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Biotecnolgica PRACTICA 5 AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS

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INTRODUCCIN La fotosntesis es el proceso por el cual las plantas convierten la energa luminosa en energa qumica. La siguiente ecuacin: 6 CO2 + 12 H2O C6 H12 O6 + 6 O2 + 6 H2O resume el proceso, pero da pocos detalles sobre su complejidad. Hay realmente 2 grupos de reacciones, las denominadas de la fase luminosa y las de la denominada fase oscura. Los productos de las reacciones de la "fase luminosa" son el oxgeno molecular, los transportadores de electrones reducidos (NADPH) y el ATP. El ATP y los transportadores reducidos se usan en las reacciones de la fase oscura para convertir el dixido de carbono en carbohidratos. La reaccin de Hill es una fase importante de las reacciones de la "fase luminosa" en la que los electrones son transportados del agua a un aceptor de electrones en presencia de luz y cloroplastos. El objetivo de esta prctica es seguir la velocidad de la reaccin de Hill usando cloroplastos aislados. Estudiaremos adems el efecto de un inhibidor. REACCIONES LUMINOSAS DE LA FOTOSINTESIS Todos los componentes que participan en las reacciones de la fase luminosa se localizan en las membranas de los tilacoides de los cloroplastos, mientras que los enzimas de la fase oscura se localizan en el estroma. Figura 1. Esquema de los cloroplastos.

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Biologa Celular II P.P de Ing. Biotecnolgica Figura 2. Esquema de la fase luminosa de la fotosntesis. Fotofosforilacin no cclica.

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La figura 2 representa el flujo de electrones en las reacciones luminosas, mientras la altura de los distintos compuestos indica los niveles energticos relativos de los electrones en cada punto de la ruta. En el centro de las distintas series de reacciones hay dos fotosistemas denominados Fotosistema II (PS II) y Fotosistema I (PS I). Cada fotosistema es un conjunto formado por clorofilas a y b, carotenoides, citocromos y otros transportadores de electrones. Cada fotosistema tambin contiene una molcula de clorofila a especial que absorbe a un mximo de 680 nm en el PS II y a 700 nm en el PS I nm. Estas molculas especiales de clorofila se denominan P680 y P700 respectivamente. Los electrones excitados en P680 del PS II son transferidos a la plastoquinona y los de la P700 se transfieren a la ferredoxina. Los dos fotosistemas estn unidos por una cadena transportadora de electrones. A medida que los citocromos y otros transportadores de electrones de esta cadena se reducen y oxidan sucesivamente, parte de la energa se acopla a la sntesis de ATP. Los electrones liberados por P700 (en PS I) pasan a travs de otra cadena transportadora de electrones hasta el NADP+. Existe adems una tercera transferencia de electrones, concretamente del agua a la forma oxidada del P680 en el PS II. En un proceso denominado fotolisis, el agua se hidroliza: se descompone en protones, oxgeno y electrones. Estos electrones pasan mediante una corta cadena de transporte de electronesa la P680. El flujo de electrones del agua al NADP+ se denomina ruta no cclica (o esquema Z) puesto que los electrones empiezan en un compuesto (agua) y terminan en otro (NADP+). La sntesis de ATP a travs de esta ruta se denomina fotofosforilacin nocclica. Los productos de la ruta no cclica de las reacciones luminosas son el oxgeno molecular, transportadores de electrones reducidos (NADPH + H+) y ATP. El ATP tambin se produce cuando los electrones siguen una ruta cclica, como se indica en la figura 3. Esta ruta implica el PS I y transportadores de electrones de la ruta principal de transporte de electrones. La sntesis de ATP a travs de esta va se denomina: fotofosforilacin cclica.

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Esquema de la fotofosforilacin cclica

Para estudiar estas reacciones se purifican los cloroplastos en un gradiente de densidad:

Al girar los tubos se produce una fuerza que se conoce como fuerza centrfuga relativa RCF que se mide en x g (veces la fuerza de la gravedad). Los rotores de las centrfugas giran y esa velocidad se mide en RPM (revoluciones por minuto). Influye tambin en la fuerza el radio de giro: r. Para medir los g que se producen se utiliza la siguiente frmula:

De esta forma podemos conocer la fuerza que se produce durante el proceso, lgicamente la centrifugacin depende tambin del tiempo.

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Biologa Celular II P.P de Ing. Biotecnolgica Objetivo: Aislar Cloroplastos Materiales y reactivos - Vaso de precipitados de 250 ml - Balanza - Gradilla - Tampn Tris-NaCl pH= 7,5: Tris (hydroximetil)aminometano 0,02 M, NaCl 0,35 M ajustar el pH a 7,5 con HCl 6 N. Almacenar a 4C. - Batidora - Embudo - Gasa - Centrfuga refrigerada - Gradilla - Tubos de centrfuga PROCEDIMIENTO

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1.- Homogeneizacin Se pesan 25 gramos de hojas de espinacas en el vaso de precipitados, se aaden 100ml del Tampn Tris-HCl Frio y se introduce la mezcla en la batidora. Se homogeneiza durante 3 min. Se coloca un enbudo en un matraz y Se filtra en una doble capa de gasa. Se aprieta bien para obtener la mxima cantidad. Llenar 6 tubos eppendorf con 1.5 ml de homogenizado filtrado, centrifugar a 5000 RPM por 5 minutos a 4C, eliminar el sobrenadante por inversin de los tubos. Juntar los pellet con la ayuda de una micropipeta, en un solo tubo y rotular el tubo con homogenizado cloroplastos Colocar 10 ul de homogenizado de cloroplastos y observar al microscopio con 40X y 100X. Dibujar y describir las observaciones

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Purificacin De Cloroplastos -Formacin del gradiente: A un tubo de centrfuga de 2 ml se le aaden las siguientes cantidades de sacarosa (use una micropipeta de 200 ul: - 200 ul de sacarosa en agua al 60% (peso/volumen) - 200 ul de sacarosa en agua al 50% (peso/volumen) - 200 ul de sacarosa en agua al 40% (peso/volumen) - 200 ul de sacarosa en agua al 30% (peso/volumen) - 200 ul de sacarosa en agua al 20% (peso/volumen) Para que el gradiente salga bien hay que tomar las siguientes precauciones: - Las disoluciones deben de estar fras (nevera). - Cada capa debe depositarse muy lentamente sobre la anterior, para evitar que se mezclen las disoluciones. - Con cada disolucin se utiliza un Tip diferente. - Sobre la ltima capa se deposita la muestra biolgica que consiste en 200 microlitros de resuspencion de cloroplastos de un homogenado de clulas de espinaca, preparado previamente. Los tubos se equilibran de dos en dos. Se colocan los tubos equilibrados uno en frente del otro en el rotor. El rotor debe de estar previamente enfriado y se coloca en la centrfuga. La temperatura se ajusta a 4C. La velocidad se ajusta a 15,000 rpm. El tiempo se ajusta a 20 minutos. Cuando se para el rotor se sacan los tubos y se extraen la fracciones con una micropipeta de 100 o 200 ul. En este caso nos interesa la fraccin verde que son los cloroplastos. Resultados: tome 10 ul de cada Fraccion del tubo y observe al microscopio con 40X o 100X si es necesario. Compare los resultados de cada una de las fracciones (densidades) y discuta los resultados. Cual es la concentracin de cloroplastos

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Biologa Celular II P.P de Ing. Biotecnolgica CUESTIONARIO.

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Densidad de los cloroplastos: Calculo de la densidad de los cloroplastos: Se pesan 10 veces 100l de agua destilada, este peso ser la densidad 1,000. Se pesan 10 veces fracciones de 100 l de los cloroplastos y el peso obtenido deber ser dividido por el peso del agua destilada, para obtener la densidad a la que sedimentan los cloroplastos.

Clculos numricos: Calcula la fuerza en g que se producen en la parte superior del tubo de centrfuga (r= 572cm). Calcula la fuerza en g que se producen en la parte media del tubo de centrfuga (r= 826cm). Calcula la fuerza en g que se producen en la parte inferior del tubo (r= 10,80cm).

Como evalua la funcin de un cloroplasto, usando un agente reductor, describa el experimento.

Bibliografia:

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