50] Phenol (18.8 g/l)
Acetone (15/
1,4-dioxane
Ethanol (15/
Ethyl acetate
buffer (5,5)
glucose
oxidase
(10mg):
glucose 36.4
g/L
Under air
oxygen
pH 5,5)
Higher Mn 7500 (20% 1,4 dioxane, 40% ethyl acetate,
40% succinate buffer pH 5.5)

42

opanol (15/10)
acetate
(10/5/10 ; 7,5/7,5/10 ;
5/10/10)
Methanol (15/10)
iso-pr
1,4 dioxane/ethyl
HRP (10mg) p-cresol
p-ethylphenol
p-n-butylphenol
p-n-pentylphenol
at (18.8g/l)
1,4 dioxane (60) Succinate
buffer (5.5)

Higher Mn (4400) with p-cresol
Higher yield (72 %) with p-n-pentylphenol

p-n-propylphenol
HRP (95 10
3
U/l) Phenols
p-methoxyphenol
ol
ethylphenol
4,4-biphenol
aniline
1-naphtol
2-naphtol
p-tert-butylphenol
p-phenylphenol
at 5-100mM
Dioxane (0-100) Acetate buffer
(5) 20mM)
Activity of enzyme up to 95 % solvent
Average molecular weight up to 2.6. 10
4
Da with p-
[20]
p-cresol
p-chlorophen
2,6-dim
H
2
O
2
, 20l at
30 % (
phenylphenol in 85 % dioxane
HRP (16 10
3
U/L) Phenols (2.235g,
2.50mmol)
ne
DMF
00
distilled water Solution at 30
% H
2
O
2
added
16 times at an
interval of 10
min
10-60 C 10 min, 4 h,
48 h
Higher yield: >98 % (1,4 dioxane 20-60 %, DMF 20 or
40 % at 30 C, 4 h)
[19] 1,4-dioxa
Methanol
0,20,40,60,80,1
HRP 4,4-biphenyldiol
tone
Phosphate
buffer (7)
H
2
O
2
(batch) Room
temperature
24 h Higher yield 97 % (80% THF, 20% phosphate buffer
pH7)
[51] Acetonitrile
Ace
1,4-dioxane
ethyl acetate
Higher M
n
26000 (80% isopropyl alcohol, 20%
phosphate buffer pH7)
43
isopropyl alcohol
THF
HRP (0.1g/l) m-cresol (0.1M;0.2M) Ethanol (0-100) HEPES buffer Dropwise
addition H
2
O
2

r
Room
temperature
24 h [52]
in excess of
30% compared
to monome
Higher yield (over 90%) and M
w
(7000) with 20%ethanol
HRP, SBP 40-120
10
3
U/l
(1.32 g/l) 1,4-dioxane (80) Phosphate
buffer (7),
acetate buffer
(5)

every
15min for 16
times
25 C 24 h HRP<SBP
Yield of polymer is pH-dependant
Higher yield: 60.6 % (phosphate buffer)
[33] Catechol

30 %
H
2
O
2
(28l,
0.25mM)
addition
HRP (17.6 U/l) 4-TBP, 4-IPP,
P, 4-MP
Ethylene glycol
1,4dioxane
1,3-dioxane
2-propanol
1-propanol
ethylene glycol
DMF
Methanol
Acetone
t-butyl alcohol
ethylene glycol
50
Phosphate
buffer (7)
H
2
O
2
(3.2ml 5
%, 5.3 mmol)
over
Room
temperature
3h Log P and monomer substituent dependant
With 4-TBP:
ld 98% (50% 1,4-dioxane, 50% phosphate
buffer pH7
Higher M
w
) 2400 (50% 1-propanol or t-butyl alcohol,
50% phosphate buffer pH7)
[53]
After 1h
precipitate
materials
were
collected
4-CHP,
4-E
(30g/l) added
dropwise
2h under air
Higher yie the
HRP 10-50mg Phenols 10.6 mmol Methanol 25,50,75 4, 5, 8 H O added Room
erature
30h Enzyme origin, buffer pH, mixed ratio of alcohol and
amount of HRP, concentration and
[4]
(10U/mg) (phosphate
2 2
dropwise for temp buffer, purity and
44
buffer for pH
7) ight and solubility of the polymer.
Mw (8.10
-3
) in 2-propanol/buffer (pH 7) (1:1)
25h addition rate of hydrogen peroxide strongly affected the
molecular we
Higher yield (80%) in 2-propanol/buffer (pH5) (1:1), and
higher
HRP (20mg/50ml) Phenols with different
substituents (32.8g/l):
p-CH
3
p-n-C
3
H
7
p-i-C
3
H
7
H
dioxane (80) Phosphate
buffer (7)
0,5 mmol
(0.56l) of
hydrogen
peroxide was
added 20 times
15 min
Room
temperature
24h Higher yield with p-i-C
3
H
7
(95%) [6] 1,4-
Higher Mn with no substituent phenol 35000

p-t-C
4
H
9
p-n-C H
after
5 11
p-n-C
7
H
15
intervals
o-i-C
3
H
7
m-i-C
3
H
7
HRP m-ethynylphenol
24 g/l
Methanol (50) Phosphate
buffer (7)
Hydrogen
peroxide
(5%,1.7ml,
2.5mmol)
added
dropwise for
2h
Room
temperature
under air
3h Mw: 1700 [7]
HRP
SBP
20mg in 25ml
Cardanol 24g/l Methanol
Ethanol
2-propanol
t-butanol
1,4-dioxane
50
Phosphate
buffer (7)
H
2
O
2
added
continuously
by a perfusion
pump for 6h
Room
temperature
24h With SBP:
Higher yield 62% (50% 2-propanol, 50% phosphate
buffer pH7)
Higher M
w
12808 (50% methanol, 50% phosphate buffer
pH7)
HRP is inefficient for polymerization of caradanol.
[54]
HRP 8.8 U/ml
SBP 8.32 U/ml
Bisphenol
Dihydroxydiphenylmeth
Acetone Phosphate
buffer (7)
H
2
O
2
(5%,
3.5ml, 5mmol)
Room
temperature
3h With bisphenol
HRP
[55]
45
46
mol in 25ml
ropanol
thanol
one
ad
dr
rea
mi or 2h
ate ane
5.0 m

2-p
me
acet
50
ded
opwise to the
ction
xture f
Higher yield 100% (50% 2-propanol, 50% phosph
buffer pH7)
Higher M
w
5400 (50% 2-propanol, 50% phosphate buffer
pH7)
SBP
Higher yield 99% (50% 2-propanol, 50% phosphate
buffer pH7)
Higher M
w
3040 (50% 2-propanol, 50% phosphate buffer
pH7)
: va this par /10): ratio 15 ent an
M
w
: rage m mass, M
n
: number-average ecular ma F: dimethyl e, THF:
HRP: ish per S sicolo ase Pi rius,
TP: la metes
riation of
weight-ave
Horserad
ccase Tra
ameter (15
olecular
oxidase,
pubescen
solv d 10
mol
buffer
ss, DM formamid
r, PCL: Lacc
tetrahydrofuran
cnoporus coccineous, CCP: Laccase Coprinus cine BP:
s
Soybe
, MYL: Lac
an p
case
eroxid
Myc
ase,
eliop
TV: L
htora
acca

se Trametes Ver

2.3.1. Effet de lenzyme

est de 5.0010 S.cm , contre 0.2510 S.cm
pour
Le type (laccase, peroxydase) et lorigine (HRP, SBP, CCP, .) de loxydorductase
utilise lors de la polymrisation peuvent avoir un impact sur les performances de cette
raction, la structure et les proprits des polymres obtenus (Tableau 4). Ainsi, Ikeda et al.
[41, 42] ont observ en prsence de 2-6 dimthylphnol ou de lacide 4-hydroxybenzoique
des rendements et des Mw variables selon le type de catalyseur utilis, en loccurrence une
laccase ou une peroxydase. De mme, ces auteurs ont not que les Mw des polymres
synthtiss diffrents selon lorigine de la peroxydase (HRP ou SBP). Lorigine de lenzyme
affecte aussi la conductivit des polymres synthtiss. Ainsi, la conductivit des
poly(catchol) obtenu par catalyse par HRP
-9 -1 -9 -1
ceux obtenus par catalyse par SBP [33].

Tableau 4. Polymerization of 2,6-dimethylphenol or 4-hydroxybenzoic acid by different
source of catalyst, in acetone and acetate buffer (40:60% vol.), at room temperature for 24h
under air.
Monomer Group Species Yield (%) M
w
PD References
HRP 33 57600 1.8 Peroxidase 2,6-
SBP 38 81000 1.8 dimethylphenol
57 5400 2.0
[48]
Laccase CCP

HRP 79 13200 Peroxidase
SBP 72 14700
CCP

62 11500
PCL 80 7700
MYL 83 9600
xybenzoic
acid
Laccase
POL O
4-
hydro
[49]
Mw: weight average molecular mass; PD: polydispersity; CCP: laccase Coprinus cinerius; PCL: laccase
Pycnoporus coccineus; MYL: laccase Myceliophthore; POL: laccase Pyricularia oryzae

Pour une enzyme donne, lactivit varie galement selon quelle est utilise sous forme
libre, immobilise, co-lyophilise ou en prsence de surfactants.
47
2.3

ue. Ainsi, Paradkar et
Dordick, Kamiya et al., Bindhu et Emilia Abraham [43-45] ont montr que lactivit des
oxyd
Lactivit des oxydorductases varie galement selon quelles sont pr-solubilises dans
une s
tion sous forme disperse. La co-lyophilisation augmente aussi sa rgioslectivit. Yu et
libanov [49] observent une plus grande regioslectivit de la HRP lyophilise pH 9.5 en
2.3.1.2. Forme immobilise
a nt des s t organiques, diffrents types de supports ont
r les oxydorductases (sp se[50], chitosan [51, 52], gel de
[53], rsine [54], billes de verre poreuses [55], lensemble des supports
tiliss a t rpertori par Duran et al. [56]). Ainsi, la laccase immobilise sur un mlange de
dextran reste active mme dans un milieu ne contenant que 3.5 %
deau [50]. Pour gnrer les cofacteurs in situ, les peroxydases ont t co-immobilises avec
des glucoses oxydases (Figure 2)
SBP, Van de Velde
.1.1. Forme libre
Lutilisation de lenzyme sous forme libre en solvant organique est rendue possible
grce lajout, dun surfactant, soit par sa co-lyophilisation avec une molcule hydrophobe.
En effet, ces procdures permettent de limiter la dnaturation enzymatiq
orductases est maintenue, mme dans un milieu presque anhydre, grce lassociation
ionique avec une molcule de surfactant. Pour viter leffet toxique de lH
2
O
2
, Angerer et al.
[46] remplacent ce dernier par le tert-butyl hydroperoxyde, qui est de surcrot plus soluble
dans le milieu ractionnel. Dans ces conditions, un turnover total de 5000 mol de substrat
transform/mol HRP a t obtenu sans changement de la masse molculaire en comparaison
aux ractions menes en micelles inverses.
olution aqueuse ou disperses sous forme solide directement dans le milieu ractionnel
[47, 48]. La lyophilisation de lenzyme en prsence du substrat, ou dun compos hydrophobe,
ou encore en prsence dun lyoprotectant hydrophile augmente son activit par rapport son
utilisa
K
prsence de 75 mM D-proline par rapport la mme enzyme non co-lyophilise.

Pour diminuer leffet dn tura olvan
t utiliss pour immobilise
polyacrylamide
haro
u
et gel Sepharose CL-6B
[23, 24]. En outre, lors de loxydation du thioanisole par la
et al. [57] ont rapport que ce systme de co-immobilisation permet
daccrotre lnantioslectivit sur le produit qui passe de 24 % 50% (S).

48
OH
O

Glucose
HRP
Polyphenols
O
2
H
2
O
Glucose oxidase
gl no-lactone uco H
2
O
2

Figure 2. atic system e polymerization of phenols [23]

Cer ont rapport co-immobilisation de peroxydase et des glucoses
oxydases s puces fixes dans un apport du milieu ractionnel en continu.
Ce systm et de sparer en l polymres synthtiss [24].

En ports classiq es peroxydases ont t immobilises sous forme de
microcapsules nanoorganises en uches successives assemblant lenzyme et des
polylectrolytes (LbL Layer by Layer) [58, 59] (Figure 1). Cette forme dimmobilisation
permet davoir une importante concentration dans un volume confin. De plus, grce sa
permabi ctive, les petites mo ules peuvent d r facilement dun compartiment
un autre alors que les polymres sont soit pigs lin r ou adsorbs en surface [58-61].

Lim sation sur des supports ou par en lation peut affecter laffinit de
lenzyme on substrat. Pour rem dier ce problm la technique dimmobilisation dans
un racteu membrane a t propose [62] et applique avec succs aux laccases (Tableau 5)
[63].

Bi-enzym used for th
tains travaux la
sur de un canal avec
e perm igne les
plus des sup ues, l
co
:
lit sle lc iffuse
trieu
mobili capsu
pour s e,
r
Tableau 5. Kinetic parameters to relative to the soluble and insoluble laccase from Rhus
vernicifera [76].
Optimum pH Optimum
temperature
Km (mM)
max
(moles.min
-1
) Km/Vm
Soluble enzyme 7.5 40C 69.00 9.58 7.20
Immobilized enzyme isothermal
nditions
7.5 50C 11.30 0.27 41.85
mobilized enzyme non-isothermal
conditions (t =20C)
5.85 0.32 18.28
co
Im

49
2.3.2. Effet du substrat

Pour une mme enzyme, le type de substrat affecte le rendement de conversion et la
taille des polymres (Tableau 6). Ceci est d, selon Mita et al. [64], laugmentation de
solubilit de certains substrats en fonction du log P. Ces auteurs ont observ en prsence de
HRP que le pourcentage dunits phenylenes (pontage C-C) augmente par rapport aux units
oxyphenylenes (C-O) quand le paramtre hydrophobique () du substrat augmente.

Tableau 6. Influence of phenol-substituent on polymerization by Horseradish peroxidase
Molecule Mw Yield References
Phenols 1400 -
p-methoxyphenol 2000 -
p-cresol 1900 -
p-chlorophenol 600 -
2,6-dimethylphenol 500 -
4,4-biphenol 400
[20]
-
p-tert-butylphenol 1900 -
p-phenylphenol 26000 -
4-cyclohexylphenol 1200 86
Aniline 1700 -
1-naphtol Very high -
2-naphtol 2000 -
4-t-butylphenol 1674 98
4-isopropylphenol 2380 99
4-methoxyphenol 1159 100
[53]
p-CH
3
6 7920
p-n-C
3
H
7
70 12200
p-i-C
3
H
7
95 11960
p-t-C
4
H
9
24 10800
p-n-C
5
H
11
92 10400
p-n-C
7
H
15
90 10080
o-i-C
3
H
7
0 -
m-i-C
3
H
7
0 -
H 72 122500
[6]

Pour rsoudre le problme de faible solubilit du substrat certains auteurs ont vectoriss
les substrats phnoliques par des polymres chargs, et des micelles. Cette vectorisation a
permis non seulement laugmentation de leur solubilit mais aussi dviter les branchements
parasites [65]. Kim et al. [66] ont quant eux observ que lutilisation de polymres solubles
dans leau tels que le poly(tylne glycol)(PEG), le poly(2-methyl-2-oxazoline)(PMOZ) ou le
50
poly(2-thyl-2-oxazoline)(PEOZ) comme agent de vectorisation favorise le couplage de type
C-C.

2.3.3. Effet du pH

Les effets du pH sont dus la balance entre 2 processus opposs [67], dune part, une
augmentation de lactivit pH lev, favorise par la baisse du potentiel redox du substrat
oxyd, provoquant une importante diffrence entre le potentiel du substrat et celui du cuivre
de type 1 de la laccase et dautre part, une dcroissance de lactivit due la fixation des
anions hydroxyles sur les cuivres de type 2 et 3. Les effets du pH sur la raction de
polymrisation peuvent aussi tre attribu son effet sur le substrat. Pour les substrats
prsentant un potentiel redox indpendant du pH (ABTS, K
4
Fe(CN)
6
), lactivit dcrot avec
laugmentation du pH. En revanche, pour les autres substrats, lactivit laccasique dpend
plus du type de laccase que du substrat [67].
Le pH optimum pour les laccases fongiques est en gnral situ entre 3 et 7. Par contre,
celui des laccases issues des plantes peut tre suprieur 9 [12]. Ces plages de pH ne
orrespondent pas toujours au microenvironnement optimal pour la conversion lors de la
le plus lev (60 %) pH 5, alors que le pH idal
pour cette enzyme est de lordre de 6 8.
c
raction de polymrisation. En effet, Kim et Nicell [68], en prsence de laccase de Trametes
versicolor, ont obtenu le taux de conversion
De plus, le pH influence le taux de conversion et la masse molculaire des oligomres
(Figure 3) [42]. Nanmoins, cette influence est variable selon le milieu ractionnel utilis [4,
23, 33].
51
pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11 pH4 pH 4.5 pH 7 pH 10 pH 11 pH 12
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
Laccase
HRP
M
o
l
.
W
T
.
pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 pH 11 pH4 pH 4.5 pH 7 pH 10 pH 11 pH 12
20
0
40
60
80
100
Y
i
ent rapport que le pH affecte le type de pontage entre units
monomriques. Un pH acide favorise les pontages C-C alors que les pontages C-O sont
majorit
sont
apables de se lier au site cuivrique T2 et dinhiber le transfert lectronique entre le site T1 et
le clu
e
l
d

Figure 3. Impact of pH variation on polymerization of phenol by HRP or laccase in 60 %
acetone or 50 % acetone respectively [42].

Il a t galem
aires pH basiques [69].

2.3.4. Effet des espces ioniques

Selon Xu et al. [70] de petites molcules exognes telles que OH
-
, F
-
, ou Cl
-
c
ster T2/T3 de la laccase. En outre, il a t dmontr que des molcules proprits
chlatantes comme les flavonodes inhibent les laccases. Cette inhibition peut tre vite par
lajout des ions Cu
2+
[71].
52
Leffet des sels inorganiques et de mtaux lourds sur la polymrisation des phnols par
HRP et par la laccase Trametes versicolor ont t tudis. La prsence de NaCl, CaCl
2
, MgCl
2
,
NH
4
Cl et (NH
4
)
2
SO
4
diminue les taux de conversions de la HRP et de la laccase par
comparaison aux ractions menes dans leau distille [72]. De mme, la prsence de sulfide
(H
2
S) inhibe la transformation de phnol par ces enzymes par rduction des radicaux
phenoxy ; alors que la prsence de Mn(II) et Zn(II) favorise lactivit de la HRP [68].

endement est explique par ces auteurs par une
diminution de lactivit catalytique de la HRP due laltration thermique de lapo-protine.

2.3.6. Effet du solvant

pon affecte svrement le rendement, la solubilit et la
masse moyenne des polymres [9, 41, 42, 64]. Ainsi, une simple variation du pourcentage de
dioxane de 10 85 % dans de leau mne des variations de masse molculaire de 500
26000 [20]. En parallle, lactivit enzymatique dcrot quand le pourcentage de dioxane
2.3.5. Effet de la temprature

Plusieurs tudes ont abord linfluence de la temprature sur les performances de la
polymrisation catalyse par les laccases [73-76]. Ces tudes ont montr que ce facteur
affecte lactivit laccasique, le taux de conversion et la solubilit des phnols. Lintensit de
cet effet est variable selon les substrats et lenzyme utiliss. Ainsi, lors de ltude dune
conversion du bisphenol A par la laccase de Trametes versicolor, Kim et Nicell [68] ont
observ une plus grande conversion de ce substrat 45 C qu 25 C alors que lactivit de
cette enzyme est plutt favorise 25 C. De mme, Akita et al. [19] ont observ, en prsence
de HRP comme catalyseur et de 1,4 dioxane comme solvant, un rendement lev (80 %) de
polymrisation tant que la temprature est infrieure 40 C, au-del, le rendement chute,
60 C, il est de 31 %. Cette diminution du r

En milieu aqueux, les ractions de polymrisation des composs phnoliques sont
souvent limites par la faible solubilit du substrat. En revanche, en milieu organique, la
ractivit est plutt freine suite la dnaturation des enzymes dans cet environnement.
Leffet des solvants a t rpertori dune faon dtaille par Rodakiewcz-Nowak [77].
Le ratio solvant organique/tam
53
augmen ermet lallongement de la chane
olymrique. Lajout de chloroforme dans le milieu en prsence de la laccase permet
dacc
tion du totarol par la
laccase de Trametes pubescens, le pontage C-O est favoris quand lhydrophobicit du co-
solvant diminue. Cette slectivit pourrait tre attribue un effet intrinsque du solvant sur la
formati terminer lorigine de cette
slectivit, cette raction a t compare une raction chimique avec le mme substrat et en
prse
la raction.

rations de racteurs ont t tudies.

te mais les polymres restent en suspension ce qui p
p
rotre le Mw des polymres form [78]. Selon Ikeda et al. [78], ce comportement est d
au phnomne dinteraction entre lenzyme, le solvant, le monomre et le polymre, et
notamment la diminution de laffinit de lenzyme pour le substrat.

De plus, les solvants ont des effets sur la structure des polymres et la slectivit de la
raction et ceci aussi bien pour la HRP que pour la laccase. Ainsi, lorsque le log P du solvant
augmente, la proportion dunit phenylene diminue [64, 79, 80]. Ce comportement est
modulable selon la nature des substrats. Dans le cas, de loligomrisa
on de pontage ou un effet solvant sur lenzyme. Pour d
nce de FeCl
3
ou MnO
2
comme catalyseurs. La raction chimique ne met en vidence
aucune stroslectivit marque; il apparat donc que le solvant affecte la slectivit via son
effet sur lenzyme. En outre, le solvant influence la slectivit de polymrisation par sa nature.
En effet, Intra et al.[81] ont observ que les solvants aromatiques (benzne, tolune) mnent
la formation des structures dimriques C1-C1 alors que les solvants type tert-amyl alcool,
chloroforme, favorisent les liaisons C1-C3.

2.4. Effet du mode de conduite de
Lalimentation en substrat et notamment en co-substrat, l O
2
pour les laccases et le
H
2
O
2
pour les peroxydases peut contrler la raction de polymrisation. En gnral, le
dioxygne est introduit initialement dans le milieu ractionnel. Par contre, le H
2
O
2
est ajout
au cours de la raction selon deux modes : contrl par sonde ou non contrl [82, 83]. De
mme, pour le substrat principal, diffrentes configu

54
2.4.1. Ajout du peroxyde dhydrogne

onduite de la raction

Majoritairement, les ractions de polymrisation enzymatique des composs
phnoliques sont menes en discontinu (Tableau 3). Pour amliorer les performances de ces
ractions, le mode continu a t test selon deux configurations. Pilz et al. [86] ont men cette
raction en racteur membrane en continu (EMR) o lajout de loxygne a t assur par
diffusion pour viter les inconvnients du bullage. De mme, Seelbach et al. [83] ont test un
EMR avec limination en continue des polymres. Ce dispositif a permis dobtenir une
productivit de lordre de 119.5 g/(L.j) et un total turnover de 192.8. Il est nettement plus
performant que le mode batch pour la productivit, qui ne permet datteindre que 42.2 g/(L.j),
mais avec un turnover trois fois plus fort.

Une autre configuration a t exprimente par Ayyagari et al. [25, 87] (Figure 4). Elle
consiste en un racteur aliment en continu avec le substrat, le co-substrat et lenzyme. Le
racteur est coupl un module dultrafiltration pour sparer en ligne les polymres forms.
Ce dispositif vise contrler la distribution de la masse molaire, tout en minimisant leffet du
solvant et en maximisant lutilisation de lenzyme.
Le peroxyde dhydrogne est la fois un co-substrat indispensable et un inhibiteur
forte concentration de lactivit proxydasique. Son ajout dans le milieu ractionnel a fait
lobjet de plusieurs travaux [84, 85]. Pour pallier les dfauts dune alimentation continue
Akita et al. [19] ont ralis des ajouts juste en quantit ncessaire et suffisante diffrents
intervalles et diffrentes concentrations. Ils ont observ que lajout de faibles concentrations
favorise le rendement de conversion. Seelbach et al. [83] quant eux ont contrl
lalimentation du peroxyde dhydrogne par lutilisation dune sonde. Cette procdure a
permis de rduire la dure de la raction et daugmenter le rendement.

2.4.2. Les diffrents modes de c
55

Fig 4. Fed-batch reactor with continuous filtration [93] ure

L des
compo la synthse des molcules la
ont
, structure
des sub tes
re
approc onstitue un dfi scientifique exaltant. Compte tenu de lintrt
e
sif
procd

Conclusion
utilisation des laccases et des peroxydases dans le domaine de la polymrisation
ss phnoliques offre une alternative intressante pour
carte en fonction des applications et des proprits recherches. Cependant, ces ractions s
affectes par des nombreux facteurs (temprature, pH, solvant, origine de lenzyme
strats, architecture du racteur, ...). Ces facteurs ont souvent des effets antagonis
comme leffet des solvants organiques qui dun ct favorise la solubilit des substrats et de
laut ct altre les activits enzymatiques. Loptimisation de ces ractions ncessite une
he pluridisciplinaire et c
majeur des polymres base des composs phnoliques, les annes venir verront un
inten ication des investigations dans ce domaine et il est fort parier que de nouveaux
s verront le jour prochainement.
56
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61

4.4. Incidence du mode pontage et du degr de polymrisation sur les
proprits
Comme nous lavons dmontr prcdemment, les conditions exprimentales influent
sur le
ontrent au cours de leurs travaux sur la catchine que le type et la
local

e sur la solubilit des polymres forms. Les polymres synthtiss dans 20 %
da o
D ent que les oligomres obtenus pH 7 ont un
pou i
D
activit rtent sur les procyanidines. Ainsi, les
dim de activit antiradicalaire face
la l p tamres et hexamres qui pour leur part possdent
des p
s dun grand nombre despce radicalaire
[163]. Cet effet est imput au grand nombre de conjugaison possible entre le groupe catchole,
le cycle B et les groupements hydroxyles du squelette polymrique engendrant une grande
stab ].
Il a t dmontr aussi que laugmentation du degr de polymrisation des
procy
pour loenine est plus marque sur les dimres lis en C4-C6 par rapport ceux lis

nombre, le type et la localisation du pontage. Ces diffrents paramtres vont agir sur les
proprits des polymres forms.
Guyot et al. [161] dm
isation du pontage ont une influence sur la couleur des produits obtenus. Les polymres
obtenus pH 6 sont colors en jaune, ceux obtenus pH 3 sont faiblement colors. A pH 3,
seuls des pontages ther ont t dcrits alors qu pH 6, les pontages sont de type C-C, C=C
ou C-O. En outre, ces derniers peuvent prsenter de 1 4 pontages simultans contrairement
ceux obtenus pH 3 qui nont quun seul pontage.
Kurisawa et al. [99] observent une incidence de la proportion en solvant dans le milieu
de synths
ct ne sont moins solubles dans le DMF que ceux synthtiss dans 5 % dactone.
esentis-Mendoza et al. [59] dmontr
vo r antiradicalaire plus lev que ceux obtenus pH 5.

e nombreuses tudes traitent de linfluence du degr de polymrisation sur diverses
s biologiques. Le plupart de ces tudes po
res et les trimres de procyanidines prsentent une gran
ipo eroxydation, contrairement aux pen
roprits anti-lastase plus marques [162].
Il a t mis en vidence que laugmentation du degrs de polymrisation accrot le
pouvoir antiradicalaire des procyanidines vis--vi
ilit du radical aryloxyl form [164
anidines influe sur leur affinit vis--vis de certaines protines. Laffinit des tannins
pour la protine salivaire humaine saccrot avec leur degr de polymrisation [165] , et
laffinit
62
en C4-C8 [166]. En fait, cette affinit est dpendante de la capacit tablir des liaisons
hydro
ation molculaire
appli
molcule : longueurs de liaison, angles de valences,
angles de torsion, liaisons hydrogne
- paramtres nergtiques : nergie de liaison, enthalpie de formation
- paramtres lectroniques : charges, densit de spin, nergies et dlocalisation des
orbitales (HOMO, LUMO), Eg (diffrence entre E
HOMO
et E
LUMO
), lectrongativit
(), lectroaffinit (EA), polarisabilit (POL)
- paramtres striques : volume et surface molculaire
- paramtres hydrophobiques : log P
ique et les activits ou les effets biologiques ou
physico-chimiques observs lors des expriences.
5.1. Etude conformationnelle

avonodes leur activit, une analyse conformationnelle de
ces m
gne avec leau, elle-mme dpendante de la conformation des oligomres dans leau.

5. La modlisation molculaire applique aux flavonodes

Les tudes abordant la structure des coumarines par modlisation molculaire tant trs
rares [167, 168], cette partie sattachera essentiellement dcrire la modlis
que aux flavonodes.
La stabilit, la ractivit et les effets physiologiques des flavonodes sont couramment
relis leur famille, la nature de leurs substituant et leur structure molculaire (gomtrie)
[12, 55, 104, 168]. Afin de corrler avec plus de prcision les donnes exprimentales sur les
activits avec la structure des molcules et de quantifier ces relations, des tudes thoriques
ont t entreprises par modlisation molculaire.
A travers la mcanique quantique ou molculaire plusieurs paramtres peuvent tre
obtenus :
- paramtres structuraux de la
De nombreuses tudes ont pour but de corrler et dexpliquer les relations entre
proprits lectronique, strique, hydrophob

Pour relier la structure des fl
olcules a t souvent ralise. Cette tape permet de dterminer la structure la plus
stable.
63

De nombreuses tudes traitent des flavonodes aglycones et notamment de la forme
aglycone de la rutine, la querctine [169-172]. Mais les tudes abordant les structures des
flavonodes glycosyles telle que la rutine sont trs rares. Van Acker et al. [173] ont tudi la
rutine et ont rapport quun angle (C6C1C2C1) de 27.17 entrane la perte de la coplanit
observe sur la querctine. Lanalyse conformationnelle a t effectue par rotation de la
liaison entre la partie chromone et le cycle B (angle ), en utilisant le champ MM (AMBER).
Les structures obtenues ont t optimises par mthode ab initio (STO-G3).
tance de 4 a t impose lors de ltude par modlisation
molculaire. Cet auteur procde une optimisation par mcanique molculaire (champ de
force MM+). La structure obtenue prsente entre autre une liaison hydrogne entre le glucose
(C
2
-
Structures optimises dnergie minimale de la rutine (calculs mcaniques
mol
Relation structure-activit antioxydante

Alluis [174] a dtermin aussi, la conformation la plus stable de la rutine par RMN dans
des solutions de rutine prpares dans le DMSO. Ltude par ROESY (Rotating frame
Overhauser Effect Spectroscopy) ralise par cet auteur a fait apparatre des corrlations entre
les positions 5 et 6, entre les positions 6 et 1 et entre les positions 5 et 2. Pour chaque
paire de protons corrls, une dis
H) et la fonction carbonyle du cycle C (C
4
=O) et une poche hydrophobe entre le
rhamnose et le cycle B (Figure I.17.).

Figure I.12.
culaires, champs de force MM+) [174]

5.2.
Diffrents facteurs ont pu tre corrls lactivit antioxydante :
Descripteurs nergtiques
Un antioxydant peut jouer son rle soit par un mcanisme de transfert de proton, soit par
un mcanisme de transfert mono-lectronique [175].
64
Le mcanisme par transfert de proton (abstraction dun atome dhydrogne de
lantioxydant par un radical libre) est particulirement important dans le cas de linhibition de
peroxydation des lipides. Pour que ce mcanisme soit vraiment efficace, le radical phnoxy
du radical phnox e conjugaison
t de iation de l un
ramtre important pour valuer lactivit antioxydante [175, 176]. En effet, plus cette
liaison est faible, plus la raction avec le radical libre sera facilite.
Le deuxime mcanisme est un transfert mono-lectronique de lantioxydant vers le
radical libre conduisant la formation dun radical cation. Cette raction nest en ralit que
la premire tape dune succession dquilibres acido-basiques et de transferts lectroniques.
Dans ce cas, le paramtre nergtique important pour lvaluation de lactivit antiradicalaire
es o
le caractre donneur et accepteur dlectron peut
nous re s de la
HOMO est leve, plus son potentiel dionisation est faible et
plus s
charge au niveau de loxygne susceptible de ragir a t corrl avec le
pouv

Descripteurs gomtriques
tioxydante tait amliore lorsque la
olcule possdait une fonction catchol, une double liaison entre C
2
-C
3
dans le cycle C. Ces
lm
la
form doit tre relativement stable. Lefficacit de lantioxydant dpend donc de la stabilit
y, c'est--dire du nombre de liaisons hydrogne et des effets d
e rsonance. Lenthalpie de dissoc iaison (BDE) de la liaison O-H est
pa
est le potentiel dionisation (IP).

Descripteurs lectroniques
A partir des valeurs de lnergie d rbitales molculaires, la plus haute occupe
(HOMO) et la plus basse vacante (LUMO),
tre valu. Lnergie de la HOMO
olcule : plus lnergie de la
nseigne sur les capacits rductrice
m
on caractre rducteur est grand [177, 178].
Dans le cas des flavonodes, une corrlation a t observe entre lexcs de charges
entre les atomes C
2
et C
3
. En effet, il a t rapport que la prsence dune densit lectronique
importante sur la double liaison C2-C3 des flavonols, avec un groupe hydroxyle libre en
position 3, peut conduire une plus grande ractivit de ces molcules avec loxygne
singulet [47].
Lexcs de
oir antioxydant, ainsi plus cette charge est ngative, plus le pouvoir antioxydant sera
lev.
Plusieurs auteurs ont remarqu que lactivit an
m
ents structuraux conduiraient probablement la formation dun radical stable en raison
de nombreux groupes phnoliques et dune dlocalisation lectronique tendue.
65
Les facteurs structuraux des radicaux des flavonodes non glycosyls impliqus dans le
pouvoir antioxydant sont prsents dans le Tableau I.6.

Tableau I.6. Elments structuraux ncessaires une bonne activit antioxydante dans le cas
des deux mcanismes par transfert dhydrogne et dlectron

Mcanisme par abstraction dhydrogne Mcanisme par transfert mono-lectronique

Formation du radical : les OH du cycle B sont les plus
adapts pour le transfert dhydrogne (O
4
)
Structure : radical plan, prsence de fonction catchol
sur cycle C (stabilisation par liaison hydrogne), dune
double liaison C
2
-C
3
et C
4
=O (dlocalisation
lectronique)
La prsence dune liaison H sur la partie catchol
confine la densit de spin sur loxygne ( 84 %)
Critre : BDE < 80 kcal/mol pour avoir une activit
anti-radicalaire par rapport au DPPH ou lABTS
+
Flavonode : querctine, taxifoline, lutoline,
picatchine, cyanidine
Formation du radical : localisation de la densit de
spin variable en fonction du flavonode
Structure : radical plan (sauf pour taxifolin : 101),
lments structuraux permettant une dlocalisation
lectronique sur toute la molcule (double liaison C
2
-
C
3
et C
4
=O), conservation des liaisons H par rapport
la molcule parent
Critre : IP le plus faible possible (reli lnergie de
la HOMO)
Flavonode : querctine, apignine, lutoline,
picatchine, kaempfrole

Plusieurs tudes sur les flavonodes et des molcules analogues Wright, Zhang et Wang
ainsi que Trouillas et al. [103, 175, 179] ont reli lactivit antiradicalaire aux enthalpies de
dissociation des OH phnoliques. De mme, le potentiel dionisation des structures tudies a
t aussi corrl avec les donnes exprimentales dactivit antiradicalaire mais de manire
moins prcise [179, 180]. Il semblerait donc que le mcanisme par transfert datome
dhydrogne soit la voie prpondrante dans lactivit antioxydante des flavonodes mme en
milieu aqueux.
Enfin, un moment dipolaire faible sera corrl avec un fort pouvoir antioxydant. (Ces
deux constatations ont t faites lors des travaux de L.Chebil au sein du laboratoire).

5.3. Relation structure-activit pro-oxydante

La cytotoxicit des flavonodes est majoritairement due leur potentiel pro-oxydant.
Tout comme pour leur activit antioxydante, leur potentiel de toxicit peut tre reli leur
O
O
= 0
O
O
OH
O
O
H
= 0
radical isonergtique
liaison hydrogne
66
Chapitre I.

structure. L
Tableau I.7..
Etude Bibliographique
67
es diffrentes relations structure-activit pro-oxydante sont rpertories dans le

68

de relation str totoxiqu

Rfrences Fl calcul m
Tableau I.7. Exem
es Cellules testes
ple ucture-activit cy
Paramtres
e
avonodes ou coumarin ation m
co
odlis thode de
rrlation
[181] 23 flav Diminution de la cy
- xyle en C3
- nombre dhydrox
- ilit da
C2-
bon
-or ydroxyle pl xyle
-O ylation ou g
-pr e du cycle B
onodes Lymphoblastes Jurkat T totoxycit :
yle
ns le milieu de culture
C3
yle en C4
us toxique que le meta-hydro
lucuronidation
hydro
forte solub
Augmentation :
- double liaison
-groupement car
tho-h
-mth
senc
F-test
[182] Querc
kaemp
Di ion de la cytoxici
radical phe
- lev
- efficient de distribu

tine, myricetine, morin
herol, taxifoline, hesper
e,
etine
Fibrobl
reins d
cellules
astes issus de
agneau (FLK),
HL-60
minut
-couple redox
Augmentation :
log P
log D (co
pH7) lev
t:
noxyl/phenol lev
tion octanol/eau
Stati
(Sta
stica
tSoft)
[183] Chrysi
phloret
apigen
luteoline, qu
fisetine, taxif
baicaleine, m
Di ion de lactivit :
- p el redox lev
-B ev
Au tation de lactivit
-lo ev
ne, biochanine, galangi
ine, naringenine, morin
ine, genisteine, kaempf
erctine, eriodicty
oline, catchine,
yricetine
ne,
e,
erole,
ol,
Hpatocytes de rat minut
otenti
DE l
gmen
g P l
:

[184] Quercetine,
taxifoline, he
acide galliqu
activit :
-po el redox lev
Au tation de lactivit
-lo ev
, DFT
311G**//HF//3-21G*
(gaussian)
morine, kaempfer
speritine, naringe
e,
ole,
nine,
HL-60 Diminution de l
tenti
gmen
g P l
:
PM3 B3LYP/6-
[185] 20 coumarin s du c
: HS
rrlation avec tion,
ne de la LUMO.
yperbolique av
Au tation de la cytot
Fai otentiel dionisati
et f .
Conflex/PM3 D log
pour le calcul g P
he
ksyste
es Cellule
humain
arcinome
C-2
Pas de co
rgie
Relation h
gmen
ble p
aible
H, , potentiel dionisa
ec le Log P (maximum 2.5)
oxicit :
on, E
HOMO
leve, forte
et AC
du lo
P CaC
Wor
4.9
m
Selon Plochmann et al. [181], la structure plane des flavonodes due la prsence de la
ouble liaison C2-C3 augmente la cytotoxicit en induisant linhibition de la glycoprotine P
(transporteur m les agents chemothrapeutiques).
La cy est pro s flavo 1, 182
ci serait du forte naire des espces l es, engend
accumulatio lulaire
Dans le cas des coum ur l ctrongativit [

5.4. Relation structure-activit inhibitrice denzymes

Les flavonodes tant connu pour leurs activits dinhibition denzymes. Des
corrlations entre la structure de flavonodes et des activits biologiques ont t tudies par
molculaires (nergtiques, striques,
hydrophobi le les de corrlation dans l
linhibition thine o

Diffr hodes t res
activits :
- La c n ent celles des activits
tudies afin dobtenir des tendances. Cette mthode permet destimer pour chaque
variable molculaire si elle a une influence.
- Lanalyse statistique par rgression multivariable permet une tude plus prcise des
effets de chaque paramtre molculaire et de leurs interactions. Cette mthode aboutit
une quation reliant la variable explique en fonction des variables explicites.
- Les mthodes danalyse de la composante principale, par hirarchisation des groupes,
discriminant sont utilises pour diminuer la dimension du nombre de variables et pour
dterminer quelles sont les variables qui pourraient tre les plus efficaces pour classer
les molcules testes selon leur degr dactivit.

d
embranaire exportant
totoxicit
e la plus
n intracel
portionnelle lhydrophobicit de nodes [18
ipophil
]. Celle-
rant une permabilit membra
des flavonodes.
arines, leur cytotoxicit est relie le e 185].
plusieurs auteurs grce des paramtres
ques). Le Tab
de la xan
au I.8. donne quelques exemp e cas de
xydase.

entes mt
omparaiso
ont t utilises pour corrler les param res molculai aux
re les donnes de la modlisation molculaire et
69
Tableau I.8. Exemples de relation structure activit inhibitrice de la xanthine oxydase
ces Flavonodes Paramtres calcul
modlisation
mthode de
corrlation

Rfren
[64] Apigenine,
querctine,
myricetine,
isovitexine,
genisteine,
allopurinol,
naringenine
Diminution de lactivit :
prsence dun groupement hydroxyle en C3
prsence dun sucre en C6
Augmentation :
structure plane
-prsence dun groupeme nyle en C4
-prsence de groupement droxyle en C5, C7
Mcanique Comparaison
molculaire
(tripos)
structure par
docking dans
le site actif
nt carbo
hy
[82] Chrysine,
galagine,
apigenine,
lutoline, fisetine,
kaempferol,
querctine,
myricetine,
morine,
taxifoline,
daidzeine,
genisteine,
picatchine,
epigallocateching
allate, allopurinol
Diminution de lactivit:
-hydroxyle en 3, 8 et 2
Augmentation de lactivit
- hydroxyle en position 5
- petite amlioration en ydroxl en 3,
4
-hydroxyle en 4
- le nombre dhydroxyle
(5>7>4=3)
Mthode de
calcul de la
contribution
des
groupements
hydroxyles
:
et 7
prsence dh
accrot linhibition
[81] Variation des
groupements
hydroxyle sur des
flavone
flavano
chalcon
-mthylation dun groupement hydroxyle
Augmentation de lactivit
cycle B
Calcul par
lindice de
connectivit
de Kier at Hall s,
nes,
e
-hydroxyle en 5 et 7
-double liaison en 2-3
- fonction catchol ou 3,4,5-pyrogallol sur le
:
[63] Allopurinol,
apigenine,
querctine,
myrecitine,
genisteine,
isovitexine,
naringenine
Angle D3 suprieur 27
Forte polarisabilit, forte rfractivit molaire, forte
aire superficielle, fort volume molculaire
Faible log de P
Augmentation de lactivit :
Angle de torsion D3 (cycle C/B) entre 26 et 27
Petite taille
Fort caractre hydrophobique

i) Analyse
conformationnelle
par MM (MM+)
ii) Optimisation
par mthode semi-
empirique (AM1)
Comparaison
entre les
structures et
les rsultats

70

CHAPITRE II.

MATRIELS ET MTHODES

Chapitre II. Matriels et Mthodes
Cha I
1.
TALYSEUR
2.3.
2. ON
3. SPARATION DES OLIGOMRES PAR FIL RATION TANGENTIELLE ..................................74
4. ETUDE DES PROPRITS PHYSICO-CHIMIQUE ET BIOLOGIQUES DES FLAVONODES
ET DE LEURS OLIGOMRES........................................................................................................................ 75
4.1. ETUDE DE LA SOLUBILITE ................................................................................................................... 76
4.2. ACTIVITE ANTIRADICALAIRE .............................................................................................................. 76
4.2.1. Principe......................................................................................................................................... 76
4.2.2. Protocole....................................................................................................................................... 76
4.3. ACTIVITE DINHIBITION DE LA XANTHINE OXYDASE ........................................................................... 77
4.3.1. Principe......................................................................................................................................... 77
4.3.2. Matriels et protocole ................................................................................................................... 78
4.4. ETUDE RHEOLOGIQUE. ........................................................................................................................ 79
4.4.1. Principe......................................................................................................................................... 79
5. MTHODES ANALYTIQUES.................................................................................................................80
5.1. ANALYSE DES FLAVONODES ET DE LEURS OLIGOMERES PAR SEC..................................................... 80
5.1.1. Principe......................................................................................................................................... 80
5.2. ANALYSE DES FLAVONODES ET DE LEURS OLIGOMERES PAR SPECTROSCOPIE INFRAROUGE .............. 82
5.2.1. Principe......................................................................................................................................... 82
5.3. ANALYSE DES FLAVONODES ET DE LEURS OLIGOMERES PAR SPECTROMETRIE DE MASSE .................. 83
5.3.1. Principe gnral de lanalyse par spectromtrie de masse........................................................... 83
5.3.2. Principe de lionisation de type MALDI ....................................................................................... 84
5.3.3. Principe de lanalyseur par temps de vol...................................................................................... 87
5.3.4. Protocole....................................................................................................................................... 88
5.4. ANALYSE DES FLAVONODES ET DE LEURS OLIGOMERES PAR RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE
(RMN) ..88
5.4.1. Principe......................................................................................................................................... 88
pitre I: Matriels et mthodes

MATRIELS..............................................................................................................................................71
1.1. ............................................................................................................................... BIOCA . 71
1.2. EACT ............................................................................................................................................ 71 R IFS
1.2.1. Flavonodes................................................................................................................................... 71
2.2. 1. .......... 72
Solutions tampons .........................................................................................................................
Solvants ...............................................................................................................................
1. 72
C DUITE DE LOLIGOMRISATION .............................................................................................73
T

Chapitre II . Matriels et Mthodes
5.4.2. Protocole....................................................................................................................................... 91
MODLISATION MOLCULAIRE.......................................................................................................92
IQU
ANI
HOD
.. 94
6.4
6.5.
6.
6.1. MECAN E QUANTIQUE .................................................................................................................... 92
6.2. MEC QUE MOLECULAIRE................................................................................................................ 93
6.3. MET ES DANALYSE DES SURFACES DENERGIE POTENTIELLE....................................................... 94
6.3.1. Optimisation de gomtries........................................................................................................... 94
6.3.2. Dynamique molculaire ..............................................................................................................
. SYSTEME PERIODIQUE......................................................................................................................... 95
CHEMINEMENT DE LANALYSE CONFORMATIONNELLE....................................................................... 98
6.6. DESCRIPTEURS MOLECULAIRES ........................................................................................................ 101

Tableaux

Tableau II.1. Flavonodes utiliss. ..................................................................................... 71
Tableau II.2. Solvants utiliss............................................................................................ 72
Tableau II.3. Lavages successifs durant la filtration tangentielle des milieux ractionnels.
...75
Tableau II.4. Matrices utilises dans le cadre de lanalyse de flavonodes par MALDI-
TOF.......86
Tableau II.5. Matrices utilises dans lanalyse MALDI-TOF. .......................................... 88
Tableau II.6. Etude par modlisation molculaire des flavonodes dans un solvant ......... 97

Figures

Figure II.1. Plateforme Chemspeed et racteurs Chemspeed pour synthse en parallle ... 74
Figure II.2. Principe du dosage de lactivit antiradicalaire des flavonodes par pigeage du
radical DPPH
................................................................................................................... 91
Figure II.3. Dtermination graphique de lIC50 (a) partir dune courbe de rgression
exponentielle (b)............................................................................................................... 77
Figure II.4. Dtermination graphique de lIC50 (a) partir dune courbe de rgression
logistique 4 paramtres (b). ........................................................................................... 78
Figure II.5. Reprsentation schmatique de la concentration critique de recouvre ment (C*)
sparant les domaines dilus (C < C*) et semi dilus (C > C*)....................................... 79
Figure II.6. Reprsentation schmatique de la sparation par exclusion strique............... 80
Figure II.7. Courbe dtalonnage de PS .............................................................................. 82
Figure II.8. Reprsentation schmatique de la dsorption laser.......................................... 85
Figure II.9. Reprsentation schmatique de lanalyseur par temps de vol en mode
rflectron.......87
Figure II.10. Exprience mene en 2D-J-DOSY sur un mlange de sucres ..................... 89
Figure II.11. Spectre 1H-RMN de la catchine et des oligomres de catechine............... 90
Figure II.12. Reprsentation schmatique de langle magique ......................................... 91
Figure II.13. Conditions priodiques pour un systme 3 dimensions (a), reprsentation
schmatique du seuil de coupure sur un systme 2 dimensions (b). ............................. 95
Figure II.14. Mthodologie de ltude dune molcule par modlisation molculaire. .... 99

Figure II.15. Diffrentes reprsentations graph
conformres dintrt dans le cas dune dynamique 600 K de la rutine dans le vide . 100
iques utilises lors du choix des


1. Matriels
Lenzyme utilise pour loligomrisation est la laccase de Trametes versicolor (1.10.3.2.)
unit correspond la quantit denzymes convertissant 1
t .

ctifs

Les flavonodes tudis (Tableau II.1.) proviennent de 2 familles diffrentes : flavonols
et coumarines.
Tableau II.1. Flavonodes utiliss.

Flavonode, Masse Molaire (g/mol), Fournisseur, Puret
1.1. Biocatalyseur

ayant une activit de 21,4 U/mg. L
mol de catchol par minute pH 4.5 e 25 C
1.2. Ra
1.2.1. Flavonodes

Flavonol Coumarine
Rutine (3-rutinoside querctine) Esculine sesquihydrate

(MM 610.5) (Sigma, >95%)

(6--D-glucopyranoside escultine)
(MM 367.61) (Fluka, >98%)

O HO
OH
OH
2 7
1'
3'
4'
O HO O
O
3
4 O
OH
OH
6'
5'
O
O
OH
4
3
5
HO
O
OH
OH
O
CH
3
O
OH
OH
OH OH
1''
1'''
3''
4'''
OH
3'

71
1.2.2. Solvants

Les solvants utiliss lors de ce travail sont de qualit CLHP (Tableau II.2).

Tableau II.2. Solvants utiliss.
Solvant, abrviation, Masse Molaire
(g/mo
Constante Log P Structure

l), Densit, Fournisseur (D) dilectrique
() (F/m)
Mthanol, MM 32.4, d 0.79, VWR 1.71 32.7 -0.82 CH
3
OH
Actonitrile (ACN), MM 41.05, d 0.786,
SDS
3.45 37.5 -0.34

CH
3
CN
Dim h
d 0.
t ylformamide (DMF), MM 73.10, 3.87 37.0 -1.01
O
944 BDH
H N
CH
3
CH
3

Eth
Ha
3
CH
2
OH
anol, MM 46.07, d 0.803, Riedel-de 1.74 24.5 -0.32
n
CH
Ac n to e, MM 58.081, d 0.790, Carlo Erba 2.86 20.7 -0.24
O
C H
3
CH
3

Tt y
d 0.88
8 0.49 rah drofurane (THF), MM 72.11, 1.75 7.5
9, VWR O

1.2.3. Solutions tampons

Les solutions tampons utilises pour les milieux ractionnels ont t prpares avec des
sels dammonium afin d viter les interfrences dionisation lors de lanalyse par MALDI-
OF. Les diffrentes solutions tampons utilises sont :
- tampon phosphate dammonium, pH 7, 10 mM
- tampon phosphate dammonium, pH 5, 10 mM
- tampon citrate dammonium, pH 4, 10 mM
T
72
73
Ces solutions ont t ajustes au pH dsir par ajout dune solution de H
3
PO
4
. Le pH de la
solution finale a t vrifi au pH-mtre avec une erreur de 0.1 unit pH.
Dans le cadre du suivi de linhibition de la xanthine oxidase, du tampon phosphate pH
7.5, 50 mM a t prpar partir dune solution de phosphate monosodique 0.2 M et dune
solution de phosphate de sodium dibasique 0.2 M.

2. Conduite de loligomrisation

Les ractions doligomrisation ont t menes sur une plateforme automatise
ASW2000 (Chemspeed Ltd). Cette installation est quipe dun bloc de 8 racteurs (27 ml)
(Figure II.1.). Linstallation est totalement automatise et permet de mener plusieurs
synthses en parallle. La temprature, lagitation par vortex ainsi que latmosphre sont
contrles. Le protocole gnral suivi se dcompose en plusieurs tapes :
ajout manuel du substrat sous forme de poudre dans chaque racteur (3 g/l final)
ajout automatique de 7 ml deau ou de tampon et de 3 ml de solvant
mise sous agitation de lensemble 600 rpm, 20 C
dclenchement de la raction par ajout de la solution enzymatique (3 U/ml final)
prlvement et dilution automatiques dans 9 volumes de DMF, 1% LiBr
injection automatique de la solution dilue sur la colonne de chromatographie
prlvements et injections rguliers pendant 72 h
En parallle de ltude cintique par SEC-UV, un protocole de dpt automatique sur
t dans la partie Rsultats
ortant sur la mise point des techniques analytiques.

dexclusion de taille (SEC)
cible MALDI a t mis au point. Celui-ci sera dtaill ultrieuremen
p


Sparation des oligomres par filtration tangentielle
e est une technique qui met en oeuvre une membrane, considre
omme une barrire poreuse et slective, permettant de traiter un fluide brut en vue de le
purif
au mdia filtrant, mais parallle la membrane filtrante. Ce flux tangentiel
perm

Figure II.1. Plateforme Chemspeed et racteurs Chemspeed pour synthse en parallle

3.

La filtration tangentiell
c
ier. Contrairement la filtration frontale, le sens de circulation du fluide nest pas
perpendiculaire
et de minimiser les phnomnes de dpt et de colmatage. Aprs filtration, un rtentat et
un permat sont recueillis.

74
Protocole :
2 l de milieu ractionnel ont t rcuprs la fin de la raction et filtrs sur diffrentes
mem
Tab
actionnels
branes de 50, 8, 5 et 3 KDa successivement. Dans le cas de loligomrisation de
lesculine, une filtration supplmentaire est effectue sur une membrane de 1 KDa. Au cours
de la filtration plusieurs volumes deau ou de mthanol sont ajouts au rtentat pour lessiver
les molcules capables de traverser la membrane (Tableau II.3.).

leau II.3. Lavages successifs durant la filtration tangentielle des milieux ractionnels.

Milieux r
Oligorutine Oligoesculine
Porosit
membr naire
Volume ajout (ml) Volume
tentat
l)
Volume
permat
(ml)
Volume ajout (ml) Volume
rtentat
(ml)
Volume
permat
(ml)
a
r
(m
50 KDa 100 1800 300 ml de mthanol 500 1800 0
8 KDa 800 ml deau milliQ 200 2400 800 ml deau milliQ 400 2200
1 KDa 400 ml deau milliQ 400 2000

Les membranes utilises sont des membranes INSIDE CeRAM
TM
(TAMI industries).
Ces membranes sont en ZrO
2
-TiO
2
de 10 mm de diamtre. Lensemble des rtentats et le
lyophilisation pour liminer toute trace
4. Etude des proprits physico-chimique et biologiques des flavonodes et
de leurs o
permat est lyophilis afin dtre analys. Une tape dvaporation est effectue avant la
de solvant.

ligomres

Lensemble des proprits des oligomres a t valu partir de poudres obtenues par
lyophilisation.
Les rgressions et lissages appliqus dans les tapes de traitement des rsultats ont t
tablis avec le logiciel SigmaPlot version 9.0.

75
4.1. Etude de la solubilit

Dans un premier temps, la solubilit de la rutine, de lesculine et de leurs oligomres a
t value dans leau 30 C (600 rpm). Les chantillons prlevs rgulirement durant 3
m (afin danalyser la fraction soluble) et analyss par SEC-UV.
Les filtres, les seringues ains
(pH, solvant, temprature, ) utilises lors de la mise en
uvre des ractions.

4.2. Activit antiradicalaire
4.2.1. Principe
Lactivit antiradicalaire des flavonodes et de leurs oligomres a t value par leur
apacit piger les radicaux DPPH
(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) (Figure II.2.).

jours ont t filtrs sur 0.2
i que les vials ont t maintenus 30 C pour viter tout
phnomne de prcipitation.
Dans un second temps, selon le mme protocole, la solubilit de la rutine et de lesculine
a t value dans les conditions

c
NO
2
NO
2
O
2
N N

N
Ph
Ph
NO
2
2
O
2
N N
H
N
Ph
Ph
O. Fl
+
FlOH
+
NO
DPPHH (jaune) Flavonoid radical DPPH (violet) e Flavonoide, radical phenoxyl

igure II.2. Principe du dosage de lactivit antiradicalaire des flavonodes par pigeage du
partir de la masse moyenne en poids du mlange doligomres. Le test de rfrence a t
F
radical DPPH
.

4.2.2. Protocole

Les tests ont t raliss par ajout de 1 mL de solution contenant les oligomres ou les
monomres (10
-6
-10
-4
M dans du mthanol) et de 2 mL de solution de DPPH (10 mg/ml dans
mthanol/eau, 80 :20, v/v) [56]. Les diffrentes concentrations doligomres ont t calcules
76
ralis avec 1 mL de mthanol et 2 mL de solution de DPPH, alors que le tmoin permettant
dapprcier la coloration intrinsque des molcules a t ralis avec 1 mL de solution
oligomrique et 2 mL de mthanol. Aprs 15 min, 23 C, les absorbances des flavonodes et
de leurs oligomres ont t values 527 nm. Lactivit antiradicalaire a t calcule partir
du pourcentage de dcoloration du DPPH selon lquation :

=
rfrence la de absorbance
oligomre l de absorbance n chantillo l de absorbance
laire antiradica activit
' '
1 100

Lactivit antiradicalaire est exprime comme la concentration permettant dengendrer
50 % de dcoloration de la solution de DPPH (IC50) (Figure II.3.a). LIC50 est dtermine
partir dune rgression exponentielle 2 paramtres (Figure II.3.b). Lensemble des mesures a
t ralis en triple.
Concentration de flavonodes ou d'oligomres (.10
-5
M)
0 2 4 6 8 10 12
A
c
t
i
v
i
t

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

(
%
)
-20
20
40
60
80
100
0
50
IC

F n graphique de lIC50 (a) partir dune courbe de rgression
exponentielle (b)

4
Xanthine + 2O
2
+ H
2
O acide urique + 2O
2
-
+ 2H
+
Xanthine + O
2
+ H
2
O acide urique + H
2
O
2
a) b)
) 1 (
0
bx
e a y y
+ =
50
igure II.3. Dterminatio
.3. Activit dinhibition de la xanthine oxydase
4.3.1. Principe

Ltude de linhibition de la xanthine oxidase consiste suivre la production dacide
urique 295 nm :

oxydase xanthine

oxydase xanthine
77
4.3.2. Matriels et protocole

Ce test dinhibition a t ralis sur la xanthine oxydase de grade IV provenant de lait
bovin (E.C. 1.17.3.2) [186].
La xanthine a t pralablement dissoute dans un volume minimal de soude 2 % et
rapidement dilue dans le tampon phosphate (pH 7.5 0.1, 50 mM). La rutine et lesculine
nt t pralablement dissoutes dans une petite quantit de dimthylsulfoxyde puis aussitt
phosphate. Les
ou doligomres (10
-5
-4.10
-4
M) et de 1000 l de xanthine. La raction est initie par lajout
de 100 xydase (0.2 U/ml). Labsorbance 295 nm est suivie
endant 6 min. 2 solutions test ont t prpares, la premire ne contenant pas de flavonodes
pour
o
dans du tampon phosphate. Les autres solutions ont t ralises directement dans du tampon
tests ont t prpars par ajout de 1600 l de tampon, de 300 l de flavonode
l de solution de xanthine o
p
mesurer la production dacide urique totale, la seconde ne contenant pas denzyme afin
dvaluer labsorbance des flavonodes et de leurs oligomres 295 nm. Linhibition de la
xanthine oxydase est exprime comme la concentration aboutissant la diminution de 50 %
de lactivit enzymatique (Figure II.4.a). LIC50 est dtermine partir dune courbe de
rgression des donnes exprimentales (Figure II.4.b). Lensemble des mesures a t ralis et
reproduit trois fois.
Concentration de flavonodes ou d'oligomres (10
-4
M)
100
120
c
i
d
e

u
r
i
q
u
e

(
%
)
Hillslope
EC
x
y
+ =
50
1
min max
min
40
60
80

d
'
a
P
r
o
d
u
c
t
i
o
n
50
20
0 20 40 60 80 100 120
IC50

Fi
a) b)

gure II.4. Dtermination graphique de lIC50 (a) partir dune courbe de rgression
logistique 4 paramtres (b).

78
4.4. Etude rhologique
4.4.1. Principe

Lorsque l'on part d'une solution dilue et que l'on augmente progressivement la
concentration en polymre, il existe une concentration critique C* partir de laquelle
intervient le recouvrement des chanes macromolculaires. La concentration de recouvrement
gomtrique, d'aprs De Gennes [203], peut tre dfinie par la valeur laquelle la
concentration moyenne en segments dans la solution devient gale la concentration des
segments au sein de la chane isole (Figure II.5.).

Figure II.5.
sparant les domaines dilus (C < C*) et semi dilus (C > C*)

ologiques des oligomres de rutine, diffrentes
solu les ont t ralises dans leau 20 C. Lanalyse a t
ra e l un bain-marie (RMS Lauda). Lensemble des
test plac au-
dessu
t trois fois.
Reprsentation schmatique de la concentration critique de recouvre ment (C*)
Afin danalyser les caractristiques rh
tions des concentrations variab
lis par un rhomtre StressTech coup
s a t conduit avec un module plan de 40 mM de diamtre. Un couvercle a t
s de lchantillon pendant lanalyse afin de limiter lvaporation. La viscosit a t
mesure pour une force applique comprise entre 0.05 et 10 Pa selon les concentrations en
oligomres. La concentration critique a t obtenue par la reprsentation graphique de la
viscosit au plateau pour une vitesse de cisaillement de 300 s
-1
en fonction de la concentration
en oligomres. Lensemble des mesures a t rp

79
5. Mthodes analytiques
5.1. Analyse des flavonodes et de leurs oligomres par SEC

La chromatographie par permation gel (CPG) ou chromatographie dexclusion strique
(SEC) est une technique chromatographique de sparation selon la masse. Cette sparation est
base sur la di
diamtre comparable ses propres dimensions. Le nombre de conformations permises pour
polymre ement lapproche dune paroi solide. Pour viter ces
rgions de faible entropie, le polymre garde une distance de sparation entre son centre de
e en fonction de diffrentes
les : le coefficient de partage, le volume de la phase mobile et le volume des pores. Le
coefficient de partage dpend de la taille relative de la macromolcule par rapport au diamtre
des pores. Les molcules qui sont exclues des pores sortent les premires, alors que celles qui
peuvent explorer la totalit du
II.6.).
5.1.1. Principe
minution dentropie dune macromolcule lorsquelle pntre dans un pore de
un flexible diminue fort
gravit et linterface solvant/gel qui est, en moyenne, de lordre du rayon hydrodynamique de
la molcule. La rtention dun solut en SEC peut tre exprim
variab
volume des pores sortent en mme temps que le solvant (Figure

Figure II.6. Reprsentation schmatique de la sparation par exclusion strique


Les diffrentes analyses ont t effectues en utilisant un systme Merck (LaChrom)
quip de :
- une colonne TSKGel -3 000 (30x7.8 mm, 7 m, constitu dune rsine polyvinyle,
Tosoh).
80
- un four de colonne (L-7350, Merck)
- une pompe (L-7100, Merck)
- un dtecteur ultraviolet (Merck).
- un logiciel dacquisition et de traitement de chromatogramme EZ-Chrom.
Les chantillons prlevs du milieu ractionnel renferment des molcules de masse
iffrentes qui sont spares sur SEC. La phase mobile est du DMF avec 1 % LiBr 1 ml/min.
La colonne est maintenue au sein du four 60 C. Ces chantillons sont prlevs
automa e de la plateforme Chemspeed. La dtection des
omposs phnoliques se fait par UV 280 nm.
d
tiquem nt, dilus et injects partir
c
Des courbes dtalonnage ont t ralises pour la rutine et lesculine. Afin de
saffranchir du chevauchement du pic du monomre et des oligomres, la hauteur du pic du
monomre a t utilise pour la gamme talon. La masse molculaire moyenne du mlange
oligomrique a t dduite dune gamme talon de polystyrne (PS) (Figure II.7.), et dfinie
selon :

=
i
i i
n
n
M n
M : masse mol
i
i
culaire moyenne en nombre

=
i
i
i i
w
w
M w
M : masse molculaire moyenne en poids
i

1
M
w
: indice de la masse molculaire moyenne en poids
M
I
m
=

n
M
O n
w
M
PDI = : polydispersit ( 1)
i
reprsente le nombre doligomres ayant une masse M
i
au degr de polymrisation i, et
s
i
la fraction massique de chane polymrique de degrs i.

81
82
Volume de rtention (ml)
5 6 7 8 9 10
L
o
g

(
M
M
)
1
2
3
4
5
6
Log MM=-0.6555x+8.6583

gure II.7.
(a) (b)
Fi Courbe dtalonnage de PS (a) permettant le dcoupage du chromatogramme
(b) en vue du calcul de
w
M

5.2. Analyse des flavonodes et de leurs oligomres par spectroscopie
ipe

L Fourier (ou FTIR) est base sur
absorption dun rayonnement infrarouge par le matriau analys. Elle permet, via la
dtec
pondre un
ensem le de bandes dabsorption caractristiques permettant de lidentifier.

infrarouge
5.2.1. Princ
a spectroscopie infrarouge transforme de
l
tion des vibrations caractristiques des liaisons chimiques, deffectuer lanalyse des
fonctions chimiques prsentes dans le matriau. Lorsque la longueur donde (lnergie)
apporte par le faisceau lumineux est voisine de lnergie de vibration de la molcule, cette
dernire va absorber le rayonnement et une diminution de lintensit rflchie ou transmise et
enregistre. Le domaine de linfrarouge entre 4 000 cm
-1
et 400 cm
-1
(2.5-25 m) correspond
au domaine dnergie de vibration des molcules. Toutes les vibrations ne donnent pas lieu
une absorption, cela va dpendre aussi de la gomtrie de la molcule et en particulier de sa
symtrie. Pour une gomtrie donne, les modes de vibration actifs en infrarouge peuvent tre
dtermins grce la thorie des Groupes. La position de ces bandes dabsorption va
dpendre en particulier de la diffrence dlectrongativit des atomes et de leur masse. Par
consquent, un matriau de composition chimique et de structure donne va corres
b
5.2.
7 (Bruker). Les solutions de
flavo d (30 :70, v/v) sont dposes sur
le cri l es dpts successifs de la mme solution
sont alys. Les spectres
sont
9 points et une normalisation.

5.3. Analyse des flavonodes et de leurs oligomres par spectromtrie de
masse
5.3.1. Principe gnral de lanalyse par spectromtrie de masse

La spectromtrie de masse permet de mesurer avec prcision la masse dune molcule
selon son rapport masse/charge (m/z). Cette analyse consiste en trois tapes, une tape
dionisation, une tape dacclration et une tape de dtection. Un spectromtre de masse est
compos dun systme dintroduction de lchantillon, dune source dions, dun analyseur
qui sparent les ions selon leur m/z et dun dtecteur.
Le systme dintroduction de lchantillon : lchantillon peut tre introduit
directement dans la source, sous forme liquide (infusion directe, couplage un systme
chromatographique, ) ou solide (canne dintroduction directe, dpt sur plaque, ...).
La source d'ionisation : elle consiste vaporiser les molcules et les ioniser. La
source dion peut tre utilise en mode positif (M + H
+
) ou ngatif (M H
-
). Si
lchantillon prsente des groupements fonctionnels accepteurs d'H
+
, le mode positif est
choisi (amine sur protine ou peptides), linverse si les groupements sont donneurs de
protons, le mode ngatif est retenu (acide carboxylique, groupements alcools sur les
sucres, oligonuclotides). Plusieurs types de sources existent et sont utilises en fonction
du rsultat recherch et des molcules analyses. Citons par exemple, lionisation
lectronique, lionisation chimique, lionisation chimique pression atmosphrique
2. Matriels et protocole

Lanalyse infrarouge a t effectue avec un cristal rflexion totale attnue (ATR) sur
un spectromtre transforme de Fourier (FTIR) Tensor 2
no es ou doligomres dans un le mlange mthanol/eau
sta ATR puis vapores sous vide 50 C. D
effectus afin de concentrer lchantillon. Le film obtenu est alors an
obtenus par laccumulation de 1024 scans avec une rsolution de 2 cm
-1
. Le traitement
des spectres a consist en une correction des bandes H
2
O/CO
2
, un lissage de Savitzky-Golay
83
(APCI), llectrospray (ESI) ou encore lionisation-desorption laser assiste par matrice
(MALDI).
Lanalyseur et de sparer les ions en f e rt m arge
(m/z), citons par exemple : le quadriple, le pige ions ou encore le temps de vol (TOF).
Aux vues des travaux prc ant lanalyse de polymres de flavonodes
an us nous so rticu rement intresss au MALDI coupl
r TOF.

Principe de lionisation de type MALDI
Le MALDI, pour Matrix As ser Desorption Ionisation, est une technique
n par ds s atrice. Ce mode dionisation provoque trs
peu de fragmentations, et est donc bien adapt lanalyse des mac les. Le compos
tudier est dabord incorpor dans une matrice org ue gnralement cristallise. Ce
isation
ainsi s
molcules (M<500 Da) sont difficiles tudier du fait de la prsence des ions produits par la
dcom autres supports base de silicium poreux par
exem our remplacer les matrices traditionnelles [187].
: perm onction d leur rappo asse/ch

dents abord
(tannins, anthocy es), no mmes plus pa li
lanalyseu
5.3.2.

sisted La
dionisatio orption laser as iste par une m
romolcu
aniq
mlange est dpos sur un support et plac dans le spectromtre au point dimpact dun
faisceau laser puls. Au point dimpact, lnergie reue est transfre par la matrice au
ompos qui se trouve la fois dsorb et ionis de faon douce (Figure II.8.). Lion c
que la dtection sont ralises sous un vide pouss (-10
6
-10
8
atm). Les petite
position de la matrice. Pour ces tudes, d
ple sont maintenant utiliss p

84

Figure II.8. Reprsentation schmatique de la dsorption laser [187].

Le succs de la mthode MALDI dpend en grande partie du choix de la matrice et de la
prparation de lchantillon. Le rle de la matrice consiste en :
lincorporation de la molcule par co-cristallisation
labsorption de lnergie du rayonnement
la mise en phase gazeuse de la molcule par codsorption [188].
Diffrentes matrices ont t utilises dans le cadre de lanalyse des flavonodes,
certaines dentre elles sont rpertories dans le Tableau II.4..

85
Tablea tilises dans le cadre de lanalyse de flavonodes par MALDI-TOF.

Molcules
u II.4. Matrices u

Matrice Mode de dpt Cation Dtection
(ionisation)
Rfrence
Proanthocyanidine DHB Dried-droplet Iodide de
sodium
TOF (+) [189]
Tannins DHB Dried-droplet NaCl TOF (+) [190]
puis analyte
TOF (+) [191]
Polygalloyl
polyflavan-3-ols
[192]
ligomres
atchiques
IAA, DHB,
CCA, SA,
Dried-droplet Sel
dargent
TOF (+) [193]
Procyanidins plet Sel
dargent
TOF [194]

Tannins DHB Matrice/polymre
/matrice
Na+ TOF (+) [195]
Flavonol
glycosides
HCCA, THAP,
IDA, HABA,
DHB
Dried-droplet NaCl TOF + ou -, le
+ tant
favorable
[196]
Rutine DHB LiCl ou
KCl
TOF + [197]
Flavonol
glycosides
THAP Dpt
matrice/schage
NaCl
t-IAA Dried-droplet TOF (+)
O
c
HABA,
dithranol,
9NA, 5SCA
IAA Dried-dro
Dried-droplet
HCCA: 4-hydroxy-R-cyanocinnamic acid ; THAP:2,4,6-trihydroxyacetophenone monohydrate ;
HABA: 2-(4-hydroxyphenylazo)benzoic acid ; IDA: trans-3-indoleacrylic acid ; DHB: 2,5-
dihy
chlo

La qualit du spectre dpend de certains facteurs lis la prparation de lchantillon :
rparation des cristaux,
la slection et la nature de la matrice,
ment:
droxybenzoic acid ; IAA: trans-3-indoleacrylic acid ; 9NA: 9-nitroanthracene ; 5SCA: 5-
rosalycilic acid ; SA: sinapinic acid ; HABA : matrice la plus approprie selon les auteurs
la mthode de p
la prsence de tampons,
le pH des solutions,
les caractristiques intrinsques de la molcule danalyte,
le ou les solvants utiliss,
la puret de lchantillon (prsence de polymres synthtiques, plastiques, sels).
Diffrents modes de dpts sont envisageables [214, 215] notam
dried droplet method : La solution danalyte est mlange la matrice en
concentration beaucoup plus leve dans le mme solvant. Le ratio matrice/analyte varie de
100 10 000 dpendant de la chimie et de la masse du polymre. 1 l de cette solution est
plac sur la cible du MALDI puis sch.
86
layer ce saturation ou forte concentration est
dabord dpose sur la cible puis sche, lchantillon est alors dpos.

masses diffrentes seront spars, dans un tube, selon
leur temps de vol. Lensemble du tube est plac sous un vide pouss. Les ions lgers sont
dtects les premiers, les ions les plus lourds parviennent au dtecteur aprs un certain dlai
qui dpend de leur masse.
Le mode de dtection peut tre linaire ou par rflectron (Figure II.9.). Le mode linaire
permet lanalyse de haute masse molculaire allant au-del de 1 000 000 Da. Dans le cas du
rflectron, le miroir lectrostatique permet dallonger la distance de vol sans augmenter la
taille de linstrument. Le dtecteur du rflectron est plac sur le plan de focalisation des ions
de mme rapport m/z.. Le rflectron corrige la dispersion en nergie cintique, mais il ne
corrige pas la dispersion en temps. Il permet daugmenter la rsolution, mais il est limit des
masses in 0

mthode, la solution de matri
5.3.3. Principe de lanalyseur par temps de vol

Lanalyse en temps de vol (TOF) est bien adapte la nature pulse de la dsorption
MALDI. une nergie cintique donne, la vitesse v dun ion est inversement
proportionnelle la racine carre de sa masse molculaire :
qV = mv2 / 2, do v = [(2qV)/m] avec q= ze, z nombre de charges de lion, V
potentiel dacclration de lion, m masse molculaire de lion.
Aprs acclration, des ions de
frieures 6 0 0 Da.

Figure II.9. Reprsentation schmatique de lanalyseur par temps de vol en mode
rflectron [187].

87
5.3.4. Protocole

La prparation de lchantillon ainsi que de la matrice et le dpt sur cible MALDI sont
raliss automatiquement sur la plateforme Chemspeed. Lensemble de lanalyse par MALDI-
TOF a t optimis et fera lobjet dun paragraphe ultrieur dans la partie rsultats.
Au cours de cette mise au point, trois matrices ont t testes :

Tableau II.5. Matrices utilises dans lanalyse MALDI-TOF.

Nom (abrviation) Structure
Acide 2,5-dihydroxybenzoique (DHB)
OH
O H
COOH

2,4,6-trihydroxyacetophenone
(THAP)
OH O H
OH
O

Acide sinapinique (SA)
COOH CH
3
O
O H
OMe

5.4. Analyse des flavonodes et de leurs oligomres par rsonance magntique
nuclaire (RMN)
5.4.1. Principe

La Rsonance Magntique Nuclaire (RMN) est une technique spectroscopique
dveloppe par Bloch et Purcell (Prix Nobel 1952). Cette technique se diffrencie des
spectroscopies UV-visible et infra-rouge, du fait que les niveaux dnergie entre lesquels
seffectue la transition nexistent pas en labsence de champ magntique. Cette technique
spectroscopique est base sur lexcitation des molcules permettant la transition entre niveaux
dnergie de spins nuclaires dans un champ magntique (B
0
).
88
De nos jo tures, prciser
enchanement des diffrents atomes le long de la chane carbone, examiner les formes
tautomres et dterminer la strochimie. Lanalyse de mlanges prsente quant elle
quelques difficults notamment dans le riques.
e diffusion RMN (DOSY) est base sur un gradient de
cham
gnal de chaque compos dcrot en fonction des diffrents taux
e diffusion, permettant la construction de donnes RMN bilinaire du mlange. Par calcul du
coefficient de diffusion pour chaque compos, il est possible dobtenir un spectre RMN 2
dimensions ents chimiques conventionnels et lautre
imension pour les coefficients de diffusion (Figure II.10.). Ce type de technique permet de
spar
urs, la RMN est couramment utilise pour dterminer des struc
l
cas de mlanges polym

Principe de la RMN de diffusion

La spectroscopie par ordre d
p puls appliqu au cours de lexprimentation RMN durant laquelle les composs
diffusent. Il en rsulte que le si
d
: une dimension pour les dplacem
d
er le spectre de diffrentes espces contenues dans un mlange [198], si tant est que les
molcules du mlange aient un coefficient de diffusion diffrent.

Figure II.10.
Principe de la RMN du solide
rsines, polymres, gels, la haute
rsolution langle magique (HRMAS) est utilise. En effet, la rigidit du rseau cristallin
accentue fortement linfluence sur la relaxation dinteractions dorigines diverses. De plus, les
Exprience mene en 2D-J-DOSY sur un mlange de sucres
(sucrose/rafinose)[199].

Dans le cas dchantillons dits mous comme les
89
tudes se font principalement sur des chantillons de poudre puisquil est difficile dobtenir
es monocristaux de taille suffisante (>1 mm
3
). Ainsi, le caractre anisotrope des interactions
et la

Figure II.11. res de catechine [200].
Disparition des pics A et B, et
s spectres
ode statique soient des spectres trs larges et souvent
ine langle magique va moyenner certaines interactions
prsentes lintrieur de lchantillon (interactions diple-diple homonuclaire, anisotropie
de dplacements chim
d
prsence de cristallites aux orientations multiples gnrent des largissements de raies de
rsonance (Figure II.11.).
Spectre 1H-RMN de la catchine et des oligom
apparition de 2 larges bandes D et C signent de la formation
dun pontage ther selon les auteurs.

La technique la plus utilise, pour liminer, ou tout du moins rduire ces largissements
consiste mettre lchantillon en rotation langle magique (angle de 54.7 par rapport au
champ magntique statique) (Figure II.12.). Les expriences HRMAS permettent dtudier
par RMN des chantillons dont les proprits se situent entre celles des liquides et des solides :
polymres sous forme de gels, membranes, molcules synthtises sur rsines, lipides La
mobilit limite des substances associe leur grande htrognit explique que le
RMN du proton obtenu en m
xploitables. Le fait de travailler
iques) [201].
90

Figure II.12. Reprsentation schmatique de langle magique

la dure des expriences
sur le

Les spectres RMN
1
H ont t effectus sur les monomres et sur les oligomres sur un
spe et sonde HRMAS. La
mise au point de la technique danalyse par RMN fera lobjet dun paragraphe ultrieur dans
la partie rs a
es structures de la rutine, de lesculine et de la dirutine ont t tudies partir de
diffr
Principe de la dtection par cryosonde

La cryosonde installe sur le spectromtre est refroidie l'hlium liquide 30 K par une
unit cryognique, ce qui entrane une forte diminution du bruit de fond. Ceci permet de
multiplier par 4 la sensibilit et donc de diviser par un facteur de 16
s chantillons standard [202].
Ainsi, un spectromtre 600 MHz quip dune cryosonde possde la sensibilit d'un
spectromtre RMN 800 MHz.
5.4.2. Protocole

ctromtre 300, 600 et 800 MHz, avec sonde classique, cryosonde
ult ts.
L
ents spectres :
Spectre
1
H une dimension
COSY : Correlated spectroscopy Y : 2D
1
H/
1
H, couplage scalaire
HMQC : Heteronuclear multiple Quantum Correlation : 2D
1
H/
13
C, couplage
scalaire
91
ROESY : Rotating frame Overhauser Effect spectroscopy Y: 2D
1
H/
1
H couplage
dipolaire (analyse supplentant le NOESY (Nuclear Overhauser effect
es rsultats pertinents de RMN ont t analyss dans le chapitre IV. et lensemble des
investigations menes en RMN a t plac en annexe 1.

6. M
oligomres.
= E
et E lnergie du systme.
prcis ; cependant, lapproximation quantique prsente des
limitations dues au nombre dorbital du systme molculaire tudi. Les calculs sont donc
fortem
approche Hartee-Fock semi-empirique. A la
iffrence dune approche ab initio, o toutes les intgrales bi-lectroniques sont calcules, on
tions de manire
rduire ce nombre dintgrales et ainsi allger le temps de calcul.
spectroscopy) pour des molcules ayant une masse molculaire infrieure
1000).

L
odlisation molculaire

Dans ce travail, la modlisation molculaire a t utilise pour tudier la conformation et
les proprits lectroniques de la rutine, de lesculine et de leurs
Nous prsentons dans ce paragraphe lensemble des mthodologies suivies au cours de
cette tude.

6.1. Mcanique quantique

Les mthodes quantiques lient les proprits molculaires et ltat solide aux
interactions entre les lectrons. Elles permettent dtudier la structure lectronique des
molcules et par suite les tats de transition et des orbitales molculaires. Le systme est
dcrit par une fonction multiparticulaire , solution de lquation de Schrdinger :
H
O H est loprateur hamiltonien
Les algorithmes sont trs
ent dpendants de la puissance des ordinateurs utiliss. On distingue les calculs de
mcanique quantique selon quils sont ab initio ou semi empiriques. La mthode de calcul
utilise au cours de ce travail est la mthode AM1 (Austin Model 1) dveloppe par Dewar et
al. [203]. Le modle AM1 est bas sur une
d
ralise dans une approche semi-empirique un certain nombre dapproxima
92
93
6
st cula res comportant jusqu plusieurs
llie
m
c
p
e
p
q
e la molcule est exprime sous la form
associes aux carts de la structure par rapport des paramtres structuraux de rfrence :
E
intramolculaire
E
intermolculaire
E = E
liaison
+ E
angle
+ E
didre
+ E
distorsion de plan
+ E
van der Waals
+ E
lectrostatiques
Les variables du calcul sont les coordonnes internes du systme : longueurs de liaisons,
angles de valence, angles didres, ainsi que les distances entre atomes non lis dont les
interactions sont reprsentes par un potentiel de van der Waals, un potentiel lectrostatique le
plus souvent de type Coulombien et un potentiel de Lennard Jones.
Habituellement, on distingue dans lquation de lnergie du champ de force des termes
in s s
concernan
e nombreux champs de force existent. Certains sont calibrs pour reproduire les
propr
nt associs. Le champ de force utilis dans cette
tude est le champ de force cff (Consistent ForceField).

.2. Mcanique molculaire

Les mthodes de la mcanique molculaire permettent le calcul de proprits
ructurales et thermodynamiques de systmes mol i
mi rs datomes. Les lectrons ny sont pas traits explicitement comme dans un calcul de
canique quantique, mais les atomes y sont reprsents comme des masses ponctuelles
harges, relies les unes aux autres par des ressorts.
Contrairement la mcanique quantique, lnergie des systmes molculaires ne
rovient pas de la rsolution de lquation de Schrdinger, mais est dcrite par les fonctions
mpiriques auxquelles sont associs des paramtres drivant de lexprience ou de calculs
rcis quanto-chimiques. Le champ de force tabli par cette mthode reprsente aussi bien
ue possible les variations de lnergie potentielle en fonction de la gomtrie molculaire.
Lnergie d e dune somme de contributions
tramolculaire concernant les atomes lis chimiquement, et des termes intermolculaire
t les interactions entre les atomes non lis chimiquement.
D
its de systmes biologiques (CHARMM, AMBER, CFF),, dautres sont adapts
de petites molcules organiques en phase condense (OPLS, MM2, MM3, ).
Les champs de force diffrent les uns des autres notamment par la fonction
mathmatique et les paramtres qui leurs so
94
6.3. Mthodes danalyse des surfaces dnergie potentielle
6.3.1. isation de gom

La gom ar un ensemble de forces exerces sur
chaque atom
potentiel correspondant aux m tous les atomes dune molcule. Une
mini ie im on success
part rma ise une optimisation gomtrique
com trie du systm atiquement
modifis par petits in oyenne atteigne un
mini m local, sans pour autant attei n u
trie des m ble de 3
algorithmes plments
dans le module Discover3 d'
ami
dyn o modlisation par laquelle lvolution en
fonction du tem crite r les principes de la mcanique
classique newtonienne. En dynam e, on essaie de simuler les mouvements
intram ps rel.
muler les m ents intramolculaires au
cours du temps. Ces mouvem des vibrations autour dun minimum, ou au
passage dun minimum un autre minimum gie. Si lnergie fournie virtuellement au
systm est suffisam t leve, des barrir portantes peuvent tre
franchies. L
mthodes de m
Le odynamiques gnrs sont VE (ensemble
microcanonique), NVT (ensemble canonique) ou NPT (ensemble isobare-isotherme).
Chacune de ces trois lettres caractrise une grandeur conserve au cours de la simulation : N
dsigne le nombre de particules, E lnergie du systme, T sa temprature et P sa pression.

Optim
trie dune m
e. La m
confo
tries
t stabilise p
saie de rep
ents de
putati
est soum
gom
que lnergie structurale m
o
canique m
plique une com
tion initiale, laquelle
tres dfinissant la
crments jusqu ce
lcule es
olculaire es
ouvem
roduire une surface dnergie de
ive et interactive dune molcule
e sont systm
misation dnerg
ir d
plte. Tous les param
mu
Loptim

6.3.2.

La
olculaires qu
La dyna
e
une
ndre le mi im m global.
olcules a t ralise par un ensem
onjugu et enfin Newton-Raphson, im
isation de la gom
: Steepest descent, gradient c
Insight II.
Dyn
amique m
ps (ou trajectoire)
mique m
que molculaire
lculaire est une technique de
n peu
lculaire consiste donc si
e
du
ique m
sualiser en
orrespondent
ne molcule est d
olculair
suite en tem
pa
ouvem
e lo
o
t vi
nts c
dner
es nergtiques im
identiques ceux qui sont utiliss dans les
le plus souvent de type N
men
erm
es champs de force utiliss sont
inimisation.
sembles th s en
95
(a) (b)
6.4. Systme priodique

icieux de se placer dans les mmes conditions que les
tests
ractions solut/solvant.
Le solvant peut tre simul implicitement par sa constante dilectrique; ainsi, une
constante de 80 pF/m sera utilise dans le cas de leau. Cette approche plus rigoureuse
perm ilieu liquide sans donner des
info
un milieu infini. Si une particule quitte la bote centrale durant la
sim
e opration de symtrie sur les
vrais atom
Dans leur grande majorit, les tudes par modlisation molculaire sont ralises dans le
vide. Cependant, il est souvent plus jud
biologiques. Ces calculs permettent de comparer la stabilit relative des diffrentes
conformations en solution et en phase gazeuse.

Diffrentes mthodes permettent de modliser un solvant (Tableau II.6.):
Une simple minimisation de la molcule en prsence dun nombre rduit de molcules
de solvant permet une premire valuation des inte
et de simuler la conformation la plus stable en m
rmations sur les interactions intermolculaires.
Enfin, une solution peut tre modlise explicitement en lassimilant une structure
priodique, dont le motif lmentaire est une bote contenant une molcule de solut et n
molcules de solvant (Figure II.13). Cette bote initiale est rplique dans toutes les
directions afin de simuler
ulation, elle est immdiatement remplace par une particule image qui rentre par le ct
oppos. Les atomes images sont employs pour calculer les nergies et les forces des
atomes rels dans lunit centrale. Les nergies et les forces des atomes images ne sont pas
calcules puisque leurs mouvements sont calculs comm
es.

Figure II.13. Conditions priodiques pour un systme 3 dimensions (a), reprsentation
schmatique du seuil de coupure sur un systme 2 dimensions (b) [204].

R
cutoff
Pour limiter les temps de calculs, un modle dimage minimale est utilis, cest--dire
quon permet des molcules dans lunit centrale dinteragir seulement avec la molcule ou
limage la plus proche delle. Un seuil de coupure (R
cutoff
) est dfini, au-del duquel, les
interactions sont considres comme nulles.
96
97

Tableau II.6. Etude par m e des flavonodes dans un solvant
Rfrence Modlisation molcu Solvant Ob
odlisation molculair
laire Molcule servations
[170] ctine,
q 3-
oside
-minimisation par stee ent,
constante dilectrique de 1 T
-dynamique (AMBER8)
Couche deau de 9 -va conformation dans leau par rapport au
vid ctine conserve sa conformation plane
Quer
uercetine-
monoglyc
pest-desc
, PBC, NP
riation de
e, la quer
[205] I chrysine -minimisation par steepe t et
congugate gradient
-dynamique
(cvff de Discover 972, Ins
Bote cubique de 30 ,
contenant 321 ou 324
molcules de mthanol
-t probabilit de trouver une molcule de
sol ximit dun groupement
de diffusion peut tre corrl aux
no iaisons hydrogne formes
soflavone, st-descen
ight)
ude de la
vant pro
-le coefficient
mbres de l
[206] ctine,
k , morine,
a luteoline,

-lenvironnement est si ant
une loi linaire de Poisson te
dans le module Delphi (In
Simulation avec une
constante dilectrique
de 80 (correspondant
leau) lextrieur de la
protine et de 4 dans le
site actif
- l nte dilectrique influe sur le mode de
prsenta du substrat dans la cavit, sur la
conform ainsi que sur lnergie de fixation lors du
Docking
Quer
myricetine,
aempferol
pigenine,
silychristin
mul suiv
implmen
sight)
a consta
tion
ation

[19] F -minimisation par AM1 ( 3D
5.0)
2 molcules dthanol
autour de la molcule
-la solu des flavones dans lthanol est due au
nombre aisons hydrogne intermolculaires et non
au mom ipolaire
lavone CS Chem bilit
de li
ent d
Chapitre II Matriels et Mthodes
6.5.Cheminement de lanalyse conformationnelle

plus basse nergie, nous avons utilis tout dabord
la d xplorer de manire exhaustive lespace
confo
calcul par la formule suivante :
Lanalyse conformationnelle des diffrentes molcules tudies se dcompose en
plusieurs tapes dcrites Figure II.14..
Pour dterminer les conformres de
ynamique molculaire, qui permet de
rmationnel du systme. La ressemblance de structure entre les diffrents
conformres de flavonodes est value en calculant le RMSD (Root Mean Square Distance).
Le RMSD est la distance moyenne entre les positions des atomes de deux structures
superposes. Il est
=
=
N
1
i
i
N
RMSD
1
2

prsentation en trois
dimensions du RMSD de chaque confor par rapport toutes les autres, on extrait les
structures les plus probables. RMSD sont reprsents par
diffr t prsentatives dune
famille conform
les conformres en fonction de leur nergie totale et de ltirement du systme. Ltirement du
syst structures
extrm
A partir d un groupe de molcules
repr t
plus stable est conserve

priodiques.

Ou est la distance entre N pairs datomes quivalents.
En traant un graphe cluster (Figures II.15.) qui est une re
mation
Les diffrents intervalles de
en s codes de couleurs. Les structures slectionnes sont celles re
ationnelle.
Une seconde reprsentation consiste crer un graphique en 3 dimensions reprsentant
me est valu partir de la distance sparant 2 extrmits de la molcule. Les
es seront slectionnes (Figures II.15.).
es 2 reprsentations prcdemment cites,
sen atives de la dynamique molculaire est obtenu. Aprs minimisation, la structure la
pour les calculs ultrieurs.
Lensemble des calculs effectus dans une bote de solvant tient compte des conditions

98
Cration de la molcule
(module Builder Insight)
Minimisation (0.001 kcal/mol)
Dynamique 600K (>10ps)
Analyse des conformres dintrt
(module Analysis Insight)
Conformre le plus stable
Recherche des descripteurs QSAR
(module QSAR, Hyperchem)
Ajouts successifs de molcules
de solvant autour du solut.
Cration dune bote cubique
autour de la molcule
Cration de ra
(par abstracti
dicaux phenoxy
on dun lectron)
Minimisation en fixant la molcule au centre de la bote
(0.01 kcal/mol, cutoff:16, constante dilectrique: 2.0)
Dynamique en laissant la molcule fixe
(300K, NVT, 20ps,cutoff:16, constante dilectrique: 2.0)
Minimisation de lensemble du systme relch
(0.01 kcal/mol, cutoff:14, constante dilectrique: 2.0)
Dynamique de lensemble du systme relch
(300K, NVT, 200ps, cutoff:14, constante dilectrique: 2.0)
Cycles de minimisation/ajout de molcules de
solvant
Solvatation de la molcule

Figure II.14. Mthodologie de ltude dune molcule par modlisation molculaire.
0.01 kcal/mol : convergence atteinte lors dune tape de minimisation
-- : calculs effectus par mthode semi-empirique AM1 avec un traitement Hartree-Fock
on-restreint (Hyperchem 7.5)
: calculs effectus par mcanique molculaire avec le champ de force cff (Discover3,
Insight II)
--
n
99

a) graphique RMSD (cluster) de la rutine, reprsentation de 2 conformres caractristiques
chacun dune famille conformationnelle

b) graphique de fluctuation de lnergie totale du systme au cours de la dynamique,
reprsentation de 2 conformres de basse et de haute nergie
Frame
Frame

nt 2 pseudo-atom c) graphique de variation de la distance spara es au cours de la dynamique,
reprsentation de 2 conformres sous forme replie (4.06 ) et tire (12.27 )

Figure II.15. Diffrentes reprsentations graphiques utilises lors du choix des conformres
dintrt dans le cas dune dynamique 600 K de la rutine dans le vide

Frame
D
i
s
t
a
n
c
e

(
A
)

100
6.6. Descripteurs molculaires

Aprs optimisation des structures tridimensionnelles sur HyperChem 7.5, des
descripteurs peuvent tre dtermins. Certains de ces descripteurs peuvent tre corrls aux
proprits biologiques selon la relation :
2D2 + 3D3 +
rgtiques, lectroniques, striques et
hydrophobiques.
tude, par le module QSAR de
Hype
- E
LUMO
: nergie de lorbitale molculaire la plus basse vacante
moment dipolaire (D) calcul partir des charges partielles)
- POL : polarisabilit molculaire (a.u.) (estime partir dun schma dadditivit )
- A : aire superficielle ()(approxim par la mthode de grille dveloppe par Still et
Coll.[207, 208])
- VOL : volume molculaire (
3
) (approxime de la mme manire que A)
- Log P : coefficient de partition octanol/eau (estim par la mthode de contribution
de groupe dveloppe par Ghose et coll.[209])
- QOn : charge partielle sur loxygne n (calcule par un model empirique bas sur
lapproche de lgalisation partielle de llectrongativit de lorbitale de Gasteiger
et Marsili [210])
- H (BDE) : variation denthalpie entre le radical phenoxy et la molcule parent
(kcal/mol)
- IP : potentiel dionisation, variation denthalpie entre le radical cation (ArOH
+
) et la
molcule parent (ArOH) (kcal/mol).
P = P0 + 1D1 +
o P est la proprit tudie (variable dpendante), Di est le descripteur (variable
indpendante) et i mesure le poids de chaque descripteur qui entre dans la relation. On peut
distinguer les descripteurs structuraux, ne
Diffrents descripteurs ont t calculs au cours de cette
rchem :
- E
HOMO
: nergie de lorbitale molculaire la plus haute occupe
- Eg : diffrence entre E
HOMO
et E
LUMO

- : letrongativit (eV) = 0.5 (-E
HOMO
et E
LUMO
)
- :
101

CHAPITRE III.

MISE AU POINT DES TECHNIQUES
ANALYTIQUES

Chapitre III. Mise au point des techniques analytiques

Introduction

Cette tude porte sur la synthse enzymatique de polymres de rutine et desculine, et
notamment sur les effets des conditions ractionnelles sur la masse des oligomres obtenus.
Au p
techniques analytiques
par M
ralable, ce travail a ncessit la mise au point dun protocole de synthse et des
mthodes de caractrisation de ces oligomres. En effet, il a t dmontr que les conditions
ractionnelles (pH, temprature, solvant, ) affectent la masse molculaire et la structure des
oligomres, et par consquent les proprits de ces composs. Les mthodes de sparation et
de dtection par SEC-UV et MALDI-TOF sont des techniques reconnues de caractrisation de
mlanges polymriques. La SEC-UV permet la sparation des oligomres selon leur taille, la
dtermination de la polydispersit, de la distribution massique, de la masse moyenne ainsi que
lanalyse quantitative des oligomres synthtiss. Le MALDI-TOF permet, quant lui, la
dtermination des masses absolues des oligomres permettant daboutir la caractrisation du
mode de pontage. Ces deux techniques combines permettent donc une bonne caractrisation
de lchantillon oligomrique. Cependant, lanalyse par MALDI-TOF ncessite la prise en
compte de plusieurs facteurs qui influencent les performances de lanalyse. De plus, compte
tenu de la complexit et parfois de la rapidit de certaines tapes de polymrisation, il nous
est apparu utile de dvelopper une plateforme automatise, permettant la synthse en parallle
dans diffrentes conditions et lanalyse en ligne afin daboutir aux grandeurs caractristiques
de cette raction. Ainsi, lobjectif de ce travail est la mise au point des
ALDI-TOF et SEC-UV et leur couplage une station automatise Chemspeed pour
assurer le suivi en ligne de cette raction de polymrisation.

Optimisation de la mthode MALDI-TOF
Lapplication de la spectromtrie par MALDI-TOF nos chantillons oligomriques a
ncessit loptimisation des diffrents facteurs clefs de cette technique : choix et prparation
de la matrice dincorporation des chantillons, mode de dtection, mode dionisation, mode
de dpt, solution de dilution. Tous ces facteurs ont t varis afin daboutir aux conditions
optimales danalyse.

102
Mise en uvre de la plateforme automatise
Il a t ncessaire de configurer et de reprogrammer la plateforme Chemspeed afin de
raliser 8 synthses en parallle, les dilutions, les injections sur SEC-UV et les dpts sur
cible MALDI-TOF de manire automatique.

Suivi cintique
Aprs la mise en place de ces diffrents protocoles de synthse et de caractrisation, un
suivi cintique des ractions doligomrisation de la rutine et de lesculine a t ralis dune
part par SEC-UV, dautre part par MALDI-TOF.
son des techniques SEC-UV/MALDI-TOF Comparai
e chacune.

et de publication intitul An automated platform for
rutin
Ces deux techniques aboutissant la caractrisation massique du mlange oligomrique,
une tude comparative a t ralise, afin de cerner les atouts et les limites d
Cette partie fait lobjet dun proj
and esculin oligomers syntheses: online preparation and SEC-UV, MALDI-TOF
analysis .
103
An automated platform for rutin and esculin oligomers syntheses: online preparation and
SEC-UV, MALDI-TOF analysis

Julie Anthoni
a
, Frederic Lionneton
b
, Jacques Magdalou
b
, Jean-Marc Engasser
a
, Catherine
Humeau
a
, Mohamed Ghoul
a
*
e Biocatalyse Bioprocds, ENSAIA-INPL, Vandoeuvre les Nancy, France

An a
(acetonitrile/water TFA 0.1 %) as a dilution solvent, a ratio of 3:1 analyte /matrix, a positive
ionization and a reflectron detection modes. The use of this platform was validated by
following the kinetic of the rutin and esculin polymerization during 72 h. All steps of these
and esculin respectively.

a
Laboratoir
b
Laboratoire de Pharmacologie UMR7561 CNRS-Universit Henri Poincar, Vandoeuvre les
Nancy, France

* author for correspondence (E-mail: mohamed.ghoul@ensaia.inpl-nancy.fr)

Abstract

utomated platform containing 8 parallel reactors, coupled with SEC-UV and MALDI-
TOF analysis was developed. The conditions of MALDI-TOF analysis were adapted to the
characterization rutin and esculin oligomers. The best conditions of use of this technique
requires the 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) as matrix, a proportion of 1:2
reactions were carried out in an automatic way. The MALDI-TOF technique allows the
detection of oligomers up to rutin hexamer and esculin nonamer, and identify a simple bridge
between monomeric units. The SEC-UV allows the detection of 18-mer and 17-mer for rutin
Keywords: MALDI-TOF, SEC-UV, parallel synthesis, automated platform,
oligomerization
104
The polymerization of phenolic species is an interesting way to generate new derivatives with
new or improved properties [1-10]. However, these properties depend on operating conditions
of the
ards with similar chemical structure to synthesized molecules. Among
the m ss spectrometry, the matrix assisted laser desorption ionization coupled with a time of
flight investigation of
n n phenomena observed with s
spectrometry and ions are detected as single-charged which facilitates the spectrum
ica e TOF d to a s o ymers.
ever, se for bi analysis sm rganic
olecules matrix n
matrix co-crystallizes s h th n of the
The uality d ix,
presence active pH of so haracteristics of analyte and t. The
ionization could be realized in positive or negative mode. If the analyte has proton acceptor
negative mode is selected. In the bibliography the flavonoids are analyzed by mass
etry as well into negative [12, 13] and positive mode [12-15].
. The reflectron mode
allows an increase in the time of the flight without increasing the size of the apparatus. The
comb
The solvent proportion is also an important factor, it allows accelerating or slowing
down the crystallization phenomena. In the same way the ratio analyte/matrix effects the
crystallisation and the analyte ionization.
reaction which affect the polymerization degree and the nature of the linkage occurred
between monomers. To evaluate the effect of the operating conditions on the oligomer
structure, different techniques are used: osmometry [11], tonometry, cryometry, size
exclusion chromatography, mass spectrometry. The last two techniques are the most used for
the biopolymers characterization.
The size exclusion chromatography (SEC) is a well-known technique in the polymer
field, but it needs stand
a
detector (MALDI-TOF) was often mentioned for the structural
biopolymers. This tech ique avoids the fragmentatio others mas
identif tion. Th is adapte broad domain of molecular masse f pol
How its u opolymer requires a judicious choice of the all o
m the used to embed a alyte, the mode of ionization and detection. The
e analyte minimizing salt contaminatio electively wit
obtained crystals. spectrum q epends of crystal preparation, nature of matr
of tensio- or buffer, lutions, c solven
function, the positive mode is recommended whereas, if the molecule is proton donor, the
spectrom
The detection can be carried out under linear or reflectron modes
ination of increased flight length and conserved time distribution increases the
resolution of the signal. But this mode is limited to masses inferior to 60 KDa. For the high-
molecular mass the linear mode is more adapted. Nevertheless, to investigate the whole
domain of masses, these two detection modes could be combined.
105
The objective of this work is to develop an automated platform based on the use of a
Chemspeed station and a two on line detectors MALDI-TOF and SEC- HPLC. This platform
will be used to evaluate the effect of the operational conditions and the nature of the used
flavonoids on the properties of the synthesized oligomers. To attempt this goal, in a first step
the optimized operating condition of MALDI-TOF analysis have established , in a second the
coupling of the two analytical techniques to Chemspeed station was realized and finally the
performance of this system was validated by the kinetic of rutin and esculin oligomerization.

Experimental section
Materials
Laccase Trametes versicolor (E.C. 1.10.13.2., 21.4 U/mg) was purchased from Fluka
and rutin (>95%) from Sigma. All solvents were HPLC grade from VWR.
vessels of 27 ml total
e. All the later operations have been automatically realized. Methanol and water have
been added in each
ns have been stirred then
injected on line on the SEC-UV system. To avoid precipitation phenomenon, the SEC dilution
zone has been also kept at sam
determination of weight average masses.
created to adapt this target on the Chemspeed platform. 3 l of the diluted solutions have been
spotted on-line then 1 l of the refrigerated matrix solution to ovoid rapid degradation of

Parallel synthesis of oligorutin
To synthesized and analyzed oligoflavonoids, a Chemspeed ASW2000 (Chemspeed Ltd,
August, Switzerland) platform has been used. The rutin or esculin powders (final
concentration 3 g/l) have been introduced in 8 parallel thermostated
volum
vessel (final volume 10 ml at the ratio 30:70, v/v). The reaction has been
started by adding the enzymatic solution of laccase (final concentration 3 U/ml). The system
has been stirred at 600 rpm. To follow the kinetic of oligomerization, DMF has been
transferred to the SEC dilution zone. Reaction media samples have been added to the DMF
(final ratio DMF/reaction media, 9:1, v/v). The diluted solutio
e temperature as the reaction. SEC analysis has allowed the
To determinate the absolute masses of rutin oligomers, samples have been automatically
diluted two fold in Acetonitril/Water with 0.1% Trifluoroacidic acid (30:70, v/v) on the
MALDI-TOF dilution zone. Homogenization has been realised by a repetitive (3 times)
suction/pouring. For the spotting, a needle with 0.4 mm diameter has been used in
combination with a Bruker MTP 384 massive MALDI target. A special support has been
106
DHB) has been dropped on the surface of the analyte. The spots have been let for
crystallization at room temperature. The positions of the samples on the MALDI target have
been located with xyz coordinates and programmed using the synthesizer software. All
samples have been automatically spotted in triplicate.

SEC analysis
Relative masses of oligomers have been evaluated by size exclusion chromatography
(SEC) (HPLC LaChrom (Merck), UV 280 nm LaChrom L-7400, Tosoh TSK Gel 3000
column, 60 C). DMF with 1% LiBr has been used as the mobile phase at a flow rate of 1
ml/min. Polystyrene standards have been used to define molecular mass calibration.

MALDI-TOF analysis:
Absolute masses have been determinated by MALDI-TOF. Three matrices have been
tested: synapinic acid (SA), 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) and 2,5-
dihydroxybenzoic acid (DHB).
MALDI-TOF-MS experiments have been performed on an Ultraflex spectrometer
mode with an
accumulation of at least 600 shots. Spectra have been calibrated with statistic calibration of
FlexA
(Bruker) in reflectron mode. Ionization has been performed with 337 nm pulsed nitrogen laser.
After time delayed extract, ionic species have been accelerated under 20 kV potential for TOF
mass spectrometry analysis. All spectra have been obtained in positive ion
nalysis software (Bruker). The resolution is defined by the peak width at the half-height.

Results Discussion

The MALDI-TOF is a very powerful analytical tool for the investigation of polymers.
This technique led to the determination of the mode of linkage and the mass distribution.
However, its use for a given substrate needs the optimisation of several factors affecting the
amplitude and the reproducibility of the spectrum signal. So, in a first step the effect of
different parameters on MALDI-TOF analysis was investigated.

1. The matrix and detection mode

To determinate the absolute mass of oligomers and so, the linkage between two units of
rutin, three parameters have been varied off-line to optimize MALDI-TOF protocol: the
107
matrix, the ionisation mode and the detection mode. In this work, to limit the pH influence,
the analyte is diluted in solution of acetonitril/water containing 0.1 % of TFA.
For a given polymer the choice of the matrix is crucial, some matrices are particularly
sensitive to impurities whereas for other the loss of efficiency is small, and hence such
matrices are preferred when salts are available in the medium. The ideal matrix should have a
high electronic absorption at the employed laser wavelength, good vacuum stability, low
vapor pressure, good solubility in solvent and good miscibility with analyte in solid state. To
select the most adapted matrix to rutin and esculin oligomers analysis, three matrices have
been tested: DHB, SA and THAP. Various alternatives of preparation of these matrices were
formulated (Table 1).

Table 1: Mode of preparation of matrix used in MALDI-TOF analysis
Matrix Designation Concentration of
matrix
Solvent Reference
DHB1 5 mg/ml ACN/water+TFA 0.1% (1:2, v/v) [16] DHB
DHB2 20 mg/ml ACN/water+TFA 0.1% (1:2, v/v)
SA1 1 mg/ml ACN/water+TFA 0.1% (9:1, v/v) SA

[17]
1:1, v/v)
SA2 Step 1: saturated
Step 2: 0.1 %
Step 1: ACN
Step 2: final ratio ACN/water+TFA
of 1:2 v/v
THAP1 10 mg/ml ACN/ammonium citrate (100 mM, [18, 19] THAP
THAP2 Saturated Acetone [13]
DHB: dihydroxybenzoic acid; SA: sinapinic acid; THAP: trihydroxyacetophenone; ACN:
aceto
intensity.
The obta
nitrile.

Different criteria have been considered to determine the most appropriate conditions:
the resolution, the quality of the crystallization and the peaks
ined results showed that for all tested matrices and alternatives of preparation
only DHB1 and DHB2 in linear and reflectron modes and THAP2 in reflectron mode led to
exploitable spectra. The corresponding data are given figure 1. Whatever the matrix used, the
positive and the negative mode of ionization leads to similar results.

108
D
H
B
1
_
L
+
D
H
B
1
_
L
-
D
H
B
1
_
R
+
D
H
B
1
_
R
-
D
H
B
2
_
L
+
D
H
B
2
_
L
-
D
H
B
2
_
R
+
D
H
B
2
_
R
-
T
H
A
P
2
_
R
+
T
H
A
P
2
_
R
-
0
1
2
3
4

a
t
i
o
n
C
r
y
s
t
a
l
l
i
z
0
10000
20000
30000
40000
D
i
m
e
r

i
n
t
e
n
s
i
t
y
(
a
.
u
.
)
0
5000
10000
15000
20000
T
r
i
m
t
e
n
s
(
a
.
u
.
)
15000
20000
e
r

i
t
y
0
5000
10000
R
e
s
o
l
(
a
.
u
i
n
u
t
i
o
n
.
)

Figure 1: Impact of type of matrix, mode of ionization and mode of detection on
crystallization, dimer and trimer intensity and resolution for the MALDI-TOF analysis of
oligomers of rutin. Three matrix tested: dihydroxybenzoic acid (DHB),
trihydroxyacetophenone (THAP), in linear (L) or reflectron (R) mode in positive (+) or
negative (-) ionization. A ratio analyte/matrix of 3/1 is applied.

DHB matrix allows a best resolution compared to THAP2. While DHB2 matrix has the
best crystallization and DHB1 has a better resolution. For DHB matrix, higher intensity of
dimer or trimer and an enhanced resolution is obtained with the reflectron mode. So, with the
sight of these results the effects of the other factors were analyzed in the presence of DHB1 in
positive mode of ionization and in reflectron mode of detection.

2. Developing of SEC and MALDI-TOF on-line analysis

accelerate the analysis by MALDI-TOF and
SEC-HPLC, these two techniques were coupled with Chemspeed platform (Figure 2).
MALDI-TOF and SEC analysis can be used to find the optimal reaction factors such
optimal temperature, pH, ratio of solvent or reactant concentration for the production of
oligomers with a given properties. However the analysis must be fast. Thus, the analysis off
line is not adapted for these optimizations. To
109
Figu
his platform allows the realize 8 parallel reaction or operating conditions and to follow
the ki andling of sample, the dilution,
the injection and the spotting were automatically controlled. The advantages of this automated
metho
optimal desorption of analyte. For this reason 3 levels
analyte/matrix (3:1, 1:1 and 1:3, v/v) were studied. The obtained results are summarized in
figure 3. It appears that the highest intensity of dimer or trimer is reached for a ratio analyte/
matrix equal to 3/1. In such conditions, a comparable resolution is obtained with the three
re 2: ASW2000 synthesizer for the oligomerization of rutin. The preparation of reaction
media, SEC samples and MALDI-TOF samples was executed on-line. HPLC injections and
MALDI spotting are controlled by the computing interface of the synthesizer.

T
netic of the reaction. The stirring, the temperature, the h
d are the facility of implementation, the saving of time, the repeatability and
reproducibility of data and the absence of contamination. However before being able to use
this station in routine way the conditions of spotting must be optimized. In fact optimum
results are obtained when the polymer and the matrix are soluble in the same solvent. So, to
solubilize, at the same time, the oligomers and the matrix, a mixture of ACN/water containing
0.1 % of TFA was used. As the kinetic of the crystallisation is affected by the solvent/water
ratio, three preparations (1:4, 1:2 and 1:1, v/v) were tested. The ratio analyte matrix is also an
important factor to allow an
110
proportions of the used solution of dilution ACN/water (TFA 0.1 %). However, highest
crystallization and dimer intensity are obtained with a ratio of 1:2 ACN/water TFA 0.1%.
3/1 1/1 1/3
Ratio analyte/matrix
3/1 1/1 1/3
3/1 1/1 1/3
3/1 1/1 1/3
3/1 1/1 1/3
3/1 1/1 1/3
3/1 1/1 1/3
3/1 1/1 1/3
3/1 1/1 1/3
0
1
2
3
4
ACN/water (1/1) ACN/water (1/2) ACN/water (1/4)
C
r
y
s
t
a
l
l
i
z
a
t
i
o
n
3/1 1/1 1/3
0
10000
20000
30000
40000
D
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r
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n
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n
s
i
t
y
(
a
.
u
.
)
3/1 1/1 1/3
0
5000
10000
15000
20000
T
r
i
m
e
r

i
n
t
e
n
s
i
t
y
(
a
.
u
.
)
3/1 1/1 1/3
0
5000
10000
15000
20000

R
e
s
o
l
u
t
i
o
n
(
a
.
u
.
)

Figure 3: Impact of ratio analyte/matrix (DHB) and proportion of solvent on resolution,
intensity of dimer and trimer and crystallization on MALDI-TOF analysis of media
containing rutin and oligomers of rutin (positive ionization mode and reflectron mode
detection).

In conclusion, DHB1 as matrix, a proportion of 1:2 (ACN/water TFA 0.1%) as a
dilution solvent, a ratio of 3:1 analyte /matrix, a positive ionization mode and a reflectron
detection mode was were retained as optimal conditions for the use of the MALDI-TOF in the
For SEC-HPLC coupling with the Chemspeed platform; the samples were taken under
agita an automatic way in vials heated at same temperature to that of the
by Chemspeed software.

field of the characterization of the oligoflavonoids.
tion and diluted in
reaction. This dilution was realized in a DMF-LiBr mixture. This solvent allows the
instantaneous solubilisation of the flavonoids and the synthesized oligomers. From this
preparation 20 l were injected via a rheodhyn valve. The elution solvent was DMF LiBr at a
flux rate of 1 ml/min. The all steps in this procedure are supervised
111
3- Validation of the developed platform
T e
esculin
T ng 72 h of
incubat ly. The SEC obtained
T can reach 18 and 17 unities
F
molecu
m l)
at 20 C

his platform was validated by studying the reaction of the polymerization of th
and the rutin.
he kinetic of oligomerization of rutin and esculin has followed duri
ion by the on line sampling and analysis described previous
spectra are given on figure 4 and 5.
hese chromatograms show that the formed oligomers
respectively for rutin and esculin.

igure 4: SEC chromatogram of rutin oligomers at different time of reaction, and
lar mass distribution determined by polystyrene standard calibration. The reaction of
oligo erization of rutin (3 g/l) is catalyzed by the laccase from Trametes versicolor (3 U/m
in methanol/water media (30:70, v/v).
112
Oligomerization degree
Minutes
400 870 1900 4160 9100 180
Molecular mass
1.17 2.6 5.6 12.2 26.8
: 0 min
: 10 min
: 30 min
: 1h
: 3h
: 12h
: 24 h
: 36 h
Oligomerization degree
Minutes
400 870 1900 4160 9100 180
Molecular mass
1.17 2.6 5.6 12.2 26.8 Oligomerization degree
Minutes
400 870 1900 4160 9100 180
Molecular mass
1.17 2.6 5.6 12.2 26.8
Minutes
400 870 1900 4160 9100 180
Molecular mass
1.17 2.6 5.6 12.2 26.8
: 0 min
: 10 min
: 30 min
: 1h
: 3h
: 12h
: 24 h
: 36 h

Figure 5: SEC chromatogram of esculin oligomers at different time of reaction, and
molecular mass distribution determined by polystyrene standard calibration. The reaction of
oligomerization of esculin (3 g/l) is catalyzed by the laccase from Trametes versicolor (3
U/ml) at 20 C in methanol/water media (30:70, v/v).

The MALDI-TOF results are summarized on figures 6.
Dimer, trimer and tetramer are synthesized immediately at the beginning of the reaction,
thus the enzymatic polymerization of flavonoids is not a sequential process. This technique
allows the detection of oligomers up to pentamer (m: 3044.5 g/mol) and nonamer (m: 3044
g/mol) for rutin and esculin respectively (Figure 5 a and b). However the comparison of the
SEC and MALDI-TOF results indicated that these two techniques lead to very different
results. The molecular mass distribution is underestimated by MALDI-TOF analysis
compared to SEC-UV. This behaviour could be to weak ionization of oligomers having molar
masses higher than 3000 Da.
113
114
4
x10
.
u
.
]
1241
1377
701
1039
1715
2053
2391
2729
3067
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4
x10
.
]
I
n
t
e
n
s
.

[
a
.
u
1000 1500 2000 2500 3000
m/z

ALDI-TOF positive ion spectrum ([M + Na or K] Figure 5: M
lising 8 parallel syntheses or operating conditions with on
line sample preparation, MALDI-TOF spotting and SEC analysis SEC has developed. This
platfo
+
) in the reflectron mode of rutin
(a) and esculin (b) oligomerization media. Dihydroxybenzoic acid was used as matrix.

Conclusion:
An automated platform allowing rea
rm will be used to study the effect of different factors on the kinetic and structural
properties of enzymatic polymerization of flavonoids by laccase.
1849
2458
3066
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 I
n
t
e
n
s
.

[
a
1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750
m/z
3675
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1
1
1
1
1
1
1
1
115
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phosphorylated peptides during MALDI TOF Mass spectrometry. Anal Chem
2004;76:1532-1536.

116
Contribution de larticle

Cet article dcrit les protocoles mis en place afin de mener dune faon automatique e
aration, le contrle des conditions opratoires et les analyses par MALDI-TOF
t SEC-UV dune raction doligomrisation de composs phnoliques. Ce dispositif a permis
lana
n de la rutine et de lesculine respectivement.
e travail. Afin de conforter cette analyse, il serait
envisageable de dterminer le coefficient dextinction molaire des espces oligomriques.

La sous-estimation de la taille des oligomres obtenue par lanalyse MALDI-TOF est
ue en grande partie la polydispersit du milieu ractionnel. Ainsi, un fractionnement du
ilieu ractionnel, aprs filtration sur SEC, permettrait une analyse plus fine des masses
es oligomres par MALDI-TOF.
t
en ligne la prp
e
lyse en ligne de 8 ractions en parallle, tout en garantissant la rptabilit et la
reproductibilit des manipulations et en diminuant les contraintes du manipulateur.

Loptimisation de la technique danalyse par MALDI-TOF a montr que les conditions
optimales danalyse des oligomres de rutine sont :
- dpt de 3 l danalyte dilu 2 fois dans ACN/eau (30 :70, v/v), 0.1 % TFA, puis
ajout de 1 l de matrice DHB 5 mg/ml ;
- analyse en mode positif rflectron.

Cette technique a permis de mettre en vidence un simple pontage entre units
monomriques et la formation doligomres allant jusqu lhexamre et le nonamre durant
loligomrisatio

Lanalyse SEC-UV rvle la prsence doligomres allant jusqu des degrs de
polymrisation de 18 dans le cas de la rutine et de 17 dans le cas de lesculine, selon les
conditions dtalonnage employes lors de c
Cette variation selon la mthode danalyse utilise serait due la nature mme de ces
deux techniques. La dtection par MALDI-TOF aboutit aux masses absolues des oligomres,
mais est dpendante de laptitude des molcules tre ionises. A linverse, la dtection par
SEC-UV est une technique entropique base sur le rayon hydrodynamique des molcules,
aboutissant des masses relatives.

d
m
d
117

CHAPITRE IV.

OLIGOMRISATION ENZYMATIQUE

CHAPITRE IV.1.

OLIGOMRISATION
DE LA RUTINE

Chapitre IV.1. Oligomrisation de la rutine


Introduction

La rutine est un flavonode glycosyl issu du groupe des flavonols. Bien quayant des
proprits antioxydantes intressantes, la formulation de la rutine est limite par sa faible
solubilit dans les solvants aqueux et son instabilit thermique. La polymrisation est lune
des mthodes de fonctionnalisation des espces phnoliques, qui peut tre utilise dans le cas
des flavonodes. La polymrisation despces phnoliques et notamment de flavonodes est
susceptible de modifier leur solubilit, leur stabilit tout en maintenant ou en augmentant
leurs capacits antioxydantes. Cependant, lamplitude de ces modifications dpend des
conditions opratoires et des structures des polymres gnrs. Ainsi, pour dterminer
lincidence des conditions de synthse sur la cintique, la structure et les proprits
antiradicalaires et dinhibition de la xanthine oxydase, cette raction a t tudie sous
diffrentes conditions opratoires. La laccase de Trametes versicolor a t utilise comme
biocatalyseur.
Les premires tudes parues dans la littrature ont montr que les conditions de synthse
affectent la masse molculaire et la structure (type de liaison mis en place entre units
monomriques) des oligomres obtenus. Ainsi, afin de contrler les proprits des polymres
de rutine, 3 axes dtudes ont t entrepris :

Effet des conditions ractionnelles :
Les proprits des polymres varient selon leur masse molculaire. Il apparat donc
judicieux de dterminer les conditions de mise en uvre de cette raction qui permettent
dobtenir des masses molaires bien dfinies et par consquent des proprits contrles. Cest
pourquoi nous avons ralis une tude dtaille de leffet des conditions ractionnelles (pH,
temprature, concentration denzyme, concentration en substrat, type et proportion de solvant)
sur la polydispersit, la masse moyenne et la production des oligomres de rutine.

118

Etude structurale :
La structure des oligomres et notamment le pontage reliant deux units monomriques
influence les proprits des polymres. Une tude de la structure des oligomres synthtiss
par UV, FTIR, MALDI-TOF et H-RMN a donc t ralise.

Impact de la polymrisation:
Le but de la polymrisation tant damliorer la lubilit de la rutine tout en conservant
limpact de la masse moyenne des oligomres sur leur activit antioxydante a t dtermin.

En parallle, de ces trois axes dtude, une analyse par modlisation molculaire dans le
vide et dans
so
voir en amliorant ses proprits antioxydantes, ces deux proprits ont t values. En outre,
le solvant a t entreprise afin de complter et dinterprter les rsultats
exprimentaux.

Lensemble de ces travaux a fait lobjet dune publication : Investigation of enzymatic
rutin oligomerization soumise dans Enzyme and Microbial Technology.

119

Investigation of enzymatic oligomerization of rutin
Julie Anthoni
a
b
, Jean-Michel Wieruszeski
c
, Jacques Magdalou
b
, Jean-
Marc Engasser
a
, Catherine Humeau
a
, Mohamed Ghoul
a
*
a
Laboratoire Biocatalyse Bioprocds, ENSAIA-INPL, Vandoeuvre-les-Nancy, France
b
Laboratoire de Pharmacologie UMR7561 CNRS-Universit Henri Poincar,
Vandoeuvre les Nancy, France
The enzymatic polymerization of rutin catalyzed by laccase from Trametes versicolor
was vestigated und f temperature, pH, solvent, enzyme
and substrate concentrations. The highest weight-average molecular mass (
c
Unit de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, UMR CNRS/USTL 8576-
Universit des Sciences et Technologies de Lille, Villeneuve dAscq, France
* author for correspondence (E-mail : mohamed.ghoul@ensaia.inpl-nancy.fr)

Abstract

in er different operating conditions o
w
M ) was about
3900 g/mol. Highest pH and temperature set point. The
production of oligomers was favored when using a cosolvent with a high dielectric constant.
MALDI-TOF analyses showed the presence of rutin oligomers with a polymerization
degre to 6 rutin unities. H-NMR analyses showed
the presence of C-C or C-O linkages in the structure of oligomers, involving both the sugar
part and the phen
Oligomers were characterized by a solubility 4200 times higher than rutin. A molecular
mode
masses were obtained for lowest
e up , resulting from simple bridges between
olic part of rutin.
ling study of the hexamer indicated a dense network of H-bonds with water molecules.
Fractions enriched with oligomers were obtained by tangential diafiltration. The antioxidant
activity of oligomers was shown to decrease with
w
M , while the xanthine oxidase inhibitory
activ eased.

ity incr
120

Intro
armaceutical, cosmetic and food preparations.
Unfo unately, the use of some of them is limited by their low solubility and stability in both
lipophilic and aqueous media. Therefore, to improve these properties different techniques of
deriv
be conducted
under mild operating conditions of temperature, pH and pressure. Different sources of enzyme
are u ion processes: transferases, hydrolases, lyases, isomerases, ligases and
oxido
olymerization of these
compounds affects their solubility in the water [9-11] and their radical scavenging activity
[12-15] of these effects depends on the degree of polymerization of the
synthe
duction

Flavonoids are a class of phenolic secondary metabolites of plant that have recently
received keen attention due to their antioxidant, antimicrobial, anticarcinogenic properties.
Many of these compounds are already used in ph
rt
atisation are suggested, among them the enzymatic polymerisation. This way allows the
control of polymer structure due to the regioselectivity of the enzyme and can
sed in polymerizat
reductases (peroxidases and laccases) [1]. This latest class is the most often used [2-7].
Laccases compared to peroxidases present the advantage of using dioxygen instead of
hydrogen peroxide [8] and are able to catalyze a large panel of substrates (ferrocyanidine,
anilines, phenols).
First data obtained in the case of the enzymatic polymerization of simple phenols and
some flavonoids (rutin, catechin, quercetin) indicated that the p
. The magnitude
sized oligomers [14]. However, for flavonoids, the exact effect of the operating
conditions both on the weight-average molecular mass (
w
M ) of the oligomers and their
biological activities is not yet clear. In the case of simple phenols and aglycone flavonoids,
some authors observed that the nature of the solvent affects the molecular mass and the
structure of the oligomers. Two dimeric products resulting from either C-C or C-O bonds
between m
of flavonoid oligomers like rutin and
catechin are still subject to controversy. Kurisawa et al. (2003) [11] observed an increase of
the antioxidant power of the oligom
onomeric unities were described, depending on the nature and the ratio of the
solvent. The structure of the oligomers was also influenced by the pH [16, 17]; a low pH
favored the formation of C-C bridges [18]. The temperature affected only the conversion yield
of the reaction [19].

Reported data concerning the antioxidant activity
ers compared to that of rutin, while Desentis-Mendoza et
al. (2006) [15] reported a decrease of the antioxidant activity. The xanthine oxydase
121

inhibitory activity, reported by Kurisawa et al. (2003) in the case of catechin oligomers [12,
13], increased compared to that of catechin. For rutin oligomers, no data are available
concerning this activity. These contradictions could be due to the variability of oligomer
struc
w
M , PDI, C-C or ture ( C-O bridges) from one study to another.

The aims of this paper are i) to investigate the effect of temperature, pH, substrate and
enzyme concentration, and solvent nature on the
w
M and the polydispersity (PDI) of rutin
oligo
erization and, iii) to investigate som properties of rutin
oligomers (solubility, antioxidant and xanthine oxidase inhibitory activities) in function of
their
mers, ii) to identify the type and the localization of the linkage occurring during rutin
oligom e physical and biological
w
M .
Rutin oligomerization was catalyzed by the laccase of Trametes versicolor, under
different operating conditions of temperature, pH, in several solvents. MALDI-TOF, SEC-UV,
FTIR and NMR techniques were used to characterize the mass distribution and the structure
of the oligomers. Rutin was chosen in this study for its known vasorelaxation [20], anti-
inflammatory [21], and hepatoprotective [22] activities. Moreover, rutin is a glycosylated
compound with several reactive hydroxyl groups both on sugar and phenolic parts. However,
the implication of the glycosidic hydroxyl groups for oligomers synthesis has never been
reported.

1. Materials and methods

Materials
Laccase from Trametes versicolor (E.C. 1.10.3.2, 21.4 U/mg) and dihydroxybenzoic
acid (DHB, matrix for MALDI-MS) were purchased from Fluka. Rutin, 2,2-diphenyl-1-
picryl-hydrazyl (DPPH), xanthine and xanthine oxidase (E.C. 1.17.3.2, grade IV from bovine
milk, 0.2 U/mg protein) were from
edia, dilution of sa
Sigma. All chemical solvents were of HPLC grade from
VWR.

Oligomerization reactions
Reactions were carried out in a Chemspeed ASW2000 automated synthesizer
(Chemspeed Ltd). This platform allows automatic preparation of samples for analyzes:
sampling from reaction m mples and injection to HPLC system or spotting
122

on MALDI target for MS analysis. Eight reactions were simultaneously performed. Rutin was
suspended in 27 ml reactor vessels in 10 ml of methanol/water, solvent/water or
methanol/buffer mixture (30:70, v/v) (citrate or phosphate ammonium buffer 0.01 M at
different pH 0.2). Laccase solution (3 U/ml) was added to the mixture. The reactions media
were stirred at 600 rpm for at least 24 h, at different temperatures ( 1 C).

SEC analyzes
Relative masses of oligomers were evaluated by size exclusion chromatography (SEC)
400, Tosoh TSKgel 3000 column, 60 C).
im
lystyrene. The obtained data
allow
(HPLC LaChrom, UV 280 nm LaChrom L-7
D ethylformamide (DMF) with 1 % LiBr was used as the mobile phase (1 ml/min).
Molecular mass calibration was obtained by using standards of po
ed the determination of number-average molecular mass, weight-average molecular
mass, weight-average molecular mass index and polydispersity:

=
i
i
i
i i
n
n
M n
M : number-average molecular mass
=
i
i
i
i i
w
w
M w
M : weight-average molecular mass
I
M
=
1
M
M
w
: weight-average molecular mass index
n
M
Where n
w
M
PDI = : polydispersity ( 1)
i
represents the number of molecules of oligomers having a mass of M
i
at a
polymerization degree of i, and w
i
weight fraction of chains at a polymerization degree i. The
quantity of oligomers was expressed in arbitrary units of area (a.u.). Error values were
determined by three repetitions of the same reaction.

MALDI analyzes
Absolute masses were determined by MALDI-TOF technology using DHB matrix (5
mg/ml in acetonitrile/water (30:70, v/v) with 0.1 % TFA). After 24 h of reaction, samples
were automatically withdrawn from reaction media and diluted two fold (acetonitrile/water
(30:70, v/v) with 0.1 % TFA). Solutions (3 l) were spotted online on MALDI target with
DHB matrix (1 l).
123

Samples analyzes were realized on MALDI-TOF Ultraflex (Bruker Daltonik) using the
reflectron operating mode. All spectra were obtained in the positive ion mode and ionization
was performed with a 337 nm pulsed nitrogen laser. Spectra were obtained by accumulation
of at least 600 laser shots and calibrated using the statistical method of FlexAnalysis software
(Bruk
analyzes were achieved by ATR-FT-IR spectroscopy using FT-IR spectrometer
Tensor 27 (Bruker). The solutions containing oligomers were diluted with water/methanol
(70:30, v/v) then deposited on the ATR unit. Solvents were evaporated under vacuum at 50
C, t
er). All samples were spotted in triplicate.

UV analyzes
The UV spectra of rutin solutions and of reaction media containing oligomers were
determinated on a UV6000LP spectrometer (Spectra System, Thermofinnigan).

FTIR analyzes
IR
o give a film which was analyzed. Spectra were obtained by the accumulation of 1024
scans, with a 2 cm
-1
resolution. Spectra treatment included H
2
O/CO
2
correction and
smoothing by Savitzky-Golay relation (9 points) and normalization.

NMR analyzes
1
H NMR analyzes of rutin and 3 KDa permeat powders was performed on a Bruker
DRX 300 MHz spectrometer, at 300 K, after dissolution in DMSO-d
6
.
1
H NMR spectra of the
4 powders of the aliquots obtained at 30 min, 1 h, 2 h and 3 h of reaction (0.2 g/l of rutin and
0.3 U/ml of laccase in methanol/water, 30:70, v/v) were recorded on a Bruker 600 MHz
spectrometer with a cryoprobe at 293 K in CD
3
OD/D
2
O (30:70, v/v) at a concentration of 3
g/l.
A diffusion-ordered spectroscopy (DOSY) NMR technique was used to aid the
deconvolution of the complex system. A diffusion delay time of 100 ms was applied, in
CD
3
OD/D
2
O (30/70, v:v). The selfdiffusion coefficient is affected by the viscosity of the
solvent. The mobility of the molecules can be converted into their hydrodynamic radius (R),
which is more informative to determine the size of the particles and to follow the formation of
aggregates through the Stokes-Einstein law expression:
Df
T k
R
B
= where is the viscosity of the solvent (
methanol
= 0.156 .10
-3
kg.m
-1
.s
-1
and
water
= 1.000 kg.m
-1
.s
-1
), k
B
the Boltzmann constant (1.38.10
-23
kg.m
2
.s
-2
.K
-1
), T the
124

temperature (293 K) and R the hydrodynamic radius of the soluble molecule, a constant
etween 4 (slip) and 6 (stick) depending on the boundary conditions. Here the stick value is
used.
Peaks related to rutin:
1
H-NMR (DMSO-d
6
, 300 MHz): = 0.99-5.36 (H of sugars), 6.20 (6-H), 6.39 (8-H),
6.85 (J
H5/H6
= 0.2 Hz, 5-H), 7.54 (2-H), 7.55 (J
H5/H6
= 0.2 Hz, 6-H), 9.17 (3-OH), 9.65
(4-OH), 10.85 (7-OH), 12.60 (5-OH) ppm.
Peaks related to rutin oligomers:
1
H-NMR (DMSO-d
6
, 300 MHz): = 0.99-6.17 (H of sugars), 6.18 (6-H), 6.40 (8-H),
6.86 (J
H5/H6
= 0.2 Hz, 5-H), 7.97 (J
H5/H6
= 0.2 Hz, 6-H) ppm.

Antioxidant activities determination
Scavenging activity and xanthine oxidase inhibitory activity of different pools of
oligomers were analyzed. Samples were prepared from reaction media after 24 h of synthesis
(methanol/water, 30:70, v/v, 20 C), by successive filtration processes: on a 50 KDa
membrane to remove the enzyme, then on 8, 5 and 3 KDa membranes by a tangential
diafiltration process (V/V). Then, the fractions were lyophilized. Scavenging free radical
power was evaluated by the DPPH test as described by Burda and Oleszek [23]. A solution of
rutin or oligomers (1 ml), at different concentrations (from 10
-6
to 10
-4
M, concentrations were
calculated from
b
w
M ) in methanol, was added to 2 ml of a DPPH solution (10 mg/l in
methanol/water, 80:20, v/v). A reference sample was prepared by adding 1 ml of methanol in
2 ml of DPPH solution. Rutin and oligomers absorbance for each concentration was evaluated
at 527 nm, after 15 min, at 23 C. The antiradical activity was calculated as a percentage of
DPPH discoloration using the following equation:

=
reference of absorbance
oligorutin of absorbance sample of absorbance
activity l antiradica 1 100 .
The antiradical activity of flavonoids is expressed as the final concentration that results
in ha
owders were
solubilized in phosphate buffer (pH 7.5, 50 mM). The rutin was dissolved in a minimum of
DMSO and then in buffer. Tests solutions were prepared by adding 1600 l of buffer, 300 l
of flavonoids solution (10
-5
4.10
-4
M), 1000 l of a solution of xanthine (0.15 mM, initially
lf-maximal DPPH discoloration (IC50) and calculated by exponential regression analysis.
Each absorbance was evaluated in triplicate.
To determine the inhibition of xanthine oxidase activity the oligomeric p
125

disso
reaction was monitored for 6 min at 295 nm. 2 samples
were prepared, the first without flavonoids to determine the total uric acid production, and the
secon
Solubility and rheological characterization
The solubility of rutin oligomers was evaluated at 30 C in water while the solubility of
rutin was determined for all operating conditions of the reaction.
To obtain a rheological characterization of the oligomers, a reaction medium
(methanol/water, 30:70, v/v, 24 h of reaction) was lyophilized and analyzed. Several samples
of oligomers were prepared at different concentrations in water and analyzed at 20 C on a
StressTech rheometer coupled with a RMS Lauda temperature controller. All tests were
conducted with 40 mm diameter parallel-plate geometry at 20 C. A solvent trap was used
during measurement to limit evaporation. Viscosity was then measured at shear stress ranging
from 0.05 to 10 Pa, according to the concentrations. The overlap concentration was obtained
by the representation of the viscosity at the plateau for a shear rate of 300 s
-1
depending on
oligomer concentration. All measures were realized in triplicate.

Molecular modeling analyzes
The molecular dynamic (MD) simulations were performed with Insight II (msi)
programs, on an O2 SGI workstation, employing the force-field cff, on Discover3. The first
step w n
un for 10 ps, at 600 K. The lowest-energy conformation was minimized with a
convergence of 0.1 kcal/(mol. ). This conformation was selected for molecular modeling in
solvent and for enthalpic study.
Polak-Ribiere) with a self consistent field (SCF) of 0.001 kcal/mol in vacuum. The bond
lved in a minimum of NaOH 2 % (w/v), then diluted in buffer) and 100 l of a solution
of xanthine oxidase (0.2 U/ml). The
d without enzyme to measure the absorbance of flavonoids at 290 nm for the range of
concentrations. The inhibition of xanthine oxidase by flavonoids is expressed as the final
concentration that results in half-maximal enzyme velocity (IC50) and calculated by standard
curve regression analysis. All measurements were realized in triplicate.

as a minimization in vacuum by using a steepest descent, a conjugate gradient desce t
and a Newton-Raphson algorithm until the energy gradient was smaller than 0.1 kcal/(mol.).
A dielectric constant = 2.0 F/m was used in all minimizations. The second step is a
molecular dynamic simulation to explore the conformational space of rutin and its oligomers.
The dynamics r
Enthalpic study was carried out using the semiemperical AM1 method, with
HyperChem software. Optimization was performed with conjugated gradient (algorithm
126

dissociation energy (BDE) was calculated as the energy of the radical resulting from the
abstraction of one hydrogen minus the energy of the neutral molecule. The most stable
radicals localized either on oxygen or a carbon atom were obtained by the abstraction of the
hydrogen atom of the 4-OH, and the hydrogen atom of the 6-CH.
Molecular modeling in water was performed in a cubic cell with periodic boundary
conditions. NVT molecular dynamic was carried out in a box of 40.0 side length containing
1294
ed with a convergence of 0.001 kcal/(mol. ) and a run duration of 8 ps.

ce of the enzyme, the concentration of rutin remained constant without any
hange of the medium coloration. In the presence of the enzyme (Figure 1), the rutin was
com
PDI increased respecti urs of incubation and
then decreased slightly. The increase o , even after otal con the monomer,
indicated the pr f an enzyme reactivity towards oligomeric ich leads to the
elongation of the chain length.

water molecules plus one molecule of rutin with a cutoff of 14.0 and a dielectric
constant of 2.0, at 300 K. The MD simulations run for 200 ps. For the simulation of the
hexamer of rutin, the same conditions were used, with a cubic cell of 50.0 side length
containing 1679 water molecules. Successive and short minimization/dynamic procedures
were appli
3. Results and discussion

To investigate the kinetic of the enzymatic polymerization of rutin catalyzed by the
laccase, two reactions, with and without addition of the enzyme, were carried out in a
methanol/water medium with an initial pH of 7.0, at a constant temperature of 20 C. The
rutin consumption, the weight-average mass index (I
M
) and the polydispersity (PDI) of
synthesized oligomers were followed during 55 hours of incubation. The results indicated that
in the absen
c
pletely depleted from the medium during the four first hours of the reaction. Both I
M
and
vely up to 3.44 and 1.24 during the first 24 ho
f I
M
the t sumption of
species, wh esence o

127

128

0
0
1
2
10 20 30 40 50 60
3
4
Time (h)
a
s
s

i
n
d
e
x
1.15
1.20
a)
1.25
W
e
i
g
h
t
-
a
v
e
r
a
g
e

m
1.00
1.05
1.10
P

2.5
o
l
y
d
i
s
p
e
r
i
s
t
y

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
[
r
u
Time (h)

Figure 1: Kinetics of rutin (3 g/l) oligomerization by laccase from Trametes versicolor
(3 U/ml) in methanol/water (30:70, v/v) at 20 C: --: weight-average molecular mass index
10 % and -- : polydispersity 2 %(a), and kinetic of consumption of rutin (b).

t
i
n
]

(
g
b)
/
l
)

3.1. Influence of pH and temperature on polydispersity, weight-average molecular
mass and production of oligomers

The oligomerization of rutin, in the presence of the laccase from Trametes versicolor
was studied at different pH and temperatures. The results, after 24 h of incubation, are
summarized in Figure 2. For a given temperature, 20 C, the increase of pH led to a slight
decrease of the PDI and a variable I
M
. The highest I
M
was reached at a pH of 5.0, when the
enzyme activity is optimal [24].
4 5 7 10C 20C 50C
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
I
M
PDI Quantity of oligomers Rutin solubility
Temperature pH
Effect of temperature
(in methanol/water media)
Effect of pH
(20 C)

Figure 2: influence of pH and temperature on weight-average molecular mass index (I
M
),
polydispersity (PDI), production of oligomers and solubility of rutin. Rutin (3 g/l)
oligomerization was catalyzed by laccase from Trametes versicolor (3 U/ml), for 24 h, in
methanol/water media at different temperatures (10, 20 or 50 C) or methanol/ buffer media at
pH 4, 5 or 7.

In methanol/water medium, a higher I
M
and heterogeneity in oligomers size were
observed at 10 C compared to 20 and 50 C. These results could be explained by a thermic
129

deactivation of the laccase, which leads to a lower concentration of radical species. In such
conditions, the elongation of the chains would be favored. The diminution of I
M
at 50 C
could be attributed to a larger concentration of radical species which favor coupling reactions
and so, the termination of the synthesis. The comparison of these data to that reported by
Kuris Myceliophtora, indicating that the effect of pH and
temp endent to the origin of laccase.
ers
produ
rutin concentrations

The enzyme is responsible for the generation of radical species in the medium. The
concentration of these radical species can affect the chain length of the oligomers. The
elongation of the oligomeric chains can also be affected by the initial concentration of rutin.
So, both enzyme and rutin concentrations were varied. The results (Table 1) showed that, the
initial concentration of enzyme and substrate has no significant influence neither on the PDI
nor the I
M
.

Table 1. Influence of enzyme and substrate concentration on oligomerization of rutin
catalyzed by laccase from Trametes versicolor.
Enzyme
(U/ml)
Rutin
(g/l)
I
M
PDI Quantity of
oligomers
(a.u. area)
awa et al. [11] with the laccase from
erature is indep
The effects of pH and temperature were also quantified on the oligomers production.
The results are summarized in Figure 2. The pH has no significant influence on oligom
ction, while an increase of temperature favors their synthesis. The highest production of
oligomers was reached at 50 C, when the solubility of rutin and the laccase activity [24] are
favored.

3.2. Effect of enzyme and
3.0 3.0 3.44 0.6 1.24 0.05 3.2 0.87
3.0 9.0 3.44 0.6 1.16 0.05 4.6

0.87
0.1 3.0 2.79
0.6
1.13
0.05
1.0 0.87

Rutin oligomers were obtained by polymerization of rutin catalyzed by laccase from
Trametes versicolor in methanol/water (30:70, v/v), at 20 C, for 24 h. Weight-average
molecular mass index (I
M
) and polydispersity (PDI) were determined by SEC-UV analyzes.
130

This observation is in agreement with those reported by Kurisawa et al. [11]. The
concentration of enzyme influences the kinetic of the reaction but not the chain length of the
oligomers. For a high concentration of rutin (9 g/l), the I
M
remained constant (3.44) although
the rutin was not totally consumed. This behavior could be attributed to the enzyme
deactivation or to a sequestering effect of the oligomers toward the enzyme, leading to its
inactivation.
opper of the active site of the enzyme, as it mentioned
by Desentis-Mendoza et al. [15].
ported the effect of the solvent on the enzymatic oligomerization of
simple phenols [3, 25-27]. These studies indicated that the nature and the proportion of the
solvent modify the yield, the I
M
and the structure of the polymers. For more complex phenols
like flavonoids, there are no data available concerning the effect of the solvent on their
oligomerization.
To investigate the effect of the solvent on the enzymatic oligomerization of rutin, seven
protic polar, aprotic polar and aprotic apolar solvents were tested (Figure 3a) at a
solvent/water ratio equal to 30:70 (v/v). In the case of methanol, three ratios (70, 50 and 30 %)
were used. The influence of each solvent was evaluated at 20 C after 24 h of reaction. The
resul
t production of oligomers were obtained in water (8.11 a.u. area) and THF/water
edium (0.28 a.u. area), respectively. These results can not be attributed to the solubility of
rutin

To verify this assumption, either 30 U of enzyme or 30 U of enzyme and 30 mg of rutin
were added after 24 hours of reaction (standard reaction, with 3 g/l of rutin). In spite of the
feeding with fresh enzyme with or without additional rutin, no change was observed. These
data suggested an inactivation of the laccase which could be due, to a sequestering effect of
rutin or/and its oligomers toward the c

3.3. Effect of solvent:

Different works re
ts indicated that the nature of the solvent affects mainly the production of oligomers. For
a given ratio (30:70 v/v), no significant change was observed for I
M
and PDI. The highest and
the lowes
m
in such media which is 0.14 g/l in water versus 9.25 g/l in THF/water. However, a
correlation was observed between the dielectric constant () of the cosolvent and the
production of oligomers (Figure 3b).
131

The increase of methanol/water ratio, led to a decrease of the I
M
, PDI and the oligomers
production, as it has reported by Kurisawa et al. [11] in the presence of the laccase from
Myceliophtora. For methanol/water ratio superior to 70 % no activity was observed.
a)
w
a
t
e
r
A
C
N
D
M
F
m
e
t
h
a
n
o
l
e
t
h
a
n
o
l
a
c
e
t
o
n
e
T
H
F
7
0

%
5
0

%
3
0

%
-
-
0
2
4
6
8
10
Effect of proportion of solvent
(methanol/water)
Effect of solvent nature
(solvent/water, 30:70, v/v)
I
M
PDI Quantity of oligomers Rutin solubility
Methanol quantity
Solvent

b)

Figure 3: effect of nature and ratio of solvent on weight-average molecular mass index
(I
M
), polydispersity (PDI), production of oligomers and solubility of rutin (a), and influence of
the dielectric constant of the cosolvent on the proportion of oligomers (b). Rutin (3 g/l)
oligomerization was catalyzed by laccase from Trametes versicolor (3 U/ml), for 24 h, in
solvent/water media (30:70, v/v), at 20 C.

In conclusion, our data showed that the dielectric constant () is an important factor to
explain the effect of the solvent on the enzymatic oligomerization of rutin. The is implicated
in dissociation phenomena and is likely to diminish the chelation effect of rutin and its
oligomers, which is supposed to decrease the activity of the enzyme. In fact, the enzymatic
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
2
4
6
8
10
P
r
o
p
o
r
t
i
o
n
s

o
f

o
l
i
g
o
m
e
r
s
(
a
.
u
.

a
r
e
a
)
Dielectric constant (F/m)
132

inhibition by a chelation phenomenon was already demonstrated by Kim et al. [28], which
studied the effect of catechin-aldehyde polycondensates on xanthine oxidase activity. Another
effect of the solvent could be the alteration of the enzyme stability.

3.4. Structural investigation

To characterize the structure of the oligomers, MALDI-TOF, UV, FTIR and NMR
analyzes were realized after 24 h of incubation in a methanol-water medium (70:30, v/v).
MALDI-TOF analysis allowed the determination of the absolute masses of rutin
oligomers. These were identified as di-, tri-, tetra-, penta- and hexamers of rutin (Figure 4).
No higher masses were observed whatever the operating conditions tested. The relative
percentage of each oligomer depends on the operating conditions (pH, temperature,
concentration of enzyme, ).
could occur between two B rings of rutin [29].
Depending on the pH [16, 30] and the solvent [26], it could be either a C-O or a C-C linkage.
1241

Figure 4: MALDI-TOF positive ion spectrum ([M H + Na or K]
+
) in the reflectron
mode of rutin oligomerization media and isotopic distribution of dimer. Dihydroxybenzoic
acid was used as matrix.

The gap of mass due to the addition of one rutin shows the abstraction of two hydrogen
atoms. This result indicates that the connection mode between rutin units is a simple bridge.
According to the bibliographic data this linkage
1849
2458
3066
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4
x10
I
n
t
e
n
s
.

[
a
.
u
.
]
1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250 3500 3750
m/z
3675
1241.187
1257.165
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4
x10
1240 1245 1250 1255 1260 1265
m/z
133

Rutin presents several reactive hydroxyl groups both on the phenolic rings and the sugar part.
So, this linkage could be also localized on the sugar moiety. To elucidate the type and the
localization of the linkage between two units of rutin, further investigations using UV, FTIR,
H-NMR at 300 MHz, diffusion ordered spectroscopy NMR (DOSY) and H-NMR at 600 MHz
with cryoprobe analyzes were realized.

of rutin, in methanol, presented two maxima of absorption at
282 and 359 nm
hypsochromic shift of 11 nm. This behaviour
uggests an implication of the B ring of rutin in the formation of oligomers. In fact, Marckam
[31] observed that the pr
ic shift.
The UV-visible spectrum
due to the -* transition of the aromatic electrons. For rutin oligomers the
359 nm band was much larger and presented a
s
esence of a substitution on the 5, 7 and 4 positions of phenolic rings
led all time to an hypsochrom

In comparison to rutin spectrum, the IR analyses of oligomers showed a broadening of
the absorption bands and a new peak at 1130 cm
-1
(Figure 5). This peak indicated the
formation of a new ether bond (C-O). Similar results were reported by Mejias et al. [29] in the
presence of peroxidase.
1800 1600 1400 1200 1000 800
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
Wavenumbers (cm
-1
)

Figure 5: FTIR (diamond ATR) spectra of rutin () and reaction media containing rutin
and oligomers (---). A film of reaction media has been realized on the diamond ATR for this
analysis.

The
1
H-NMR analysis of rutin oligomers was already reported by Kurisawa et al. [11].
These authors observed 3 broad peaks at 0.8-1.3, 3.0-4.0, 4.4-5.0 ppm but these data didnt
allow to identify the type and the localisation of the linkage established during the oligomers
134

formation. In order to complete these results, different complementary techniques were used:
DOSY and
1
H-NMR with cryoprobe.
The DOSY analysis was expected to separate the oligomers in function of their
hydrodynamic radius and then improve the spectrum resolution. Unfortunately, this analysis
didnt permit to separate the oligomers and the spectrum was similar to that reported by
Kurisawa et al. [11]. However, this technique gave the global self-diffusion coefficients
(8.4.10
-11
m.s
-1
) and the hydrodynamic radius (29.8 ) of the oligomers.
To overcome the heterogeneity of the reaction medium and then to increase the
resolution of
1
H-NMR analysis, four aliquots were taken from the reaction medium after 30
minutes, 1 h, 2 h and 3 h of synthesis. These samples were heated at 95 C for 5 minutes to
inact
f
time of NMR spectra revealed a progressive broadening of all signals both in aromatic and
ivate the enzyme, then lyophilized and analyzed by
1
H-NMR, at 600 MHz, with
cryoprobe, at a concentration of 3 mg/ml (D
2
O:CD
3
OD, 70:30, v/v). For the first sample (30
min of reaction), the
1
H-NMR spectrum revealed our new signals with a multiplicity of 2 at
7.17, 7.26, 7.31, 7.52 ppm (Figure 6).
These peaks could result from the upfield shift of the 6H signal and the downfield shift
of the 5H signal of rutins linked together, by a C-O bridge (C2-O4). The evolution with
sugar zones. This profile suggests that several types of bridges should occur during the
oligomerization of rutin, involving both the aromatic and the sugar parts of the flavonoid.

135

136

rs of rutin at four times (30 min, 1 h, 2 h, 3 h) of reaction. Rutin (0.2 g/l)
ligomerization was catalyzed by laccase from Trametes versicolor (0.3 U/ml) in
CD
3
O v/v), at 20 C.
react
ome
e 6H signal and the absence of
the 2H peak. This behaviour suggests a symm
established during rutin oligomerization.
rutin
30 min
1 h
2 h
3 h
Figure 6:
1
H-NMR (600 MHz by cryoprobe) spectra of media containing rutin and
oligome
o
D/D
2
O (30:70,

The data obtained by different techniques confirm the presence of a C-O linkage and
suggest that this linkage occurres on the phenolic and sugar parts of rutin. However these data
dont allow to conclude about the presence or the lack of the C-C linkage. For this reason, the
ion medium was filtrated on a 3000 Da membrane by tangential flow filtration to obtain
a fraction enriched with olig rs with low molecular weight. As expected, the permeate
contained mainly residual rutin and dirutin. This was lyophilized then dissolved in DMSO-d
6

and analyzed by
1
H-NMR spectroscopy. The analysis of the spectrum showed a limited
number of signals in the aromatic zone, a downfield shift of th
etrical structure which results from a C2-C2
bridge between two rutin units (Figure 7). So, it is clear that both C-C and C-O linkages were

137
O H O
O
OH
OR
OH
OH
OH O
O
O H
OR
O H
OH
O H O
O
OH
OR
OH
OH
Laccase
O
2
H
2
O
2
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
B
3
4
5
6
7
A
Rutin
+
Dirutin

Oxidation products
F syl)--D-

3 f

T
powder
describ
T e H-
The
lowest- molecular

O4-C6 ed a
folded
mo led an
unfolde e
numbe -bonds between the hexamer and water molecules was evaluated
amer
compar

T in and rutin oligomers was evaluated for each
fraction obtained by tangential flow diafiltration with a cut-off of 50, 8, 5, 3 KDa respectively.
igure 7: Polymerization reaction of rutin (R: 6-O-(-L-rhamnopyrano
glucopyranosyl) catalyzed by laccase.
.4. Solubility, antioxidant activity and inhibitory effect on xanthine oxidase o
rutin oligomers:
o study the solubility, reaction media containing rutin oligomers were lyophilized. The
was dissolved in water, at 30 C. The solubility was about 600 g/l. This solubility is
4200 fold higher than rutin solubility value. The solubility of polymers could also be
ed by a critical overlap concentration (C*). This parameter characterizes the beginning
of the contact between macromolecular coils [32]. In the case of oligomers with an I
M
of 3.44,
the rheological investigation showed that this factor was around 20 wt %.
o explain the high solubility of rutin oligomers, the interactions and especially th
bonds between theses molecules and water were evaluate by a molecular modeling study.
energy conformation of rutin monomer and rutin hexamer furnished by
dynamics were introduced into two distinct water cells. The hexamer was built on the basis of
bridges which implicate the most stable radicals (O
, C
). In water, rutin show

structure where the rhamnose and the ring A become closer together. Six
inter lecular H-bonds were established with the water molecules. The hexamer revea
d structure where sugars offer a large contact with the surrounding solvent. Th
r of intermolecular H
to 94. This dense network of H-bonds could explain the high solubility of the hex
ed to rutin.
he radical scavenging activity of rut

These fractions, corresponding to retentates and permeate, were characterized by I
M
of 4.59,
.46, 2.38 and 2.02. As indicated in Figure 8, the IC50 increased progressively versus I 2.95, 2

the IC50
value o ibuted
]
reported that these groups play a major role in the antioxidant power. The diminution of the
PPH

T nd oligomers was evaluated for each
progres oligomers of high
M
,
which means a decrease of the radical scavenging activity. The retentate fraction obtained
with a membrane of 50 KDa (I
M
of 4.59) led to a high IC50 (11.7M) compared to
btained for rutin (1 M). This diminution of the antioxidant activity could be attr
to the loss of the free hydroxyl group on C-4 and/or C-3. In fact Burda and Oleszek [23
antioxidant activity was also observed by Desentis-Mendoza et al. [15], using also the D
test.
he xanthine oxidase inhibitory activity of rutin a
fraction of tangential flow filtration. As indicated in Figure 8, the IC50 decreased
sively versus I
M
. The
w
he inhibition of the xanthine oxidase activity was followed by Kurisawa et al. [12]
M showed a greater inhibitory activity than
rutin. T
analyze the
effect o
during the oligomerization of catechin by peroxidase but these authors didnt
f
w
n C-4 and the double bond between C-2 and C-3 are not implicated in the reaction of
rization. In fact, several authors [33-36] reported that the presence of these groups a
M . This behaviour suggests that the hydroxyl groups on C-5 and C-7, the carbonyl
group o
polyme re
M de
polycondensates onto the Fe/S and/or the flavin adenine dinucleotide (FAD) center of the

responsible for the inhibition of the xanthine oxidase activity.
oreover, Kim et al. [28] observed the chelation of the catechin-aldehy
xanthine oxidase. So, the high inhibitory activity of the oligomers reported in our study could
also be linked to their high chelating capacity.
138

0 2 4 6
0
10
20
30
40
80
50
60
70
We
X
a
n
t
h
i
n
e
I
C
5
0

(
0
2
4
ight-average mass index

o
x
i
d
a
1
0
-
5
6
12
s
e

t
e
s
t
M
)
8
10
D
P
P
I
C
5
0

luence of weight-average molecular mass index of rutin and rutin oligomers
on antirad cal a
of rutin catalyzed by Trametes versicolor
laccase led to a com
by with C-C and C-O bridges invol
H

t
e
s
t

(
1
0
-
6
M
)
Figure 8: Inf
i ctivity determined by DPPH test () and on xanthine oxidase inhibitory
activity (). The antiradical activity of flavonoids is expressed as the final concentration that
results in half-maximal DPPH discoloration (IC50). The inhibition of xanthine oxidase by
flavonoids is expressed as the final concentration that results in half-maximal enzyme activity
(IC50).

4. Conclusion

This work showed that the oligomerization
plex mixture of oligomers containing up to 6 units of rutin linked together
ving both the sugar part and the phenolic part of rutin. The
w
M , the am PDI depended on pH and temperature conditions.
High temper
ount of oligomers and the
w
M and high production of oligomers whereas high atures led to low
w
M were
ow temperature or a pH of 5. The lowest PDI (1.1 obtained at l 6) was obtained at 20 C. The
solvent nature influenced also the production of oligomers. The increase of dielectric constant
medium rea inc ses these concentrations.
Rutin oligomers exhibited a solubility 4200 fold higher than that of rutin. A decrease of
the antioxidant power and an increase of the xanthine oxidase inhibitory activity were
observed when increasing
w
M .
139

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19
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flammatory properties of plant
22
23
24.
25
26
27
Kim YJ, Chung JE, Kurisawa M, Uyama H, Kobayashi S. Superoxide anion
scavenging and xanthine oxidase inhibition of (+)-catechin-aldehyde polyconden
de
141


Ces travaux se sont ports sur la polymrisation enzymatique de la rutine catalyse par
Trametes versicolor et plus particulirement sur les effets des conditions
pratoires sur la cintique, la structure et les proprits des oligomres synthtiss.
grande quantit doligomres. En outre, au-del
de 70 % de solvant aucune ractivit na t observe. La diminution du pourcentage de
solva
us est leve, plus les proprits de
chlation sont dfavorises, ce qui diminuerai leffet inhibiteur de lactivit
tivit enzymatique.
dun simp de type C-C ou C-
O et stablit tant sur la partie phnolique que sur la partie sucre. En outre, une structure de
dirutine a pu tre caractrise; les deux units de rutine sont relies par un pontage C2-C2,
formant ainsi une structure dimrique symtrique.

la laccase de
o

Lanalyse cintique de la raction a permis de mettre en vidence que cette raction
permet datteindre un I
M
de lordre de 3.44 au bout de 24 h de raction. Larrt observ de la
raction nest pas d ni labsence de substrat, ni linactivation de lenzyme, mais plutt
son inhibition par les oligomres. En effet, il semble que les proprits chlatantes de la rutine
soient amplifies dans le cas de polymres. Les oligorutines pigent les cuivres du site actif de
lenzyme, provoquant son inhibition.

Ltude de leffet des conditions ractionnelles a mis en vidence que les plus
hauts I
M
sont obtenus de faibles pH et temprature. La nature du solvant a trs peu dimpact
sur lI
M
, en revanche il influe sur les quantits doligomres forms. Ainsi, un solvant
hydrophile permettra la synthse dune plus
nt permet daugmenter la quantit doligomres forms sans effet significatif sur lI
M
.
Une corrlation a pu tre tablie entre la constante dilectrique du co-solvant et la quantit
doligomres: plus le constante dilectrique du solvant est leve, plus la quantit
doligomres est importante. Ceci peut tre d :
- des capacits de dissociation du co-solvant dautant plus importantes que sa
constante dilectrique est leve. Ainsi, pl
laccasique des oligomres.
- la plus importante dnaturation de lenzyme dans des co-solvants faible ,
engendrant une plus faible ac

Ltude structurale des oligomres de rutine a mis en vidence la formation
le pontage entre unit monomrique. Le pontage mis en place est
142

Ltude des proprits des oligomres a permis de mettre en vidence une
solubilit dans leau 4200 fois plus importante aprs polymrisation. Ltude mene par
odlisation molculaire a pu dmontrer que, cette importante augmentation de solubilit est
due
leur pouvoir
antiradicalaire diminue, linverse de leur potentiel dinhibition de la xanthine oxydase qui
lui augmente avec laccroissement de lI
M
.

m
une conformation ouverte des oligomres dans leau, permettant la mise en place dun
rseau dense de liaisons hydrogne. En outre, plus les I
M
sont importantes plus
143

CHAPITRE IV.2.

OLIGOMRISATION DE LESCULINE

Chapitre IV.2. Oligomrisation de lesculine


Introduction

Aprs ltude de loligomrisation de la rutine, notre intrt sest port sur une autre
classe de polyphnols, les coumarines et en particulier lesculine. Lesculine est une
escultine glycosyle. Initialement cette molcule a une solubilit dans leau plus importante
que celle de la rutine, mais prsente un pouvoir antioxydant plus faible. Compte tenu de sa
solub
t dpendantes de leur structure molculaire. Ainsi pour conserver les activits
initia
re d re
et u
ilit relativement leve dans les solutions aqueuses et de son faible cot, cette molcule
est une cible de choix pour valuer le dveloppement dun procd de polymrisation
enzymatique, mais il faut que les polymres obtenus aient des activits intressantes et que les
conditions opratoires permettent une polymrisation rgioslective. En effet, les activits des
coumarines son
les de lesculine, les groupements essentiels impliqus dans ces activits ne doivent pas
tre altres par la polymrisation. La structu es oligom s forms joue donc un rle
crucial dans la modification des proprits.

Afin dexplorer les relations structure-activit des oligomres desculine, deux
approches dinvestigation ont t combines. Une premire approche exprimentale base sur
lanalyse par UV, FTIR, MALDI-TOF et RMN, ne seconde approche par modlisation
molculaire dans le vide et dans le solvant. Les informations obtenues sur les structures des
oligomres par ces deux approches ont t corrles aux proprits de solubilit,
antiradicalaires et dinhibition de la xanthine oxydase.

Ainsi, les objectifs de cet article sont :
lanalyse structurale par approche exprimentale base sur lutilisation de l UV,
FTIR, MALDI-TOF et RMN ;
lanalyse structurale par modlisation molculaire dans le vide et dans le solvant ;
lanalyse des proprits des oligomres, cest--dire, la solubilit, le pouvoir
antiradicalaire et le pouvoir dinhibition de la xanthine oxydase.

144

Les rsultats obtenus ont t ventuelles corrlations structure-
activit des oligomres synthtiss.

utiliss pour chercher d
Lensemble de ce travail fait lobjet dun projet de publication intitule Enzymatic
synthesis of oligoesculin : structure and biological activities characterizations .

145

En
a

* author for correspondence (E-mail : mohamed.ghoul@ensaia.inpl-nancy.fr)
Abstract
The
lic
in
unite
nt
zymatic synthesis of oligoesculin: structure and biological activities characterizations
Julie Anthoni
a
b
, Jean-Michel Wieruszeski
c
, Jacques Magdalou
b
, Jean-
Marc Engasser
a
, Catherine Humeau
a
, Mohamed Ghoul
a
*
Laboratoire Biocatalyse Bioprocds, ENSAIA-INPL, Vandoeuvre les Nancy, France
b
Laboratoire de Pharmacologie UMR7561 CNRS-Universit Henri Poincar, Vandoeuvre les
Nancy, France
c
Unit de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, UMR CNRS/USTL 8576-Universit des
Sciences et Technologies de Lille, Villeneuve dAscq, France

oligomerization of esculin, catalyzed by the laccase from Trametes
versicolor was realized in an attempt to improve the properties of this
glycosydic coumarin. MALDI-TOF analyses showed a degree of
oligomerization up to 9 whereas NMR spectra revealed the formation of
C-C and C-O bridges which involve both the pheno and the glucosidic
part of the coumarin. Oligomers were characterized by a solubility in
water which is 189 fold higher than esculin solubility. Moreover
antioxidant properties of oligomers were correlated to their mass: the
more the mass is high, the more the xanthine oxidase inhibitory activity
and the radical scavenging activity are important. These experimental
results were completed by in silico structural investigations which
suggested the preferential formation of C8-C8 linkages between escul
s during the oligomerization reaction.

Keywords: Oligomerization, esculin, laccase from Trametes versicolor, solubility, antioxida
activity, molecular modeling

146

Introduction
Esculin is a glycosylic coumarin belonging to a group of phenolic compounds widely
distributed in natural plants
1
. Coumarins are naturally occurring derivatives of benzopyrene.
They are used in beverages
2
, food
3
, perfumes
4
, cosmetics
5
and as additives in polymers for
their fluorescence, photodimerization, photocleavage or liquid crystalline properties. They
have
chestnut tree.
It exh
ifications led to a higher solubility in water, thermal stability and an
hol moiety
25, 26
, a 1,2-pyrone in B ring
27
, two phenolic
hydro
gate the structure of esculin oligomers.
recently attracted much attention due to their antiradical
6-8
, xanthine oxidase inhibitory
9
,
anti-inflammatory
10
, anticarcinogenic
11
and anti-HIV
12
activities. The magnitude of
coumarins activities depends upon the degree and the localization of hydroxyl, glycosyl or
methoxy group on their backbone.
Esculin or aesculin is a monosaccharide of esculetin characterized by a fine blue
fluorescent solution. It is extracted from the Aesculus hippocastanum, or horse-
ibits an UV-B protective effect and antiflogistic, cytostatic and antimutagenic properties.
Contrary to the majority of phenolic species, esculin is soluble in water and relatively stable
in this media.
The enzymatic polymerization of several phenolic species like hydroxybenzene
13-17
,
cresol
14, 17, 18
,cardanol
19
,catechol
20
,catechin
21, 22
or rutin
23, 24
have been yet reported. In
some cases, these mod
increase of antioxidant and xanthine oxidase inhibitory activities, and in other cases a lost of
these activities was observed. This behaviour is due to the fact that such activities are
correlated with the structure and the functional groups of the molecules. Different studies
have demonstrated that, an ortho-catec
xyl groups in the ortho position
28
, an O-glucopyranoside group and more globally
hydroxyl functions
26
increase the antioxidant activity of coumarins. Moreover a substitution
in position 8 (hydroxyl group or glucosyl group)
28
, a methyl substitution in positions 3, 4 and
8 or a double bond on positions 4,3 increase the xanthine oxidase inhibitory activity.
In spite of the interesting properties of esculin, the polymerisation of this compound has not
been yet studied. The aim of this paper is to investigate the relationships between the structure
of esculin oligomers and their solubility, antioxidant and xanthine oxidase inhibitory activities.
To attempt this goal experimental and molecular modeling approaches were used. UV, FTIR,
MALDI-TOF and NMR analyses were used to investi
Properties results (stacking, solubility and antioxidant activity) were correlated to structural
descriptors which were calculated by molecular modeling in vacuum and in solvent
environment.

147

Experimental Section

Materials. Laccase Trametes versicolor (E.C. 1.10.3.2., 21.4 U/mg) and esculin
sesqu
ed as the phase mobile at a flow rate
f 1ml/min. Polystyrene standards were used to define molecular mass calibration. Average
molecular masses were defined by:
ihydrate (>98 %) were purchased from Fluka and xanthine, xanthine oxidase (1.17.3.2.,
grade IV from bovine milk, 0.2 U/mg protein) from Sigma. All solvents were HPLC grade
from VWR.
Oligomerization reaction. Reactions were carried out on a Chemspeed ASW2000
automated synthesizer (Chemspeed Ltd). Eight parallel reactions were realized
simultaneously. Esculin (3 g/l) was suspended in 27 ml vessels in 10 ml of methanol/water
(30:70, v/v). Laccase solution (3 U/ml) was added to the mixture. The reactions were stirred
at 600 rpm, for 24 h, at 20 C.
SEC analysis. Relative masses of oligomers were evaluated on-line by size exclusion
chromatography (SEC) (HPLC LaChrom (Merck), UV 280 nm LaChrom L-7400, Tosoh TSK
Gel 3000 column, 60 C). DMF with 1% LiBr was us
o

=
i
n
n
M : number-a
i i
M n
verage molecular mass
i
i

i
i
i i
w
w
M w

=
i
M : weight-average molecular mass
n
M
M
PD = : polydispersity ( > 1)
n
w
mer
Da membrane to remove the enzyme, then
successively on 8, 5 and 3 KDa membranes by a tangential diafiltration process (V/V). Then,
the fractions were lyophilized.
i
represents the number of oligomer molecules having a mass of M
i
at a poly ization
degree of i, and w
i
the weight fraction of chain at a polymerization degree of i. The quantity
of oligomers was expressed in arbitrary units of area (a.u.). Error values were determined by
three repetitions of the same reaction.
Properties determination. Scavenging activity and xanthine oxidase inhibitory activity
of different pools of oligomers were analyzed. Fractions enriched with oligomers of various
mass were prepared from 24 h reaction medium (methanol/water, 30:70, v/v, 20 C), by
successive filtration processes on a 50 K
148

Scavenging free radical power was evaluated by the DPPH test as described by Burda et
Oleszek
29
. 1 ml of solution of esculin or oligomers at different concentrations (10
-6
10
-4
M,
concentration were calculated from
w
M ) in methanol was added to 2 ml of DPPH at 10 mg/l
in methanol/water (80:20, v/v). A reference sample was prepared with 1 ml of methanol in 2
ml of DPPH solution. Esculin and oligomers absorbance for each concentration was evaluated
at 527 nm. After 15 min, at 23 C, the absorbance at 527 nm was measured. The antiradical
activity was calculated as a percentage of DPPH decoloration using the following equation:

=
reference of absorbance
in oligoescul of absorbance sample of absorbance
activity l antiradica 1 100 .
The antiradical activity of the molecules is expressed as the final concentration that
results in half-maximal DPPH decoloration (IC50) and calculated by exponential regression
tested the capacity to inhibit the activity of xanthine oxidase. All
olutions were prepared in phosphate buffer (pH 7.5, 50 mM), except for esculin which was
oligomers
m
analysis.
Each absorbance was measured in triplicate.
A second property
s
initially dissolved in a minimum of DMSO, then rapidly diluted in buffer. Test solutions were
prepared by adding 1600 l of buffer, 300 l of solution of esculin or its
(concentration varying from 10
-5
to 4.10
-4
M and calculated fro
w
M ), 1000 l of a solution
MALDI analysis. Absolute masses were determinated by MALDI-TOF. The
concentration of DHB matrix is 5 mg/ml in acetonitrile/water (30:70, v/v) with 0.1 % TFA.
After 24h of reaction, samples were automatically taken from reaction media and diluted
two fold in acetonitrile/water (30:70, v/v) with 0.1 % TFA. Solutions (3 l) were spotted
online on MALDI target with DHB (1 l), and crystallized at room temperature. All samples
were spotted automatically in triplicate, on the Chemspeed ASW2000 (Chemspeed Ltd,
August, Switzerland) platform.
of xanthine (0.15 mM, initially dissolved in a minimum of NaOH 2 %, then rapidly diluted in
buffer) and 100 l of a solution of xanthine oxidase (0.2 U/ml). The reaction was monitored
for 6 min at 295 nm. 2 test mixtures were prepared, the first containing no phenolic species to
measure the total production of uric acid, and the second containing no enzyme to measure
the absorbance of phenols at 290 nm for the range of concentrations. The capacity of the
molecules to inhibit the xanthine oxidase is expressed as the final concentration that results in
half-maximal enzyme velocity (IC50) and calculated by standard curve regression analysis.
Each absorbance was measured in triplicate.
149

MALDI-TOF-MS was performed on Ultraflex (Bruker) in reflectron operation mode.
All spectra were obtained in positive ion mode. Ionization was performed with 337nm pulsed
nitrogen laser and accelerated under 20kV with time-delayed extraction. Spectra were
obtained by accumulating of at least 300 shots. Spectra were calibrated with statistic
calibration of FlexAnalysis software (Bruker).
FTIR analysis. IR analyses were achieved by ATR-FT-IR spectroscopy using a FT-IR
spectrometer Tensor 27 (Bruker). The solutions containing oligomers were diluted with
water/methanol (70:30, v/v) then deposited on the ATR unit. Solvents were evaporated under
vacuum at 50C, to give a film which was analyzed.
UV analyzes. The UV spectra of esculin solutions and oligomers in methanol were
determinated on a UV6000LP spectrometer (Spectra System, Thermofinnigan).
NMR analysis.
1
H NMR spectra of reaction media were recorded on a Bruker 600 MHz
spectrometer with a cryoprobe, at low concentration of esculin (0.2 g/l) and 0.6 U/ml of
laccase in CD OD/D O (30:70, v/v), at 300 K.
3 2
A diffusion-ordered spectroscopy (DOSY) NMR technique was also used to aid the
deconvolution of the system. A diffusion delay time of 100 ms was applied, in CD OD/D O
(30:70, v/v), at 293 K.
3 2
70 :30, v/v) : = 3.52 (2d J H4), 3.62 (m
H6 2.0 + 12.5 Hz), 5.06 (d J
semiemperical AM1 method, with HyperChem
software. Optimization was made with conjugated gradient (algorithm Polak-Ribiere) with a
self consistent field (SCF) of 0.001 kcal/mol in vacuum. The bond dissociation energy (BDE)
was calculated as the energy of the radical resulting from hydrogen atom abstraction minus
Esculin
1
H NMR (D O/CD OD,
2 3 H3/H4/H5
J
H2/H3/H4/H5/H6
H2,H3,H5), 3.77 (d,d J
H5/H6/H6
H6 5.8 + 12.5 Hz), 3.95 (dd J
H6/H6/H5

H1/H2
H1 7.5 Hz), 6.31 (d J
H3/H4
H3 9.6Hz), 6.91 (s H8), 7.37
(s H5), 7.93 (d J
H4/H3
H4 9.6Hz) ppm.
Molecular Dynamic Simulation. The molecular dynamic (MD) simulations were
performed with Insight II programs, on an O2 SGI workstation, employing the force-field cff,
on Discover3. The first step was a minimization to optimize the geometry of molecules in
vacuum by using a steepest descent, a conjugate gradient descent and Newton-Raphson
algorithm until the energy gradient was smaller than 0.1 kcal/(mol.). A dielectric constant
= 2.0 F/m was used in all minimizations. The second step was a molecular dynamic
simulation to explore the conformational space of esculin and its oligomers. The dynamic run
during 20 ps, at 600 K. The lowest-energy conformation was minimized with a convergence
of 0.1 kcal/(mol. ). This conformation was selected.
Enthalpic study was carried out using the
150

the energy of the neutral molecule. For the dimers, the BDE was calculated with the radical
species formed in position 7. For dimers which present two hydroxyls in position 7, two
radical species and so two BDE were obtained.
For simulation of water, a cubic cell with periodic boundary conditions was used. NVT
molecular dynamic (MD) was carried out in a box of 40.0 side length, with a cutoff of 14.0
and a dielectric constant of 2.0 at 300 K. The box contained 1370 water molecules plus one
molecule of esculin or 418 water molecules and one molecule of diesculin (O7-C4 linkage).
The MD simulation run 200 ps. To simulate the operating conditions, the same conditions
were used with a cell of 60.040.040.0 side length containing 138 methanol molecules
and 725 water molecules plus 4 molecules of esculin or 395 methanol molecules and 2073
water molecules plus 2 molecules of diesculine (cutoff 14.0, dielectric constant 2.0, 300 K).
For the 4 esculins system, three short dynamic runs were realized of 2400, 90 and 260 fs.
Each dynamic was followed by a minimization with a convergence of 0.01 kcal/mol. For the
2 diesculins system, the molecular dynamic run 112 ps.

Results and Discussion
ium with an initial pH
f 7.0, at 20 C. After 72 h of incubation, the

Production of esculin oligomers
The oligomerization of esculin was conducted in a methanol/water med
w
M of esculin oligomers and the residual o
concentration of esculin were respectively equal to 1800 g/mol (corresponding to a degree of
oligomerization of 5) and 0.7 g/l (Figure 1). This stable value of
w
M was reached after 12 h
of reaction, whereas the consumption of esculin was stabilized after 48 h of reaction. The
polydispersity was stabilized around 0.6 after 12 h of reaction. The limit value of
w
M is due
neither to the limitation of the substrate, which is not totally consumed, nor to the
denaturation of enzyme, which remains active after 12 h. After 12 hours of reaction, the
esculin continues to diminish showing that the enzyme is always active, but the size of the
oligomers has reached its ceiling. This could be due to a lower reactivity of large oligomers
comparing to smaller ones. The enzyme continues to catalyze the formation of esculin radical
species, but these radicals are supposed to react preferentially with each other, rather than
with large oligomers which are less reactive.
151

0 10 20 30 40 50 60 70 80
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Time (h)
[
e
s
c
u
l
i
n
]

(
g
/
l
)
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
W
e
i
g
h
t
-
a
v
e
r
a
g
e

m
a
s
s

Figure 1: Kinetic study of the oligomerization reaction of esculin catalyzed by laccase from
Trametes versicolor, in methanol/water (30:70, v/v), at 20 C. : concentration of esculin,
:weight-average mass.

To establish the structure of esculin oligomers MALDI-TOF, UV, FTIR and NMR analyse
were realized both on the bulk medium and on the enriched fractions of oligomers.
Structural investigation by MALDI-TOF, UV, and FTIR:
The determination of the absolute masses of oligomers by MALDI-TOF showed that, under
the used conditions, the longer oligomer was a nonamer (Figure 2). The gap of mass due to
the addition of one esculin monomer indicated the abstraction of two hydrogen atoms,
showing that the connection mode between esculin units is a simple bridge. The UV-visible
spectra of esculin and reaction medium containing the mixture of oligoesculins revealed two
peaks around 204 and 336 nm. However, oligomers peaks were broader than those of esculin,
which could be attributed to conjugated oligomeric structure
24
. FTIR spectra of esculin and
oligoesculin were similar; no new characteristic band was observed .
152

153
1377
701
1039
1715
2053
2391
2729
3067
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4
x10
I
n
t
e
n
s
.

[
a
.
u
.
]
1000 1500 2000 2500 3000
m/z

Figure 2: MALDI-TOF positive ion spectrum ([M + Na or K]
+
) in the reflectron mode of
esculin oligomerization media and isotopic distribution of tetramer. Dihydroxybenzoic acid
was used as matrix.
Structural investigation by NMR
The bulk medium after 24 h of incubation and oligomers enriched fractions were analyzed.
1
H-NMR spectra revealed broad signals both in aromatic and sugar zones and the apparition
of new peaks around 7.5 ppm (Figure 3). These peaks could correspond to a downfield shift
of the 5 H signal, due to the formation of a C4-O7 bridge, or an upfield shift of the 4 H signal
due to the formation of a C3-C bridge. This profile suggests that several types of bridges
should occur during the oligomerization of esculin, involving both the aromatic and the sugar
parts of this compound. Moreover, NMR spectra indicated in one hand, the presence of
residual esculin (340 g/mol) even in the retentat obtained with a 50 KDa membrane and in an
stacking phenomenon between aromatic rings. The stacking of phenolic species due
hydrophobic interactions is well known
30
and has already been observed in the case of
uercetin by Desentis-Mendoza et al.
23
.
1377
1393
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4
x
1
0
I
n
t
e
n
s.

[
a
.
u
.
]
1380 1390 1400 m/z
other hand, a signal shift in the aromatic zone for sample issued from 1 KDa membrane
retentat. The presence of residual esculin for high cut off membrane and the signal shift
suggest a
to
q

Figure 3:
1
H-NMR spectra (600 MHz by cryoprobe)of media containing esculin and its
oligomers enriched fraction. Esculin (3 g/l) oligomerization was catalyzed by laccase
Trametes versicolor (3 U/ml) in methanol/water (30:70, v/v), at 20 C.

This stacking phenomenon was studied by molecular modeling. Four molecules of esculin
(A,B,C, D) were introduced in a methanol/water cell and were minimized as described before.
At the equilibrium of the system two esculins C and D were clearly piled up and positioned
head to tail (Figure 4). The distances between their aromatics rings were about 3.64 and 4.08
.
154

Figure 4 : Graphical representation of a 4 esculins system (A, B, C, D in blue, orange, violet
and green respectively) in a methanol/water cell (30:70, v/v), the water and methanol
molecules implicated in hydrogen bond with the esculins are indicated in yellow and red,
respectively.

olubility study.
00 g/l in water and 0.4 g/l in
methanol/water. In order to understand such variations of solubility and especially the low
solubility of oligomers in methanol/water mixture, the interactions between esculin, diesculin
S
The solubility of esculin was 3.70 in water and 5.96 g/l in methanol/water (30:70, v/v, 20 C).
The solubility of oligomers of esculin was around 7
155

(O7-C4) and the solvent (water or methanol/water) were studied by molecular modeling then
compared. The stable conformation of esculin was shown to form 9 H-bonds with water
olecules and 11 H-bonds in the case of a methanol/water medium. These observations could
igure 5) were established with water
molecules while only 4 H-bonds were
is consistent with experimental results.

m
explain why esculin is slightly less soluble in water than in methanol/water medium. For
esculin dimer (based on a O7-C4 linkage) 22 H-bonds (F
observed with methanol/water medium. This behavior

Figure 5
water m
: Graphical representation of esculin imer (based
olecules implicated in intermolecular hydrogen bonds with diesculin are indicated in
ellow.

d on a O7-C4 linkage) in water,
y

Study of xanthine oxidase inhibitory activity
Figure 6 shows xanthine oxidase inhibition activity of esculin and its oligomers, assessed by
measuring uric acid formation from xanthine oxidase. IC 50 of oligomers appeared to be
156

lower than the IC 50 of esculin (770 M). The IC50 fell when increasing
w
M and stabilized
around 150 M. This evolution of the IC50 with mass has been yet reported for catechin
oligomers
21
. Taking into account the data described by Chang and Chiang
28
this behavior
ould be due to a substitution in the position 8. c
Weight-average mass
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
esculin
I
C
5
0

(
.
1
0
-
4
M
)

Figure 6: Influence of
w
M of esculin oligomers on their xanthine oxidase inhibitory activity.
The inhibition of xanthine oxidase is expressed as the final concentration of inhibitor species
that results in half-maximal velocity (IC50), and compared to esculin activity.

Study of antiradical activity
The antiradical activity for each oligomeric fraction was evaluated. Results are reported on
Figure 7. The IC50 of esculin (9 mM) is 18 fold higher than the IC50 of oligomers (0.5 mM).
However, the degree of polymerization doesnt affect this activity. Different authors reported
that the absence of the catechol moiety
25, 26
and/or the hydroxyl groups
26, 28
led to a decrease
of the antiradical activity. These results show that these essential groups are not affected
during the oligomerization of esculin. Moreover, the high scavenging activity of oligomers
indicates a high capacity to stabilize radical species, which can be evaluated by the BDE
31
.
157

158
Weight-average mass
0.015
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
I
C
5
0

(
M
)
0.000
0.005
0.010
0.020
esculin

w
M of esculin oligomers on their antiradical activity, determinated by

modes were
Figure 7: Influence of
DPPH test. The antiradical activity is expressed as the final concentration of scavenger
species that results in half-maximal DPPH decoloration (IC50), and compared to esculin
activity.

To verify these assumptions molecular modeling of esculin and dimers was realized in
vacuum. Four different structures of dimer corresponding to four linkage
modeled: O7-C4, C4-C5, C4-O2, C8-C8 (Figure 8).

O O
OH
OR
O O O H
OR
O O
O
OR
O O
OH
OR
O O
OH
O
O
O
O
O
O
O O
OH
O
O
O
O
O
O
O O
OH
OR
O O O H
OR
O O
OH
OR
O O
O

OR
n

6
7
1 2
8
O
2
H
2
O
3
Laccase
4 5
O7-C4 bridge C4-C5 bridge C8-C8 bridge
C4-O2' bridge

lar structures of Figure 8: Reaction of esculin oligomerization catalyzed by laccase and molecu
four diesculins study by molecular modeling (R: glucose)

The dimers O7-C4, C4-C5 were chosen because they result from the association of the most

ization in vacuum, calculated by AM1.
Radical species : abstraction of a hydrogen atom from:
stable radicals (Table 1).

Table 1: Heat of formation of esculin and its radicals in different positions, obtained from
molecular minim
Esculin
C3 C4 C5 O7 C8
H
(kcal/mol)
-350,17 -295,49 -298,34 -295,84 -321.74 -292,37
H
esculin
-H
radical
= BDE
a
(kcal/mol)
54,68 51,83 54,33 28,43 57,80
a
: Bond Dissociation Energy

NMR analysis of oligomers showed that linkage between aromatic part and glycosidic
part of esculin units could occurred. Thats why, the dimer C4-O2 was modeled. Finally, the
dimer C8-C8 was studied because all essential groups remain free. The dimers were
minimized as described before. Their BDE were estimated and compared to that of esculin
(Table 2).

Table 2: Bond dissociation energy (BDE) of the O
7
-H bond of esculin and its dimers, obtained
from molecular minimization in vacuum, calculated by AM1.
Diesculin with linkage between: Esculin
O7-C4 C4-C5 C8-C8 C4-O2
H (kcal/mol) -350.17 -677.30 -688.15 -690.59 -681.71
BDE
1
28.43 30.54 30.65 25.98 30.65
H

(
k
c
a
l
/
m
o
l
)

BDE
2
22.34 27.43 27.46

At least one BDE value of the dimers (C4-C5), (C8-C8) and (C4-O2) is lower than that
of esculin. The dimer C8-C8 is characterized by two low BDE values which suggests a high
scavenging activity. The dimer O7-C4 seems to be the less probable structure because its
BDE is higher than that of esculin. The high antioxidant activity measured for esculin
oligomers suggests that the dimer C8-C8 is the most probable, and the dimer O7-C4 the less
159

one. This assumption is in accordance with data reported by Ncanana et al.
32
, Intra et al.
33

nd Mita et al.
15
who observed a majority of C-C linkages, in the case of totarol, tetrahydro-
2-nap
Conclusions
Struc
aracterized by a very high solubility in water and a very bad one in
methanol/water mixture. These observations have been correlated with the number of
hydro
gests the preferential
form ng esculin oligomerization.
a
htol and phenol polymerization.

tural analyses of esculin oligomers showed that esculin units are linked by a simple
bridge, which can occurred on both sugar part and phenolic part of the coumarin. Esculin
oligomers are ch
gen bonds between oligomers and the solvent. The oligomers show a very high
antioxidant activity compared with esculin. This interesting result sug
ation of C8-C8 linkages duri
160

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161

(3
C
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13.
3) Intra, A.; Nicotra, S.; S., R.; Danieli, B., Adv. Synth. Catal. 2005, 347, (7-8), 973-977.
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15, (18), 2927.

15
(3

162


Ces travaux se sont ports sur la polymrisation enzymatique de lesculine catalyse par
la laccase de Trametes versicolor.
L
le
g/mol e

L
type et
al
pourrai
a
en
re
observa
obtenus o
hydrogn
modli

E
tra on
de la xanthine oxydase. Grce la m
antiradica
lesculine
la plus forte augm

es rsultats obtenus montrent que la cintique de loligomrisation de lesculine est
nte. A 72 h, la Mw et la concentration en substrat rsiduelle sont respectivement de 1800
t 0.7 g/l.

Lanalyse par MALDI-TOF a dmontr la formation dun simple pontage liant deux
units successives desculine et ce jusquau degrs de polymrisation 9.
es analyses structurales par UV, FTIR et RMN nont pu aboutir la dtermination du
de la localisation du mode de pontage. Nanmoins, la prsence de nouveaux pics aux
entours de 7.5 ppm, sur le spectre
1
H-RMN des oligomres desculine, a t observe. Ils
ent tre due la formation dun pontage de type C4-O7 ou C3-C. Lanalyse par RMN
permis, galement, de mettre en vidence un phnomne dempilement de lesculine ; ce
phnomne a t corrl aux rsultats obtenus par modlisation molculaire.

Loligomrisation de lesculine permet daugmenter sa solubilit dans leau,
vanche, elle diminue sa solubilit dans un milieu mthanol/eau. Pour expliquer cette
tion nous avons entrepris des investigations de modlisation molculaire. Les rsultats
nt permis de corrler les observations exprimentales aux nombres de liaisons
e tablies entre la molcule de solut et les molcules de solvant identifies par
sation molculaire.
nfin, les rsultas obtenus indiquent que laugmentation de la masse des oligomres se
duit par un accroissement du pouvoir antiradicalaire tout comme de lactivit dinhibiti
odlisation molculaire, laccroissement du pouvoir
laire a pu tre mis en relation avec un pontage de type C-C localis en position 8 de
. En effet, ce pontage mne, selon les rsultats obtenus par modlisation molculaire,
entation du pouvoir antioxydant
163

En
ltude structurale par approc
molculaire et les augmentations de proprits observes.
conclusion, au cours de ce travail, diffrentes corrlations ont pu tre tablies entre
he exprime ltude structurale par modlisation ntale,
164

CHAPITRE V.

MODLISATION MOLCULAIRE

Chapitre V. Modlisation Molculaire

Chapitre V. : Modlisation Molculaire

1. CONTRIBUTION DE LA MODELISATION MOLECULAIRE A LA DETERMINATION DE LA
REACTIVITE DES ESPECES RADICALAIRES ........................................................................................ 165
1.1. DTERM ATION DES CONFORMRES LES PLUS STABLES IN .... 166
166
IN 0
SI 3

s de
ES
N
U .
... 190
.1. Cas de la rutine 190
.3. C
.1. Etud
.2. E
terp
U .
.1. C
.3. C ........... 202
3.2.2.1. Etude du systme: quatre esculines dans un mlange mthanol/eau..................................................... 204
.....................................................................
1.1.1. Cas de la rutine ............................................................................................................................................
1.1.2. Cas de lesculine........................................................................................................................................... 168
1.2. DTERM ATION DE LESPCE RADICALAIRE LA PLUS STABLE................................................................. 17
1.2.1. Cas de la rutine ............................................................................................................................................ 170
1.2.2. Cas de lesculine........................................................................................................................................... 172
1.3. CONCLU ONS .......................................................................................................................................... 17
2. CONTRIBUTION DE LA MODELISATION MOLECULAIRE A LANALYSE DE LA VARIATION
DES ACTIVITES ANTIOXYDANTES.......................................................................................................... 174
2.1. DFINITION DU PONTAGE LE PLUS PROBABLE PAR TUDE DES OLIGOMRES DANS LE VIDE ...................... 175
2.1.1. Ca s oligorutines ..................................................................................................................................... 175
2.1.2. Cas des oligoesculines.................................................................................................................................. 178
2.2. RECHERCHE DE CORRLATIONS DESCRIPTEURS/ACTIVIT ANTIOXYDANTE.............................................. 181
2.2.1. Cas des dimres de rutine ............................................................................................................................ 182
2.2.2. Cas des oligoesculines ................................................................................................................................. 185
2.3. CONCLUSIONS .......................................................................................................................................... 188
3. ANALYSE D INTERACTIONS SOLUTE/SOLVANT ET SOLVANT/SOLUTE PAR
MODELISATIO MOLECULAIRE............................................................................................................. 189
3.1. MODLISATION MOLCULAIRE DE LA RUTINE ET DE SES OLIGOMRES DANS LEAU ET DANS UN MILIEU
MTHANOL/EA ............................................................................................................................................. 189
3.1.1. Modlisation molculaire de la rutine et de ses oligomres dans leau ....................................................
3.1.1 .....................................................................................................................................
3.1.1.2. Cas des dirutines................................................................................................................................... 191
3.1.1 as de lhxarutine............................................................................................................................... 193
3.1.2. Etude des interactions dun mlange de rutine ou de dirutine dans un milieu mthanol/eau....................... 195
3.1.2 e du systme: quatre rutines dans un mlange mthanol/eau ........................................................ 195
3.1.2 tude du systme: deux dirutines dans un mlange mthanol/eau ....................................................... 196
3.1.3. In rtations structure/fonction et conclusions ......................................................................................... 198
3.2. MODLISATION MOLCULAIRE DE LESCULINE ET DE SES OLIGOMRES DANS LEAU OU DANS UN MILIEU
MTHANOL/EA ............................................................................................................................................. 199
3.2.1. Modlisation molculaire de lesculine et de ses oligomres dans leau...................................................... 199
3.2.1 as de lesculine................................................................................................................................... 199
3.2.1.2. Cas des diesculines............................................................................................................................... 200
3.2.1 as du nonamre desculine......................................................................................................
3.2.2. Etude des interactions dun mlange de molcules desculine ou de diesculine dans un milieu mthanol/eau
................................................................................................................................................................................ 204

3.2.2.2. Etude du systme: deux diesculines dans
3.2.4. Interprtations structure/fonction et conclusions ......................................................................................... 207

un mlange mthanol/eau.................................................... 205

Tableaux

Table
e formation et du moment dipolaire de la
tine et de ses radicaux. ........................................................................................................ 171
Tab cturales de lesculine et de
ses radicaux. .173
Tableau V on et pri cipaux paramtres molculaires des dirutines
obtenues par mcanique molculaire (cff). ............................................................................ 175
Table
...................................... 183
ableau V.8. Impact des descripteurs des dirutines sur le pouvoir antiradicalaire et le pouvoir
inhibiteur de la xanthine oxydase........................................................................................... 184
Tableau V.9. Comparaison des proprits lectroniques et nergtiques de lesculine et de ses
dimres. .................................................................................................................................. 186
Tableau V.10. Impact des descripteurs des dies ulines sur le pouvoir antiradicalaire et le
pouvoir inhibiteur de la xanthine oxydase. ............................................................................ 187
ableau V.11. Analyse de la trajectoire des dirutines lies en O4-C6, C6-C6 et C2-C2.
................. 192
Tableau on.
................. 198
Tableau V.1
Figure V.1. Dfinition des angles de flexibilit et numrotation de la rutine. .................. 166
Figure V.2. Analyse de la trajectoire issue de la dynamique 600 K de la rutine. ........... 167
au V.1. Enthalpie de formation et principaux paramtres molculaires des
conformres de la rutine. ........................................................................................................ 168
Tableau V.2. Enthalpie de formation et principaux paramtres molculaires des
conformres de lesculine....................................................................................................... 170
Tableau V.3. Comparaison des enthalpies d
ru
leau V.4. Comparaison des proprits nergtiques et stru
.5. Enthalpie de formati n
au V.6. Enthalpie de formation et principaux paramtres molculaires des diesculines
par mcanique molculaire (cff). ........................................................................................... 179
Tableau V.7. Comparaison des proprits lectroniques et nergtiques de la rutine et de ses
dimres. ............................................................................................
T
c
T
...............................................................................................................................
V.12. Impacts de loligomrisation de la rutine sur la solubilit et sur lagrgati
...............................................................................................................................
3. Analyse de la trajectoire des diesculines lies en O7-C4 et C4-C5................ 201
Tableau V.14. Impacts de loligomrisation de lesculine sur la solubilit et sur lagrgation.
................................................................................................................................................ 207

Figures

Figure V.3. Dfinition des angles de flexibilit et numrotation de lesculine. ................ 169
Figure V.4. Analyse de la trajectoire issue de la dynamique 600 K de lesculine.......... 169
Figure V.5. Reprsentation de la HOMO et de la LUMO de la structure optimise de la
rutine. .171
Figure V.6. Reprsentation de la HOMO et de la LUMO de la structure optimise de
lesculine. .172
Figure V.7. Formes de rsonance du radical phenoxy dans le cas de la rutine et lesculine.
.174
Figure V.8. Conformre le plus stable et ensemble des conformres des dirutines lies en
O4-C6, C6-C6 et C2-C2................................................................................................. 177
Figure V.9. Conformation la plus stable et analyse de la trajectoire de lhxarutine lie en
O4-C6. .178
Figure V.10.
en O7-C4 et C4-C5................................................................................................................. 180
Conformation la plus stable du nonamre desculine lie en O7-C4.. ....... 181
Figure V.12.
................................ 194
Figure V.16.
rutines dans un m 196
Figure V.17. lange de 2 dirutines
dans un m 197
Figure V.18. 200
Figure V.19. Modlisation des liaisons hydrogne entre les diesculines lies en O7-C4 et
C4-C5 avec leau.
lange de 2
diesculines dans un milieu mthanol/eau (30/70, v :v). ......................................................... 206

Conformre le plus stable et ensemble des conformres des diesculines lies
Figure V.11.
Modlisation dune molcule de rutine dans une cellule cubique deau de 40
de ct, contenant 1294 molcules deau, cutoff de 14.0 ............................................... 190
Figure V.13. Modlisation des liaisons hydrogne rutine/eau. ....................................... 191
Figure V.14. Modlisation des liaisons hydrogne des dirutines lies en O4-C6, C6-C6
et C2-C2 avec leau. ............................................................................................................ 192
Figure V.15. Modlisation des liaisons hydrogne hxarutine/eau.
Modlisation des interactions hydrogne tablies dans un mlange de 4
ilieu mthanol/eau (30/70, v : v). ...............................................................
Modlisation des liaisons hydrogne tablies dans un m
ilieu mthanol/eau (30/70, v :v). ............................................................................
Modlisation des liaisons hydrogne esculine/eau.....................................
................................................................................................................... 201
Figure V.20. Modlisation des liaisons hydrogne nonamre desculine/eau ................ 203
Figure V.21. Modlisation des liaisons hydrogne tablies dans un mlange de 4 esculines
dans un milieu mthanol/eau (30/70, v :v).. ........................................................................... 205
Figure V.22. Modlisation des liaisons hydrogne tablies dans un m


Chapitre V. Modlisation molculaire

Les rsultats de lo utine et de l e ont montr
exprimentalement, la formation de pontage de type C-C et C-O localiss tout aussi bien sur
la partie sucre que sur la partie phnolique d s ue De plus,
loligomrisation de la rutine a induit une aiss uv ica ne
augm ation de dinh de la x hine e ubili dans leau
des oligomres f lors qu omrisa n de ne dau la
fois la solubilit, lactivit antiradicalaire et lactivit dinhibition de la xanthine oxydase.
Pour comprendre et expliquer ces rsultats exprime e odlisation
mol ire a t . Elle po r :
L la stab es espce adic l l n
comprendre le mca de la raction radicalaire ayant abouti aux pontages
servs e entalem
dterminer dventuelles corrlations entre ces descripteurs et les variations du

1. Contribution de la modlisation molculaire la dtermination de la
activit des espces radicalaires

ue molculaire utilisant le champ de
rce cff. Cette tude permet dune part, didentifier, pour chaque flavonode, la conformation
ligomrisation de la r esculin
es unit monomriq s.
b e du po oir antirad laire et u
ent lactivit ibition ant oxydase t de la sol t
orms, a e ig lol tio lesculi a p rmis e gm nter e
ntaux, un approche par m
cula ralise rte su

tude de ilit d s r alaires de a rutine et de esculine afi
de nisme
ob xprim ent.
Ltude de descripteurs lectroniques, nergtiques et gomtriques afin de
pouvoir antioxydant observes exprimentalement.
Ltude conformationnelle dans un solvant des monomres et des oligomres
afin dexpliquer les modifications de solubilit et de dispersion observes
exprimentalement.
Ces trois axes dtude ont t mens sur la rutine, lesculine et leurs oligomres

r
Pour comprendre les mcanismes ractionnels aboutissant la formation des oligomres,
une tude conformationnelle a t ralise par mcaniq
fo
165

la plus stable partir de laquelle seront gnres les espces radicalaires, et dautre part,
analyser les repliements et la flexibilit de la molcule.
A partir de la conformation la plus stable, une analyse par mthode semi-empirique
M1) de la molcule parent et de ses radicaux a t ralise. La comparaison des enthalpies
e formation de la molcule parent et de ses radicaux, nous renseigne sur la ractivit de
chaque ns avoir
eu au cours de la raction de polymrisation.

a flexibilit de la rutine est caractrise par 5 angles de torsion , , , , . Ces angles
dfinissent la position du cycle B par rapport la partie chromane (), celle du glucose par
rapport la gnine (, ) et celle du rhamnose par rapport au glucose (, ). La dfinition des
angles de flexibilit et la numrotation sont indiques Figure V.1.

, un ensemble de conformres a t retenu,
selon des critres nergtiques et structuraux. Aprs limination des conformres redondants,
les 16 structures restantes sont nouveau minimises 300 K puis analyses. Ltude de ces
16 conformations indique que la partie glycosyle de la rutine est trs flexible et se dplace de
part et dautre de la partie aglycone (Figure V.2), et que le cycle B dcrit un mouvement
circulaire autour de la liaison C2-C1.

d
(A
d
espce et ai i peut nous informer sur le mcanisme ractionnel susceptible d
li
1.1. Dtermination des conformres les plus stables
1.1.1. Cas de la rutine

L

Figure V.1. Dfinition des angles de flexibilit et numrotation de la rutine.

Suite une dynamique molculaire 600 K
OH
OH
HO
O
O
OH
CH
3
OH OH
2
3
4 6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
4''
5''
1'''
4'''
O
CH
2
O O
OH
OH O
5
6''
5'''
OH
HO
1''
2''
3''
2''' 3'''
166

Figure V.2. Analyse de la trajectoire issue de la dynamique 600 K de la rutine
(superposition par les cycles A et C).

culaires a t mise en
vidence (Tableau V.1.). Le nombre et la localisation des liaisons hydrogne
intram
onformations, entre:
- le cycle B et le rhamnose entranant un repliement de la molcule (conformre 1)
- la fonction carbonyle et le rhamnose ou le glucose (conformres 3, 4 et 5)
- la fonction hydroxyle en C
7
et le rhamnose (conformre 6)
- la fonction hydroxyle en C du cycle B et le rhamnose (conformre 5)

La mise en place de plusieurs liaisons hydrogne intramol
olculaires varient en fonction de la conformation, mais la liaison hydrogne OH

5
---O
4

entre lhydroxyle en C
5
et la fonction carbonyle est maintenue quelque soit le conformre. En
revanche, le nombre et la position des autres liaisons intramolculaires sont variables et
stablissent, selon les c
3
- entre le glucose et le rhamnose (conformres 3, 8, 10, 14 et 16)

La proximit spatiale entre la partie sucre et les hydroxyles du cycle B observe dans ce
travail est conforme aux rsultats rapports par Zhang et Brodbelt [211]. De mme, la
formation dune liaison hydrogne entre OH
2
et la fonction carbonyle est conforme aux
observations de Alluis [174]. Ces deux observations sont corrler respectivement avec les
conformres (1 et 5) et (4 et 5) observs dans cette tude.
167

conformres de la rutine.
Liaisons H Conformres Enthalpie
(kcal/mol)
Distance
entre le
cycle A et le
rhamnose
()
a
Nombre Type
1 -20.42 5.59 2
OH
5
---O
4
OH
3
---OH
4

2 -18.64 4.84 2
OH
5
---O
4
OH
4
---O
5
H

3 -15.80 12.09 3
OH
5
---O
4
OH
2
--- O
4
OH
2
---OH
4
4 -15.42 11.42 2
OH
5
---O
4
OH
2
--- O
4

5 -15.12 11.74 3
OH
5
---O
4
OH
2
- O
4
OH
3
---O
rha
7 -14.81 5.28
---O
4

8 -14.63 8.6
-O
4
OH
2
---OH
4

5.61 1
OH
5
---O
4

--
6 -15.04 5.52 3
OH
5
---O
4
OH
2
---O
glc
OH
7
---OH
4
1
OH
5
1 2
OH
5
--
9 -14.35
10 -14.29 4.67 2
OH
5
---O
4
OH
2
---O
glc

11 -13.98 5.17 1
OH
5
---O
4

13 -12.47 5.18 1
OH
5
---O
4

14 -11.40 8.64 3
OH
5
---O
4
OH
2
---- OH
3
OH
4
---O
pont
osidique
15 -9.97 11.56 1
OH
5
---O
4

16 -9.10 9.49 2
OH
5
---O
4
OH
4
---O
pont
osidique

a
: pour chaque cycle un pseudo-atome (localis quidistance des 6 atomes du cycle) a t pris comme rfrence

Afin dvaluer le repliement de la rutine, 2 pseudo-atomes ont t crs au centre du
cyc tre
ableau V.1). Selon ces rsultats, le nombre de liaisons hydrogne intramolculaires et le
repliement de la molcule n uls la stabilit

nfor la us s ( d ea . t
lus f ible e ie rete o ca de r vit

le A et au cen du rhamnose. La distance les sparant fluctue entre 4.67 et 12.09
(T
expliquent pas eux se des conformations.
La co mation pl table conformre 1 u tabl u V.1 ), ces --dire celle
prsentant la p a nthalp a t nue p ur les lculs acti .

1.1.2. Cas de lesculine

La flexibilit de lesculine est caractrise par 2 angles de torsion et . Ces angles
dfinissent la position du glucose par rapport la gnine (, ). La dfinition des angles de
flexibilit et la numrotation sont indiques Figure V.3.
168

mrotation de lesculine.

Aprs dynamique molculaire (600 K) et minimisation, les 7 conformres retenus
montrent que lesculine prsente une structure beaucoup moins flexible que celle de la rutine.
Lors de lanalyse de la trajectoire, il apparat que de nombreuses liaisons hydrogne
stab

Figure V.4. Analyse de la trajectoire issue de la dynamique 600 K de lesculine
(superposition par les atomes C6-O-C1) .

ne
avec le glucose.
La distance sparant les deux pseudo-atomes crs dans le cycle A et le glucose varie
peu,

Figure V.3. Dfinition des angles de flexibilit et nu
lissent au sein du glucose haute temprature, mais que ces interactions sont en nombre
plus limit au sein du systme minimis 300 K (Figure V.4., Tableau V.2.).

Le groupement hydroxyle en position 7 est souvent impliqu dans une liaison hydrog
ce qui indique que cette molcule est rigide.

O O HO
OH
3
7
8
1'
2'
3'
O
O
HO
HO
4'
5'
6'
OH
4 5

169

Tableau V. Enthalpie de formation et principaux paramtres molculaires des
rmres de lescu
2.
confo line.
Liaisons H Conformres Enthalpie
(k l)
ce

cycle A et le
glucose ()
a
Nombre Type
cal/mo
Distan
entre le
1 12.71 7.28
---OH
4
--
2
OH
7 2
OH -OH
5
2 14 7 9 1 7
---OH
2
H
5
19.90 7.00 0

.1 7.6
OH

3 17.03 7.55 2
OH
7
---O
glc
OH
4
---O
4
5 21.24 6.76 0

6 22.19 7.44 1
OH
7
---O
glc
7 23.62 6.97 0

a
: pour le cycle A un pseudo-atome (localis quidistance des 6 atomes du cycle) a t pris comme rfrence

Le conformre 1 caractris par la plus faible enthalpie a t retenu pour les calculs de
ractivit (Tableau V.2.).

1.2. Dtermination de lespce radicalaire la plus stable

espce radicalaire attaquera prfrentiellement les atomes prsentant une forte densit
lectr
de la rutine ont t values par mthode semi-empirique. Dans le cas de la rutine, la
confo mation la plus stable prsente une HOMO et une LUMO de -8.81 eV et -0.88 eV
respectivement, toutes deux localises sur la partie aglycone de la rutine (Figure V.5.).
Afin de dterminer la position du radical qui est susceptible dtre form en priorit par
lenzyme, les proprits lectroniques, reprsentatives de la distribution de charges des
conformres les plus stables et les proprits nergtiques de leurs radicaux ont t
dtermines par AM1.

1.2.1. Cas de la rutine

L
onique, cest--dire sur la HOMO [212]. Ainsi, pour dterminer la localisation de
lespce radicalaire susceptible dtre forme en priorit au cours de la raction
doligomrisation, les localisations de la HOMO et de LUMO de la conformation la plus
stable
r
170

Figure V.5. Reprsentation de la HOMO (rose) et de la LUMO (vert) de la structure
optimise de la rutine.
ait que la HOMO est localise prfrentiellement sur la partie aglycone
et 4 radicaux hydroxyles ont t crs sur cette partie. Afin
de dfinir le radical le plus probablement form, les enthalpies de formation de ces radicaux
ce
des eurs lectroniques, nergtiques et structuraux a t
dtermin et report en annexe 2.

Compte tenu du f
de la rutine, 5 radicaux carbones
ont t reportes dans le Tableau V.3 et compares ceux de la rutine. En plus de
cripteur, un ensemble de descript

Tableau V.3. Comparaison des enthalpies de formation de la rutine et de ses radicaux.

Radicaux phnoxy en position : Radical carbone en position:
C5 C6 C8 C6
Rutine
O3 O4 O7 O5 C2
H (kcal/mol) -630.08
-
604.35
-609.11 -598.29 -594.51 - 537.06 -578.41 -578.30 -570.83 -572.85
H (kcal/mol): BDE 25.73 20.97 31.79 35.57 93.02 51.67 51.78 59.25 57.23
H: enthalpie de formation (kcal/mol), H (BDE) : variation denthalpie entre le radical et la molcule parent (kcal/mol)

rt BDE, et lenthalpie de formation la plus leve; il semble
donc tre le radical le plus instable. Par contre, le radical form en position O4 a le BDE et
lenthalpie de formation les plus faibles; il serait le radical le plus stable. Ce rsultat est

Il apparat de ce tableau que les enthalpies de formation des radicaux hydroxyles sont
plus faibles que les enthalpies de formation des radicaux carbones. Le radical form en
position C2 possde le plus fo
171

com
en 4 et 3 de la querctine sont les plus stables.
Selon ces rsultats, il est probable quau cours de la raction doligomrisation de la
rutine cata ce radicalaire porte par lhydroxyle en 4 soit forme.
en ressort galement que parmi les radicaux ports par un carbone, les positions 5 et 6
sont les plus fa rable adical le plus stable.

LUMO de -9.14 eV et -0.92 eV respectivement. Toutes deux localises sur la partie aglycone
de l

parable celui rapport par de Russo et al. [213] qui observent que les radicaux forms
lyse par la laccase, une esp
Il
vo s pour gnrer le r
1.2.2. Cas de lesculine

Dans le cas de lesculine, la conformation la plus stable prsente une HOMO et une
esculine (Figure V.6.).

Figure V.6. tation de O (rose) e e la LUMO (vert) de la structure
o e de lescu
fin de dterminer les radicaux susceptibles dtre crs lors de la raction
dolig
, nergtiques et structuraux complmentaires a t valu et report en annexe 3.
Reprsen la HOM t d
ptimis line.

A
omrisation, 4 radicaux carbones et 1 radical hydroxyle ont t gnrs, comme pour la
rutine, sur la partie aglycone de lesculine. Pour dterminer le radical susceptible dtre form,
les enthalpies de formation de ces radicaux ont t calculs et reports dans le Tableau V.4 et
compars ceux de lesculine. En plus de ce descripteur, un ensemble de descripteurs
lectroniques

172

Tableau V.4. Comparaison des proprits nergtiques et structurales de lesculine et
de ses radicaux.
Radical
phnoxy en
position:
Radical carbone en position:
Esculine
O7 C3 C4 C5 C8
H (kcal/mol) -350.17 -321.74 -295.49 -298.34 -295.84 -292.37
H (kcal/mol): BDE 28.43 54,68 51.83 54.33 57.80
H: enthalpie de formation (kcal/mol) , H (BDE) : variation denthalpie entre le radical et la molcule parent (kcal/mol)

Ce tableau montre que les enthalpies de formation du radical phnoxy en position 7 de
lesculine et le radical carbone en position 4 sont les plus faibles. Il est donc probable que
lespce radicalaire majoritairement forme soit porte par loxygne en position 7 de
lesculine. De plus, si lespce radicalaire forme est porte par un carbone, le radical sera
prfrentiellement localis en position 4.

1.3. Conclusions
gir comme agent de transfert radicalaire conduisant la formation de divers radicaux,
notam
dimre (C2-C2) identifi
par RMN.
, formant des pontages de type C-C comme
-O.

Daprs cette tude de modlisation molculaire, il apparat que le radical O
4
de la
rutine est le plus stable. Une fois dans le milieu, celui-ci peut agir comme propagateur de la
raction formant ainsi des pontages C-O. Il peut aussi se dlocaliser (Figure V.7.) ou encore
a
ment de type C
. Cette tude a galement dmontr que le radical C2
est le plus ractif.

Cette ractivit est susceptible de favoriser les mcanismes de terminaison par combinaison
de type : C2
+ C2
C2-C2. Ceci expliquerait la prsence du

En ce qui concerne lesculine, il a t dmontr au cours de cette tude que le radical
O7
est le plus stable. Tout comme pour le radical phnoxy de la rutine, une fois dans le
milieu, ce radical peut tre propag ou dlocalis
C

173

174

O H O
O
OH
OR
OH
OH
O H O
O
O

OR
OH
OH
O H O
O
OH
OR
OH
OH
n

O H
C

O
O
OR
OH
O
OH
O H O
OR
OH
O
O

OH
O H O
O
O
OR
OH
C

OH
O H
OH
O
O
O
OR
C

OH
O H O
O
O
OR
O

OH
O H
OH
O
O
O
OR
C

OH

O H O
O
O
OR
O
OH
2
3
4 5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6' (a)
(b)
Forme Stable
O2
H2O
Laccase

Figure V.7. Formes de rsonance du radical phenoxy dans le cas de la rutine (a) et
lesculine (b).

2. Contribution de la modlisation molculaire lanalyse de la variation
des activits antioxydantes
oprits nergtiques et gomtriques des diffrents types de dimres
usceptibles dtre forms ont t values et compares, afin de dfinir les pontages les plus
probablement forms ligomrisation.
En se basant sur le mode de pontage le plus probable, des structures oligomriques ont
t c
riques et
dim
uite t corrls aux activits
antioxydantes exprimentales.

O O
OH
OR
O O OH
OR
n

O O
O

OR
C

O O
O
OR
C

O O O
OR
O
C

O
O
OR
O O

O
OR
C

O O
O
OR

1 2
3
4 5
6
7
8
O
2
H
2
O
Laccase

Pour comprendre les variations des activits antioxydantes observes exprimentalement,
diffrentes tapes de modlisation molculaire ont t ncessaires :
- les pr
s
lors de la raction do
-
res et une tude conformationnelle par mcanique molculaire de ces structures a t
faite, afin de dfinir les conformations les plus stables.
- Enfin, une analyse par mthode semi-empirique des structures monom
riques les plus stables a permis daboutir aux diffrents descripteurs lectroniques,
nergtiques et gomtriques. Ces diffrents descripteurs ont ens

2.1. Dfinition du pontage le plus probable par tude des oligomres dans le
vide
2.1.1. Cas des oligorutines

Cas des dirutines

Dans le cas de la rutine, les radicaux forms sur le cycle B prsentant des enthalpies de
formation plus faibles que ceux des cycles A et C, lensemble des pontages impliquant le
cycle B a t analys. Les caractristiques des conformres les plus stables obtenus pour
chaque type de pontage sont regroupes dans le Tableau V.5..

Tableau V.5. Enthalpie de formation et principaux paramtres molculaires des dirutines
obtenues par mcanique molculaire (cff).
Pontage
de
formation
(kcal/mol)
Nombre de
liaison H
Distance entre
les 2
rhamnose ()
a
Enthalpie
O4-C6 -30.70 5 21.21
O3-C6 -28.50 2 12.27
O4-C5 -22.67 3 16.37
O3-C5 -21.79 3 15.12
O3-C2 -21.76 3 8.81
O4-C2 -21.34 10 9.45
C2-C5 74.82 3 13.03
C2-C2 78.05 4 13.10
C6-C6 62.88 2 11.45
C2-C6 67.99 2 3.28
C6-C5 69.63 3 14.37
C5-C5 70.92 3 10.64
a
: pour chaque cycle un pseudo-atome (localis quidistance des 6 atomes du cycle) a t pris comme rfrence

Il apparat que selon le type de pontage, la structure dimrique de la rutine peut tre
tabilise par de iai molculaires dont le nombre varie de 2 10. La
liaison hydrogne prcdemment observe sur la rutine entre la fonction carbonyle et
lhyd
x rhamnoses, caractristique du degr de repliement de la
irutine, est comprise entre 3.28 et 21.21 selon le type de dirutine. La flexibilit de la partie
s s l sons hydrogne intra
roxyle en C5 est maintenue sur chacune des units monomriques quel que soit le type
de pontage.
La distance sparant les deu
d
175

sucre de s le
pontage est altre.
Les pontages O4-C6 et O3-C6 ont les enthalpies d plus faibles avec
respectivement des valeurs de - .70 nc ces deux types de
liaisons soient favoriss lors du processus doligomrisation. A linverse, lenthalpie de
formation de la dirutine comportant une liaison C2-C2 est la plus leve avec une valeur de
78.05 eV, ce qui im ait que e de pontag oit dfavor rs exprimentalement,
ce type de structure a t dtect par RMN. Dans cas dun m , lanalyse par RMN
caractrise les esp ritaire t donc probable que les autres types de pontage soient
prsents dans le m fa s, comme tr par Ncanana et al.
[156]. Le radical en position C2 lus instable ableau V.3.), donc le plus ractif. Cette
importante ractivi r effet liter les co ages (C2
, , ce qui peut expliquer

la formation de dirutines lies en C2-C2.

aprs ltude par RMN, il apparat que loligomrisation de la rutine entrane
diffr
r ces deux types de pontages, les
deux
nues pour la suite de ce travail.

ues. En revanche dans le cas du
pontage C2-C2, les sucres se positionnent prfrentiellement dun seul ct de la molcule,
ce qu
stablissent au nombre de 5, 2 et 3 pour les pontage O4-C6, C6-C6 et C2-C2
la rutine est conserve sur le dimre, seule la rotation du cycle B implique dan
e formation les
probable que 30.70 et -28 eV. Il est do
pliquer ce typ e s is. Ho
le lange
ces majo s, il es
ilieu mais des quantits plus ible dmon
est le p (T
t a pou de faci upl C2
)
D
ents types de pontage. De plus, plusieurs tudes bibliographiques ont mis en vidence la
prsence de pontages C-O et C-C lors de loligomrisation despces phnoliques catalyse
par des oxydorductases [155, 156, 214, 215]. Afin dtudie
dirutines prsentant les enthalpies de formation les plus faibles (O4-C6 et C6-C6) et
la dirutine (C2-C2) dmontre exprimentalement ont t rete
Une analyse conformationnelle de ces 3 structures a t ralise par dynamique
molculaire. Lensemble des conformations extraites de la dynamique ainsi que les structures
les plus stables pour ces 3 pontages sont reprsentes Figure V.8..

Dans le cas des pontages O4-C6 et C6-C6, la flexibilit de la molcule permet aux
sucres de se placer de part et dautre des cycles aromatiq
i conduit aux conformres les plus stables.

Dans le cas des conformres les plus stables, des liaisons hydrogne intramolculaires
176

respectivement.

s B
dans le plan.

Cas de lhxarutine
Afin de s ids molculaire, loligomre prsentant la plus
aute masse dtecte en MALDI-TOF a t analys. Lenthalpie de formation obtenu avec le
ponta
A1 A2 A3
B1 B2
B3
Figure V.8. Conformre le plus stable (A) et ensemble des conformres (B) des dirutines
lies en O4-C6 (1), C6-C6 (2) et C2-C2 (3) (superpostion par les cycles B). Cycle

imuler un oligomre de haut po
h
ge de type O4-C6 tant le plus bas, lhexamre li en O4-C6 a t choisi.
La superposition de certains des conformres extraits de la dynamique 600 K ainsi
que la conformation la plus stable sont reprsentes Figure V.9..
177

Figure V.9. Conformation la plus stable et analyse de la trajectoire de lhxarutine lie en
O4-C6 (superposition par les cycles B).

La superposition des atomes O4-C6 de plusieurs con res dhxarutine fait
t de lautre de la chane forme par les cycles aromatiques.

2.1.2. Cas des oligoesculines

caractristiques des confor
form
apparatre une structuration symtrique o les sucres se positionnent alternativement dun
ct e
Dans le cas de la conformation la plus stable, 9 liaisons hydrogne intramolculaires ont
t tablies entre les sucres dune part et les cycles aromatiques dautre part. Lensemble de la
molcule stend sur 34.03 (distance entre les deux groupements mthyles des rhamnoses
finaux).

Cas des diesculines
Lensemble des pontages impliquant la partie aglycone de lesculine a t analys. Les
mres les plus stables obtenus pour chaque type de pontage sont
regroupes dans le Tableau V.6..

178

diesculines par mcanique molculaire (cff).
Pontage
Enthalpie de
formation
(kcal/mol)
Nombre de
liaison H
Distance entre
les 2 atomes
C6 ()
C4-C5 26.24 3 4.51
O7-C4 27.24 2 9.09
C4-C8 30.84 2 4.21
C4-C4 31.41 3 7.56
C3-C4 40.68 4 12.93
C3 3 7.23
C3-C8 46.25 3 17.68
O7-C5 46.56 2 5.06
-C5 44.11
O7-C3 48.26 3 14.57
C3-C3 48.30 2 18.67
O7-C8 54.50 3 4.59
C5-C5 140.40 3 10.77
C5-C8 144.65 6 9.72
C8-C8 152.28 5 14.37

Les structures de la diesculine sont stabilises par des liaisons hydrogne
intramolculaires dont le nombre varie entre 2 et 6. Des liaisons hydrogne sont frquemment
tablies entre groupements hydroxyles dun mme glucose.
La distance sparant les deux groupements mthyles des deux glucoses, caractristique
u repliement du dimre est comprise entre 4.21 et 18.67 .

Les pontages impliquant la position C4 ont les enthalpies de formation les plus faibles,
alors que les pontages impliquant les positions C5 et C8 ont les enthalpies de formation les
plus leves. Les enthalpies les plus faibles tant obtenues avec les pontages de type O7-C4 et
C4-C5, il est probable que ses deux types de pontage soient favoriss lors de la raction
doligomrisation. Ainsi, ces deux pontages ont t retenus pour la recherche dventuelles
corrlations entre descripteurs et activits antiradicalaires.

Les structures les plus stables pour ces deux pontages ainsi que la superposition de
certains conformres gnrs au cours de ltude par dynamique molculaire sont reprsentes
Figure V.10.
d
179

Figure V.10. Co e plus able (A emble des conform ) des lines
lies en O7-C4 (1) et C4-C5 (2) (superposition par les atomes impliqus dans le pontage).

diesculine par un p tage C-O apparat plus flexible que celle lie par un
pontage C-C.

fin de simuler un oligomre de haut poids molculaire, loligomre prsentant la plus
haute
A1
B1 B2

A2
nformre l st ) et ens res (B diescu
La lie on
Cas de la nona-esculine

A
masse observe en MALDI-TOF a t analys. Lenthalpie de formation la plus basse
tant obtenue avec le radical form en position O7, le nonamre li en O7-C4 a t choisi.
Des analyses conformationnelles par dynamique molculaire 600 et 800 K ont t
ralises. La conformation la plus stable est reprsente Figure V.11..
180

Figure V.11. Conformation la plus stable du nonamre desculine lie en O7-C4. Glucose en
bleu.

Durant la dyn mol les st ctures phnoliques sont peu flexibles,
contrairement aux su ar de mobilit. Dans le cas de la conformation la
ol et le glucose, entre deux glucoses conscutifs
dun mme glucose. Le nonamre desculine a une structure tendue de 34.86 ,
e la fonction catchole du premier monomre jusqu la fonction mthyle du dernier glucose.
2
inhibition de
la x
ues ont t valus pour chaque type de dimres et compars aux
amique
cres qui g
culaire, ru
dent une gran
plus stable, 15 liaisons hydrogne intramolculaires stabilisent le systme. Ces liaisons
hydrogne stablissent entre la partie catch
ou au sein
d

.2. Recherche de corrlations descripteurs/activit antioxydante

Pour comprendre et expliquer la variation des activits antiradicalaire et d
anthine oxydase observe exprimentalement, diffrents paramtres structuraux,
lectroniques et nergtiq
181

valeu
mres les plus stables obtenus par
dynamique molculaire ont t nouveau minimiss par mthode semi-empirique AM1. Cette
m d s 166 atomes, notre tude se limitera aux
cas d
en position 4 tant le plus stable,
il a t choisi afin de dterminer la valeur de BDE. Aprs minimisation des structures par
AM1, diffrents descripteurs ont pu tre dtermins et sont regroups dans le Tableau V.7. .
En plus des dirutines lies en C6-C6, C2-C2 et O4-C2 tudies prcdemment, une
irutine lie par le rhamnose (O4-C2) a galement t analyse afin de confirmer ou
dinf
rs obtenues pour le monomre initial. Ces descripteurs sont : E
HOMO
, E
LUMO
, Eg, , ,
polarisabilit, aire, volume, Log P, charges, BDE et IP.
Pour dterminer ces descripteurs, les confor
tho e pouvant sappliquer des systmes dau plu
es monomres et des dimres de rutine et desculine.

2.2.1. Cas des dimres de rutine

Afin dvaluer lactivit antiradicalaire des dimres de rutine par un mcanisme de
transfert mono-lectronique, un lectron a t limin de la HOMO des molcules parents
pour obtenir un radical cation (ArOH
+
). Le radical phnoxy
d
irmer les observations exprimentales par RMN, qui suggrent que la partie sucre est
implique dans le processus de loligomrisation.

182

Tableau V.7. Comparaison des proprits lectr
ses dimres.

Diru en :
oniques et nergtiques de la rutine et de
tine lie Rutine
6-C -C -C -O4 C 6 C2 2 O4 6 C2
-63 1253. 253.9 35.7 39.5 0.08 - 52 -1 9 -12 2 -12 4 H (kcal/mol)
E
HOMO
(eV) -8.81 -9.02 9.248 .153 .965 0 - -9 -8
E ) -0.88 -1.013 1.247 .132 1.012
LUMO
(eV - -1 -
Eg (eV) 7.93 8.007 8.001 .021 .953 8 7
(eV) 4.845 5.016 5.247 .142 5 4.988
(D) 3.4 5.082 6.312 7.47 0 4.463
POL 54.75 108.7 08.72 8.72 8.7 (au) 2 1 10 10 2
A (
2
) 634 970. 7.5 6.6 8. .82 08 97 6 113 0 104 80
V ) 1458.47 2541.0 567.07 40.44 652.0 OL (
3
5 2 27 2 4
log P -1.61 -3.5 -3.59 3.56 3.22 9 - -
Q -0.266 -0.23 0.238 .263 .264 O
4
9 - -0 -0
Q 0.122 0.162 .112 .103 .165
QC -0.096 -0.124 -0.082 -0.075 -0.096
C
2
0 0 0
3
U
n
i
t

m
o
n
o
m
r
i
q
u
e

1

E 0.218 0.286 0.194 .178 .261 xcs de
charge C
2
-
C
3
0 0
Q -0.240 .152 .272
p
O
4
-0.239 -0 -0
Q 0.107 0.154 .080 .144
QC -0.078 -0.120 -0.055
U
n
i
t

o
n
o
m
r
i
q
u
e

C
2
0 0
-0.121
3
m
2

E 0.185 0.274 .135 .265 xcs de
charge C
2
-
C
3
0 0
BDE 20.97 25.12 25.94 19.58 23.73
1
BDE
2
27.03 25.59 24.96
k
IP 180.04 177.3 83.45 0.11 7.9
H

c
a
l
/
m
o
l
)

2 1 17 17 2 (

H: enthalpie de formation (kcal/mol), E
HOMO
: nergie de lorbitale la plus haute occupe (eV), E
LUMO
: nergie de lorbitale la plus basse
vacante (eV), Eg : diffrence dnergie entre le LUMO et la HOMO, :lectrongativit (eV), : moment dipolaire (D), A : aire (
2
), VO
3
L :
volume ), POL : polarisabilit (
3
), Q : excs de charge, H (BDE) : variation denthalpie entre le radical et la molcule parent
(kcal/m , H (IP) : variation denthalpie entre le radical cation et la molcule parent (kcal/mol), P : atome impliqu dans le pontage
et de loligomrisation et du mode de pontage des
flavonodes sur leur activit antioxydante, un code couleur a t adopt : une couleur rouge a
t attribue aux descripteurs relatifs aux dimres impliquant une baisse du pouvoir
antioxydant par rapport au monomre de dpart et une couleur verte a t attribue aux
descripteurs impliquant une hausse du pouvoir antiradicalaire (Tableau V.8.). Les valeurs de
descripteurs similaires ceux du monomre initial ne sont pas colores.

(
ol)

Afin de faciliter la lecture de leff
183

Tableau V.8. Impact des descripteurs des dirutines sur le pouvoir antiradicalaire et le
pouvoir inhibiteur de la xanthine oxydase.
Dirutine lie en :

C
2
-
O
4

C
6
-
C
6

C
2
-
C
2
O
4
-
C
6
E
HOMO
(eV)
(D)
QO
4

Excs d
charge C
e
2
-
3
C

QO
4

Excs d
charge C
e
2
-
3
C

BDE
BDE
H

(
k
c
a
l
/
m
o
l
)

IP
D
e
s
c
r
i
p
t
e
u
r
s

d
e

l
a
c
t
i
v
i
t

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Hydroxyle
libre
s
s

Log P
POL
Planit
Angle
D
e
s
c
r
i
p
t
e
u
r
s

d
e

l
a
c
t
i
v
i
t

a
n
t
i
-
x
a
n
t
h
i
n
e

o
x
y
d
a
s
e

Hydroxyle
libre
s
s

HOMO
: nergie de lorbitale la plus haute occupe (eV) : moment dipolaire (D), POL : polarisabilit
(
3
), Q : excs de charge, H (BDE) : variation denthalpie entre le radical phenoxy et la molcule parent (kcal/mol), H (IP) : variation
denthalpie entre le radical cation et la molcule parent (kcal/mol)
: impact positif sur lactivit par rapport au monomre; : impact ngatif sur lactivit par rapport au monomre; : sans impact par rapport
au monomre

Activit antiradicalaire

Limplication du groupement hydroxyle en position 4 dans le pontage ninfluence pas
les valeurs du BDE du dimre, mais diminue lexcs de charge ainsi que la charge porte par
latome O
4
. Dans le cas des pontages C-C ou C2-O4, le BDE est augment.
En revanche, quelque soit le type de pontage, la dimrisation de la rutine entrane une
augmentation de E
HOMO
.
184

Selon ces rsultats, il apparat que plusieurs descripteurs suggrent une baisse du
pouvoir antiradicalaire quelque soit le type de pontage des dirutines, ce qui est en accord avec
les mesures exprimentales prsentes chapitre IV.1..

Activit dinhibition de la xanthine oxydase
Daprs la bibliographie, lactivit de la xanthine oxydase est favorise par un angle
de lordre de 26 27 ou par une certaine planit, or initialement, la rutine ne prsente ni
lun i et tat de fait. En outre, il a observ que
laug
dirutines, ce
qui n
Cas des oligoesculines

tude de la rutine, le PI et le BDE de lesculine et de ses dimres ont
t calculs afin dvaluer leur potentiel antiradicalaire. Le radical phnoxy en position 7
tant le plus stable, il a t choisi afin de dterminer la valeur de BDE. A partir des structures
minimises par AM1, diffrents descripteurs ont t dtermins et regroups dans le Tableau
V.9.. En plus des diesculines lies en O7-C4 et C4-C5, choisies du fait de leur stabilit, les
proprits des diesculines lies en C8-C8 et C4-O2 ont t values afin de vrifier
lhypothse formule sur limplication de la partie sucre dans le processus doligomrisation.

n lautre, et la dimrisation ne lamliore pas c
mentation de la taille des molcules entrane une forte polarisabilit dfavorable
lactivit de cette enzyme.
pouvoir dinhibition de la xanthine oxydase quelque soit le type de pontage des
est pas concordant avec les mesures exprimentales.

2.2.2.
Tout comme pour l
185

Tableau V.9. Comparaison des proprits lectroniques et nergtiques de lesculine et de
ses dimres.

Diesculine lie en : Esculine
O7-C4 C4-C5 C8-C8 C4-O2
H (kcal/mol) -350.17 -677.30 -688.15 -690.59 -681.71
E
HOMO
(eV) -9.254 -9.350 -9.431 -9.187 -9.283
E
LUMO
(eV) -0.819 -1.367 -1.403 -1.044 -1.071
Eg (eV) 8.435 7.983 8.028 8.143 8.212
(eV) 5.036 4.675 4.715 5.115 5.177
(D) 7.81 7.696 6.096 9.120 9.57
POL (au) 30.39 60.01 60.01 60.01 60.01
A (
2
) 409.44 653.06 670.90 649.92 680.53
VOL (
3
) 866.74 1535.39 1567.10 1580.85 1587.92
log P -0.21 -1.50 -1.10 -0.79 -1.15
QO
7
-0.239 -0.141
p
-0.236 -0.247 -0.235
QC -0.243 -0.208
3
-0.229 -0.217 -0.355
QC
4
-0.013 -0.042 0.059
p
-0.033 0.193
U
n
i
t

m
o
n
o
m
r
i
q
u
e

1

Excs de
charge C
3
-C
4
0.203 0.166 0.288 0.184 0.548
QO
7
-0.233 -0.247 -0.256 -0.238
QC
3
-0.325 -0.208 -0.223 -0.220
QC
4
0.184
p
-0.042 -0.028 -0.031
U
n
i
t

m
o
n
o
m
r
i
q
u
e

2

Excs de
charge C
3
-C
4
0.509 0.166 0.195 0.189
BDE
1
28.43 30.54 30.65 25.98 27.46
BDE
2
22.34 27.43 30.65
H

(
k
c
a
l
/
m
o
l
)

3 IP 189.34 193.45 191.19 190.82 185.6
H: enthalpie de f orbitale la plus haute occupe (eV), E
LUMO
vaca a HOMO, :lectrongativit (eV), : moment dipolaire (D), A : aire (
2
), VOL :
volu rge, H (BDE) : variation denthalpie entre le radical et la molcule parent
(kcal/mol), H (IP) : variation denthalpie entre le radical cation et la molcule parent (kcal/mol), P: atome impliqu dans le pontage

ormation (kcal/mol), E
HOMO
: nergie de l
nte (eV), Eg : diffrence dnergie entre la LUMO et l
me (
3
), POL : polarisabilit (
3
), Q : excs de cha

Tout comme pour la rutine, un code couleur a t attribu chaque modification de la
valeur des descripteurs (Tableau V.10.).

186

Table et le
pouvoir inhibiteur de la xanthine oxydase.
Diesculine lie en :
au V.10. Impact des descripteurs des diesculines sur le pouvoir antiradicalaire

O
7
-
C
4

C
4
-
C
5

C
8
-
C
8

C
4
-
O
2

E
HOMO
(eV)
(D)
QO
7

Excs de
charge C
3
-
C
4

QO
7

Excs de
charge C
3
-
C
4

BDE
BDE
H

(
k
c
a
l
/
m
o
l
)

IP
D
e
s
c
r
i
p
t
e
u
r
s

d
e

l
a
c
t
i
v
i
t

a
n
t
i
r
a
d
i
c
a
l
a
i
r
e

Hydroxyles
libres

Log P
POL
planit
Angle
D
e
s
c
r
i
p
t
e
u
r
s

d
e

l
a
c
t
i
v
x
a
n
t
h
i
n
e

o
x
y
d
a
s
e

Hydroxyles
i
t

a
n
t
i
-
libres

HOMO
: nergie de lorbitale la plus haute occupe (eV) : moment dipolaire (D), POL : polarisabilit
(
3
), Q : excs de charge, H (BDE) : variation denthalpie entre le radical phenoxy et la molcule parent (kcal/mol), H (IP) : variation
denthalpie entre le radical cation et la molcule parent (kcal/mol)
: impact positif sur lactivit par rapport au monomre; : impact ngatif sur lactivit par rapport au monomre; : sans impact par rapport
au monomre

Activit antiradicalaire
Dans le cas de lesculine, il apparat que limplication de lhydroxyle OH
7
dans le
pontage dfavorise lactivit antiradicalaire du dimre, par rapport aux autres types de
pontage. Au contraire les pontages impliquant deux carbones de la partie phnolique de
lesculine engendrent un pouvoir antioxydant plus lev. Ceci pourrait tre d au fait que le
ponta ance plus importante du radical. Le pontage par le sucre (C4-
O2), u us que lesculine susceptible de ragir avec
une espce radicalaire, prsente des descripteurs avec des valeurs similaires celles de
ge C-C permet une rson
to t en ayant un groupement hydroxyle de pl
187

lescu
obable que la majorit des pontages mis en jeu
soient de type C-C ou C-O
glucose
.

Activit dinhibition de la xanthine oxydase
De mme que la rutine, lesculine ne prsente pas initialement une planit et un angle
favorables lactivit anti-xanthine oxydase, sa dimrisation na pas dincidence sur ce critre.
En revanche, la dimrisation induit une augmentation de la taille de la molcule ainsi que de
sa polarisabilit, ce qui diminue le pouvoir dinhibition de la xanthine oxydase.
pouvoir dinhibition de la xanthine oxydase quelque soit le type de pontage des diesculines,
ce qui nest pas concordant avec les mesures exprimentales.

2.3. Conclusions

En ce qui concerne lactivit antioxydante des dirutines, ltude de modlisation
molculaire a suggr une baisse du pouvoir antiradicalaire quelque soit le type de pontage.
C
En r pouvoir
inhibiteur de lactivit xanthine oxydase, ce qui est contraire aux observations exprimentales.
Ceci pourrait tre d un effet chlatant, vis vis du Cu
2+
de lenzyme, accru dans le cas des
ligomres. Or cet effet na pas t pris en compte lors de ltude par modlisation
mol
augmentation dactivit
antira
line de dpart. De plus, le greffage dun groupement lectroattracteur (cycle aromatique)
permet daccrotre lexcs de charge de la liaison C3-C4 de lunit desculine lie par sa
position C4.
Etant donn quexprimentalement une augmentation importante du pouvoir
antioxydant est observe, il est donc fort pr
eci est en accord avec les mesures exprimentales.
evanche, ltude par modlisation molculaire suggre une baisse du
o
culaire.

Ltude par modlisation molculaire de lesculine et des ses oligomres a suggr que
les pontages de type C-C et C-O
glucose
engendraient une augmentation du pouvoir
antiradicalaire, et particulirement le pontage de type C8-C8. L
dicalaire observe exprimentalement suggre donc que les pontages de types C-C ou
C-O
glucose
soient favoriss par rapport au pontage C-O.
188

En ce qui concerne le pouvoir inhibiteur de lactivit xanthine oxydase, contrairement
lobservation exprimentale, ltude par modlisation molculaire suggre une baisse de cette
activ i pourrait tre attribu, comme pour les dimres de rutine, un effet chlatant
des dimres desculine plus important que celui de lesculine.

3. Analyse des interactions solut/solvant et solvant/solut par modlisation
molculaire

in dexpliquer les variations de solubilit et les interactions intermolculaires
observes exprimentalement, une tude par modlisation molculaire dans le solvant a t
ralise. Les deux objectifs de cette tude sont :
ltude des interactions solut/solvant afin dexpliquer les variations de solubilit
entre monomre et oligomres.
ltude des interactions solut/solut dans un milieu type de synthse afin
thanol/eau) ont t cres et
d
onformationnelle de ces diffrents syst tues.
. Modlisation molculaire de l et de ses oligomres dans leau et
dans un milieu mthanol/eau

Afin dexplorer les conformations des molcules dans un solvant, d'tudier les
in s solut/solvant et dinterprte les variations e solubilit observes
ex e nt, les diffrentes molcules d onomres et doligomres ont t places
l co t des molcules deau ou mthanol/eau. Dans la bibliographie, le
a ns olculair a t corrl la solubilit [19], nous nous
sommes donc particulirement intress leur caractrisation. Afin didentifier les liaisons
hydrogne intra- et inter-molculaires, les conformations aboutissant au plus grand nombre de
es liaisons ont t slectionnes.
it. Cec
Af
-
-
dvaluer les proprits dagrgation des monomres et de leurs dimres.

Pour mener cette tude, des cellules de solvant (eau ou m
es molcules de solut (monomre ou dimre) y ont t introduites, puis une analyse
c mes a t effec

3.1 a rutine
teraction
primental
dans une cel
nombre de li
r d
me
ule
iso
e m
ntenan
hydrogne interm es
c
189

3.1.1 la rutine et de ses oligomres dans leau
V.12.).
. Modlisation molculaire de
3.1.1.1. Cas de la rutine

Une molcule de rutine a t place dans une maille ou cellule cubique de 40 de ct
contenant, lors de la dernire tape de dynamique 300 K, 1294 molcules deau (Figure

Figure V.12. Modlisation dune molcule de rutine dans une cellule cubique deau de 40
de ct, contenant 1294 molcules deau, cutoff de 14.0 .

Au cours de la dynamique, la flexibilit des sucres de la rutine est maintenue et la forme
replie est prpondrante, tout comme dans le vide.
Diffrentes liaisons hydrogne intramolculaires stablissent durant la dynamique :
- OH
5
---O
4
: conserve comme dans le vide
- OH
5
---OH
4

- Entre les 2 hydroxyles du cycles B
- OH
4
---O
pont osidique

- OH
2
---O
3

- glucose---rhamnose
- glucose---glucose/rhamnose---rhamnose
190

La stabilisation du systme se fait par la formation de liaisons hydrogne
intermolculaires entre la rutine et le solvant comme indiqu dans la Figure V.13.. Ces
liaisons hydrogne font intervenir aussi bien la partie sucre, les hydroxyles des cycles
aromatiques, que la fonction carbonyle. Sur le systme reprsent sur la Figure V.13., 6
liaisons hydrogne rutine/eau sont formes.

Figure V.13. Modlisation des liaisons hydrogne rutine/eau, les molcules deau formant
rutines dans leau, 3 structures
dim
N (C2-C2) (Figure V.15.). Lensemble des
caractristiques de ces 3 dirutines est report dans le Tableau V.11..
Ces rsultats indiquent une variation du nombre de liaisons hydrogne intermolculaires
et une variation de la conformation, ce qui suggre que le type de pontage mis en jeu lors de
la formation des dimres de rutine a un impact non seulement sur la conformation de la
une ou deux liaisons hydrogne avec la rutine sont reprsentes en jaune.

3.1.1.2. Cas des dirutines

Afin danalyser le comportement des dimres de
riques ont t modlises dans des cellules cubiques de 40 de ct. Ces 3 structures
correspondent dune part, aux pontages les plus probables (O4-C6 et C6-C6), dautre part
la dirutine observe exprimentalement par RM
191

dirutine, m
pontage ther dfavorise les interactions solut/solvant, contrairement aux pontages C-C.

ais aussi sur les capacits des dimres interagir avec le solvant. Il semble quun

Figure V.14. Modlisation des liaisons hydrogne des dirutines lies en O4-C6 (a), C6-
C6 (b) et C2-C2 (c) avec leau, les molcules deau formant une ou deux liaisons
hydrogne avec le dimre sont reprsentes en jaune.
Tableau V.11. Analyse de la trajectoire des dirutines lies en O4-C6, C6-C6 et C2-C2.
Dirutine lie en :
O4-C6
a
C6-C6 C2-C2
Nombre de molcules deau dans la cellule 706 1222 1451
(a) (b) (c)

Distance rhamnose
1
/rhamnose
2
() [18.6 ; 23.5] [9.70 ; 17.3] [11.0 ; 14.3]
Forme Allonge Replie Replie
Liaisons intramolculaires -OH
5
---O
4
(quasi
permanente)
-sucre---sucre
- OH
5
---O
rhamnose
-OH
5
---O
4
(quasi
permanente)
-sucre---sucre
-OH
5
---O
rhamnose
- OH ---O
-OH
7 rhamnose
-OH
cycleB
---rhamnose
cycle B
5
---O
4
(quasi
permanente)
-sucre---sucre
-OH
cycle B
--- OH
cycle B
-OH ---rhamnose
Nombre 10 17 15
Sucres 6 8 12
Carbonyle 1 2 1
Ether 1 1 0
Hydroxyles cycle A 2 1 0
L
i
a
i
s
o
n
s

i
n
t
e
r
m
o
l
c
u
l
a
i
r
e
s

o
b
s
e
r
v
e
s

s
u
r

l
e
s

r
e
p
r
s
e
n
t
a
t
i
o
n
s

d
e
l
a

f
i
g
u
r
e

V
.
1
4
.

L
o
c
a
l
i
s
a
t
i
o
n

Hydroxyles cycle B 0 5 2

a
: dans le cas de la dirutine lie en O4-C6, 6 cycles de minimisation/dynamiques courtes ont t raliss
(minimisation une convergence de 0.001 kcal/mol, dynamique de 500, 500, 200, 6900, 7900 et 4400 fs).

192

3.1.1.3. Cas de lhxarutine

Afin de modliser lhxarutine forme par 5 pontages de type O4-C6, une cellule
cubique de 50 de ct a t cre. Pour limiter le temps de calcul, la cellule na pas t
remplie deau. Une couche deau de 15 dpaisseur a t ralise autour de lhexamre.
Lors de la dernire tape de dynamique, 1679 molcules deau entourent lhexamre.
Linstabilit du systme na pas permis dexplorer la totalit de lespace
conformationnel. Plusieurs tapes de minimisation/dynamique courte ont t ralises afin
dvaluer le comportement de lhexamre dans leau. Au cours de la dynamique,
lallongement de lhexamre varie de 32.86 36.10 .
Sur la conformation reprsente Figure V.16., 9 liaisons hydrogne intramolculaires
sont observes. Sur ces 9 liaisons, 6 liaisons correspondent aux liaisons de type OH
5
---O
4
, 2
liaisons sont tablies entre le cycle B et le glucose, et enfin une liaison sest forme entre 2
glucoses appartenant respectivement aux rsidus 2 et 4 dans lordre denchanement. De plus
94 liaisons hydrogne intermolculaires se sont tablies entre lhxarutine et leau. Sur ces 94
liaisons, 37 stablissent avec les units rham ose, 30 avec les motifs glucose, 20 avec les
ycles A et C et 7 avec le cycle B.
n
c
Lhxarutine expose ses motifs sucres leau, permettant ainsi la mise en place dun
rseau dense dinteractions avec le solvant. Ceci pourrait expliquer la forte solubilit observe
exprimentalement.

193

Figure V.15. Modlisation des liaisons hydrogne hxarutine/eau, les molcules deau
formant une ou deux liaisons hydrogne avec lhexamre sont reprsentes en jaune.

Aprs avoir valu les interactions solut/eau, nous nous sommes intresss dune part
la solubilit des monomres et des dimres dans un milieu de synthse (mthanol/eau), puis
dautre part, aux proprits de dispersion et dagrgation de ces molcules. Afin de simuler le
milieu de synthse, plusieurs molcules de monomres ou de dimres ont t places dans des
cellules de mthanol/eau, dans les proportions: 30 :70, v/v.
Les systmes raliss prsentant des carts nergtiques trs importants entre deux
conformations successives, des cycles de minimisation/dynamique courte ont t raliss afin
dobtenir la trajectoire la plus longue possible.

194

3.1.2. Etude des interactions dun mlange de rutine ou de dirutine dans un milieu
mthanol/eau
3.1.2.1. Etude du systme: quatre rutines dans un mlange mthanol/eau

rutines (a, b, c et d) ont t places dans une cellule cubique de 40 de ct, dans un
mlange m v. Lors de la dernire tape
e dynamique, la cellule contient 269 molcules de mthanol, 1411 molcules deau et 4
mol
ents relatifs
des m
ont indiques
Figur
Outre les liaisons hydrogne intramolculaires, des liaisons hydrogne intermolculaires
sont observables entre 3 rutines, im
cycle B et la fonction carbonyle dune rutine. Il semble donc que la stabilisation du systme
implique la fo termolculaires t le solvant : les rutines a,
b, c et d tablissent respectivement 4, 2, 1 et 3 liaisons hydrogne avec les molcules de
mthanol, et 4, 4, 7 et 1 avec les molcules deau (Figure V.16.). Le rapprochement des
rutines b, c e c le o le m ol linverse
de la rutine a. En revanche, leur rapprochement naltre pas leur capacit se lier leau.
La rutin e que 6 liaisons hydrogne avec le solvant
contre 8 liais thanol/eau. Ainsi, il apparat que la
prsence du solvant or avorise la solubilisation de la rutine. Ceci est
confirm par es exprimentales de solubilit de la rutine qui sont de 0.14 g/l dans
leau et 0.25 /70).

4
thanol/eau dans les proportions de synthse 30:70, v/
d
cules de rutine. Cette dernire dynamique a une trajectoire de 60 ps.
4 pseudo-atomes (A, B, C et D) ont t dfinis afin de suivre les mouvem
olcules au cours de la dynamique. Chaque pseudo-atome se trouve quidistance entre
la position C2 et la position C4. Les distances sparant les monomres s
e V.16.. Les rutines b, c et d se sont rapproches tout au long de la dynamique alors que
la rutine a sest loigne progressivement.
pliquant la fois les fonctions hydroxyles des sucres, du
rmation de liaisons in entre le solut e
t d diminue leur capacit interagir ave s m lcu s de than
e dans leau ne forme en moyenn
ons quand elle est isole dans un milieu m
ganique dans leau f
les mesur
g/l dans mthanol/eau (30
195

196

20.5
5.8
22.0
11.7

Figure V.16. Modlisation des interactions hydrogne tablies dans un mlange de 4 rutines
dans un milieu mthanol/eau (30/70, v : v). Les molcules deau formant une ou deux liaisons
hydrogne avec une rutine sont reprsentes en jaune et les molcules de mthanol formant
une liaison hydrogne avec une rutine en rouge. Les distances sparant les pseudo-atomes A,
B, C et D lquilibre sont indique en .

molcules de mthanol, 1343
molcules deau et 2 molcules de dirutine. Cette dernire dynamique a une trajectoire de 21
ps.
4 pseudo-atomes (A, B, C et D) ont t dfinis afin dvaluer lloignement des
molcules au cours de la dynamique. Chaque pseudo-atomes se trouve quidistance entre la
position C2 et la position C4 dune mme unit de rutine. Les distances lquilibre
sparant ces pseudo-atomes sont reportes Figure V.17..
3.1.2.2. Etude du systme: deux dirutines dans un mlange mthanol/eau

Pour simuler les interactions intermolculaires qui ont lieu dans le milieu ractionnel,
deux dirutines lies en C2-C2 ont t places dans une cellule cubique de 60 de ct. Lors
de la dernire tape de la dynamique, la cellule contient 257

197

8.1
14.2

Figure V.17. Modlisation des liaisons hydrogne tablies dans un mlange de 2 dirutines
dans un milieu mthanol/eau (30/70, v :v). Les molcules deau formant une ou deux liaisons
, C et D lquilibre sont indiques en .

A la stabilisation du systme, des liaisons hydrogne stablissent entre les 2 units de
dirutine, celles-ci venant sajouter aux liaisons hydrogne intramolculaires formes au sein
de chaque unit dimrique. Sur la conformation reprsente Figure V.17., une interaction
hydrogne OH
4
---OH
5
est tablie entre les 2 dirutines. 15 liaisons hydrogne sont formes
avec les molcules de mthanol (9 et 6 respectivement pour les 2 dirutines) et 43 avec les
molcules deau. Les liaisons formes avec des molcules de mthanol impliquent les
glucoses, les rhamnoses, les hydroxyles du cycle A, les hydroxyles du cycle B ainsi que le
groupement carbonyle, pour respectivement 7, 2, 3, 3 et 1 dentre elles. Les liaisons
hydrogne formes avec des molcules deau impliquent les rhamnoses, les glucoses, les
hydroxyles du cycle A, les hydroxyles du cycle B, le groupement carbonyle pour
respectivement 20, 8, 5, 9 et 1 dentre elles.
Le rapprochement des molcules de dirutine limite leur accessibilit au solvant en
favorisant les interactions solut/solut. Malgr cela, les interactions entre la dirutine et le
solvant sont nombreuses. Ceci suggre :
B

- S
dirutine
(mthanol/eau) > S
dirutine
(eau)
- S
dirutine
>S
rutine

Ces rsultats sont en accord avec les rsultats exprimentaux : S
oligomres
(eau) : 600 g/l >
S
rutine
(eau) : 0.14 g/l.

3.1.3. Interprtations structure/fonction et conclusions

Il apparat que le nombre de liaisons hydrogne intermolculaires tablies entre le solut
et les molcules de solvant est un bon indicateur de la solubilit (Tableau V.12.).
La structure de lhxarutine permet la mise en place dun rseau dense de liaisons
hydrogne, ce qui expliquerait la grande solubilit obtenue exprimentalement.
Aucun phnomne de dispersion des molcules oligomrises na t observ,
contrairement lagrgation des molcules de rutine.
Rutine
Tableau V.12. Impacts de loligomrisation de la rutine sur la solubilit et sur lagrgation.
Unit monomrique
Degr doligomrisation 1 2 6
Pontage
O
4

C
6

C
2

O
4
C
6
C
6
C
2
C
6
Liaison H dans leau par unit 6 5 8.5 7.5 15
monomrique
.7
Liaison H dans un milieu mthanol/eau
par unit monomrique
8 n.d. n.d. 14.5 n.d.
Solubilit dans leau, 20 C (g/l) 0.14 ~600
a
S
20
olu un milieu mthanol/eau,
C (g/l)
0.25 ~500
a
bilit dans
Distance entre molcule () 11 n.d. n.d. 11 n.d.
a : valeur dte rique ; n.d. : non dtermin

rmine sur le mlange oligom

198

3.2. Modl et de ses oligomres dans leau
o
des
mol
de ct
conte
ses fonctions au solvant.
Diffrentes liaisons hydrogne intramolculaires stablissent durant la dynamique :
- OH
7
---O
glucose

- OH
7
---OH
glucose

- OH
7
---O
pont osidique

- glucose---glucose

Des liaisons hydrogne intermolculaires se forment entre la molcule desculine et le
solvant, ce qui stabilise le systme (Figure V.18.). La majorit de ces liaisons stablissent
entre les groupements hydroxyles du glucose et des molcules deau. Par ailleurs, lhydroxyle
en position 7 est frquemment impliqu dans ce type dinteractions et plus rarement la
fonction catchole. Dans le cas de lesculine reprsente Figure V.18., 9 liaisons hydrogne
intermolculaires sont formes impliquant 8 molcules deau.
isation molculaire de lesculine
u dans un milieu mthanol/eau

Tout comme pour la rutine, lesculine et ses oligomres ont t places dans une cellule
contenant des molcules deau ou mthanol/eau, afin dexplorer les conformations
cules dans un solvant, d'tudier les interactions solut/solvant et dinterprter les
variations de solubilit observes exprimentalement.

3.2.1. Modlisation molculaire de lesculine et de ses oligomres dans leau
3.2.1.1. Cas de lesculine

Une molcule desculine a t place dans une cellule cubique de 40
nant, lors de la dernire tape de dynamique 300 K, 1370 molcules deau.
En raison de sa rigidit, lesculine expose lensemble de
199

200

Figure V.18. Modlisation des liaisons hydrogne esculine/eau, les molcules deau formant
une ou deux liaisons hydrogne avec lesculine sont reprsentes en jaune.

Le nombre de liaisons hydrogne formes dune part, entre la rutine et les molcules
deau (6 liaisons) et dautre part, entre lesculine et les molcules deau (9 liaisons) suggrent
une meilleure solubilit de lesculine. Ce rsultat est en accord avec les rsultats
exprimentaux de solubilit (S) : S
rutine
: 0.14 g/l ; S
esculine
: 3.70 g/l.

3.2.1.2. Cas des diesculines

Les deux types de pontages, les plus probables, O7-C4 et C4-C5 de la diesculine ont t
modliss (Figure V.19.). Deux cellules cubiques de 30 de ct ont t cres. Lensemble des
caractristiques de ces deux diesculines dans leau est indiqu dans le Tableau V.13. .


201

Figure V.19. Modlisation des liaisons hydrogne entre les diesculines lies en O7-C4 (a) et
C4-C5 (b) avec leau, les molcules deau formant une ou deux liaisons hydrogne avec le
dimre s
(a) (b)
ont reprsentes en jaune.

Tableau V.13. Analyse de la trajectoire des diesculines lies en O7-C4 et C4-C5.
Diesculine lie en :
O7-C4

C4-C5
Nombre de molcules deau dans la cellule 418 385
Distance glucose
1
/glucose
2
() [6.3 ; 11.1] [5.6 ; 10.5]
Liaisons intramolculaires -glucose---glucose
- OH
7
---glucose
-catchol---glucose
-glucose---glucose
- OH
7
---glucose
-catchol---glucose
(rare)
Nombre 21 22
Sucres 15 14
Fonction catchole 3 4
L
i
a
i
s
o
n
s

i
n
t
e
r
m
o
l
c
u
o
b
s
e
r
v
e
s

s
u
r

l
e
s

r
e
p
r
s
e
n
t
a
t
i
o
n
s

d
e

l
a

f
i
g
u
r
e

V
.
1
9
.

L
o
c
a
l
i
s
a
t
i
o
n

Hydroxyle en position 7 2 4
l
a
i
r
e
s

Selon ces rsultats, il apparat que le type de liaison mis en jeu lors de la formation des
diesculines a peu dimpact sur la structure et sur les interactions du dimre avec le solvant.


3.2.1.3. Cas du nonamre desculine

Pour modliser le nonamre desculine, form par 8 pontages de type O7-C4, une
cellule de dimension 40x60x50 a t cre. Afin de limiter le temps de calcul, la cellule na
pas t remplie deau. Une couche de 15 dpaisseur a t ralise autour du nonamre.
Lors de la dernire tape de la dynamique, 683 molcules deau entourent le nonamre.
Au cours de la dynamique de 200 ps, la distance sparant les glucoses (symboliss par
deux pseudo-atomes) des units desculine des extrmits du nonamre varie de 12.2 29.1
pour se stabiliser vers 19.2 .
4 liaisons hydrogne intramolculaires sont observes. Ces liaisons sont toutes tablies
entre groupements hydroxyles dun mme sucre sur les units 1, 2, 4, 5. 22 liaisons hydrogne
intermolculaires sont formes entre le nonamre et leau (Figure V.20.). Sur ces 22 liaisons,
2 impliquent les fonctions catcholes, 20 impliquent des groupements du glucose.
Ce nombre de liaisons hydrogne est peu lev. Ce rsultat semble contradictoire avec la
forte solubilit des oligomres constate exprimentalement.
202

Figure V.20. Modlisation des liaisons hydrogne nonamre desculine/eau, les molcules
deau formant une ou deux liaisons hydrogne avec le nonamre sont reprsentes en jaune.

203

3.2.2. Etude des interactions dun mlange de molcules desculine ou de
diesculine dans un milieu mthanol/eau
3.2.2.1. Etude du systme: quatre esculines dans un mlange mthanol/eau

Afin de modliser les interactions entre esculines au sein du mlange ractionnel, quatre
escul
s desculine a, b, c et d forment respectivement 2, 3, 2 et 1 liaisons
h
esculines. Les esculines a, b, c et d forment respectivement 9, 8, 5 et 9 liaisons hydrogne
avec des molc s avec le solvant nt intervenir aussi bien la partie sucre
que les 2 autres cycles de lesculine (Figure V.21.).
Ces rsultats suggrent une lgre amlioration de la solub d esculine dans un
mlange mthanol/eau par rapport leau. Ceci est confirm par les mesures de solubilit
exprimentales
culin
th l/e .96 g/l.

ines ont t places dans une cellule de dimension 60x40x40 , contenant, 138
molcules de mthanol et 725 molcules deau. Quatre cycles de minimisation/dynamique
trs courte de respectivement 100, 2400, 90 et 260 fs une convergence de 0.01 kcal/mol ont
t effectus. La dernire tape de minimisation est analyse ici.
Afin de caractriser les mouvements relatifs des molcules desculine, un pseudo-atome
a t dfini sur chaque monomre. Ce pseudo-atome est gal distance des atomes C4, O1
et O2. Chaque monomre est not respectivement a, b, c et d. Les distances lquilibre
sparant ces pseudo-atomes sont reportes Figure V.21.. Except les 3 liaisons hydrogne
intramolculaires, aucune liaison hydrogne nest observable ce stade entre les units
desculine. En revanche, un phnomne dempilement a t observ entre monomre (Figure
V.21.).
Les molcule
ydrogne avec des molcules de mthanol. Toutes ses liaisons font intervenir le glucose des
ules deau. Ces liaison fo
ilit e l
de lesculine : S
esculine
(eau)

:3.70 g/l < S
es e
(m ano au)

:5
204

205

13.1
11.1
6.4
5.8
3.6
4.1

Figure V.21. Modlisation des liaisons hydrogne tablies dans un mlange de 4 esculines
dans un milieu mthanol/eau (30/70, v :v). Les molcules deau formant une ou deux liaisons
B, C et D lquilibre sont indiques en .

3.2.2.2. Etude du systme: deux diesculines dans un mlange mthanol/eau

Afin de simuler les interactions intermolculaires dans le milieu ractionnel, deux
diesculines lies en O7-C4 ont t places dans une cellule cubique de 60 de ct. Lors de
la dernire tape de dynamique, la cellule contient 395 molcules de mthanol, 2073
molcules deau et 2 molcules de diesculines. Cette dernire dynamique a une trajectoire de
119 ps.

206
4 pseudo-atomes ont t dfinis afin dvaluer lloignement des molcules au cours de
dynamique. Chaque pseudo-atome se trouve quidistance entre la position C4, O1 et la
position O2 dune mme unit desculine. Les distances sparant ces pseudo-atomes
quilibre sont reportes Figure V.22..
A la stabilisation du systme, une liaison hydrogne intramolculaire est tablie sur
chacune des diesculines, celle-ci tant localise sur le glucose. Sur la conformation
reprsente Figure V.22., 9 liaisons hydrogne sont formes avec les molcules deau (3 et 4
spectivement pour les 2 diesculines) et aucune avec des molcules de mthanol. Ces liaisons
impliquent toutes les glucoses.

la
l
re

53.2
60.5

Figure V.22. Modlisation des liaisons hydrogne tablies dans un mlange de 2 diesculines
dans un milieu mthanol/eau (30/70, v :v). Vue zoome du systme. Les molcules deau
formant une ou deux liaisons hydrogne avec une diesculine sont reprsentes en jaune. Les
distances sparant les pseudo-atomes A, B, C et D lquilibre sont indiques en .

Ces rsultats suggrent :
- S
diesculine
(mthanol/eau) < S
diesculine
(ea
- S
diesculine
< S
esculine

Ces rsultats sont confirms par les mesures exprimentales : S
oligomres
(mthanol/eau) :
0.4 g/l < S
oligomres
(eau) : 700 g/l et S
oligomres
(mthanol/eau) : 0.4 g/l < S
esculine

(mthanol/eau) :5.96 g/l.
Les phnomnes dempilement constats pour lesculine ne sont pas observs pour la
diesculine.

u),

3.2.4. Interprtations structure/fon

Tout comme pour la rutine, il apparat que le nombre de liaisons hydrogne
intermolculaires tablies entre le solut et les molcules de solvant est un bon indicateur de
la sol
dans le modle ne correspond
pas celui tabli exprimentalement ; ii) le nombre de liaisons hydrogne nest pas un
indicateur suffisant de la solubilit. En effet, la gomtrie de la molcule (forme, volume,
distribution de la masse), la topologie (masse molculaire, branchement, flexibilit), les
caractristiques lectrostatiques (charge dun atome, surface des liaisons hydrogne) ainsi que
les caractristiques chimiques (polarisabilit, nergie des orbitales, enthalpie, entropie, Cp,
moment dipolaire, ) sont autant de paramtres pouvant aussi intervenir dans la prdiction de
la solubilit [216].
Tableau V.14. Impacts de loligomrisation de lesculine sur la solubilit et sur lagrgation.
Unit monomrique Esculine
ction et conclusions

ubilit (Tableau V.14.).
Nanmoins, une contradiction subsiste. Dans le cas du nonamre desculine, 22 liaisons
hydrogne intermolculaires ont t tablies entre la molcule et les molcules deau, soit
moins de 3 liaisons par unit desculine. Ceci devrait se traduire par une moindre solubilit
dans leau, or les donnes exprimentales indiquent une augmentation. Plusieurs raisons
peuvent tre lorigine de ce rsultat dont: i) le pontage utilis
Degr doligomrisation 1 2 9
Pontage

O
7
C
4

C
4
C
5

O
7
C
4

Liaison H dans leau par unit
monomrique
9 10.5 11 < 3
Liaison H dans un milieu mthanol/eau
par unit monomrique
11 4 n.d. n.d.
Solubilit dans leau, 20 C (g/l) 3.70 ~700
a
Solubilit dans un milieu mthanol/eau,
20 C (g/l)
5.96 ~0.4
a
Distance entre molcule () 9 55 n.d. n.d.
a : valeur dtermine sur le mlange oligomrique ; n.d. : non dtermin

207

Initialement, les esculines forment en moyenne 11 liaisons avec les molcules deau et
de mthanol, mais une fois dimrises, seules les liaisons hydrogne tablies avec des
molcules deau sont conserves. Ceci suggre que les molcules de diesculine ont moins
daffinit pour le mthanol que pour leau. Ce rsultat est en accord avec les mesures
exprimentales de solubilit des oligomres. De plus, il a t dmontr par RMN quau cours
de loligomrisation lenvironnement des molcules change. Au dpart, les molcules sont
entoures deau et de mthanol, puis progressivement, seule leau est dtecte.

Dans le cas de lesculine, un phnomne dempilement a pu tre dmontr, ce qui
corrobore les rsultats obtenus par RMN. Cet empilement nest pas observ dans le cas des
dimres desculine. Cette observation est en accord avec les mcanismes proposs par de
Desentis-Mendoza et al. [59] qui suggrent une diminution du potentiel dagrgation due
loligomrisation.
208

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Conclusions et Perspectives
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Ce travail a port sur ltude de la raction doligomrisation enzymatique de
flavonodes et de coumarines, en prsence de la laccase de Trametes versicolor. Cette tude a
pour but de comprendre les mcanismes ractionnels mis en jeu, didentifier et de
dterminer les facteurs clefs de cette raction et de quantifier leurs effets sur les performances
et la structure des oligomres, et enfin dvaluer les proprits de ces oligomres et dessayer
de dterminer la relation structure-activit de ces oligomres.
Cette tude a ncessit, au pralable, la mise au point dune plateforme de synthse en
rallle et danalyse en ligne par MALDI-TOF et SEC-UV. Les conditions optimales
danalyse par MALDI-TOF varient selon les molcules tudies, nous avons donc cherch le
type de matrice, le pourcentage si que les modes de dtection
et dionisation les plus appropri dans ce travail. Les conditions
optimales danalyse des oligomres de rutine sont : 3 l danalyte dilu deux fois dans
ACN/eau TFA 0.1 % (30 :70, v/v), 1l DHB mg/ml) dans ACN/eau TFA 0.1 % (30 :70,
v/v), et une dtection en mode reflectron positif. La validation de cette plateforme a mis en
vidence la sous-estimation de la masse moye e des oligomres par lanalyse par MALDI-
TOF, et sa sur-estimation par lanalyse par SEC-UV.
Du point de vue cintique, cette tude a dmontr que quel que soit le monomre utilis
(rutine ou esculine) et quel que soient les c ditions opratoires appliques (temprature,
pH, ) les masses molaires moyennes en poids des oligomres synthtiss ne dpassent pas
une valeur maximale variable selon la nature d ligomre. Dans le cas de loligomrisation
de la rutine, lI
M
des oligomres est limit 3.44 , ceci pourrait tre d un phnomne de
chlation de lenzyme par les oligomres form s, conduisant son inhibition. Dans le cas de
loligomrisation de lesculine, lI
M
des oligom res est limit 5, ceci serait d la moindre
ractivit des oligomres de haut poids molculaire. Ltude de limpact des conditions
actionnelles sur loligomrisation de la rutine a permis de constater quun faible pH (4 ou 5)
rmet lobtention doligomres haut poids molculaire, que laugmentation de la
temprature ractionnelle aboutit une diminution de la longueur des chanes et une
gmentation de la production doligomres et quenfin, laugmentation de la constante
dilectrique du co-solvant induit un accroissement de la production doligomres.
eu
pa
de solvant, le ratio de dpt ain
s pour les molcules tudies
(5
nn
on
e lo
r
pe
au
208

Du point de vue structurale, ltud I-TOF a permis de rvler la formation
r
la rutin

en place de liaisons tant C-C que C-O localises tout aussi bien sur la partie sucre que sur la
a
mati
mis
es
phnom dirutines lies en C2-C2.
Du point de vue de la caractrisation des proprits, une forte augmentation de la
solubilit dans leau a t observe tant sur les oligorutines, que sur les oligoesculines. Cette

revanch de
uli n
videnc mres
rits
cette m de
isse du
pouvoi evanche,
laugm n pontage
ans le
cas de ir
es
oligom
C rmis
cules
phnol me par les produits a t dmontre,
t de la
ts de
Kurisaw
e par MALD
dun simple pontage entre unit monomrique, allant jusquau degr doligomrisation 6 pou
e et 9 pour lesculine. Lanalyse par FTIR a mis en vidence la formation dun pontage
ther dans le cas des oligomres de rutine. Lanalyse par RMN a indiqu, dune part, la mise
partie phnolique des monomres de rutine et desculine. Dautre part, elle a rvl l
for on dun dimre de rutine li en C2-C2. Lapproche par modlisation molculaire a
per de corrler cette observation la forte ractivit des radicaux C2 , favorisant l
nes de couplage (C2
, C2
) engendrant la formation de
forte augmentation de la solubilit des oligorutines a t corrle la mise en place dun
rseau dense de liaison hydrognes, grce la conformation dplie prise par lhexamre. En
e, la solubilit dans un milieu mthanol/eau est diminue lors de loligomrisation
lesc ne. Lanalyse par RMN tout comme lanalyse par modlisation molculaire ont mis e
e un phnomne dempilement des molcules desculine, tandis que les oligo
sont disperss. En ce qui concerne les proprits antioxydantes, une diminution des prop
antiradicalaires par rapport au monomre a t observe dans le cas des oligorutines, alors que
me activit a t accrue par loligomrisation de lesculine. Quel que soit le type
pontage, lanalyse par modlisation molculaire des dimres de rutine prvoit une ba
r antiradicalaire, ce qui corrobore les donnes exprimentales. En r
entation du pouvoir antioxydant des oligomres desculine laisse supposer u
de type C-C ou C-O
glucose
daprs les rsultats obtenus par modlisation molculaire. D
la rutine comme de lesculine, loligomrisation a permis daugmenter leur pouvo
inhibiteur de la xanthine oxydase. Ceci peut tre imput au pouvoir chlatant accru d
res qui provoque linhibition de lenzyme.
ette tude a permis de confirmer certains travaux antrieurs mais a galement pe
dapprofondir les connaissances concernant loligomrisation enzymatique de mol
iques glycosyles. Ainsi, une inhibition de lenzy
ce qui corrobore les rsultats de Desentis-Mendoza et al. [59], leffet du pH e
concentration en solvant sur la Mw a t dmontr ce qui est en accord avec les rsulta
a et al. [28], un accroissement de la solubilit dans leau des oligomres de rutine en
209

com aison la rutine a t observ tout comme Kurisawa et al. [28] et enfin, une
tion de lactivit antiradicalaire des oligomres de rutine compar la rutine a t
par
diminu
outre
C2, la et
coumar sur les
act de la
constante dilectrique du solvant sur la quantit doligomres de rutine forme. Enfin, lun
permis

Perspectives
observe ce qui est en accord avec les observations de Desentis-Mendoza et al. [59]. En
cette tude a permis pour la premire fois la dtermination structurale dune dirutine en C2-
mise en vidence dune multitude de pontage de type C-C et C-O sur la partie sucre
sur la partie phnolique. De plus, pour la premire fois, la cintique doligomrisation dune
ine (lesculine) a t suivie et il a t mis en vidence limpact de la Mw
proprits antiradicalaires et dinhibition de la xanthine oxydase ainsi que limp
des cts novateur de cette tude et lapproche par modlisation molculaire qui nous a
dinterprter les rsultats exprimentaux.

C ant
de ces
B j t utilises
tures
m est
or e
L
tude,
L
valus au cours de ce travail. Ces informations peuvent tre exploites pour mettre au point
mo s
proprits cible.
ette tude a permis de dmontrer la formation de pontage de type C-C et C-O reli
les units monomriques, limpact des conditions ractionnelles sur la taille des oligomres
ainsi que leffet de cette taille sur les activits biologiques des oligomres synthtiss. A partir
rsultats un certain nombre de perspectives peuvent tre envisages.
ien que de nombreuses techniques de caractrisation structurale aient d
au cours de ce travail, elles nont pas permis de caractriser lensemble des struc
oligo riques. Pour affiner la caractrisation structurale des molcules synthtises, il
prim dial de dvelopper des outils spcifiques de caractrisation et probablement d
sparation de ces molcules.
effet de la masse des oligomres sur leurs proprits a pu tre valu au cours de cette
nanmoins dautres facteurs structuraux influencent ces proprits. Il serait notamment
intressant dvaluer limpact du type de pontage (C-C ou C-O) sur ces proprits.
es facteurs ractionnels influenant la production et la taille des oligomres ont pu tre
des des de conduite appropris afin dobtenir des oligomres avec des structures et de
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222

ANNEXES

ANNEXE 1

Investigations supplmentaires menes en RMN
A la suite de la mise au point et de loptimisation des procds de synthse et de
dtection par SEC-UV et MALDI-TOF, nous avons cherch identifier le type et la
localisation du pontage reliant les units monomriques. Pour ce faire, lanalyse par RMN a
t utilise. Le faible nombre danalyses RMN rpertories dans la bibliographie sur ltude
de mlanges oligomriques et la complexit du milieu ractionnel ont ncessit lutilisation
dun large panel de techniques RMN.

Initialement, une solution ractionnelle (mthanol/eau, 30/70, v:v, 20 C, 24 h) a t
lyophilise afin dtre analyse par RMN 300 MHz. Le spectre
1
H-RMN obtenu est
compos de 3 larges pics 0.8-1.3, 3.0-4.0, 4.4-5.0 ppm, tout comme observ par Kurisawa
et al. [28]. Afin dliminer tout problme de solubilit de lanalyte, trois solvants de
dissolution ont t tests : DMSO- d
6
, D
2
O, DMF- d
6
et la temprature a t ajuste 323 K.
Mais mme dans ces conditions, les trois mmes larges pics ont t observs. Afin de
rsoudre ce problme de rsolution, diffrentes techniques RMN ont t employes.

Dans un premier temps, un ensemble de filtrations tangentielles du milieu
ractionnel a t ralis, afin de limiter lhtrognit du milieu. Par une seule filtration
tangentielle sur une membrane de 3 KDa, le permat obtenu est enrichi en molcules
dimriques ce qui a permis lidentification dun dimre de rutine de type C2-C2 (la structure
ainsi que les dplacements chimiques de cette structure seront dtailles dans le chapitre
IV.1.). En revanche, la succession de filtrations tangentielles sur des membranes de porosit
dcroissantes (50, 8, 5, 3 KDa) na pas permis didentifier prcisment dautres structures. Il
apparat nanmoins que laccroissement de la taille des oligomres engendre une importante
variation de lenvironnement chimique des protons des molcules, ce qui provoque
llargissement des signaux (Figure 1.). Cet largissement la base des signaux serait d
une grande diversit dans le type et la localisation du pontage entre units monomriques.
223
Rfrences

Figu Spectre -RM 600 z cr de ili ct l f su
membranes de po d san 0, il ac l tenu
partir de loligomrisation d la ruti ar la laccase de Trametes versicolor
(3 U/m , dans un u m ol 30 :v, 20 C, 24 h).

Da n s t , n RMN par diffusion (DOSY) a t
entreprise, afin de sparer les spectres RMN des rent oligom M reusemen
omres ont des coefficients de diffusion tr
sparables par DO En ch oe en iff de cu an
rayon hydrodyna e, n vo s le n dy ue
rutine aux alentou 29 co n u ffi de ion .4 m

Da tr e s, une an pa N oli R ) a
envisage. Lanalyse par HRMAS du milieu ractionnel a permis de diminuer la largeur des
signaux (Figure 2.). En plus des pics de la structure dimrique identifie, un nouveau pic ainsi
quun massif de pics sont observs = 7.44 et 7.25 ppm. Nanmoins, la rsolution reste
insuffisante pour permettre la dtermination du type et de la localisation du pontage. La
largeur de la base des pics suggre nouveau une grande diversit denvironnements
chimiques des protons des molcules, suggrant une grande diversit de mode de pontage.

re 1. s
1
H N MH avec yoson du m eu ra ionne iltr r des
rosit crois te (5 8, 5 et 3 KDa). Le m ieu r tionne est ob
e ne (3 g/l), catalyse p
l) milie than /eau ( /70, v
ns u econd emps une a alyse
diff res. alheu t, les
olig op proches pour que leurs spectres soient
SY. revan e, le c ffici t de d usion s parti les t t reli leur
miqu ous a ns pu ituer rayo hydro namiq des oligomres de
rs de .8 ( rrespo dant n coe cient diffus de 8 .10
-11
.s ).
-1
ns un oisim temp alyse r RM du s de (H MAS t
224
Rfrences
225

Rfrences
225
Figure 2. Spectres
1
H-R 300 M ec so RMA ilieu ractionnel. Le milieu
ractionnel est obtenu partir de lol risatio la ruti g/l), c se par ccase
de Trametes versicolor l), dan ilieu nol/eau (30/70, v C, 2

Dans un quatrime temps, afin dobserver lapparition progressive des
oligomres, un suivi de la cintique doligomrisation de la rutine au sein de lappareil de
RMN a t entrepris. Po rantir la totale solu ion de tine a e pou inuer
la vitesse de la raction oncent s initi nt t s 0. e ruti 0.3
U/ml de laccase de Tra versico ors de ivi, s consommation de la rutine
a pu tre observe. Les signaux des ns aro ues d issent ressive (8H,
6H, 2H, 6H puis le 5H) alors que les protons des sucres sont conservs (Figure 3.). Ces
changements dans la zone aromatique peuvent tre attribus des phnomnes dempilements
provoqus par des interactions - inter- et/ou intra-molculaires
MN Hz av nde H S du m
igom n de ne (3 ataly la la
(3 U/m s un m mtha :v, 20 4 h).
ur ga bilisat la ru insi qu r dim

, les c ration ales o fixe 2 g/l d ne et
metes lor. L ce su eule la
proto matiq ispara prog ment
Rfrences
226

Figure 3. Suivi cintique in-situ de loligomrisation de la rutine par
1
H-RMN (spectromtre
600 MHz avec cryosonde). Loligomrisation de la rutine (0.2 g/l) a t catalyse par la
laccase de Trametes versicolor (0.3 U/ml) dans un milieu CD
3
OD/D
2
O (30:70, v/v), 293 K.
Un spectre est obtenu toute les 10 min 33 sec durant 14 h, et un spectre est reprsent toutes
les 1 h 46 min.

Pour finir, afin daccrotre la rsolution et daugmenter la concentration en
oligomres, 4 aliquots ont t prlevs du milieu ractionnel 30 minutes, 1 h, 2 h et 3 h.
Aprs dnaturation thermique de lenzyme et lyophilisation, ces 4 aliquots ont t analyss
par
1
H-RMN 600 MHz avec une cryosonde. Le spectre de laliquot prlev 30 minutes a
mis en vidence 3 doublets aux alentours de 7.2 ppm (les spectres obtenus ainsi que la
description des dplacements sont dtaills dans le chapitre IV.1.).

Lutilisation de ce large panel de techniques RMN a permis damliorer la rsolution
des spectres
1
H-RMN et ainsi daboutir, en partie, la rsolution structurale des oligomres
de rutine. Les rsultats pertinents de lanalyse RMN ont t dtaills dans la partie IV.1.

227

ANNEXE 2

Tableau. Comparaison des proprits lectroniques, nergtiques et structurales de la rutine et
de ses radicaux.

Radicaux phnoxy en position : Radicaux carbones en position:
Rutine
O3 O4 O7 O5 C2 C5 C6 C8 C6
H (kcal/mol) -630.08 -604.35 -609.11 -598.29
-
594.51
-537.06 -578.41 -578.30 -570.83 -572.85
E
HOMO
-8.82 -9.132 -9.259 -9.022 -8.873 -8.687 -9.173 -9.032 -8.868 -8.888
E
LUMO
-0.88 -1.125 -0.680 -1.141 -0.883 -1.128 -0.576 -1.017 -0.956 -0.941
Eg 7.94 8.007 8.579 7.881 7.990 7.559 8.597 8.015 7.912 7.947
E
HOMO
-8.81 -9.337 -9.358 -9.006 -8.859 -8.541 -9.072 -9.151 -8.863 -8.879
E
LUMO
-0.89 -1.266 -1.746 -2.119 -1.956 -2.347 -1.026 -0.532 -1.004 -1.046
Eg 7.92 8.071 7.612 6.887 6.903 6.054 8.046 8.619 7.859 7.833
E
HOMO
(eV) -8.81 -9.234 -9.308 -9.014 -8.866 -8.614 -9.122 -9.091 -8.865 -8.883
E
LUMO
(eV) -0.88 -1.195 -1.213 -1.630 -1.419 -1.737 -0.801 -0.774 -0.980 -0.993
Eg (eV) 7.93 8.039 8.095 7.384 7.466 6.877 8.321 8.316 7.885 7.889
Angle ()
153.75 153.97 157.66 154.25 154.65 146.33 155.87 179.59 153.85 153.707
-75.49 -75.52 -75.94 -77.13 -77.77 -77.31 -76.77 -81.02 -76.17 -76.36
-62.62 -63.53 -63.49 -63.15 -62.92 -65.90 -62.71 -54.44 -63.28 -63.23
-153.89 153.13 153.03 153.25 152.94 153.51 153.14 153.76 153.22 153.32
-77.67 -77.98 -77.95 -77.94 -78.45 -78.23 -78.07 -78.01 -78.03 -78.03
(eV) 4.845 5.214 5.260 5.322 5.142 5.175 3.461 4.932 4.922 4.938
(D) 3.40 6.164 6.502 5.334 2.785 2.906 4.245 3.972 4.205 3.445
POL (au) 54.75 54.29 54.29 54.29 54.29 54.29 54.29 54.29 54.29 54.29
A (
2
) 634.82 638.77 637.31 632.77 637.95 650.75 654.77 643.75 654.79 655.35
VOL (
3
) 1458.47 1451.45 1449.59 1449.93 145.51 1459.60 1454.10 1453.83 1452.86 1453.54
log P -1.61 -0.19 -0.19 -0.19 -0.19 -1.80 -1.80 -1.80 -1.80 -1.80
Q
1
-0.126 -0.127 -0.137 -0.127 -0.126 -0.086 -0.125 -0.129 -0.100 -0.124
QO
3
-gluc -0.178 -0.181 -0.182 -0.177 -0.180 -0.181 -0.181 -0.176 -0.178 -0.178
QO
4
-0.321 -0.311 -0.307 -0.288 -0.230 -0.327 -0.314 -0.313 -0.310 -0.312
QO
7
-0.239 -0.237 -0.237 -0.228 -0.239 -0.241 -0.238 -0.239 -0.214 -0.223
QO
5
-0.253 -0.251 -0.251 -0.247 -0.213 -0.255 -0.252 -0.252 -0.251 -0.227
QO
3
-0.245 -0.227 -0.219 -0.244 -0.246 -0.149 -0.236 -0.239 -0.244 -0.245
QO
4
-0.266 -0.199 -0.275 -0.264 -0.266 -0.205 -0.246 -0.257 -0.265 -0.265
QC
2
0.122 0.082 0.074 0.140 0.108 0.149 0,095 0.095 0.127 0.129
QC
3
-0.096 -0.06 -0.048 -0.109 -0.089 -0.119 -0,068 -0.044 -0.101 -0,100
Excs de charge C
2
-
C
3
0.218 0.142 0.122 0.249 0.197 0.268 0.163 0.139 0.228 0,229
H (kcal/mol) 25.73 20.97 31.79 35.57 93.02 51.67 51.78 59.25 57.23
HOMO
: nergie de lorbitale la plus haute occupe (eV), E
LUMO
vacante (eV), Eg : diffrence dnergie entre la LUMO et la HOMO, :lectrongativit (eV), : moment dipolaire (D), A : aire (
2
), VOL :
volume (
3
), POL : polarisabilit (
3
), Q : excs de charge, H (BDE) : variation denthalpie entre le radical et la molcule parent
(kcal/mol)

228

ANNEXE 3

Tableau. Comparaison des proprits lectroniques, nergtiques et structurales de lesculine
et de ses radicaux.
Radical
phnoxy en
position:
Radical carbone en position:
Esculine
O7 C3 C4 C5 C8
H (kcal/mol) -350.175 -321.74 -295.49 -298.343 -295.84 -292.37
EB
HOMO
B -9.142 -9.489 -9.80 -9.165 -9.213 -9.725
EB
LUMO
B -0.910 -0.638 -0.647 -1.073 -1.119 -0.643
Eg 8.2321 8.851 9.153 8.092 8.094 9.082
EB
HOMO
B -9.131 -10.02 -9.172 -9.731 -9.749 -9.297
EB
LUMO
B -0.922 -1.932 -0.828 -0.538 -0.492 -1.122
Eg 8.209 8.088 8.344 9.193 9.257 8.175
EB
HOMO
B (eV) -9.136 -9.754 -9.486 -9.448 -9.481 -9.511
EB
LUMO
B (eV) -0.916 -1.285 -0.737 -0.805 -0.805 -0.882
Eg (eV) 8.220 8.469 8.749 8.649 8.676 8.629
Angle ()
- 94.58 -167.57 -94.51 -95.50 -95.72 -93.16
- 96.32 -78.11 -96.25 -96.16 -100.59 -96.81
(eV) 5.026 5.519 5.111 5.126 5.143 5.196
(D) 7.821 7.367 7.657 6.867 6.943 8.849
POL (au) 30.39 29.94 29.93 29.93 29.93 29.93
A (P
2
P) 408.34 426.76 430.87 430.17 427.08 429.54
VOL (P
3
P) 866.17 865.07 859.70 860.55 863.89 861.34
log P -0.21 1.21 -0.20 -0.33 -0.40 -0.40
QB
1
B -0.187 -0.186 -0.195 -0.192 -0.183 -0.161
QOB
6
B-gluc -0.198 -0.148 -0.199 -0.199 -0.180 -0.197
QOB
2
B -0.287 -0.271 -0.249 -0.269 -0.277 -0.275
QOB
7
B -0.236 -0.221 -0.234 -0.234 -0.230 -0.210
QCB
3
B -0.244 -0.192 -0.126 -0.214 -0.218 -0.217
QCB
4
B -0.013 -0.063 -0.052 0.0124 -0.023 -0.036
Excs de charge CB
4
B-
CB
3
B
0.231 0.129 0.074 0.2264 0.195 0.181
H (kcal/mol) 28.43 54,68 51.83 54.33 57.80
H: enthalpie de formation (kcal/mol), EB
HOMO
B: nergie de lorbitale la plus haute occupe (eV), EB
LUMO
B: nergie de lorbitale la plus basse
vacante (eV), Eg : diffrence dnergie entre la LUMO et la HOMO, :lectrongativit (eV), : moment dipolaire (D), A : aire (P
2
P), VOL :
volume (P
3
P), POL : polarisabilit (P
3
P), Q : excs de charge, H (BDE) : variation denthalpie entre le radical et la molcule parent
(kcal/mol)

Titre : Synthse enzymatique, modlisation molculaire et caractrisation doligomres
de flavonodes.

URsum:U Ce travail a pour objectif de mettre au point un procd doligomrisation de rutine
et desculine par la laccase de Trametes versicolor. Un procd de synthse en parallle et
danalyse en ligne par SEC-UV et par MALDI-TOF a t mis au point. Lanalyse par
MALDI-TOF a rvl la formation dun simple pontage, allant jusquau degr
doligomrisation 6 pour la rutine et 9 pour lesculine. Un pontage par liaison ther a t
observ par FTIR dans le cas des oligorutines. Lanalyse par RMN a dmontr la mise en
place de liaisons tant C-C que C-O localises sur la partie phnolique et la partie sucre des
monomres.
De faibles pH et tempratures favorisent lallongement de la chane, alors que laugmentation
de la constante dilectrique du solvant ou de la temprature augmente la production des
oligomres de rutine. La limitation de la masse de ces oligomres serait due une inhibition
de lenzyme, provoque par les capacits chlatantes des oligomres.
Une diminution du pouvoir antioxydant et une augmentation du pouvoir inhibiteur de la
xanthine oxydase ont pu tre observes lors de laccroissement de la masse des oligomres de
rutine. Ces deux activits sont amliores lors de laccroissement de la masse des oligomres
desculine. Pour ces deux types doligomres, la solubilit dans leau est fortement accrue.
Dans le cas des oligorutines, cette forte augmentation a t corrle la mise en place dun
rseau dense de liaisons hydrogne observ par modlisation molculaire. Globalement,
lapproche par modlisation molculaire dans le vide et dans le solvant a permis de dgager
des relations structure-activit, reliant notamment le nombre de liaisons hydrogne la
solubilit.

UMots cls:U flavonode, coumarine, oligomrisation, laccase de Trametes versicolor, MALDI-
TOF, RMN, pouvoir antioxydant, solubilit, modlisation molculaire.

UAbstract:U The aim of this work is the elaboration of rutin and esculin oligomerization process
by the laccase from Trametes versicolor. A parallel synthesis process and on-line analysis of
reaction media by SEC-UV and MALDI-TOF have been elaborated. The MALDI-TOF
analysis has revealed the formation of simple bridges between rutin and esculin units, up to
degree of oligomerization of 6 and 9 respectively. An ether bond has been observed by FTIR
spectrometry for the rutin oligomers. Finally, the NMR analysis has revealed the formation of
C-C and C-O bridges both on phenolic and the sugar parts of the flavonoids.
At low pH and temperature, the elongation of the chain is favored, whereas increasing the
dielectric constant of the solvent or the temperature favors the production of rutin oligomers.
The limitation of oligomers mass is explained by the inhibition of the enzyme, probably due
to the highest chelation properties of oligomers.
In the case of oligorutin, a decrease of antiradical activity and an increase of xanthine oxidase
inhibitory activity have been observed when the oligomers molecular mass increases. In the
case of esculin oligomers, these two activities increase with the increase of the oligomers
mass. For these two types of oligomers, the water solubility is considerably increased. For the
oligorutins, this augmentation has been correlated to a dense network of H-bonds, which has
been demonstrated by molecular modeling. Globally, the molecular modeling approach in
vacuum and in solvent has allowed to establish structure-activity relationship.

UKey words:U flavonoid, coumarin, oligomerization, laccase from Trametes versicolor,
MALDI-TOF, NMR, antioxidant activity, solubility, molecular modeling

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AVERTISSEMENT

Ce document est le fruit dun long travail approuv par le jury de

: La propagation est une tape rapide. La

X. Le plus souvent, cette raction provoque lactivation de lagent de transfert, qui

(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) (Figure II.2.).

). In water, rutin show

olculaires varient en fonction de la conformation, mais la liaison hydrogne OH

. Cette tude a galement dmontr que le radical C2

est le plus ractif.

C2-C2. Ceci expliquerait la prsence du

, , ce qui peut expliquer

ur ga bilisat la ru insi qu r dim

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