Farmacia Soldani Ch. Test - Antiox Crema - 2013

Universit Degli Studi Di Ferrara
Via Luigi Borsari, 46 44121 Ferrara

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Questo report valido elettronicamente, perch costituisce copia esatta controllata e firmata del certificato di analisi
originale, conservato in accordo alle procedure di Norme di Buona Prassi di Laboratorio UNIFE.

REPORT CHALLENGE TEST METODO ISO 11930:2012

Valutazione in vitro della stabilit microbiologica di un prodotto cosmetico
in base al metodo ISO 11930:2012, secondo il Regolamento 1223/2009
According the European Regulation 1223/2009 the evaluation of antimicrobial
preservation in cosmetic products by the method ISO 11930:2012.

PRODOTTO / PRODUCT:

ANTIOX CREMA

COMMITTENTE / CUSTOMER:

AMBROSIALAB S.R.L.
via Mortara 171 - 44121 Ferrara

Data report: 25/07/2013 / Date: July 25
th
2013




CHALLENGE TEST: METODO DELLEFFICACIA PRESERVANTE
PRESERVATIVE EFFICACY METHOD ISO 11930:2012 - REG. 1223/2009

PREMESSA

In base al Regolamento Europeo 1223/2009 la
valutazione in vitro della stabilit microbiologica di
un prodotto cosmetico effettuato secondo la norma
ISO (International Organization for Standardization),
applicando il metodo ISO 11930:2012.

Questa norma ISO (International Organization for
Standardization) utilizzata per la valutazione
complessiva della protezione antimicrobica di un
cosmetico, che comprende:
-le caratteristiche chimiche del sistema conservante;
-le caratteristiche della formulazione:
-il design del packaging;
- il processo di fabbricazione (norme GMP).

1-SCOPO DEL TEST

Verificare nel tempo la stabilit microbiologica di un
cosmetico lo stoccaggio e luso.

Il test prevede la contaminazione del prodotto con
microrganismi di diversa specie e la successiva
valutazione della variazione di carica microbica
mediante il conteggio in piastra del numero dei germi
vivi ad intervalli di tempo regolari per un periodo di 28
giorni.

La capacit di difesa del prodotto cosmetico
dallaggressione microbica viene verificata in base
allosservazione della riduzione di carica microbica
(per ciascun ceppo microbico in esame) entro un certo
intervallo di tempo, secondo i criteri di accettabilit
della norma ISO 11930:2012.

2-FASI DEL CHALLENGE TEST

Le fasi procedurali consistono in:

! Conta microbica preliminare sui campioni da
esaminare.
! Preparazione dei microrganismi per linoculo.
! Inoculo dei campioni.
! Controlli ad intervalli prestabiliti della
sopravvivenza dei microrganismi.
! Valutazione dei risultati.
FOREWORD

According to the European Regulation 1223/2009
evaluation "in vitro" microbiological stability of a
cosmetic is carried out in accordance with ISO
(International Organization for Standardization) by the
method ISO 11930:2012.

This ISO (International Organization for
Standardization) is to be used in the overall
evaluation of the antimicrobial protection of a cosmetic
product, which comprises:

-chemical preservation;
-Inherent characteristics of the formulation:
-package design;
-manufacturing process (GMP).

1-PURPOSE OF THE TEST

Checking the microbiological stability of the cosmetic
product (storage and use) over time.

The test is carried out by contaminating the product
with microorganisms from several species, and by
subsequently assessing the change in the microbial
load by plate counting the number of live germs after
pre-determined time spans.

The cosmetic formulations capacity of defending
against microbial attack is verified based on the
observation of the reduction of the count viable total
(for each test microbial strain) within a given time
span, according to the criteria of acceptability
emanated by ISO 11930:2012.

2-CHALLENGE TEST STEPS

Challenge test can be carried out by following different
methodological procedures, however its procedure
could be summarized in:

! Preliminary microbial count on test samples.
! Preparation of microorganisms for the inoculum.
! Inoculation of samples.
! Check of microorganism survival at pre-determined
intervals.
! Evaluation of the results.




3-METODO ISO 11930:2012
TEST DI EFFICACIA DEL PRESERVANTE

La norma ISO (International Organization for
Standardization) 11930:2012, descrive come eseguire
le analisi microbiologiche per la valutazione
dellefficacia microbicida del sistema conservante di
un cosmetico, sottoposto ad una contaminazione
microbica in vitro.

3.1-MATERIALI E METODI.
3-METHOD ISO 11930:2012
PRESERVATION EFFICACY TEST

Cosmetics Microbiology.
Evaluation of the antimicrobial protection of a
cosmetic product (ISO 11930:2012)

3.1-MATERIALS AND METHODS

Microrganismi utilizzati ATCC / ATCC microorganisms for antibacterial testing:

Staphylococcus aureus (Gram+/ Bacteria Gram positive) ATCC* 6538
Pseudomonas aeruginosa (Gram- / Bacteria Gram negative) ATCC* 9027
Escherichia coli (Gram- / Bacteria Gram negative) ATCC* 8739
Candida albicans (Lievito / Yeast) ATCC* 10231
Aspergillus brasiliensis (Muffa / Molds) ATCC* 16404

*ATCC (American Type Collection Control)

Entit dellinoculo microbico:

La concentrazione dellinoculo (tempo zero : T0) deve
essere compresa tra 10
5
e 10
6
Unit Formante Colonia
[UFC (microrganismi vitali)] / gr di prodotto.
Batteri: 10
6
ufc/gr.
Miceti: 10
5
ufc/gr.

Diluente: soluzione Ringer (soluzione fisiologica)

Neutralizzante appropriato al test antimicrobico:
Eugon LT 100 liquid broth.

Terreni di coltura

! Tryptic Soy Broth (TSB) per la preparazione delle
sospensioni microbiche dei ceppi standard utilizzati

! Tryptic Soy Agar (TSA) per i batteri.

! Sabouraud Dextrose Agar (SDA) + CFL per
Candida albicans.

! Potato Dextose Agar per Aspergillus brasiliensis

Inoculum concentration at T
0
:

The inoculum concentration (Time 0: T
0
) should be
between 10
5
and 10
6
Colony-forming units [CFU (count
viable total) ]/ gr. of the product.

For bacteria : the bacterial inoculum of 10
6
ufc/gr.
For fungi (Yeasts and Molds) :
the fungal inoculum of 10
5
ufc/gr..

Diluent: Ringer solution

Neutralizer: Eugon LT 100 liquid broth
Neutralizing Broth should inactive the preservative and
allow for unrestrained microbial growth.

Medium:

! Tryptic Soy Broth (TSB) for the vitality of the
microbial suspensions ATCC.

! Tryptic Soy Agar (TSA) for bacteria

! Sabouraud Dextrose Agar (SDA) + CFL for
Candida albicans.

! Potato Dextose Agar for Aspergillus brasiliensis




Tecnica analitica:

Si utilizza per il metodo di semina in superficie in
piastra Petri.
Il prodotto di prova inoculato viene conservato a
temperatura ambiente.

Tempo di verifica del Challenge test

Il tempo di verifica per ogni campione e per ogni ceppo
standard corrisponde al momento dellinoculazione del
microrganismo (tempo 0=T
0
) e dopo 7, 14 e 28 giorni,
per verificare labbattimento totale dellinoculo
iniziale.

Espressione dei risultati

Nel certificato di analisi i risultati sono espressi in ufc
(unit formanti colonia) / gr per ogni microrganismo in
funzione degi intervalli di tempo prestabiliti.

4-CRITERI DI ACCETTABILIT:
CRITERIO A - B

Il prodotto in esame deve presentare attivit inibente
nei confronti dei microrganismi utilizzati secondo i
criteri di accettabilit del metodo ISO 11930:2012.

Il metodo prevede i seguenti criteri per la valutazione
dell'efficacia del sistema di conservazione:
Analytical Technique

Plate-count method: spreading plate in duplicate using
medium agar. A neutralizer is incorporated the plated
agar when recovering bacteria by streaking plates.
The inoculated samples are incubated at room
temperature.

Evaluation of test time

The total incubation time of the sample is 28 days and
the controls for the verification of the possible
reduction of microorganisms by the preserving system
are performed after 7, 14 and 28 days from the
inoculation.

Expression of the results.

In the certificate of analysis shows the values cfu
(colony forming units) / g for each micro-organism as a
function of the predetermined time intervals.

4-ACCEPTANCE CRITERIA:
CRITERION A and B

The product was tested for the preservative efficacy
testing against the microorganisms used according to
the criteria of acceptability method ISO 11930:2012.

The method provides the following criteria for the
evaluation of the efficacy of the preserving system:
TABLE 1: Log reduction value (R
x
= log N
0
-Log N
x
) required
a
Microorganisms: Sampling Time
Limit of acceptability
METHOD ISO 11930
After
7 days
After
14 days
After
28 days

BACTERIA (A Criteria) !3 !3 and NI
b
!3 and NI
b
ACCEPTABLE
YEASTS: Candida albicans (A Criteria) !1 !1 and NI
b
!1 and NI
b
ACCEPTABLE
MOLDS : Aspergillus brasiliensis (A Criteria) - !0
c
!1and NI
b
ACCEPTABLE

BACTERIA (B Criteria) Not performed >3

!3 and NI
b
ACCEPTABLE
YEASTS: Candida albicans (B Criteria) Not performed !1 !1 and NI
b
ACCEPTABLE
MOLDS : Aspergillus brasiliensis (B Criteria) - !0
c
!1and NI
b
ACCEPTABLE

a: in this test, on acceptable range of deviation of 06 log is accepted
b: NI no increase in the count from the previous contact time
c: R
x
- 0 when lg N
0
-lg N
x
(no increase from the initial count) R:Reduction / Riduzione
N
0
= number of microorganisms inoculated at time T
0
N
x
= number of surviving microorganisms at each sampling time T
x




I criteri di interpretazione sono:

Criterio A :
dopo 7 giorni: riduzione di almeno 3 logaritmi per i
batteri e almeno 1 logaritmo di Candida albicans;

batteri (senza alcun aumento rispetto a quello
precedente), almeno 1 logaritmo per Candida albicans
(senza alcun aumento rispetto a quello precedente) e
nessun incremento rispetto tempo zero per Aspergillus
brasiliensis;

precedente), almeno 1 logaritmo per Candida albicans
(senza alcun aumento rispetto a quello precedente) e
almeno 1 logaritmo Aspergillus brasiliensis.

Criterio B:

batteri, almeno 1 logaritmo per Candida albicans e
nessun aumento rispetto al tempo zero per Aspergillus
brasiliensis;

precedente), di almeno 1 logaritmo per Candida
albicans (un aumento rispetto a quello precedente) e
nessun aumento per Aspergillus brasiliensis;

Conformit al criterio A:

il rischio microbiologico accettabile:
il prodotto cosmetico considerato protetto contro la
proliferazione microbica e non necessario considerare
altri fattori che sono indipendenti dal la formulazione.

Conformit al criterio B:

il rischio microbiologico accettabile, ma la
valutazione del rischio microbiologico dovr prendere
in considerazione anche i fattori di controllo
indipendenti dalla formulazione, quali le
caratteristiche del packaging , per ridurre il rischio
microbiologico.

The criteria for interpretation are:

Criterion A is assigned if obtained results satisfy at the
same time all the conditions reported below:
after 7 days: reduction of at least 3 logarithms for the
bacteria and at least 1 logarithm for Candida albicans;

bacteria (without any increase with respect to the
previous time), at least 1 logarithm for Candida
albicans (without any increase with respect to the
previous time) and no increase with respect to time
zero for Aspergillus brasiliensis;

previous time), at least 1 logarithm for Candida
albicans (without any increase with respect to the
previous time) and at least 1 logarithm for Aspergillus
brasiliensis

Criterion B is assigned if the obtained results satisfy at
the same time all the conditions reported below:

bacteria, at least 1 logarithm for Candida albicans and
no increase with respect to time zero for Aspergillus
brasiliensis

previous time), of at least 1 logarithm for Candida
albicans (any increase with respect to the previous
time) and no increase for Aspergillus brasiliensis

If at the end of the challenge test the sample is in
accordance with the A criterio:
the microbiological risk is acceptable:
the cosmetic product is considered protected against
the microbial proliferation and it is not necessary to
consider other factors that are independent from the
formulation.

If at the end of the challenge test the sample is in
accordance with the B criterion:
the microbiological risk is acceptable, whereby the
level of protection is acceptable if the risk analysis
demonstrates the existence of control factors not
related to the formulation, such as the characteristics
of the packaging, to reduce the microbiological risk.




Se al termine del test sfida il campione non soddisfa n
l'una n i criteri B (criterio no A no B), la valutazione
antimicrobica del prodotto dovr essere valutato
considerando esclusivamente la stima del rischio
microbiologico (prodotto confezionato in mono-dose,
nel rispetto delle norme di buona prassi di produzione
(GMP), per garantire la qualit microbiologica del
prodotto finito.

La sicurezza microbiologica di un prodotto
cosmetico basata sulla combinazione di diversi
fattori, non solo basati ai risultati del Challenge
test, ma anche alla formulazione dei prodotti, alle
condizioni di utilizzo e al tipo di confezione che li
contiene, alla modalit di produzione e di
confezionamento in conformit alle norme di
buona fabbricazione (GMP).

If at the end of the challenge test the sample does not
satisfy neither the A nor the B criteria:
the antimicrobial evaluation of the product will have
to be evaluated considering exclusively the estimation
of the microbiological risk ( a single-dose product and
on condition that the microbiological quality of this
product is guaranteed at the moment of the production
(GMP).

The microbiological safety of a cosmetic product is
based on a combination of several factors, not only
based on the results of the Challenge test, but also to
the formulation of the products under the conditions of
use and the type of packaging that contains them, the
mode of production and packaging in accordance with
good manufacturing practice (GMP).
5-BIBLIOGRAFIA

" Regolamento (CE) 1223/2009: regolamento
sui cosmetici, approvato dal Parlamento europeo e dal
Consiglio, allo scopo di armonizzare le disposizioni gi
esistenti in materia (Direttiva Europea 76/768/CEE e
succ. mod.); Gazzetta Ufficiale dellUnione europea:
22 dicembre 2009.
" Linee guida COLIPA sui requisiti del
documento informativo Product Information File
(PIF) 15 dicembre 2011.
" Norma ISO (International Organization for
Standardization) 11930:2012.

5-BIBLIOGRAPHY:
" Regulation (EC) No 1223/2009 (the Cosmetic
Products Regulation), replaced the European Union
(EU) Cosmetics Directive 76/768/EEC, which
harmonizes and simplifies the cosmetics regulations
across the EU member states by Product Information
File (PIF).
" COLIPA Guidelines Product Information File
(PIF)- December 15
th
2011.
" ISO (International Organization for
Standardization) 11930:2012.




CERTIFICATO DI ANALISI:
Certificate of analysis: Challenge test ISO 11930:2012

COMMITTENTE / CUSTOMER:
AMBROSIALAB S.R.L.
via Mortara 171 - 44121 Ferrara

Data ricevimento campione: 21/06/2013

Periodo di Analisi:
Data inizio del test: 24/06/2013 Data fine test 19/07/2013.
Date of testing: 2013-06-24 End date test: 2013-07-19.

PRODOTTO / PRODUCT:
ANTIOX CREMA

Microrganismi/ Microorganisms test T
0
inoculum

T
2 gg.
T
7 gg.
T
14 gg.
T
28 gg.

Stafilococcus aureus ATCC 6538 1,9x10
6
<10 <10 <10 <10
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 2,5x10
6
1,0x10
3
<10 <10 <10
Escherichia coli ATCC 8739 2,3x10
6
<10 <10 <10 <10
Candida albicans ATCC 10231 1,6x10
5
1,0x10
4
<10 <10 <10
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 1,8x10
5
<10 <10 <10 <10

I dati esprimono le unit formanti colonia (ufc) relative ad 1 gr di prodotto; /
The data express the colony forming units [cfu] relative to 1 g of product;
T= intervallo di tempo di analisi. / T= time of analysis.
TVC= Total Vital Count prima dellesecuzione del Challenge test= <10 cfu/gr. /
TVC [Total Vital Count] before the execution of the test.=<10 cfu/g.

TABELLA RIDUZIONE LOG MICROBICA /
LOG REDUCTION OF BACTERIA AND MOLDS TABLE:

Microrganismi test/ Microorganisms test RIDUZIONE LOG / LOG REDUCTION
T
2gg.
T
7gg.
T
14gg.
T
28gg.
Criterio A di Accettabilit
Stafilococcus aureus ATCC 6538 ! 6 Log NI NI NI
ACCETTABILE / ACCEPTABLE
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ! 3 Log 6 Log NI NI
Escherichia coli ATCC 8739 ! 6 Log NI NI NI
Candida albicans ATCC 10231 ! 1 Log 5 Log NI NI
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 ! 5 Log NI NI NI

I dati esprimono la riduzione microbica in LOG in funzione del tempo. (NI=nessun incremento) /
The data express the LOG reduction of inoculated germs relative to established control intervals.
(NI: No Increase).

th
2013




GRAFICO/GRAFIC

PRODOTTO / PRODUCT:
ANTIOX CREMA

0,00E+00
1,00E+00
2,00E+00
3,00E+00
4,00E+00
5,00E+00
6,00E+00
7,00E+00
T0 T 2 gg T 7 gg T 14 gg T 28 gg
Tempo (giorni) / Time (days)
L
O
G
:

c
f
u
/
g
r

(
E
=
v
a
l
o
r
e

e
s
p
o
n
e
n
z
i
a
l
e
)
ST
PS
EC
CA
ASP

Variazione logaritmica della carica microbica rispetto alla carica inoculata. / Logarithmic variation
of microbial load in the inoculated sample.

LEGENDA:

LOG cfu/gr:
unit formanti colonia relative ad 1 gr o ml di prodotto espresse in valore logaritmico (numero
scientifico E = esponenziale) / colony forming units relative to a gram (g) of product.

Tempo di esecuzione / T= time of analysis.:

T
0.=
tempo subito dopo linoculo del campione / microbial titer in the inoculated sample
T
2 g.=
tempo dopo 2 giorni dallinoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 2 days;
T
7 g.=
T
14 g.=
T
28 g.=
tempo dopo 28 giorni dallinoculo iniziale del microrganismo / microbial titer at 28 days.

th
2013




CONCLUSIONI / CONCLUSIONS

In base ai risultati ottenuti il prodotto cosmetico conforme al criterio A: il rischio microbiologico
accettabile, ed in generale, si riscontra il seguente comportamento: / According to the obtained
results the cosmetic product complies with the criterion A: the microbiological risk is acceptable,
and in general, we find the following behavior:

Riduzione batterica / Bacterial reduction:

Gram + : Riduzione inoculo entro 2 giorni / Reduction of the inoculum within 2 days
Staphylococcus aureus
Gram - : Riduzione inoculo entro 2 giorni / Reduction of the inoculum within 2 days
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa :
Riduzione inoculo entro 7 giorni / Reduction of the inoculum within 7 days

Riduzione micetica / Fungal Reduction:

Candida albicans : Riduzione inoculo entro 7 giorni / Reduction of the inoculum within 7 days
Aspergillus brasiliensis :
Riduzione inoculo entro 2 giorni / Reduction of the inoculum within 2 days

Il sistema preservante, secondo i criteri di valutazione raccomandati dal metodo ISO 11930:2012
(REG. 1223/2009), del cosmetico esaminato denominato: / According to the assessment criteria
recommended by the ISO 11930:2012 (European Regulation 1223/2009), the preservative system of
the test cosmetic product called:

AMBROSIALAB SRL

ANTIOX CREMA

conforme al criterio A e risulta ACCETTABILE, in quanto il sistema conservante si dimostra
efficace nei confronti dei microrganismi di prova, / in conforming to the criterion A and is
ACCEPTABLE, and the preservative system shows efficacy against test microorganisms.

th
2013

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