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OFICINA ESPAOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Nmero de publicacin: 51 Int. Cl.:

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ESPAA

A23J 1/20 (2006.01) A23L 1/305 (2006.01)

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TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA

86 Nmero de solicitud europea: 02745586 .4 86 Fecha de presentacin : 05.07.2002 87 Nmero de publicacin de la solicitud: 1406507 87 Fecha de publicacin de la solicitud: 14.04.2004

T3

54 Ttulo: Mtodos de extraccin de casena a partir de leche y caseinatos y produccin de productos novedo-

sos.

30 Prioridad: 06.07.2001 GB 0116509

73 Titular/es: THE HANNAH RESEARCH INSTITUTE

Ayr, Ayrshire KA6 5HL, GB

45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI:

72 Inventor/es: Law, Andrew y

16.10.2007

Leaver, Jeff

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:

74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel

16.10.2007

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Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. P de la Castellana, 75 28071 Madrid

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DESCRIPCIN Mtodos de extraccin de fracciones de casena a partir de leche y caseinatos y produccin de productos novedosos.
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Introduccin La presente invencin se reere a un mtodo novedoso para precipitar de manera selectiva fracciones de casena a partir de leche desnatada o caseinatos mediante la adicin de una sal de calcio a pH alcalino.

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La invencin se reere en particular a la preparacin de fracciones puras de s -casena y -casena, y por primera vez una fraccin altamente enriquecida en -casena. Los productos son adecuados para su uso en alimentos o para preparar materiales alimenticios novedosos y el mtodo puede usarse a una escala industrial. Las fracciones de casena puricadas tienen propiedades distintivas y tienen una amplia variedad de usos, incluyendo la estabilizacin de emulsiones y espumas, la preparacin de preparaciones o frmulas para lactantes adecuadas para su uso por los que padecen trastornos metablicos, tales como fenilcetonuria (PKU), y la fabricacin de recubrimientos comestibles y plsticos biodegradables. Las fracciones tambin son particularmente adecuadas como materiales de partida para procesos que implican proteolisis limitada para producir nuevos sabores de queso, nutracuticos y una amplia variedad de pptidos bioactivos. Estos incluyen fosfopptidos y otros pptidos bioactivos con funciones antimicrobianas, antihipertensoras, inmunomoduladoras, antitrombticas y opioides. Los productos lcteos forman una parte muy importante de la dieta humana, siendo la produccin mundial total de leche de vaca en 1998 de aproximadamente 57 millones de toneladas. La leche en s es una mezcla relativamente compleja, siendo los constituyentes principales grasa, minerales, azcar (lactosa) y protena. Las protenas estn presentes en la leche a una concentracin de aproximadamente 35 g/l, y pueden dividirse de manera conveniente en dos clases principales -las casenas, que quedan retenidas en la cuajada, y las protenas de suero, que se mantienen en el lquido residual durante la fabricacin del queso. Las casenas representan el 80% de la protena en la leche y se encuentran, junto con gran parte del calcio y fosfato, en partculas coloidales de tamao submicromtrico, que se denominan micelas de casena. La dispersin de la luz por las micelas de casena da a la leche su apariencia blanca caracterstica. La integridad de las micelas de casena es crucial para la estabilidad de la leche y las propiedades de los productos preparados a partir de la leche estn determinadas en parte por las propiedades de las micelas. Por ejemplo, se sabe que la rmeza de los quesos puede correlacionarse directamente con el dimetro promedio de las micelas en la leche a partir de la cual se preparan. Se estim que la produccin mundial de queso era de alrededor de 15 millones de toneladas en 1998. Cada vez se consumen ms protenas de leche, no como leche lquida, sino como ingredientes en productos que se han procesado en un grado mayor o menor. El grado de procesamiento vara desde yogurt y fabricacin de queso casero, en los que se induce a las micelas para que se agreguen mediante acidicacin, hasta la incorporacin de fracciones de protenas de leche en salsas y cremas para untar. Cuando se acidica la leche hasta pH 4,6, el fosfato de calcio se disuelve de las micelas de casena y se deteriora la estructura micelar, provocando que la casena se agregue y precipite. Este procedimiento se usa en la fabricacin de caseinato de sodio, que se prepara volviendo a suspender el precipitado de casena cido en solucin acuosa mediante la adicin de hidrxido de sodio hasta aproximadamente pH 7,0, seguido por secado. Otras formas de caseinato con propiedades funcionales diferentes, tales como caseinato de calcio o caseinato de amonio, pueden obtenerse ajustando la casena a pH 7,0 con el hidrxido de calcio o amonio apropiado. La produccin mundial anual de casena y caseinatos es alrededor de 250.000 toneladas. Los caseinatos se usan en la fabricacin de una amplia variedad de alimentos procesados cuando se hace uso de sus excelentes propiedades espumantes, emulsionantes y de unin a agua. La casena de la leche de vaca se compone de cuatro protenas diferentes, concretamente -, -, s1 y s2 -caseina. La composicin de la casena completa, en promedio, es el 11,0% de ; el 35,0% de ; el 36,0% de s1 y el 10,0% de s2., siendo el resto productos de descomposicin de las casenas principales. Las casenas individuales tienen pesos moleculares y puntos isoelctricos bastante similares, y tienen altas anidades por Ca2+ y fosfato inorgnico, pero tienen propiedades y secuencias de aminocidos completamente diferentes. Tras la biosntesis, todas las casenas experimentan fosforilacin en residuos de aminocido serina y ocasionalmente treonina en las secuencias de tripptidos caractersticas -Ser/Thr-X-A, en las que X representa cualquier residuo de aminocido y A es un residuo de aminocido cido tal como Asp, Glu, SerP o ThrP. Estos centros de fosfato son importantes porque estn implicados en la unin de fosfato de calcio y en el mantenimiento de la estructura micelar de la casena. De esta forma, tanto la protena como el fosfato de calcio, que son importantes en la nutricin, se mantienen a concentraciones altas estables en la leche. Las s1 y s2 -casenas son las que tienen ms grupos serina fosfato en su estructura, las ms altas cargas negativas netas a pH alcalino, y las mayores anidades por Ca2+ . La -casena es intermedia en estos aspectos, mientras que la -casena tiene slo un grupo serina fosfato, la carga negativa ms baja y la menor anidad por Ca2+ . Las casenas como grupo son muy hidrfobas y, cuando se deteriora la estructura micelar, tienen una alta tendencia a agregarse en solucin acuosa, siendo la -casena la ms hidrfoba, las s1 y s2 -casenas intermedias, y la -casena la menos hidrfoba. La -casena diere tambin de las otras casenas porque se encuentra en la leche como una serie de polmeros unidos por disulfuros, y contiene cadenas laterales de hidratos de carbono.
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Las casenas tienen una estructura abierta y experimentan fcilmente proteolisis, pero muestran diferentes vulnerabilidades a una amplia variedad de enzimas proteolticas. Por ejemplo, las y s2 -casenas se atacan ms fcilmente que las otras casenas por plasmina, que est presente en la leche. La -casena tambin experimenta fcilmente proteolisis especca con quimosina, y esto forma la base del proceso de cuajado que se produce durante la fabricacin de queso. La parte hidrla de la -casena que sobresale de la supercie de las micelas y que normalmente mantiene su estabilidad, se rompe, permitiendo al resto de la casena agregarse y formar la cuajada. El fragmento de la -casena roto en el suero (el caseinomacropptido (CMP)) tiene propiedades distintivas y, puesto que no contienen aminocidos aromticos, es til como una protena alimenticia para los sujetos que padecen el trastorno metablico gentico fenilcetonuria (PKU). Especcamente, la fraccin de -casena es poco corriente porque se rompe de una forma especca por la enzima quimosina en dos partes bien denidas -para -casena y CMP. Se ha noticado que CMP tiene propiedades farmacolgicas tiles. En particular, no contienen aminocidos aromticos, y no contiene especcamente fenilalanina. Esto es particularmente signicativo porque CMP es una posible fuente de protena esencial para pacientes que padecen PKU. PKU es un estado metablico en el que los sujetos son incapaces de metabolizar los aminocidos aromticos fenilalanina. El estado es tal que si se consume fenilalanina, se acumula en el torrente sanguneo y en el tejido cerebral y puede provocar en ltima instancia trastornos mentales graves. El estado es grave y todos los lactantes en el Reino Unido se investigan rutinariamente poco despus del nacimiento para identicar el estado, y para tomar medidas para modicar la dieta para excluir la fenilalanina. Sin embargo, se conocen pocas protenas naturales que estn completamente libres de este aminocido. Como resultado, los requisitos dietticos de aquellos que padecen PKU se cumplen mediante una mezcla de aminocidos de la cual se ha eliminado la fenilalanina mediante tratamiento enzimtico especco. Estas mezclas son relativamente ecaces como nutrientes, pero son caras de fabricar y de sabor desagradable. Sin embargo, el CMP, tal como se fabrica a partir de la fraccin -casena descrita en el presente documento, ofrece una fuente alternativa prctica de aminocidos esenciales sin el peligro concomitante de ingestin de fenilalanina. Tcnicas de la tcnica anterior para fraccionar casenas
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En la leche, las cuatro casenas individuales, , , s1 y s2 -casenas, estn estrechamente asociadas con microgrnulos de fosfato de calcio en forma micelar. Con el n de fraccionar las casenas, es necesario deteriorar al menos parcialmente la estructura micelar mediante cierta combinacin de acidicacin, cuajado, enfriamiento o adicin de un agente quelante. Las casenas son de naturaleza hidrfoba y, una vez disociadas de las micelas, ha de impedirse que vuelvan a agregarse mediante la adicin de un agente caotrpico o enfriamiento. Entonces pueden separarse las casenas individuales basndose en las diferencias en su carga negativa neta, anidad por Ca, o hidrofobicidad. La tcnica ms comnmente usada a escala de laboratorio para separar las cuatro casenas principales es cromatografa de intercambio aninico. La resolucin de las casenas individuales depende principalmente de las diferencias en las cargas negativas netas de las protenas a pH alcalino, y de su anidad por un medio de columna cargado positivamente. Todas las separaciones requieren que la casena se disocie en concentraciones altas de un medio caotrpico tal como urea (> 3,3 M) y que se trate en presencia de un agente reductor tal como 2-mercaptoetanol para reducir los enlaces disulfuro en la serie de polmeros de -casena (JOURNAL OF DAIRY SCIENCE, vol. 49, 1966, pginas 792795. Thompson, M.P. DEAE-Cellulose-urea chromatography of casein in the presence of 2-mercaptoethanol). Las caractersticas de resolucin y ujo de los medios de columna han mejorado con los aos, pero la tcnica no se ampla a escala fcilmente. Tambin, incluso con dilisis exhaustiva de las fracciones, estn presentes algunos materiales txicos residuales, y las fracciones de casena no son adecuadas para su uso en alimentos. La separacin de las casenas principales a partir de la casena completa se ha logrado tambin a escala de laboratorio usando cromatografa de intercambio catinico en la que la separacin se basa en la carga positiva neta de las casenas a pH cido y su unin a un medio de columna cargado negativamente (JOURNAL OF DAIRY RESEARCH vol. 36, 1969, pginas 259-268. Annan, W.D. y Manson, W. A fractionation of the as-casein complex of cows milk; JOURNAL OF DAIRY RESEARCH vol. 59, 1992, pginas 557-561. Leaver, J. y Law, AJR. Preparative-scale purication of bovine caseins on a cationexchange resin). La cromatografa de intercambio catinico no se ampla a escala fcilmente, y requiere la presencia de altas concentraciones de un agente de disociacin tal como urea (> 3,3 M), y un tratamiento de reduccin previo con un material tal como 2-mercaptoetanol. Por tanto, las fracciones de casena no son adecuadas para consumo humano. Otro mtodo de laboratorio usado ocasionalmente para el fraccionamiento parcial de las casenas implica la adicin de una alta concentracin de urea, como agente caotrpico, a casena completa, para provocar la disociacin de las casenas individuales. Se obtiene entonces una separacin en bruto de los componentes de s , y -casena basndose en la solubilidad diferencial en urea (JOURNAL OF DAIRY CHEMISTRY vol. 46, 1963, pginas 1183-1188. Zittle, CA. y Custer, J.H. Purication and some properties of s -casein and -casein). Debido a la muy alta concentracin de urea (6,6 M) requerida para disociar la casena, no es prctico econmicamente realizar estas separaciones a gran escala, y los productos no son adecuados como materiales alimenticios. Tambin puede obtenerse un fraccionamiento en bruto de las casenas principales segn sus solubilidades en etanol en presencia de diversas sales (JOURNAL OF DAIRY SCIENCE vol. 35, 1952, pginas 272-281. Hipp, N.J., Groves, M.L., Custer, J.H. y McMeekin, T.L. Separation of -, - and -casein). Se han usado los renamientos de este procedimiento para obtener fracciones puricadas de -casena a partir de mezclas que contienen s y -casenas
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(BIOCHIMICA BIOPHYSICA ACTA vol. 47, 1961, pginas 240-242. McKenzie, H.A. y Wake, R.G. An improved method for the isolation of -casein; BIOCHEMISTRY vol. 9, 1970, pginas 2807-2813. Talbot, B y Waugh, D.F. Micelle-forming characteristics of monomeric and covalent polymeric -caseins). Estos mtodos requieren altas concentraciones de etanol, y la mayora de las sales usadas son txicas. La -casena es ms hidrfoba que las otras casenas principales y tiende a disociarse a bajas temperaturas cuando las interacciones hidrfobas son ms dbiles, incluso en su punto isoelctrico. Por tanto, la -casena puede prepararse a partir de una solucin de caseinato de sodio mediante precipitacin isoelctrica de las otras casenas a pH 4,5 y 2C, y precipitacin de la -casena del sobrenadante calentando a 20C (JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY vol. 67, 1944, pginas 17251731. Warner, RC. Separation of - and -casein). El enfriamiento de la leche, particularmente a pH cido, provoca disociacin de algunas de las casenas, particularmente -casena, a partir de las micelas. La fase lquida enriquecida en -casena puede separarse despus de la otra fase mermada en -casena. Esta solubilizacin inducida por fro de -casena, comenzando por la casena de cuajo (el slido obtenido en la etapa inicial de la fabricacin de queso), se ha noticado (patente nmero WO9406306, A process for producing beta-casein enriched products. Ram, S., Loh, DW., Love, DC. y Dudley, EP.; patente nmero US5397577 Method for obtaining beta casein Le Magnen, C. y Maugas, J-J.). La patente US5397577 describe un procedimiento para extraer -casena a partir de una suspensin o solucin de casena de cuajo acidicando hasta un pH de 4 a 5 y enfriando hasta de -2 a 10C. Se forman dos fases de las cuales la fase lquida contiene -casena y la fase slida una mezcla de las otras s1 y -casenas y esta sustancialmente libre de -casena. La patente WO9406306 describe un procedimiento para la extraccin parcial de -casena manteniendo una suspensin de materia prima de casena en fro a un pH de entre 3,5 y 8,0 durante un tiempo adecuado y separando dicha suspensin en dos fases para obtener una fase slida que es -casena reducida y una fase lquida que es -casena enriquecida. La patente FR2592769 (Process for producing a material enriched in beta-casein, apparatus for implementing this process, and application of the products obtained by this process as foodstuffs, food supplements or additives in the food and pharmaceutical industries. Terre, E., Maubois, J-L., Brule, G. y Alice, P.) describe un procedimiento para la produccin de una fraccin enriquecida en -casena y una fraccin reducida de la misma manera o bien tratando la leche con un agente complejante de calcio o bien tratando una solucin de caseinato con un agente que polimeriza toda la casena y enfriando hasta de 0 a -7C y sometiendo al material a microltracin sobre una membrana inorgnica en ujo tangencial. El material microltrado se enriquece en -casena y el material retenido se reduce. La microltracin a baja temperatura es muy lenta, haciendo al procedimiento menos atractivo industrialmente. Puede obtenerse una separacin parcial de las casenas a escala de laboratorio mediante la adicin de cloruro de calcio a pH neutro a leche o caseinato (JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY vol. 78, 1956, pginas 4576-4582. Waugh, DF y von Hippel, PH. -Casein and the stabilization of casein micelles; BIOCHIMICA BIOPHYSICA ACTA vol. 47, 1961, pginas 240-242. McKenzie, HA y Wake, RG. An improved method for the isolation of -casein). Ambos mtodos dan un precipitado de s y -casenas y un sobrenadante que contiene una mezcla de , s y -casenas. Estos mtodos tienen las desventajas de que requieren centrifugacin a alta velocidad para separar el precipitado no del sobrenadante, y dilisis para eliminar el exceso de cloruro de calcio de la fraccin enriquecida en -casena, y por tanto no puede ampliarse a escala fcilmente. El uso de concentraciones altas de cloruro de calcio hace difcil la recuperacin de la fraccin enriquecida en -casena, puesto que la casena no experimentar la precipitacin isoelctrica normal. Tambin, la adicin de oxalato de potasio, que es txico, para eliminar el exceso de calcio, descarta el uso de esta fraccin como material alimenticio. Por tanto, los mtodos previos de fraccionamiento de casena que implican la precipitacin selectiva de calcio se han llevado a cado a pH neutro (JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY vol. 78, 1956, pginas 45764582. Waugh, DF y von Hippel, PH. -Casein and the stabilization of casein micelles; BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA vol. 47, 1961, pginas 240-242. McKenzie, HA y Wake, RG. An improved method for the isolation of casein). Estos mtodos describen la separacin parcial de las protenas obtenidas mediante la adicin de cloruro de calcio a leche o caseinato, respectivamente, cerca de 7,0. Ambos mtodos requirieron concentraciones superiores de cloruro de calcio (0,25-0,36 M) que en la presente precipitacin alcalina (0,059-0,071 M), y la precipitacin de las s y -casenas no se produjo fcilmente, pero en su lugar requiri centrifugacin a alta velocidad. Tambin, la alta concentracin de cloruro de calcio en el sobrenadante impidi la posterior precipitacin con cido de la fraccin de -casena, y se requirieron la adicin de oxalato para quelar el calcio y dilisis antes de que pudiera recuperarse la protena. Por tanto, no fue posible ampliar a escala estos mtodos, y los productos no eran adecuados para consumo humano. Debido a la hidrofobicidad de los componentes individuales de la casena, es difcil fraccionar las casenas a gran escala, incluso aunque cada una de las protenas tenga propiedades funcionales especcas que pueden ser interesantes para las industrias alimentaria y farmacutica (PROCEEDINGS OF THE 25th INTERNATIONAL DAIRY CONGRESS, 1998, pginas 74-86. Maubois, J.L. Fractionation of milk proteins). En la actualidad, por tanto, las casenas tienden a usarse como una mezcla de las cuatro protenas en lugar que como componentes individuales. Un mtodo barato, sencillo de fraccionamiento de esta mezcla de protenas sera benecioso ya que permitira a los fabricantes de alimentos y productos farmacuticos usar ingredientes que actualmente son tan caros como para descartar su uso
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a cualquier escala mayor que la de laboratorio. El objetivo de la presente invencin es proporcionar un mtodo que puede usarse a escala industrial para la produccin de fracciones de casena individuales en una forma adecuada para su uso en alimentos o productos alimenticios novedosos o en la preparacin de nutracuticos, fosfopptidos y otros pptidos bioactivos.
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La presente invencin implica el fraccionamiento de las casenas mediante la adicin de un cloruro de calcio a leche o caseinato a pH alcalino. Las ventajas de llevar a cabo la precipitacin selectiva a pH alcalino son que las s y -casenas sensibles al calcio precipitan ms fcilmente, y pueden obtenerse sin centrifugacin a alta velocidad. Tambin, se requiere una concentracin inferior de sal de calcio a pH alcalino, y la fraccin enriquecida en -casena puede obtenerse mediante precipitacin con cido sin el uso de agentes quelantes txicos o dilisis. El presente procedimiento, a diferencia del de pH neutro, puede llevarse a cabo a escala industrial, y los productos son adecuados para su uso en alimentos y materiales alimenticios novedosos y como materiales de partida para preparar nutracuticos, fosfopptidos, y una amplia variedad de pptidos bioactivos. Adems, el procedimiento descrito en esta solicitud permite la separacin prctica ecaz y barata de CMP a partir de mezclas de protena de suero, casena y proteosa peptonas encontradas en la leche y el suero. Los mtodos convencionales de fabricacin de CMP usan preparaciones de -casena que contienen impurezas signicativas. Por ejemplo, si se fabrica una preparacin de -casena a partir de leche desnatada, la preparacin contiene -lactoglobulina desnaturalizada en fro. Por el contrario, si se prepara una preparacin de -casena usando casena completa (normalmente de sal de sodio o de potasio), la preparacin contiene una pequea proporcin de s y -casena. Durante la hidrlisis de la -casena mediante quimosina para formar CMP, se pueden producir contaminantes de proteolisis limitada. Como resultado, existe peligro de que la preparacin nal pueda contaminarse con pptidos que contienen fenilalanina, haciendo por tanto a la preparacin inadecuada para la ingestin por aquellos que padecen PKU. Por tanto, los objetivos de la presente invencin incluyen: Idear un nuevo mtodo de extraccin de fracciones de casena puricadas y -lactoglobina a partir de leche, produciendo no solo las fracciones de protena sino tambin un suero cido parcialmente reducido en -lactoglobina. El mtodo puede usarse a escala industrial, y las fracciones de protena y el suero cido son adecuados para su uso en alimentos o para preparar materiales alimenticios novedosos tales como frmulas lactantes humanizadas, sabores de queso, emulsiones, recubrimientos comestibles y nutracuticos. Las fracciones puricadas pueden usarse tambin para preparar plsticos, fosfopptidos y otros pptidos bioactivos biodegradables. Idear un nuevo mtodo de extraccin de fracciones de casena puricadas a partir de caseinato. El mtodo puede usarse a escala industrial, y las fracciones de casena son adecuadas para su uso en alimentos, productos alimenticios novedosos, nutracuticos y aplicaciones biomdicas tal como se mencion anteriormente. Idear un nuevo mtodo de fabricacin de CMP, adecuado para su uso por sujetos que padecen el trastorno metablico fenilcetonuria.

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En este documento, las referencias a micelas de casena, casenas, caseinatos y otros componentes de la leche, deben interpretarse, a menos que el contexto requiera lo contrario, como que incluyen todas las variantes inter e intraespecie relacionadas de estos componentes. La -casena, por ejemplo, tendr una estructura primaria ligeramente diferente en mamferos diferentes; estar claro para el experto en la tcnica que la invencin se aplicar a todas estas variantes. El trmino as -casena se reere a una mezcla de as1 - y as2 -casenas. Segn un primer aspecto de la presente invencin, se proporciona un mtodo de obtencin de fracciones de protena puricadas a partir de leche que incluye las etapas de:

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i) aumentar el pH de la leche hasta aproximadamente pH 11; ii) aadir cloruro de calcio para precipitar selectivamente las fracciones; iii) disminuir el pH; y

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iv) llevar a cabo centrifugacin o ltracin para separar las fracciones. Preferiblemente, las fracciones son s , y -casena.
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Normalmente la leche es leche desnatada. Preferiblemente, la centrifugacin se lleva a cabo a baja velocidad.

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El mtodo puede comprender adems la etapa de llevar a cabo precipitacin a pH cido del sobrenadante obtenido de la centrifugacin o ltracin llevadas a cabo en la etapa (iv), para obtener una fraccin altamente enriquecida en casena.

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En la etapa en la que la fraccin enriquecida en -casena se obtiene ajustando el sobrenadante a pH cido, preferiblemente el pH es 3,8. Normalmente, el contenido de -casena es aproximadamente del 60%, y el de -lactoglobulina de aproximadamente el 20%.
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El mtodo puede comprender tambin las etapas de volver a disolver los componentes de s y -casena en agua, y llevar a cabo precipitacin isoelctrica selectiva repetida de la s -casena a pH cido y baja temperatura, para obtener una fraccin que contiene principalmente s -casena. En la etapa en la que el precipitado de s y -casena se vuelve a disolver en agua, el agua est preferiblemente a pH 7,0 y 20C. La solucin de s y -casenas puede enfriarse despus de volver a disolverse en agua, preferiblemente hasta 2C, y ajustarse hasta pH cido, preferiblemente hasta pH 4,5.

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El procedimiento de volver a disolver y volver a precipitar puede repetirse, preferiblemente dos veces adicionales, produciendo una fraccin que contiene principalmente s -casena (ms del 85%) y una fraccin que contiene principalmente -casena (ms del 95%). An adicionalmente el mtodo tambin puede comprender las etapas de calentar el sobrenadante obtenido de la precipitacin isoelctrica selectiva, y llevar a cado la precipitacin con cido para recuperar la fraccin que contiene principalmente -casena. El suero cido sobrenadante se reduce parcialmente en -lactoglobina, pero contiene todas las otras protenas de suero en forma no desnaturalizada, y se enriquece en calcio. Preferiblemente, el sobrenadante se calienta hasta 35C.

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Preferiblemente el pH de la leche se aumenta mediante la adicin de una solucin alcalina y se disminuye mediante la adicin de una solucin cida. Preferiblemente, en la etapa en la que el pH de la leche se aumenta, se aade hidrxido de sodio.
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Preferiblemente, la temperatura de la leche en la adicin de la solucin alcalina es de 30C. Opcionalmente, despus de aadir la solucin alcalina, se deja reposar la leche durante unos pocos minutos. Preferiblemente, se deja reposar la leche durante menos de 5 minutos.
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Preferiblemente, la concentracin nal de cloruro de calcio en la solucin de caseinato alcalina es de 0,059 M. El pH puede disminuirse mediante la adicin de uno o varios cidos minerales.
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El mtodo puede comprender tambin la etapa de aumentar el pH de la fraccin altamente enriquecida en -casena y llevar a cabo la ultraltracin para separar el material de bajo peso molecular de las casenas, protenas de suero y caseinomacropptido. El pH se elevara normalmente hasta un valor neutro.

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Preferiblemente, la ultraltracin se lleva a cabo usando una membrana con un tamao de poro inferior a 25 kD, pero superior a 12 kD.
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An adicionalmente, el mtodo puede comprender tambin la etapa de disminuir el pH de la fraccin altamente enriquecida en -casena y llevar a cabo la ultraltracin para separar la protena de suero del caseinomacropptido. El pH normalmente se baja hasta entre pH 4 y pH 5. Preferiblemente, el pH se baja hasta pH 4,6.

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Preferiblemente, se lleva a cabo la ultraltracin usando una membrana con un tamao de poro superior a 7 kD, pero inferior a 20 kD.
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Segn un segundo aspecto de la presente invencin, se proporciona un mtodo de obtencin de fracciones de protena puricadas a partir de una solucin de caseinato de sodio que incluye las etapas de: i) aumentar el pH de la solucin de caseinato hasta aproximadamente pH 11; ii) aadir cloruro de calcio para precipitar de manera selectiva las fracciones;

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iii) disminuir el pH; y iv) llevar a cabo la centrifugacin o ltracin para separar las fracciones.
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Preferiblemente, la centrifugacin se lleva a cabo a baja velocidad. El mtodo puede comprender tambin la etapa de llevar a cabo la precipitacin a pH cido del sobrenadante obtenido a partir de la centrifugacin o ltracin en la etapa (iv) para obtener una fraccin altamente enriquecida en -casena. En la etapa en la que la fraccin enriquecida en -casena se obtiene ajustando el sobrenadante a pH cido, preferiblemente el pH es 3,8. El contenido en -casena de esta fraccin ser normalmente superior al 30%.
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Opcionalmente, la fraccin enriquecida en -casena puede enriquecerse adicionalmente en -casena mediante la precipitacin selectiva con etanol. La fraccin de -casena puede volver a disolverse en agua a pH 7,0, volver a precipitarse a pH 4,6, y despus precipitarse de manera selectiva con etanol al 50% a pH 7,0 y 25C con la adicin de una pequea cantidad de NaCl 2 M en etanol al 50%. El precipitado de -casena se forma fcilmente y puede extraerse por ltracin o centrifugacin a baja velocidad. (BIOCHEMISTRY vol. 9, 1970, pginas 2807-2813. Talbot, B. y Waugh, D.F. Micelle-forming characteristics of monomeric and covalent polymeric -caseins). El contenido en -casena de esta fraccin ser normalmente aproximadamente del 65%. El mtodo puede comprender adems las etapas de volver a disolver los componentes de s - y -casena en agua y llevar a cabo la precipitacin isoelctrica selectiva repetida de la s -casena a pH cido y baja temperatura para obtener una fraccin que contienen principalmente s -casena. En la etapa en la que el precipitado de s - y -casena se vuelve a disolver en agua, preferiblemente el agua est a pH 7,0 y 20C.

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La solucin de s - y -casena puede enfriarse, preferiblemente hasta 2C, y ajustarse a pH cido, preferiblemente hasta pH 4,5. Preferiblemente, el mtodo tambin comprende las etapas de calentar el sobrenadante obtenido a partir de la precipitacin isoelctrica selectiva, y llevar a cabo la precipitacin con cido para recuperar la fraccin que contiene principalmente -casena. La -casena puede precipitarse del sobrenadante calentando, preferiblemente hasta 35C. El procedimiento de volver a disolver y volver a precipitar se repite, preferiblemente dos veces ms, produciendo una fraccin que contiene principalmente s -casena (superior al 85%) y una fraccin que contienen principalmente -casena (superior al 95%).

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Preferiblemente, el pH de la solucin de caseinato de sodio se aumentar mediante la adicin de una solucin alcalina y se disminuir mediante la adicin de una solucin cida.
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Ms preferiblemente, en la etapa en la que el pH de la solucin de caseinato de sodio se aumenta, el pH puede elevarse hasta 11 mediante la adicin de hidrxido de sodio. Preferiblemente, la temperatura de la solucin de caseinato de sodio en la adicin de la solucin alcalina es de 30C.

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La solucin de caseinato de sodio con un aumento de pH puede dejarse reposar durante unos pocos minutos, preferiblemente menos de 5 minutos. Preferiblemente, la concentracin nal de cloruro de calcio en la solucin de caseinato de sodio alcalina ser de 0,071 M.

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El pH puede disminuirse hasta 7,0 mediante la adicin de uno o varios cidos minerales. El mtodo puede comprender tambin la etapa de aumentar el pH de la fraccin altamente enriquecida en -casena y llevar a cabo la ultraltracin para separar el material de bajo peso molecular de las casenas, protenas de suero y caseinomacropptido. El pH normalmente se elevar hasta un valor neutro.
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Preferiblemente, se lleva a cabo la ultraltracin usando una membrana con un tamao de poro inferior a 25 kD, pero superior a 12 kD. An adicionalmente, el mtodo puede comprender tambin la etapa de disminuir el pH de la fraccin altamente enriquecida en -casena y llevar a cabo la ultraltracin para separar la protena de suero del caseinomacropptido.

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El pH normalmente se disminuye hasta entre pH 4 y pH 5. Preferiblemente, el pH se disminuye hasta pH 4,6. Preferiblemente, se lleva a cabo la ultraltracin usando una membrana con un tamao de poro superior a 7 kD, pero inferior a 20 kD.
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El caseinomacropptido puede concentrarse y secarse. Normalmente, esto se lleva a cabo mediante liolizacin por pulverizacin. La invencin se describir ahora con referencia a las siguientes guras en las que:
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La gura 1 es un diagrama que ilustra las etapas implicadas en el fraccionamiento de la casena de leche desnatada en s -casena, -casena, y una fraccin enriquecida en -casena y -lactoglobulina (-Lg), que contiene algo de s - y -casenas. Este procedimiento tambin da un suero cido parcialmente reducido en -lactoglobina, tal como se detalla en el ejemplo 1;
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La gura 2 es un diagrama que ilustra las etapas implicadas en el fraccionamiento de caseinato de sodio en s casena, -casena, y una fraccin enriquecida en -casena, que contiene s - y -casenas tal como se detalla en el ejemplo 2; La gura 3 muestra los perles de la cromatografa lquida rpida de protenas de intercambio aninico de la casena original de leche desnatada y las fracciones obtenidas a partir de la misma tal como se detalla en el ejemplo 1. El anlisis se llev a cabo tal como se explica en JOURNAL OF DAIRY RESEARCH vol. 54, 1987, pginas 369-376. Davies, D.T. y Law, A.J.R. Quantitative fractionation of casein mixtures by fast protein liquid chromatography; La gura 4 muestra los perles de permeacin en gel de las protenas de suero en la leche desnatada original (__), y en el sobrenadante obtenido despus de la adicin de cloruro de calcio y despus de la precipitacin con cido de la fraccin enriquecida en -casena (---). La gura muestra la reduccin de -lactoglobulina debido a la desnaturalizacin alcalina y la precipitacin posterior a pH cido. El anlisis se llev a cabo tal como se explica en MILCHWISSENSCHAFT vol. 48, 1993, pginas 663-666. Law, A.J.R., Leaver, J., Banks, J.M. y Horne, D.S. Quantitative fractionation of whey proteins by gel permeation FPLC. (Ig, immunoglobulinas; SA/Lf, albmina de suero y lactoferrina, b-Lg, b-lactoglobulina; a-La, a-lactalbmina); La gura 5 muestra los perles de la cromatografa lquida rpida de protenas de intercambio aninico del caseinato de sodio original y de las fracciones obtenidas del mismo tal como se detalla en el ejemplo 2. El anlisis se lleva a cabo tal como se indica para la gura 3; La gura 6 muestra los perles de la cromatografa lquida de protena rpida de intercambio aninico del caseinato de sodio original (---) y de la fraccin de -casena obtenida del mismo (__) tal como se detalla en el ejemplo 2, despus de la puricacin adicional mediante precipitacin con etanol. El anlisis se realiza tal como se indica para la gura 3;

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La gura 7 muestra los perles de la cromatografa lquida rpida de protenas de intercambio aninico del caseinato de sodio original (parte superior) y del caseinato de sodio despus de mantenerse a 30C y pH 11,0 durante 5,0 min. El anlisis se llev a cabo tal como se indica para la gura 3;
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La gura 8 muestra el patrn de electroforesis capilar obtenido para el caseinato de sodio original (parte superior), y para el caseinato de sodio despus de mantenerse a 30C y pH 11,0 durante 5,0 min. Anlisis esencialmente segn el mtodo en JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY vol. 652, 1993, pginas 207-213. de Jong, N., Visser, S. y Olieman, C. Determination of milk proteins by capillary electrophoresis; La gura 9 muestra los perles de la cromatografa lquida rpida de protenas de intercambio catinico del caseinato de sodio original (parte superior), y del caseinato de sodio despus de mantenerse a 30C y pH 11,0 durante 15,0 min. El anlisis se realiz segn el mtodo en JOURNAL OF DAIRY SCIENCE vol. 74, 1991, pginas 2403-2409. Hollar, C.M., Law, A.J.R., Dalgleish, D.G. y Brown, R.J. Separation of major casein fractions using cation-exchange fast protein liquid chromatography; y La gura 10 es un diagrama que ilustra los usos de las fracciones puricadas obtenidas mediante precipitacin de calcio selectiva a partir de leche desnatada o caseinato tal como se explica en los ejemplos 1 y 2 (guras 1 y 2, respectivamente).

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La presente invencin se reere a un mtodo novedoso para precipitar de manera selectiva fracciones de casena a partir de leche desnatada o caseinatos mediante la adicin de una sal de calcio a pH alcalino. La invencin se reere en particular a la preparacin de fracciones puras de s -casena y -casena, y una fraccin altamente enriquecida en -casena. El mtodo puede usarse a escala industrial, y los productos son adecuados para su uso en alimentos o para preparar materiales alimenticios novedosos, plsticos biodegradables, nutracuticos y pptidos bioactivos (gura 10). Los mtodos previos de fraccionamiento de la casena que implican precipitacin selectiva de calcio se han realizado a pH neutro y requieren centrifugacin a alta velocidad, puesto que la precipitacin de las s y casenas no se producan fcilmente. Las concentraciones superiores de cloruro de calcio impedan la precipitacin con cido posterior de la fraccin de -casena, y requeran la adicin de oxalato para quelar el calcio, y la dilisis antes de que la protena pudiese recuperarse. Por tanto, no era posible ampliar a escala estos mtodos, y los productos no eran adecuados para el consumo humano.

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En el presente mtodo, el fraccionamiento de la casena se lleva a cabo mediante precipitacin selectiva de calcio a pH alcalino. Cuando el pH de la leche desnatada se aumenta hasta aproximadamente 11,0, la carga de las casenas cargadas negativamente, particularmente en los grupos fosfato, aumenta, y las casenas se disocian de las micelas. Las s -casenas estn ms altamente cargadas que la -casena, y la -casena es la menos altamente cargada. Cuando se aade una sal tal como cloruro de calcio, las s1 - y B-casenas unen ms Ca2+ que la -casena, y precipitan fcilmente dejando el sobrenadante enriquecido en -casena. A pH alcalino, algo de la -lactoglobulina de la leche experimenta desnaturalizacin (JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY vol. 81, 1959, pginas 4032-4036. Tanford, C., Bunville, L.G., Nozaki, Y. The reversible transformation of -lactoglobulin at pH 7.5). La -lactoglobulina desnaturalizada se mantiene en el sobrenadante enriquecido en -casena. Cuando el pH se reduce posteriormente hasta aproximadamente 3,8, se forma fcilmente un precipitado enriquecido en -casena, junto con la -lactoglobulina desnaturalizada y algo de las s - y -casenas (gura 3). El sobrenadante cido est parcialmente reducido en -lactoglobulina (gura 4) pero contiene todas las otras protenas de suero y cloruro de calcio adicional, y es adecuado para uso alimenticio. Llevar a cabo la precipitacin selectiva de calcio a pH alcalino en lugar de pH neutro tiene varias ventajas. A pH alcalino, las micelas de casena se deterioran y las casenas se disocian sin requerir agentes quelantes o caotrpicos txicos. Las casenas tambin tienen cargas negativas netas superiores y, cuando se aade cloruro de calcio, unen ms Ca2+ . Por tanto, las casenas pueden precipitarse de manera selectiva a concentraciones inferiores de cloruro de calcio que las que se requieren a pH neutro. A pH alcalino, el precipitado de s - y -casenas sedimenta fcilmente cuando se aade cloruro de calcio, y pueden separarse fcilmente mediante ltracin o centrifugacin a baja velocidad. La fraccin de sobrenadante enriquecida en -casena precipita fcilmente de manera similar a pH cido cuando la concentracin de cloruro de calcio es baja, y se separa fcilmente mediante ltracin o centrifugacin a baja velocidad. Ambas fracciones pueden puricarse despus adicionalmente, si es necesario a escala industrial. Por ejemplo, puede llevarse a cabo un procesamiento adicional para separar el caseinomacropptido (CMP) de la fraccin de -casena. El CMP tiene un tamao molecular de aproximadamente 6.500 daltons en forma monomrica, sin embargo, el CMP slo adopta una forma monomrica a valores de pH cidos, por ejemplo, a pH 4. A pH neutro, el CMP toma una forma tetramrica y tiene un tamao molecular ecaz de 25.000 daltons. Por tanto, manipulando el pH, puede inducirse al CMP para que se comporte como una molcula de tamao comparable a las protenas de suero, como -lactoglobulina o, alternativamente, para que se comporte como un pptido pequeo. Esta caracterstica puede utilizarse para separar ecazmente el CMP de mezclas con o bien protenas de suero nativas (tales como preparaciones de -casena preparadas a partir de leche desnatada) o bien de otros pptidos (tales como la fraccin de proteosapeptona encontrada en la leche desnatada o de otros pptidos derivados mediante la ruptura no especca de otras fracciones de casena). Las propiedades de las diversas fracciones se muestran a continuacin:

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Las diferencias en las propiedades descritas anteriormente pueden explotarse para fabricar CMP en un estado muy puro, libre de contaminantes, incluyendo fenilalanina. Por tanto, la fraccin de -casena producida mediante el mtodo descrito anteriormente puede procesarse para producir CMP muy puro. Normalmente, el pH de la fraccin de -casena se aumentar hasta pH neutro con el n de convertir el CMP en su forma tetramrica. Despus de esto, el tratamiento mediante ultraltracin usando una membrana con el tamao de poro apropiado, normalmente superior a 7 kD, pero inferior a 20 kD separar todo el material de bajo peso molecular de las casenas, protenas de suero y CMP. La acidicacin hasta pH 4,6 da como resultado la conversin de nuevo de CMP en la forma monomrica y la precipitacin de las otras fracciones de casena. En este caso, el tratamiento mediante ultraltracin usando una membrana con el tamao de poro apropiado, normalmente superior a 7 kD, pero inferior a 20 kD, da como resultado la separacin de la protena de suero de CMP. El CMP puede concentrarse y secarse convenientemente, normalmente
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mediante congelacin o secado por pulverizacin. Se apreciar que el procedimiento descrito anteriormente es slo una de las muchas combinaciones adecuadas (algunas de las cuales pueden invertir el orden de ajuste de pH) y se da slo a modo de ejemplo.
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La aplicacin del principio para la puricacin de CMP no est restringida al material derivado de la leche desnatada, por ejemplo el procedimiento puede aplicarse igualmente para la separacin y puricacin de CMP de queso o suero de cuajo. En tales casos, es apropiado un tratamiento preliminar mediante separacin por centrifugacin y/o mediante microltracin (normalmente usando una membrana con un punto de corte a 1,8 ) para eliminar contaminantes tales como partculas de cuajada, grasa residual y bacterias. Tras este tratamiento, los principios descritos anteriormente pueden emplearse para obtener preparaciones de CMP libres de pHA y adecuadas para la nutricin de pacientes que padecen PKU. A bajas temperaturas, la -casena sigue siendo soluble en su punto isoelctrico, y por tanto puede separarse de las s -casena mediante su precipitacin a 2C y pH 4,6 (JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY vol. 67, pginas 1725-1731. Warner, R.C. Separation of - y -casein). Entonces se recupera la -casena mediante precipitacin del sobrenadante a 35C. Este precocimiento se repite hasta que se extrae toda la -casena de las s casenas, dando fracciones puras de s - y -casenas (gura 3). El procedimiento de precipitacin de manera selectiva de las fracciones de casena puricadas a partir de una solucin caseinato sigue bsicamente los mismos principios que los descritos para la leche desnatada, excepto que en la adicin de cloruro de calcio, el sobrenadante contiene slo - - y s -casenas (gura 5). Tal como se mencion anteriormente, las casenas pueden puricarse parcialmente basndose en sus solubilidades en etanol (BIOCHEMISTRY vol. 9, 1970, pginas 2807-2813. Talbot, B. y Waugh, D.F. Micelle-forming characteristics of monomeric and covalent polymeric -caseins). Este procedimiento puede usarse para puricar la fraccin de -casena. La fraccin de -casena inicial se vuelve a precipitar para eliminar el calcio residual y se precipita de manera selectiva con solucin de etanol, quedndose en el sobrenadante s1 - y -casenas. El precipitado se forma fcilmente y puede eliminarse mediante centrifugacin a baja velocidad, dando una fraccin enriquecida en -casena (gura 6). Tal como se encontr para la leche desnatada, el fraccionamiento del caseinato de sodio a alto pH tiene la ventaja sobre los mtodos anteriores de implicar la precipitacin de calcio a pH neutro, o la separacin en presencia de agentes caotrpicos, que da las tres fracciones de caseinato libres de materiales txicos, y por tanto adecuadas para su uso como ingredientes alimenticios. Las concentraciones de calcio ms bajas requeridas a pH alcalino, facilitan la recuperacin posterior de la fraccin enriquecida en -casena sin la necesidad de aadir un agente quelante txico, o de dilisis que no se lleva a cabo fcilmente a gran escala. Similarmente, la separacin mejorada a pH alcalino del precipitado de s - y -casena a partir del sobrenadante de -casena sin requerir una centrifugacin a alta velocidad, facilita la ampliacin a escala del mtodo para producir materiales de grado alimenticio. El tratamiento prolongado a pH alcalino, especialmente a alta temperatura, puede conducir a la desfosforilacin de la casena (JOURNAL OF DAIRY RESEARCH, vol. 39, 1972, pginas 189-194. Manson, W. y Carolan, T. The alkali-induced elimination of phophate from -casein). La deshidroalanina formada en las casenas como resultado de la desfosforilacin, y posiblemente tambin debido a la eliminacin de grupos SH de cistena, reacciona con grupos s-amino en los residuos de lisina para formar residuos de lisinoalanina. Esta reaccin conduce a una reduccin de la cantidad de lisina disponible para la nutricin y a un aumento de la reticulacin y reduccin en la digestibilidad de las casenas. Se producen reacciones similares cuando se calienta leche, y existen algunas pruebas de estudios con animales de que la lisinoalanina puede ser nociva si se ingesta en grandes cantidades (JOURNAL OF NUTRITION, vol. 98, 1969, pginas 45-46. De Groot, A.P. y Slump, P. Efects of severe alkali treatment of proteins on amino acid composition and nutritive value). Se cree que el riesgo para la salud de seres humanos de comer protenas de leche caliente o tratadas con lcali es pequeo (JOURNAL OF DAIRY RESEARCH, vol. 49, pginas 725-736. de Koning, P.J. y van Rooijen, P.J. Aspects of the formation of lysinoalanine in milk and milk products). Sin embargo, en el presente trabajo, se lleva a cabo un estudio cuidadoso de los efectos del tratamiento alcalino sobre las protenas de la leche, aplicando tcnicas tales como cromatografa lquida rpida de protenas de intercambio catinico y aninico y electroforesis capilar. Estas tcnicas se han usado previamente con xito para detectar los cambios anlogos en las protenas inducidos mediante calor (MILCHWISSENSCHAFT, vol. 49, 1994, pginas 125129. Law, A.J.R., Home, D.S., Banks, J.M. y Leaver, J. Heat-induced changes in the whey proteins and caseins); JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY, vol. 652, 1993, pginas 207-213. de Jong, N., Visser, S. y Olieran, C. determination of milk proteins by capillary electrophoresis). Los cambios que se producen en el tratamiento alcalino riguroso, tales como la desfosforilacin, eliminacin de los grupos hidratos de carbono y SH (cido silico), conducen todos a una reduccin de la carga negativa de las protenas, y estos cambios, que se producen tambin en el calentamiento, pueden detectarse mediante la cromatografa lquida rpida de protenas de intercambio aninico (FPLC). Similarmente, la determinacin de residuos de Arg y -amino Lys que se producen en el tratamiento prolongado a pH alcalino, conduce a la prdida de carga positiva en las protenas, y estos cambios pueden determinarse mediante la FPLC de intercambio catinico y la electroforesis capilar a pH cido. Estas tcnicas se usaron para examinar casenas que se haban sometido a las condiciones alcalinas requeridas para obtener la precipitacin selectiva de las fracciones de casena a partir de leche desnatada o caseinato de sodio. Los resultados de la FPLC de intercambio aninico (gura 7) muestran que en los tiempos cortos requeridos para realizar la disociacin de las micelas de casena en la leche (5 min.), no haba cambios que pudieran medirse en los perles
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o en las reas de pico respectivas de las casenas individuales. Ya que la separacin se basa en la carga neta negativa, parece que no hubo cambios apreciables en las cargas de las casenas individuales y que, en particular, no tuvo lugar la desfosforilacin. Los resultados de la electroforesis capilar (gura 8) y la FPLC de intercambio catinico (gura 9) muestran similarmente que tras el tratamiento alcalino durante 5 min., no hubo cambios que pudieran medirse en los perles o en las reas de pico respectivas de las casenas. Ambas tcnicas se llevaron a cabo a pH cido y, ya que las separaciones se basan en la carga neta positiva, muestran que el tratamiento alcalino corto no tuvo efecto sobre los grupos cargados positivamente tales como Lys y Arg de las casenas. Los resultados en conjunto muestran que el tratamiento corto en condiciones alcalinas requerido para obtener la precipitacin selectiva de las casenas a partir de la leche desnatada o del caseinato de sodio no provoc ningn dao qumico a las protenas. Durante el tratamiento alcalino de la leche desnatada, la -lactoglobulina experimenta un cambio conformacional, y posteriormente se vuelve insoluble en su punto isoelctrico (JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY vol. 81, 1959, pginas 4032-4036. Tanford, C., Bunville, L.G. y Nozaki, Y. The reversible transformation of -lactoglobulin at pH 7,5). En las condiciones alcalinas requeridas para obtener la precipitacin de calcio selectiva, algunas de las -lactoglobulinas se vuelven desnaturalizadas pero las otras protenas de suero, tal como se muestra mediante la FPLC de permeacin en gel (gura 4), no se desnaturalizaron y mantuvieron sus solubilidades en sus puntos isoelctricos. Los resultados previos de HPLC en fase inversa, electroforesis capilar y digestiones triptcas de las protenas a partir de la leche desnatada mantenida brevemente a pH alcalino, mostraron que no haba cambios signicativos en las propiedades qumicas de las protenas (SOLICITUD DE PATENTE, 2001, Leaver, J. y Law, A.J.R. Milk and cheese extraction process, including methods of extracting -lactoglobulin and caseins from milk and milk products, and novel products thereby produced). Ejemplo 1
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Se calent leche desnatada hasta 30C y se ajust rpidamente el pH hasta 11,0 mediante la adicin, con agitacin, de hidrxido de sodio 5 M. Mientras se continu agitando, se aadi una solucin de cloruro de calcio 0,5 M, siendo el volumen total de cloruro de calcio aadido de 133 ml por litro de solucin de leche desnatada y siendo la concentracin nal de 0,059 M. Entonces se aadido cido clorhdrico (5 M), con agitacin con el n de reducir el pH de la leche desnatada hasta 7,0. Se form un precipitado (A) que se recogi o bien mediante centrifugacin o bien se dej sedimentar y se extrajo mediante ltracin. Este precipitado era rico en s - y -casenas y contena poca -casena. Se redujo el pH del sobrenadante hasta 3,8 mediante la adicin, con agitacin de HCl 1 M. Se form un segundo precipitado (B) que se recogi de la misma manera que el precipitado A. El precipitado B contena -casena (60%) y -lactoglobulina (20%) y pequeas cantidades de s - y -casenas (gura 3). Se merm parcialmente el sobrenadante de suero cido en -lactoglobulina (gura 4). Se volvi a suspender el precipitado A en agua en aproximadamente la misma concentracin tal como en el caseinato inicial, mediante agitacin vigorosa a 20C ajustndose continuamente el pH hasta 7,0 mediante la adicin de HCl 1 M. Despus de completarse la disolucin, se enfri la solucin hasta 2C y se ajust el pH hasta 4,5 mediante la adicin, con agitacin, de HCl 1 M. Se form un precipitado (C) y tras la agitacin durante 15 minutos a 2C, ste se recogi del sobrenadante (D) o bien mediante ltracin o bien centrifugacin a 2C. Este precipitado estaba altamente enriquecido en s -casena pero contena algo de -casena. Se redujo la cantidad de -casena en esta fraccin volviendo a disolver el precipitado en agua y repitiendo la precipitacin a 2C dos veces ms. El anlisis mostr que ms del 85% de la protena era s -casena (gura 3). Se calent el sobrenadante D hasta 35C y se ajust el pH hasta 4,6 mediante la adicin, con agitacin de volmenes pequeos de HCl 1 M. Se form un precipitado (E) que se recogi mediante centrifugacin o ltracin de la misma manera que el precipitado A. El anlisis mostr que ms del 95% de la protena era -casena (gura 3). Ejemplo 2

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Se disolvi caseinato de sodio en agua en una concentracin de 27 g/l mediante agitacin a aproximadamente 37C durante 10 minutos (gura 4). Se enfri la solucin hasta 30C y se ajust rpidamente el pH hasta 11,0 mediante la adicin, con agitacin, de hidrxido de sodio 0,5 M. Mientras se continu agitando, se aadi una solucin de cloruro de calcio 0,5 M, siendo el volumen total de cloruro de calcio aadido de 166 ml por litro de solucin de caseinato y siendo la concentracin nal de 0,071 M. Entonces se aadi cido clorhdrico (5 M), con agitacin, con el n de reducir el pH de la solucin de caseinato hasta 7,0. Se form un precipitado (A) que se recogi o bien mediante centrifugacin o bien se dejo depositar y se elimin mediante ltracin. Este precipitado era rico en s - y -casenas y contena poca o ninguna -casena. Se redujo el pH del sobrenadante hasta 3,8 mediante la adicin, con agitacin de HCl 1 M. Se form un segundo precipitado (B) que se recogi de la misma manera que el precipitado A. El precipitado B estaba altamente enriquecido en -casena y contena cantidades aproximadamente iguales de s - - y -casena (gura 4). Pudo puricarse el precipitado B adems disolviendo en agua a pH 7,0, y volviendo a precipitar a pH 4,6 para reducir el contenido de sal de calcio. Se volvi a disolver el precipitado a pH 7,0, y se precipit de manera selectiva -casena con solucin de etanol al 50% mediante la adicin de una pequea cantidad de cloruro de sodio 2 M en etanol al 50%, mantenindose la mayor parte de las s - y -casenas en el sobrenadante. Se form el precipitado fcilmente y pudo separarse mediante centrifugacin a baja velocidad o ltracin. La fraccin era de aproximadamente el 65% de -casena (gura 6) y, ya que no estaban implicados materiales txicos, era adecuada como un ingrediente alimenticio.
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Se volvi a suspender el precipitado A en agua en aproximadamente la misma concentracin tal como en el caseinato inicial mediante agitacin vigorosa a 20C ajustndose continuamente el pH hasta 7,0 mediante la adicin de HCl 1 M. Despus de completarse la disolucin, se enfri la solucin hasta 2C y se ajust el pH hasta 4,5 mediante la adicin, con agitacin, de HCl 1 M. Se form un precipitado (C) y tras la agitacin durante 15 minutos a 2C, ste se recogi del sobrenadante (D) o bien mediante ltracin o bien centrifugacin a 2C. Este precipitado estaba altamente enriquecido en s -casena pero contena algo de -casena. Se redujo la cantidad de -casena en esta fraccin volviendo a disolver el precipitado en agua y repitiendo la precipitacin a 2C dos veces ms. El anlisis mostr que ms del 85% de la protena era s -casena (gura 5). Se calent el sobrenadante D hasta 35C y se ajust el pH hasta 4,6 mediante la adicin, con agitacin de volmenes pequeos de HCl 1 M. Se form un precipitado (E) que se recogi mediante centrifugacin o ltracin de la misma manera que el precipitado A. El anlisis mostr que ms del 95% de la protena era -casena (gura 5). Aplicaciones de las fracciones de casena puricada
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Las fracciones de casena puricadas pueden prepararse a gran escala, libres de materiales txicos, y pueden aadirse a los alimentos o usarse para preparar nuevos productos alimenticios. Las casenas individuales tienen estructuras y propiedades diferentes y pueden seleccionarse por tanto para dar propiedades funcionales ptimas para obtener un n particular. La -casena, por ejemplo, es ms hidrfoba y ms soluble en etanol que las otras casenas, mientras que la -casena es hidrla y precipita fcilmente con soluciones de etanol. Similarmente, las s -casenas, que son ricas en grupos fosfato, se unen fcilmente a iones divalentes y son mucho ms sensibles a concentraciones de calcio que la -casena, que tiene slo un nico grupo fosfato. Tambin, la -casena tiene propiedades especiales debido a su existencia como una serie de polmeros unidos a disulfuros, la presencia de cadenas laterales de hidratos de carbono hidrlos, y su capacidad de estabilizar a las otras casenas en soluciones acuosas. Las fracciones de casena tambin muestras diferentes susceptibilidades hacia diferentes enzimas, y son materiales de partida adecuados para preparar una amplia variedad de pptidos tal como se describe a continuacin. Durante la maduracin del queso, las casenas experimentan proteolisis y los pptidos y aminocidos resultantes producen una contribucin importante para el sabor de los quesos curados. En las etapas tempranas de la maduracin, quimosina y plasmina producen la proteolisis de pptidos de tamao grande e intermedio, mientras que en las ltimas etapas otras enzimas proteolticas producen pptidos cortos y por ltimo aminocidos. Sin embargo, la curacin es un proceso lento, y existe un potencial considerable para desarrollar sabores de queso mediante proteolisis rpida de casenas aisladas. Durante este proceso pueden producirse pptidos hidrfobos, especialmente de -casena, que tienen un sabor amargo. Las fracciones de casena puricadas descritas en el presente documento pueden usarse como materiales de partida que permiten ms control sobre el tipo de pptidos formados y los sabores desarrollados. La hidrlisis controlada de las casenas mediante condiciones cidas o alcalinas o mediante la proteolisis enzimtica limitada da pptidos que tienen capacidad de formacin de espuma mejorada, pudiendo difundirse las molculas pequeas ms rpido que las casenas originales hacia las supercies de contacto. Los pptidos de las casenas tienen las ventajas de ser estable frente al calor, tener baja alergenicidad y facilitar la unin al calcio. Los hidrolizados especcos tambin se usan para optimizar la tasa de fermentacin y aumentar el recuento celular de ciertas cepas de bacterias bioactivas en el procesamiento del yogurt. La disponibilidad de las fracciones puricadas obtenidas mediante el presente procedimiento facilita la produccin de una amplia variedad de pptidos que tienen las propiedades requeridas. Aunque la mayor parte de los alimentos de sustitucin de lactantes se basan en leche de vaca, la concentracin de la protena total en la leche humana es inferior, y las proporciones respectivas de las protenas individuales dieren considerablemente de las de la leche de vaca. En particular, la leche humana no contiene -lactoglobulina, y la proporcin respectiva de s -casenas es muy baja. En contraste, las proporciones respectivas de -lactoalbumina, lactoferrina y de - y -casenas son superiores en la leche humana. Tambin, la -casena que representa aproximadamente el 60% de la casena total en la leche humana, se produce como una serie de polipptidos fosforilados de manera diferente, siendo el grado global de fosforilacin inferior que en la leche de vaca. Se cree que las diferencias en la composicin pueden explicar algunos de los problemas asociados con la ingesta de leche de vaca por lactantes. Por ejemplo, la alergenicidad de la leche de vaca se ha relacionado en parte a la presencia de -lactoglobulina. Similarmente, las dicultades en la digestin pueden deberse a la textura ms dura de la cuajada formada en el estmago a pH cido, cuando la leche tiene menos de la -casena poco fosforilada y ms de las s -casenas altamente fosforilada. En los aos recientes, ha existido un cambio gradual en la fabricacin de frmulas de lactantes hacia la obtencin de un producto que se parezca estrechamente a la leche humana. La preparacin a gran escala de fracciones de casena individuales y suero que est parcialmente reducido en -lactoglobulina, tal como se describe en el presente documento, puede ayudar a conseguir esto. La -casena puricada puede desfosforilarse parcialmente mediante la accin de la fosfatasa, y recombinarse con -casena y el suero para dar leche que se parece estrechamente a la leche humana en la composicin de protena. En comn con muchas molculas sintticas o naturales de cadena larga, las casenas pueden reticularse para formar polmeros, normalmente mediante la aplicacin de calor y alta presin, seguido de tratamiento con formalina (en CASEIN AND ITS INDUSTRIAL APPLICATIONS, 1939, pginas 181-232, Reinhold Publishing Corporation, Nueva Cork, Brother, G.H. Casein Plastics). El proceso se us comnmente una vez para producir una amplia variedad de plsticos que tenan textura y color satisfactorios pero, debido al coste de los materiales de partida y el peligro de la formalina, se ha sustituido por mtodos que utilizan polmeros sintticos. Sin embargo, hay un mercado
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de recubrimientos de alimentos comestibles y plsticos biodegradables y, usando tcnicas de reticulacin ms suaves que implican la adicin de calcio a pH alcalino, es posible usar las fracciones de casena individuales descritas en el presente documento para producir un intervalo de plsticos blandos que tienen propiedades adecuadas.
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En los aos recientes se ha establecido que la ruptura proteoltica de las casenas en la leche, o durante la digestin, da un aumento de pptidos bioactivos que tienen funciones siolgicas especiales. Los pptidos bioactivos incluyen fosfopptidos, y pptidos con funciones antimicrobianas, antihipertensoras, inmunomoduladoras, antitrombticas y opioides (JOURNAL OF DAIRY SCIENCE, vol. 83, 2000, pginas 1187-1195. Clare, D.A. y Swaisgood, H.E. Bioactive milk peptides: A prospectus). Los fosfopptidos de casena se han identicado tras la liberacin de tripsina a partir de casenas individuales y, debido a las caractersticas de grupo de los residuos de fosfoserina y alta carga negativa de los centros de fosfato, se cree que funcionan como vehculos de diferentes minerales, especialmente calcio (PROCEEDINGS OF 25th INTERNATIONAL DAIRY CONGRESS, 1998, pginas 200-208. Holt, C. Casein structure and casein-calcium phosphate interactions. Los fosfopptidos de casena son en su mayor parte resistentes a la proteolisis enzimtica en el intestino y normalmente se encuentran formando complejos con fosfato de calcio. Esta formacin de complejos da como resultado un aumento de la solubilidad y una absorcin potenciada de calcio requerido para la calcicacin sea. Tambin, los fosfopptidos de casena inhiben lesiones de caries ayudando a recalcicar el esmalte dental, y se est promoviendo su aplicacin en el tratamiento de enfermedades dentales. Las casenas individuales dan un aumento de fosfopptidos diferentes, algunos de los que ya han encontrado aplicaciones como complementos dietticos y medicinas debido a sus capacidades de unir Fe, Zn y Cu, y la disponibilidad de las fracciones de casena puricadas descritas en el presente documento facilita su preparacin. Se han identicado diversos pptidos de casena con propiedades microbianas en la leche, incluyendo casosidina I de s2 -casena e isracidina de s1 -casena B. La isracidina previene ecazmente la mastitis en ovejas y cabras, y existe un potencial considerable para desarrollar adicionalmente los antibiticos especcos de este tipo. Diversos pptidos de las casenas inhiben la enzima de conversin de la angiotensina y por tanto, actan para reducir la tensin arterial. De estos pptidos bioactivos, uno es un fragmento de s1 -casena (s1 -casoquinina-5) y dos se obtienen de -casena (-casoquinina-7 y pptido antihipertensor). Tambin se ha establecido que los fragmentos de casena afectan al sistema inmunitario y las repuestas de proliferacin celular relacionadas. De estos pptidos bioactivos, un tripptido de -casena y un pptido de -casena han mostrado aumentar la proliferacin de los linfocitos de sangre perifrica.

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Varios pptidos de las casenas tienen propiedades antitrombticas y actan bloqueando los receptores especcos de las plaquetas durante la coagulacin sangunea. Estos pptidos incluyen los glucomacropptidos, y dos fragmentos ms pequeos de -casena que dan casoplatelina y pptido inhibidor de la trombina, respectivamente.
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Varios estudios han mostrado que algunos fragmentos de las casenas, los pptidos opioides, tienen propiedades similares a la morna. Los principales pptidos opioides son fragmentos de -casena, pero tambin pueden obtenerse mediante la hidrlisis de pepsina de s1 -casena. Las -casomornas son resistentes a las enzimas digestivas y en adultos sus inuencias siolgicas se limitan al aparato gastrointestinal, con efectos importantes sobre el tiempo del trnsito intestinal, la absorcin de aminocidos y el equilibrio de agua. Sin embargo, en recin nacidos las -casomornas pueden entrar en la circulacin sangunea promoviendo calma y sueo en los lactantes. Algunos pptidos, antagonistas opioides, ejercen los efectos opuestos de las -casomornas, y actan suprimiendo la actividad de la encefalina. Tres de estos, las casoxinas, son pptidos de -casena. El caseinomacropptido de -casena tambin tiene un efecto directo sobre el aparato gastrointestinal, e inhibe las secreciones del cido gstrico. El papel de los pptidos bioactivos de las casenas es un rea de investigacin de expansin, especialmente ahora que existe un mejor entendimiento de los procesos biolgicos a nivel molecular. La preparacin de casenas puricadas mediante el presente mtodo facilita la produccin de los diversos pptidos en forma pura. El mtodo novedoso de la presente invencin permite fraccionar la casena para dar material de pureza hasta ahora no alcanzada con costes marcadamente reducidos y libre de reactivos potencialmente nocivos. En particular, la presente invencin permite, por primera vez, la preparacin de material altamente enriquecido en -casena.

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REIVINDICACIONES 1. Mtodo de obtencin de fracciones de protenas puricadas de leche, que incluye las etapas de:
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i) aumentar el pH de la leche hasta aproximadamente pH 11; ii) aadir cloruro de calcio para precipitar de manera selectiva las fracciones;

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iii) disminuir el pH; y iv) separar las fracciones. 2. Mtodo segn la reivindicacin 1, en el que las fracciones son s -, -, y -casena.

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3. Mtodo segn las reivindicaciones 1 a 2, en el que las fracciones se separan mediante centrifugacin. 4. Mtodo segn las reivindicaciones 1 a 2, en el que las fracciones se separan mediante ltracin.

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5. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la leche es leche desnatada. 6. Mtodo segn la reivindicacin 3, en el que la centrifugacin se lleva a cabo a baja velocidad. 7. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adems la etapa de llevar a cabo la precipitacin a pH cido del sobrenadante obtenido a partir de la centrifugacin o ltracin, para obtener una fraccin altamente enriquecida en -casena. 8. Mtodo segn la reivindicacin 7, en el que el pH es 3,8.

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9. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende tambin las etapas de volver a disolver los componentes de s -, -casena en agua, y llevar a cabo la precipitacin isoelctrica selectiva repetida a pH cido y baja temperatura, para obtener una fraccin que principalmente contiene s -casena. 10. Mtodo segn la reivindicacin 9, en el que el agua est a pH 7,0 y 20C.

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11. Mtodo segn las reivindicaciones 9 a 10, en el que se enfra la solucin de las s -, -casenas tras volver a disolverse en agua, y ajustarse hasta pH cido. 12. Mtodo segn la reivindicacin 11, en el que se enfra la solucin de las s -, -casenas hasta 2C, y se justa hasta pH 4,5. 13. Mtodo segn las reivindicaciones 9 a 12, en el que se repite el procedimiento de volver a disolver y de volver a precipitar, dando una fraccin que contiene principalmente s -casena y una fraccin que contiene principalmente casena.

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14. Mtodo segn la reivindicacin 13, en el que se calienta el sobrenadante obtenido a partir de la precipitacin isoelctrica selectiva, y se trata mediante precipitacin con cido para recuperar la fraccin que contiene principalmente -casena. 15. Mtodo segn la reivindicacin 14, en el que se calienta el sobrenadante hasta 35C. 16.Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se aumenta el pH de la leche mediante la adicin de una solucin alcalina, y se disminuye mediante la adicin de una solucin cida.

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17. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se aumenta el pH de la leche mediante la adicin de hidrxido de sodio. 18. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la temperatura de la leche en la adicin de la solucin alcalina es de 30C.

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19. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que tras la etapa de aumentar el pH de la leche, se deja reposar la solucin durante un periodo de hasta 5 minutos. 20. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentracin nal de cloruro de calcio en la solucin es de 0,059 M. 21. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se disminuye el pH mediante la adicin de uno o varios cidos minerales.
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22. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende tambin la etapa de aumentar el pH de la fraccin altamente enriquecida en -casena, y llevar a cabo la ultraltracin para separar el material de bajo peso molecular de las casenas, protenas de suero y caseinomacropptido en la leche.
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23. Mtodo segn la reivindicacin 22, en el que se aumenta el pH hasta un valor neutro. 24. Mtodo segn las reivindicaciones 22 a 23, en el que se lleva a cabo la ultraltracin usando una membrana con un tamao de poro inferior a 25 kD, pero superior a 12 kD.

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25. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende tambin la etapa de disminuir el pH de la fraccin altamente enriquecida en -casena y llevar a cabo la ultraltracin para separar la protena de suero del caseinomacropptido. 26. Mtodo segn la reivindicacin 25, en el que se disminuye el pH hasta entre pH 4 y pH 5.

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27. Mtodo segn las reivindicaciones 25 a 26, en el que se lleva a cabo la ultraltracin usando una membrana con un tamao de poro superior a 7 kD, pero inferior a 20 kD.
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28. Mtodo de obtencin de fracciones de protenas puricadas a partir de una solucin de caseinato de sodio que incluye las etapas de: i) aumentar el pH de la solucin de caseinato de sodio hasta aproximadamente pH 11; ii) aadir cloruro de calcio para precipitar de manera selectiva las fracciones;

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iii) disminuir el pH; y iv) separar las fracciones.

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29. Mtodo segn la reivindicacin 28, en el que las fracciones son s -, -, -casenas. 30. Mtodo segn las reivindicaciones 28 a 29, en el que las fracciones se separan mediante centrifugacin. 31. Mtodo segn las reivindicaciones 28 a 30, en el que las fracciones se separan mediante ltracin.

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32. Mtodo segn la reivindicacin 31, en el que la centrifugacin se lleva a cabo a baja velocidad. 33. Mtodo segn las reivindicaciones 28 a 32, que comprende tambin la etapa de llevar a cabo la precipitacin a pH cido del sobrenadante obtenido a partir de la centrifugacin o ltracin, para obtener una fraccin altamente enriquecida en -casena. 34. Mtodo segn la reivindicacin 33, en el que el pH es 3,8.
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35. Mtodo segn las reivindicaciones 28 a 34, en el que la fraccin altamente enriquecida en -casena se precipita de manera selectiva con etanol para enriquecerla adicionalmente en -casena. 36. Mtodo segn la reivindicacin 35, en el que la fraccin altamente enriquecida en -casena se vuelve a disolver en agua a pH 7, se vuelve a precipitar a pH 4,6, y entonces de precipita de manera selectiva con etanol al 50% a pH 7 y a 25C con la adicin de una pequea cantidad de 2NaCl en etanol al 50%.

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37. Mtodo segn las reivindicaciones 28 a 36, que comprende adems las etapas de volver a disolver los componentes de s - y -casena en agua, y llevar a cabo la precipitacin isoelctrica selectiva repetida a pH cido y baja temperatura para obtener una fraccin que contiene principalmente s -casena.
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38. Mtodo segn la reivindicacin 37, en el que el agua est a pH 7,0 y 20C. 39. Mtodo segn las reivindicaciones 37 a 38, en el que se enfra la solucin de s - y -casena hasta 2C, y se ajusta hasta pH cido.

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40. Mtodo segn la reivindicacin 39, en el que se enfra la solucin de s - y -casena hasta 2C, y se ajusta hasta pH 4,5. 41. Mtodo segn las reivindicaciones 37 a 39, en el que se calienta el sobrenadante obtenido a partir de la precipitacin isoelctrica selectiva, y se trata mediante precipitacin con cido para recuperar la fraccin que contiene principalmente -casena.

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42. Mtodo segn las reivindicaciones 37 a 41, en el que se repite el proceso de volver a disolver y volver a precipitar, dando una fraccin que contiene principalmente s -casena, y una fraccin que contiene principalmente casena.
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43. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 42, en el que se aumenta el pH de la solucin de caseinato de sodio mediante la adicin de una solucin alcalina, y se disminuye mediante la adicin de una solucin cida. 44. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 43, en el que se aumenta el pH de la solucin caseinato de sodio hasta pH 11 mediante la adicin de hidrxido de sodio. 45. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 44, en el que la temperatura de la solucin de caseinato de sodio en la adicin de la solucin alcalina es de 30C.

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46. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 45, en el que tras la etapa de aumentar el pH de la solucin de caseinato de sodio, se deja reposar la solucin durante un periodo de hasta 5 minutos. 47. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 46, en el que la concentracin nal del cloruro de calcio en la solucin alcalina de caseinato de sodio ser de 0,071 M.

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48. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 47, en el que se disminuye el pH hasta pH 7,0 mediante la adicin de uno o varios cidos minerales.
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49. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 48, que comprende tambin la etapa de aumentar el pH de la fraccin altamente enriquecida en -casena, y llevar a cabo la ultraltracin para separar el material de bajo peso molecular de las casenas, protenas de suero y caseinomacropptido en la solucin de caseinato de sodio. 50. Mtodo segn la reivindicacin 49, en el que se aumenta el pH hasta un valor neutro.

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51. Mtodo segn las reivindicaciones 49 a 50, en el que se lleva a cabo la ultraltracin usando una membrana con un tamao de poro inferior a 25 kD, pero superior a 12 kD. 52. Mtodo segn una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 51, que comprende tambin la etapa de disminuir el pH de la fraccin altamente enriquecida en -casena, y llevar a cabo la ultraltracin para separar la protena de suero del caseinomacropptido. 53. Mtodo segn la reivindicacin 52, en el que se disminuye el pH hasta entre pH 4 y pH 5.

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54. Mtodo segn las reivindicaciones 52 a 53, en el que se lleva a cabo la ultraltracin usando una membrana con un tamao de poro superior a 7 kD, pero inferior a 20 kD.

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