Suero

CARACTERIZACION MOLECULAR DE BACTERIAS CIDO
LCTICAS AISLADAS DE SUERO COSTEO

VIVIANA SUREZ RAMREZ

UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERA
INGENIERA DE PRODUCCIN AGROINDUSTRIAL
BOGOTA
2007

CARACTERIZACION MOLECULAR DE BACTERIAS CIDO LCTICAS
AISLADAS DE SUERO COSTEO

Proyecto de grado para optar por el ttulo de Ingeniero de
Produccin Agroindustrial

VIVIANA SUREZ RAMREZ

Director del proyecto:

Maria Clementina Cueto Vigil, MSc en Ciencias

Asesor:

Yenny Gomez, MSc Biologa Molecular

UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE INGENIERA
INGENIERA DE PRODUCCIN AGROINDUSTRIAL
BOGOTA
2007

2

Nota de aceptacin:

V.B. Director Autor

3

TABLA DE CONTENIDO

Glosario.......................................................................................................................... 6
Resumen y Abstract....................................................................................................... 9
Introduccin.................................................................................................................... 9
OBJ ETIVOS.................................................................................................................. 10
Objetivo general............................................................................................................ 10
Objetivos especficos.................................................................................................... 10
1. MARCO TERICO................................................................................................... 11
1.1 Bacterias cido lcticas .......................................................................................... 11
1.2 Expresin gentica................................................................................................. 12
1.2.1 Estructura del ADN (cido Desoxirribonuclico) ................................................. 12
1.2.2 Sntesis de protenas........................................................................................... 12
1.2.3 Regin 16S.......................................................................................................... 13
1.3 Tcnicas de Identificacin Molecular...................................................................... 14
Mtodos basados en cidos nucleicos......................................................................... 15
1.3.1 Reaccin en cadena de la polimerasa................................................................. 15
1.3.2 Anlisis de Restriccin de ADN........................................................................... 16
Tipos de enzimas de restriccin: .................................................................................. 17
1.4 Estado del arte........................................................................................................ 18
2. METODOLOGIA...................................................................................................... 20
2.1 Cepas microbianas usadas para el estudio............................................................ 19
2.2. Extraccin ADN..................................................................................................... 20
2.3 PCR RFLP ........................................................................................................... 21
Amplificacin de fragmentos......................................................................................... 21
Anlisis de restriccin................................................................................................... 21
3. RESULTADOS Y ANLISIS..................................................................................... 23
4. CONCLUSIONES..................................................................................................... 27
Recomendaciones........................................................................................................ 28
BIBLIOGRAFIA............................................................................................................. 29
ANEXOS....................................................................................................................... 31

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Bacterias cido lcticas usadas para extraccin de ADN .............................. 20
Tabla 2. Iniciadores PCR.............................................................................................. 21
Tabla 3. Patrones de restriccin enzimtica con la enzima Alu I y HpyCH4 V de una
regin codificante de la subunidad 16s del ARN ribosomal de BAL
...................................................................................................................................... 23
Tabla 4. Anlisis general de los perfiles de restriccin de las muestras estudiadas con
la tcnica de PCR-RFLP
...................................................................................................................................... 24

4

TABLA DE ANEXOS

ANEXO 1. Protocolo para la amplificacin por PCR de la region V3 V9 del gen que
codifica para la subunidad 16S ribosomal................................................................... 31
ANEXO 2. Protocolos Electroforesis ............................................................................ 34
Protocolo electroforesis en gel de acrilamida............................................................... 34
Protocolo electroforesis en gel de agarosa ................................................................. 36
ANEXO 3.Protocolo para el anlisis bioinformtico de las especies de BAL............... 39
ANEXO 4.Protocolo digestin con enzimas de restriccin........................................... 40
ANEXO 5.Protocolo para la extraccin del ADN genmico de bacterias cido lcticas
(BAL)............................................................................................................................. 41
Extraccin con el estuche Wizard Genomic DNA Purification, Promega................... 41
Extraccin ADN bacteriano con el estuche comercial de Invitrogen.......................... 43
Evaluacin de la calidad y cantidad del adn genmico extrado a partir de BAL ......... 45
Reactivos necesarios.................................................................................................... 46
ANEXO 6. Resultados de la aplicacin de la tcnica de PCR-RFLP en la identificacin
de BAL.......................................................................................................................... 48
- Lactobacillus plantarum 1........................................................................................... 48
- Lactobacillus plantarum No. 2 .................................................................................... 50
- Lactobacillus plantarum No. 3 .................................................................................... 52
- Lactobacillus paracasei No. 1..................................................................................... 54
- Lactobacillus paracasei No. 2..................................................................................... 55
- Lactococcus lactis ...................................................................................................... 57
- Muestras para identificacin No. 1 (mezclas)............................................................ 59
- Muestras para identificacin No. 2............................................................................. 61

5

GLOSARIO

- ADN Polimerasa: enzima que sintetiza una cadena (o varias) de ADN bajo la
direccin de una plantilla o molde de ADN.

- Amplificacin: se refiere a la produccin de copias adicionales de una secuencia
cromosmica, que se encuentran como ADN intra o extra cromosmico.

- ATCC: (American Type Culture Collection) coleccin de microorganismos
identificados y caracterizados para fines de investigacin.

- Codn: triplete de nucletidos que representa un aminocido o una seal de
terminacin.

- Cromosoma: unidad discreta del genoma que transporta muchos genes.

- Deleciones: cambios generados por la eliminacin de una secuencia de ADN,
unindose las regiones que existan a cada lado.

- Desnaturalizacin: (del ADN, o del ARN); comprende la conversin desde la cadena
doble al estado cadena sencilla; la separacin de las cadenas se consigue sobre todo
mediante calentamiento.

- Divergencia: es la diferencia porcentual en secuencia de nucletidos entre dos
secuencias parecidas de ADN o en las secuencias de aminocidos entre dos
protenas.

- Endonucleasas: son enzimas que rompen unidades dentro de una cadena de un
cido nuclico; pueden ser especficas para el ARN o bien para el ADN de cadena
sencilla o doble.

- Extremos pegajosos o cohesivos: son cadenas complementarias sencillas de ADN
que provienen de extremos opuestos de un dplex (cadena doble) o de extremos de
diferentes molculas dplex; se pueden generar por cortes escalonados en el ADN
dplex.

- Fenotipo: es el aspecto u otras caractersticas de un organismo, que resulta de la
interaccin de su constitucin gentica con el medio.

- Gen: (o cistrn) segmento de ADN involucrado en producir una cadena;
polipeptdica; comprende regiones que preceden y siguen a la regin codificadora as
como secuencias intermedias (intrones) entre segmentos codificadores individuales
(exones).

- Insercin: la presencia de un tramo adicional de pares de bases en el ADN.

- Lisis: muerte de las bacterias por ruptura de su pared celular para liberar su material
gentico.
6

- Marcador: (de ADN) es un fragmento de tamao conocido que se usa para calibrar
un gel de electroforesis.

- Mutacin: cualquier cambio en la secuencia del ADN del genoma.

- pb: abreviatura de par de bases, la distancia a lo largo del ADN se mide en pb.

- PCR (reaccin en cadena de la polimerasa): tcnica en la que se utilizan ciclos de
desnaturalizacin, anillamiento o apareamiento y extensin con ADN polimerasa para
amplificar el nmero de copias de una secuencia diana de ADN.

- Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP): se refiere
a diferencias heredadas en los sitios de corte para las enzimas de restriccin que dan
lugar a diferencias en las longitudes de los fragmentos producidos por separacin con
la correspondiente enzima de restriccin.

- Secuencia de Shine- Dalgarno: es parte o toda la secuencia AGGAGG localizada
en el ARNm bacteriano justo antes de un codn de iniciacin AUG; es complementaria
a la secuencia del extremo 3 del ARNr 16S; participa en la unin del ribosoma al
ARNm.

7

Resumen

En la etapa previa de este proyecto (Evaluacin y modelacin matemtica de la
presencia de bacterias cido lcticas productoras de sustancias antimicrobianas de
inters industrial en el Suero Costeo) se identificaron 31 de 40 aislamientos de
bacterias cido lcticas (BAL) encontradas en muestras de suero costeo; dicha
identificacin se realiz usando la fermentacin diferencial de azucares (API 50-CHL)
de cada bacteria. En este estudio (Caracterizacin molecular de bacterias cido
lcticas aisladas de Suero Costeo) se extrajo y purific el ADN total de cada cepa a
partir del cultivo fresco de cada uno de las cepas haciendo uso de un estuche
comercial (Wizard DNA Purification Kit, Promega) y se utilizaron como controles las
cepas ATCC 12315 de Lactobacillus delbrueckii, una de Enterococcus faecalis y la
cepa WZ4174 de Lactobacillus plantarum. Se estandariz la tcnica de PCR
amplificando dos regiones del gen que codifica para la subunidad 16S ribosomal y se
us una de estas regiones (V3 a V9, 1050 pb aprox.) para la aplicacin de la tcnica
de RFLP. Se realiz digestin enzimtica a los fragmentos amplificados con las
enzimas de restriccin Alu I, y HpyCH4V. Los resultados confirmaron la identificacin
previa para algunas cepas, y mostraron posible variacin gentica a nivel de especie
para otras.

Abstract

During the first stage of this project (Mathematic evaluation and modelling of the
presence of industrially suitable antimicrobial-substance-producing acid lactic bacteria
in Suero Costeo), 31 out of 40 isolates of acid lactic bacteria obtained from samples
of an autochtonous whey (suero costeo, also known as sour cream) were identified;
such identification was carried using a method based on the differential sugar
fermentation (API 50-CHL ). In this study (Molecular typing of acid lactic bacteria
isolated from Suero Costeo) the DNA from each isolate was extracted using a
commercial kit (Wizard DNA Purificaction Kit, Promega ), and using ATCC 12315 of
Lactobacillus delbrueckii, Enterococcus faecalis and WZ4174 of Lactobacillus
plantarum, as control strains. The PCR technique was standardized by amplifying two
regions (V3 V9, 1050 pb approximately), and was used to apply the RFLP technique.
The amplified DNA fragments were digested with the restriction enzimes Alu I and
HpyCH4V, in order to obtain the polymorphisms for identification. The results confirmed
the previous identification for a few strains, and showed possible genetic divergence at
the species level for others.
8

Introduccin

Las BAL son de gran importancia en la industria alimentaria debido a sus metabolitos,
es decir que de acuerdo a las propiedades fermentativas (determinadas en este caso
por los productos de la fermentacin en cada especie) de estas bacterias, la oferta
alimenticia en sabores, textura, y conservacin son muy amplias. Entre los ms
relevantes se encuentra el cido lctico responsable del sabor de muchos alimentos y
los polisacridos usados como agentes emulsivos y gelificantes. Las oportunidades de
utilizacin varan segn el gnero y la especie por lo que se requiere la utilizacin de
tcnicas suficientemente especficas para la identificacin taxonmica. La metodologa
clsica para la identificacin se basa en la fermentacin diferencial de azcares y
presenta una limitada capacidad discriminativa para ciertas especies de importancia.
Debido a esto se han comenzado a emplear tcnicas basadas en biologa molecular
para la identificacin de estos microorganismos.

En un estudio llevado a cabo por la Facultad de Ingeniera de Produccin
Agroindustrial de la Universidad de La Sabana (Evaluacin y modelacin matemtica
de la presencia de bacterias cido lcticas productoras de sustancias antimicrobianas
de inters industrial en el Suero Costeo) se identificaron 31 aislamientos de BAL
presentes en muestras de suero costeo, mediante la metodologa basada en el perfil
bioqumico de fermentacin diferencial de azcares (API 50-CHL).

El objetivo del presente proyecto fue identificar por la tcnica de PCR-RFLP
(Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin basado en la amplificacin por
la reaccin en cadena de la polimerasa) las BAL aisladas a partir del suero costeo,
previa estandarizacin de los procedimientos involucrados y comparar los resultados
obtenidos por tcnicas de Biologa Molecular con los obtenidos por pruebas
bioqumicas. Asimismo, iniciar un banco de ADN que pueda ser usado para futuras
investigaciones en este campo.

Mediante la tcnica de PCR se amplificaron dos regiones de 1050 pb
aproximadamente (V3 a V9), y de 628 pb aproximadamente (V3 a V6) del gen que
codifica para la subunidad 16S ribosomal, los productos de PCR fueron visualizados
mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Para el anlisis bioinformtico de los fragmentos de digestin esperados, se
recuperaron las secuencias disponibles del ADN del gen 16S ribosomal de las
diferentes especies estudiadas con el sistema de recuperacin de secuencias del
Instituto Europeo de Bioinformtica. Se amplificaron y se digirieron los fragmentos in
silico utilizando las enzimas de digestin disponibles en las aplicaciones Digestion of
DNA sequences y REBsites. Posteriormente se estandariz en el laboratorio la
restriccin con la enzima seleccionada, visualizando los productos mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%.

El anlisis bioinformtico de la restriccin de las secuencias disponibles mostr mayor
discriminacin por patrones de corrido electrofortico con la enzima Alu I para el
fragmento amplificado de 1050 pb de los gneros y especies de BAL aisladas a partir
del suero costeo. Resultados preliminares de la restriccin enzimtica realizada en el
laboratorio para las cepas de Lactobacillus plantarum y Lactobacillus paracasei,
mostraron concordancia con los patrones obtenidos in silico e in vitro y se observaron
variaciones en el patrn de restriccin a nivel de especie.
9

OBJETIVOS

Objetivo general:

- Clasificar segn gnero y especie bacterias cido lcticas aisladas del suero costeo,
mediante el uso de tcnicas de Biologa Molecular.

Objetivos especficos:

- Estandarizar los protocolos para la clasificacin de bacterias acido lcticas por
mtodos de Biologa Molecular.

- Implementar los protocolos establecidos para la identificacin, y de esta forma
clasificar las bacterias cido lcticas.

- Comparar los resultados obtenidos por tcnicas de Biologa Molecular con los
obtenidos por pruebas bioqumicas.

- Crear un banco de ADN que pueda ser usado para futuras investigaciones en este
campo.

10
Marco Terico

1. MARCO TERICO

1.1 Bacterias cido Lcticas

Las BAL constituyen un grupo de bacterias Gram Positivas de caractersticas
complejas. La descripcin general para las bacterias de este tipo comprende entre
otras caractersticas las siguientes: son no esporuladas, morfolgicamente son cocos
o bacilos, y producen cido lctico como principal producto final de la fermentacin de
carbohidratos. Los lmites respecto a las especies que conforman este grupo han sido
objeto de controversia, pero histricamente se considera formado por los gneros de
Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus.

Los estudios taxonmicos de estos gneros y la descripcin de otros nuevos significan
que las BAL podran en lo que a su definicin general fisiolgica se refiere,
comprender alrededor de 20 gneros. Desde el punto de vista de la tecnologa de
alimentos, los siguientes gneros son considerados los principales de BAL:
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc,
Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, y Weisella.
La clasificacin de las bacterias cido lcticas en distintos gneros est basada
principalmente en su morfologa, modo de fermentacin de azcar, crecimiento a
distintas temperaturas configuracin del cido lctico producido, habilidad para crecer
en altas concentraciones salinas, y tolerancia cida o alcalina. Los marcadores
quimiotaxonmicos como las composiciones de los cidos grasos y los constituyentes
de la pared celular tambin se incluyen en la clasificacin. Algunos de los gneros
recientemente descritos son determinados ms fcilmente con pruebas de
oligonucletidos, tecnologas que usan estas secuencias basadas en reaccin en
cadena de polimerasa (PCR) o secuenciacin directa de los genes de ADNr 16S
(Salminen et al., 2004).

Los ribosomas bacterianos que participan en la elongacin de la cadena polipeptdica
(el ribosoma se une formando un complejo con el ARN mensajero en la sntesis de
protenas) estn constituidos por una subunidad pequea (30S) y una grande (50S). (S
corresponde a un coeficiente de sedimentacin de Svedberg, que se relaciona con la
masa molecular). La subunidad menor en los ribosomas bacterianos (30S), consta de
un ARNr 16S y 21 protenas. La subunidad mayor (50S) contiene ARNr 23S, un ARN
pequeo de 5S, y 31 protenas. El extremo 3 de la regin 16S es de vital importancia
en la sntesis de protenas, debido a que es el sitio de unin con el ARNm por
complementariedad. Esta regin ha sido ampliamente usada para identificacin
molecular de bacterias por contener informacin gentica especfica de cada especie
con respecto a las protenas funcionales de cada una, y por ser una regin comn en
el genoma de todas las especies bacterianas, por lo cual facilita su ubicacin y
diferenciacin entre microorganismos (Persing y Tenover, 2004).

11
Marco Terico

1.2 Expresin gentica

1.2.1 Estructura del ADN (cido Desoxirribonuclico)

Una molcula de ADN est constituida por dos cadenas largas de nucletidos con
polaridad opuesta, unidas entre s formando una doble hlice. Cada nucletido est
formado por una molcula de azcar ( desoxirribosa), una base orgnica nitrogenada -
bases pirimdicas como citosina (C), y timina (T), y bases pricas como adenina (A), y
guanina (G) y grupos fosfato. Los nucletidos se enlazan entre s a travs del grupo
fosfato formando cadenas en las que las bases nitrogenadas quedan en la parte
central unidas al carbono 1 del azcar. Las cadenas de polinucletidos que
constituyen una molcula de ADN se mantienen unidas entre s por puentes de
hidrgeno entre las bases nitrogenadas complementarias de ambas cadenas que
quedan enfrentadas.
La estructura primaria del ADN viene dada por la secuencia de nucletidos, que es
definida por la inicial de cada una de sus bases. El orden de la secuencia es muy
importante, ya que en l reside la informacin contenida en el cido nucleico; cada
triplete de bases conforma un codn, que a su vez es traducido en un aminocido la
orientacin viene dada en el sentido 5-3 o 3- 5; el 5 representa el extremo terminal
del fosfato y el 3 el extremo final del tomo de carbono de la desoxirribosa.
El ADN es una doble hlice antiparalela ya que el enfrentamiento entre las bases
nitrogenadas es constante; la adenina siempre se enfrenta por complementareidad
con la timina formando dos puentes de hidrgeno y la guanina siempre se enfrenta con
la citosina igualmente por complementareidad formando tres puentes de hidrgeno.
Esta caracterstica provoca que las dos cadenas sean complementarias. Las dos
cadenas de la doble hlice tienen sentidos opuestos, mientras una va en sentido 5- 3
y la otra lo hace en sentido 3- 5.

1.2.2 Sntesis de protenas
La expresin de un gen se desarrolla en un proceso de 2 fases:

1. - La transcripcin genera un ARN de cadena nica con una secuencia idntica a
una de las cadenas del ADN doble. En este proceso se generan diferentes tipos de
ARN. Las tres principales clases que participan en la sntesis de protenas son:
ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt) y ARN ribosmico (ARNr).

2. - La traduccin convierte la secuencia de nucletidos del ARN en la secuencia de
aminocidos que forman una protena. Un ARNm se traduce en una secuencia
protenica, el ARNt y ARNr proporcionan otros elementos componentes del proceso de
la sntesis de protenas. Cada triplete de nucletidos (codn) de la regin codificadora
representa un aminocido.

Slo se transcribe una de las cadenas de ADN doble en cada ARNm. La cadena de
ADN que dirige la sntesis del ARNm por medio de los pares complementarios de
bases se llama cadena molde, complementaria, o antisentido. La otra cadena de
12
Marco Terico
ADN tiene la misma secuencia que el ARNm (a excepcin de que contiene T en vez
de U) y se llama la cadena codificadora (Lewin, 2001).

El ARNt contiene una secuencia de trinucletidos llamada anticodn, y sta es
complementaria del codn que representa su aminocido. El anticodn permite que el
ARNt reconozca el codn por medio de las bases apareadas complementarias. Un
ARNm contiene una serie de codones que interactan con los anticodones de los
ARNt, de manera que se incorporen las correspondientes series de aminocidos en
una cadena polipeptdica.

El ribosoma proporciona el ambiente para controlar la interaccin entre el ARNm y el
ARNt. Todos los ribosomas de una clula son idnticos. Un ribosoma consta siempre
de dos subunidades, cada una de las cuales contiene un ARNr principal y un cierto
nmero de protenas pequeas. La subunidad mayor puede tambin contener ARN(s)
ms pequeos. En las bacterias, los ribosomas tienen una masa de 70S. La masa de
los ribosomas se describe tradicionalmente segn su coeficiente de sedimentacin
(aproximado), que se mide en unidades Svedberg, en que un valor S ms elevado se
corresponde con un mayor coeficiente de sedimentacin, y una masa mayor. El ARNm
se asocia con la subunidad menor y el ARNt entrante se une al sitio A (o sitio aceptor),
previa exposicin del codn que representa el siguiente aminocido que ms
recientemente se ha aadido a la cadena polipeptdica naciente se localiza en el sito P
(o sitio donante). El extremo del ARNt que transporta un aminocido se localiza en la
subunidad grande, mientras que el anticodn del otro extremo interacta con el ARNm
que est unido por la subunidad pequea. La formacin de la unin peptdica se
produce cuando el polipptido transportado por el peptidil-ARNt es transferido al
aminocido transportado por el aminoacil-ARNt (Lewin 2001).

1.2.3 Regin 16S

Se ha determinado que el ARN tiene actividades catalticas, y que el ARNr interacta
con el ARNm o con el ARNt en cada fase de la traduccin. Las protenas son
necesarias para mantener el ARNr en una estructura en la que pueda llevar a cabo las
funciones catalticas. Diversas interacciones afectan a regiones especficas del ARNr
(Lewin, 2001).

- El extremo 3del ARNr 16S interacta directamente con el ARNm en la iniciacin.

- Regiones especficas del ARNr 16S interactan directamente con las regiones del
anticodn de los ARNt tanto en el sitio A como en el sitio P.

- Las interacciones de las subunidades comprenden a los ARNT tanto 16S como 23S.

Estudios estructurales muestran que algunas regiones en particular del ARNr se
localizan en unos puntos importantes del ribosoma, y que modificaciones qumicas de
las bases dificultan algunas funciones ribosmicas en particular (Lewin, 2001).

Las mutaciones en el ARNr pueden tambin influir sobre la especificidad de la sntesis
de protenas. Un ejemplo puede ser que una mutacin en el dominio principal 3 del
ARNr 16S suprime codones UGA.

13
Marco Terico
Los cambios en la estructura del ARNr 16S se producen cuando los ribosomas estn
ocupados en sintetizar protenas. Algunos de los cambios en el ARNr 16S inician al
ensamblarse con las subunidades 50S, con la unin del ARNm o al unirse con el
ARNt. Esto indica que estos sucesos estn asociados con cambios en la conformacin
del ribosoma que afectan a la exposicin del ARNr.

El ARNr 16S participa en las funciones tanto del sitio A como del sitio P, y cuando
estos lugares se ocupan se producen cambios significativos en su estructura. Dos
regiones distintas estn protegidas por el ARNt unido en el sitio A. Uno est en el
regin terminal 3 y el otro se llama el asa 530 (y es tambin el punto de una mutacin
que impide la terminacin en los codones UAA,UAG y UGA) (Lewin, 2001).

La caracterizacin de BAL ha sido antes generalmente conducida por medio de
pruebas bioqumicas y morfolgicas de las colonias bacterianas, basando el tipo de
bacteria segn los azcares que fermenta, y los cidos producidos como cido actico
y cido lctico. Desafortunadamente, estos mtodos de caracterizacin no son
completamente acertados, pues se encuentra frecuentemente cepas que presentan
caractersticas intermedias que no las definen dentro de ninguna especie (Zhong et al.,
1998).

Por esta razn elegir el ARNr 16S para la identificacin de especies constituye una
buena alternativa, ya que es una regin presente en todas las especies bacterianas, y
es un agente de vital importancia en la sntesis de protenas, y de cuyo ensamblaje
con la subunidad 50S dependen las diferencias estructurales entre especies. Esto
permite ver variaciones genticas dentro de una misma especie, y as identificar cepas
nativas del producto en cuestin.

1.3 Tcnicas de Identificacin Molecular

El concepto de una conexin entre aislamientos de microorganismos de una fuente
particular es importante en la identificacin de caractersticas deseables producidas
por especies en condiciones especficas debido a algn agente en comn. A nivel de
especie bacteriana, hay suficiente diversidad gentica para permitir la identificacin de
diferentes grupos clonales (cepas que tienen un alto grado de relacin gentica) entre
aislamientos de la misma especie recolectados de distintas fuentes y momentos, o
asilamientos de distintas especies recolectados de una misma fuente. Esto se llama
subtipificacin, y se hace examinando diferentes caractersticas que permiten
discriminar a nivel de especie, en un conjunto de aislamientos (Swaminathan y Matar,
1993).

Los mtodos de identificacin molecular estn basados en la caracterizacin fsica de
molculas (cidos grasos, protenas, carbohidratos, cidos nucleicos, y otros
compuestos qumicos) producidos por las bacterias, y son de aplicacin a nivel
universal. Muchos factores influenciaron el desarrollo de estos mtodos : (i) los
avances hechos en cuanto a separacin de macromolculas y macromolculas, (ii) el
amplio acceso a instrumentos sofisticados que permiten la separacin de mezclas
qumicas complejas y la identificacin de los componentes por separado, (iii) la
disponibilidad de computadores personales y la posibilidad de hacer interfaces con
instrumentos analticos que permiten el anlisis de datos, y (iv) el desarrollo de la
tecnologa de cidos nucleicos que lleva a la adaptacin de estos mtodos sofisticados
en laboratorios modestamente equipados (Swaminathan y Matar, 1993.)

14
Marco Terico
Los mtodos de identificacin molecular se pueden clasificar en tres grupos basados
en el tipo de macromolculas usadas como blanco de identificacin: mtodos basados
en lipopolisacridos (LPS) y cidos grasos, mtodos basados en protenas, y mtodos
basados en cidos nucleicos.

Mtodos basados en cidos nucleicos

El desarrollo del aislamiento, separacin, y amplificacin de cidos nucleicos desde
1975, ha llevado a la aplicacin de mtodos basados en dichos cidos nucleicos para
muchos problemas epidemiolgicos e industriales especficos (Swaminathan y Matar,
1993). La biologa molecular se ocupa de estudiar los procesos celulares implicados
en la transmisin de la informacin gentica a nivel celular; esta informacin gentica
est localizada en unidades discretas (genes) los cuales codifican la informacin
valindose de molculas intermediarias como el ARN mensajero (Persing y Tennover,
2004). Estos genes estn a su vez compuestos por cidos nucleicos, u
oligonucletidos que son analizados en estas tcnicas.

Existen numerosas tcnicas que permiten aislar y estudiar la regulacin de un gen
determinado utilizando la gentica molecular para amplificarlo, caracterizar la especie
a que pertenece, y analizar el efecto de sus versiones alteradas.

1.3.1 Reaccin en cadena de la polimerasa

Es un procedimiento rpido para la amplificacin enzimtica in Vitro de un segmento
especfico de ADN.

La tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls),
fue ideada por Kary Mullis a mediados de los ochenta, y ha revolucionado la gentica
molecular al hacer posible un mayor acercamiento al estudio de los genes.

La PCR explota ciertos rasgos de la replicacin del ADN. La ADN polimerasa usa una
cadena sencilla de ADN como plantilla para la sntesis la cadena complementaria.
Estas plantillas de cadena sencilla de ADN se pueden producir simplemente
calentando la doble cadena de ADN a temperaturas cercanas a la ebullicin. La ADN
polimerasa adems requiere una pequea seccin de cadena doble de ADN para
iniciar la sntesis. De esta manera el punto de inicio para la sntesis de ADN puede
especificarse al proveer de un oligonucletido iniciador (primer) que se anilla a la
plantilla en este punto. Este es el primer rasgo importante de la PCR: que la ADN
polimerasa puede ser direccionada para sintetizar una regin especfica de ADN.
(Ausubel et al, 2005).

Para visualizar los fragmentos amplificados, se puede correr una electroforesis en gel
de agarosa. Este es un mtodo simple, y altamente efectivo para separar, identificar y
purificar fragmentos de 0.5 a 25 kb (kilobases) de ADN. Este proceso puede dividirse
en 3 etapas:
(1) Se prepara un gel con una concentracin de agarosa apropiada para el
tamao de los fragmentos de ADN a ser separados.
15
Marco Terico
(2) Las muestras de ADN son cargadas en las cmaras y el gel se corre a un
voltaje y por un periodo de tiempo que logre la separacin ptima.
(3) El gel es teido, o si el bromuro de etidio ha sido incorporado en el gel, es
visualizado directamente con iluminacin ultravioleta (UV). Posteriormente se
realiza el anlisis de las bandas evidenciadas con un equipo analizador de
imgenes. Dicho anlisis consiste en que cada banda corresponde al peso
molecular del fragmento amplificado, lo cual se verifica con un marcador de
peso molecular que se monta en la corrida. Se espera que el fragmento
amplificado difiera para cada especie del de las dems en suficientes pares de
bases de manera que se pueda diferenciar la banda segn su peso (Ausubel
et al., 2005).

1.3.2 Anlisis de Restriccin de ADN

El anlisis de restriccin de sitio provee un medio efectivo de determinacin de
variaciones en secuencias de ADN. Este mtodo involucra la comparacin del nmero
y el tamao de fragmentos producidos por digestin con una enzima de restriccin,
que es una enzima endonucleasa que corta el ADN en una posicin constante dentro
de un sitio especfico de reconocimiento usualmente compuesto de 4 a 6 pares de
bases (pb). Debido a la alta especificidad de las enzimas de restriccin, la digestin
completa de una ADN dado con una enzima de restriccin especfica provee un
arreglo reproducible de fragmentos. Estos fragmentos pueden separarse por
electroforesis en gel de agarosa o acrilamida, y visualizados por tincin con bromuro
de etidio.

Las variaciones en el arreglo de los fragmentos generados por una enzima de
restriccin especfica se llaman polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin
(RFLP, de su sigla en ingls). Los RFLP pueden resultar de reorganizacin de
secuencias, insercin o delecin de ADN, o sustitucin de bases en los sitios de
reconocimiento de las enzimas de restriccin. Los dos primeros tipos de cambios se
pueden observar con todas las enzimas de restriccin, mientras que el tercer tipo de
cambio se puede observar solamente con las enzimas de restriccin para las cuales el
sito de reconocimiento coincide con el sitio de sustitucin.

La seleccin de una enzima de restriccin para su uso en anlisis por RFLP se basa
en dos criterios importantes. Primero, los fragmentos de restriccin deben ajustarse al
anlisis en trminos de tamao y frecuencia. Los mejores resultados se obtienen con
fragmentos de restriccin de 1000 a 15,000 pb. Segundo, los fragmentos en este
rango de tamao no deben ser muy numerosos, para evitar solapamiento de bandas
que oscurecen las diferencias.

Las enzimas de restriccin son extradas de bacterias, donde actan como un
mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la
clula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para
distinguir entre el DNA extrao y el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden
cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extrao y no el DNA bacterial
(Swaminathan y Matar, 1993).

16
Marco Terico
Tipos de enzimas de restriccin:

Tipo I y Tipo III:
- Tienen actividad de restriccin (cortan) y modificacin (metilan).
- Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de
la secuencia de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo. Las tipo III
cortan de 5 8 pb antes o despus de la secuencia que reconocen.
- Necesitan ATP para moverse a lo largo de la molcula de ADN, desde el lugar de
reconocimiento, hasta el sitio de corte.

Tipo II:
- Slo tienen actividad de restriccin.
- Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
- Slo requieren Mg
++
como cofactor.
- No necesitan ATP.

Figura 1. Tipos de corte de las enzimas restriccin.
- Cohesivos o pegajosos:

GAATTC GGATCC AAGCTT
CTTAAG CCTAGG AACGAA

EcoRI BamHI HindIII

- Abruptos:

AATATT CCCGGG
TTATAA GGGCCC

SspI SmaI

Fuente: Rivera y Maldonado, 2006.

Los pasos bsicos en el anlisis por RFLP son (i) crecimiento de bacterias y
aislamiento y purificacin de ADN, (ii) amplificacin del fragmento de ADN a analizar
por tcnicas de PCR, (iii) tratamiento del ADN con una o ms enzimas de restriccin
bajo condiciones ptimas para obtener la digestin completa, (iv) separacin de los
fragmentos de restriccin por electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, y (v)
visualizacin de los fragmentos separados por tincin con bromuro de etidio.

El aislamiento y purificacin del ADN son pasos crticos en el anlisis por RFLP. El
ADN debe estar suficientemente libre de impurezas que inhiban a las enzimas de
restriccin y lleven a la digestin parcial o a que no haya corte. Los procedimientos de
aislamiento o extraccin de ADN varan dependiendo de la especie bacteriana. El ADN
genmico se asla fcilmente de bacterias Gram-negativas con un pretatamiento con
lisozima seguido de lisis con un detergente no inico. Es difcil lisar bacterias Gram-
positivas con el mtodo de lisozima y detergente. Algunas Gram-positivas se pueden
lisar eficientemente con pre-tratamiento de las clulas con enzimas lticas especficas.

17
Marco Terico
La eficiencia de la digestin de ADN genmico con enzimas de restriccin depende de
la pureza del ADN: Los contaminantes (protenas, polisacridos, fenol, cloroformo,
etanol, EDTA, SDS, y una concentracin inapropiada de sal), inhiben la actividad de
las enzimas de restriccin y llevan a una digestin incompleta del ADN. Los efectos
inhibitorios pueden superarse incrementando el nmero de unidades de la enzima en
la reaccin, incrementando el volumen de reaccin para diluir los contaminantes,
incrementando el tiempo de incubacin, o haciendo adiciones sucesivas de la enzima
despus de la incubacin por 1- 3 horas. Finalmente, algunas enzimas de restriccin
son inhibidas por mutilacin de nucletidos en el sitio de reconocimiento. No hay
solucin a este problema; se debe evaluar el uso de enzimas de restriccin que no se
afecten por mutilacin de nucletidos. Los RFLP de ADN amplificado por PCR no son
susceptibles a este problema pues el ADN amplificado por PCR no es metilado.

La ventaja del anlisis de restriccin de ADN cromosomal es que es universalmente
aplicable, sensible ya que el genoma entero puede ser evaluado para RFLP, y si no es
el genoma entero es un fragmento grande que permita ver diferencias especficas
entre especies en una misma regin, adems es relativamente fcil de aplicar
(Swaminathan y Matar, 1993).

1.4 Estado del arte

Se han usado tcnicas moleculares para caracterizar y diferenciar especies
bacterianas aisladas de alimentos, desde que se descubrieron las ventajas de este
tipo de identificacin. Se han diferenciado subespecies de Lactobacillus delbrueckii
aisladas de productos lcteos, cuyo ADN ha sido extrado por lisis con SDS y
perclorato de sodio, lavado con etanol y precipitado en buffer TAE, por medio de PCR
tradicional y RAPD (tcnica de amplificacin aleatoria polimrfica de ADN), logrando
distinguir entre las subespecies bulgaricus y lactis (Torriani, et. al, 1999).

Sin embargo, el diseo de primers estaba limitado en ese momento por la falta de
informacin en bases de datos sobre el genoma de esta especie. Ms recientemente,
se logr pulir la tcnica del diseo de estos primers mediante el uso de las
herramientas bioinformticas que permiten el acceso al GenBank, y la rpida
comparacin de secuencias de nucletidos. En el 2003 se analiz la diversidad
microbiana durante la elaboracin del queso Ragusano, un queso artesanal producido
en Sicilia (Italia), y mediante la amplificacin y secuenciacin de las regiones V6 a V8,
y V1 a V3, se encontraron miembros de los gneros Lactobacillus, Streptococcus,
Enterococcus, Pediococcus y Lactococcus utilizando el GenBank (Randazzo, et al. ,
2002). Hace poco se disearon varios sets de primers para la identificacin de
Lactobacillus plantarum entre varias especies bacterianas aisladas del vino, mediante
aplicacin de DGGE (tcnica de electroforesis en que se adiciona un exceso de
guaninas y citosinas a uno de los iniciadores, y el gel ubica por gradientes de
diferencias de peso molecular los productos de la amplificacin), lo cual la separ de
otras especies bacterianas y levaduras (Lpez et al., 2003).

Se ha diferenciado entre todas las especies del gnero Leuconostoc mediante el uso
de PCR RFLP (tcnica en se usan enzimas endonucleasas repeticin), de manera
exitosa (J ang, 2002). Se han aislado cepas de varias especies de Leuconostoc a partir
del kimchi, un alimento vegetal fermentado de Corea. Se amplific su regin gnica
16S de ADNr, y se diferenciaron 6 cepas de Leuconostoc con la aplicacin de PCR
RFLP , mediante la digestin con 4 enzimas endonucleasas, MseI, HaeIII, Tsp5091, y
BsmAI (Kim, 2003.)
18
Marco Terico

Recientemente, se aislaron varios microorganismos de alimentos probiticos, en
especial del gnero Lactobacillus. En dicho estudio se pretenda encontrar nuevas
cepas de Lactobacillus que pudieran ser usadas como vehculo transgnico para
inmunizar el pollo contra la coccidiosis, como agentes antagnicos contra bacterias
patgenas durante el procesamiento de queso y almidn de casava de manera que se
incrementara la inocuidad y calidad de los alimentos, y como medicina viva contra la
vaginosis y vaginitis femeninas (Moreira, et. al, 2005).

En estudios previos se haba notado que es difcil la identificacin de BAL por medios
fenotpicos en muchos casos, debido a que requiere la determinacin de propiedades
bacterianas ms all de las pruebas comunes de fermentacin (Tannock et al., 1999.)
Debido a esto, Moreira y colaboradores encontraron que en estudios anteriores se
haba usado la regin 16S para identificacin de Lactobacillus (Zhong et al., 1998) y
decidieron amplificar la regin del espaciador intergnico de 16S-23S de ADNr.
Despus realizaron el anlisis in silico para encontrar las enzimas de restriccin que
mejor digirieran estas secuencias de nucletidos, y encontraron 11 enzimas que
permitan diferenciar entre especies. Los patrones obtenidos por la digestin del
espaciador corto 16S 23S permitieron diferenciar entre la mayora de especies, pero
en el caso de L. acidophilus, L. helveticus, y L. amylovorus, se obtuvo el mismo patrn,
que era el esperado para L. acidophilus. Para lograr la diferenciacin entre estas
especies, se realiz la digestin en el espacio intergnico 16S- 23S de RNAr con el
mismo conjunto de enzimas usadas para la digestin del espaciador corto, y los
patrones permitieron diferenciar entre L. acidophilus y L. helveticus. Para la
diferenciacin de L. amylovorus se hizo secuenciacin de los nucletidos del
espaciador intergnico 16S- 23S de RNAr amplificado (Moreira, et al, 2005).

En una investigacin anterior a este proyecto se aislaron 40 cepas de bacterias cido
lcticas las cuales se aislaron por medio de cultivos sucesivos en MRS (Man, Rogosa
and Sharpe), y se realiz la identificacin bioqumica de 36 de stas tras determinar el
perfil de fermentacin de azcares usando el mtodo API de Biomerieux (API ,
Biomerieux Industry, France) A partir de esta informacin se seleccionaron por
referencias bibliogrficas las herramientas con la cuales se elabor esta primera
clasificacin de tipo molecular.

19
Metodologa

2. METODOLOGIA

2.1 Cepas microbianas usadas para el estudio

Tabla 1. Bacterias cido lcticas usadas para la extraccin de ADN
Cepa Identificacin bioqumica
204 L. plantarum 1
97 L. plantarum 1
105 L. plantarum 1
236 L. paracasei paracasei 1
10 L. acidophilus 3
206 Leuconostoc lactis
40 Lactobacillus brevis 1
1 L. plantarum 1
121 L. plantarum 1
2 L. pentosus
47 L. plantarum 1
67 L. plantarum 1
105 L. plantarum 1
120 L. plantarum 1
238 L. plantarum 1
187 L. plantarum 1
156 Lactococcus lactis 2
403 Sin identificacin
393 L. rhamnosus
207
Leuconostoc mesenteroides
cremoris
116 L. plantarum 1
292 L. plantarum 1
235 L. plantarum 1
20
Metodologa
157 L. plantarum 1
Fuente: Cruz, 2006.

2.2. Extraccin ADN

Se tom una perla crioconservada de cada cultivo y se adicion a un tubo de 5 ml de
caldo de cultivo MRS, y se incub a 37 C durante 24 horas o hasta que se present
turbidez. Luego se tomaron 100 l de este caldo, y se adicionaron a un tubo de 10 ml
de caldo de cultivo MRS, y nuevamente se incubaron a la misma temperatura durante
24 horas o hasta que se present turbidez, la cual se evalu de forma cualitativa. Se
centrifugaron los tubos a 11000 rpm (16248 g) segn el tamao del rotor de la cf
durante 5 minutos, se descart el sobrenadante, y las clulas se almacenaron en un
tubo Eppendorf de 1.5 ml, que se incuba a 37C hasta su uso.

Se extrajo el ADN total a partir del cultivo fresco de las cepas (Tabla 1) usando un
estuche comercial (Wizard DNA Purification Kit, Promega) y se utilizaron como
controles la ATCC 12315 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland,
USA), de Lactobacillus delbruecki, una de Enterococcus faecalis y la cepa WS4174 de
Lactobacillus plantarum (Loessner et. al, 2003). Se verific la concentracin de ADN
extrado en el espectrofotmetro con 1l de muestra del ADN en 1 ml de Buffer TE 1X,
y se tomaron las lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm, que corresponden a las
absorbancias del ADN y las protenas suspendidas en la muestra por adherencia al
ADN, respectivamente. Estos valores fueron llevados a trminos de concentracin
multiplicndolos por el factor de dilucin segn el volumen de la celda de medicin.

2.3 PCR RFLP

Amplificacin de fragmentos

En la estandarizacin de la tcnica de PCR se amplificaron dos regiones de 1050 pb
aproximadamente (V3 a V9), y de 628 pb aproximadamente (V3 a V6) del gen que
codifica para la subunidad 16S ribosomal. Los iniciadores se seleccionaron con base
en estudios previos con bacterias similares (Lpez, et. al, 2003).

Tabla 2. Iniciadores PCR
Inciadores Secuencia Fragmento
HDA 1 5- ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT - 3
WLAB 2 5- TCGAATTAAACCACATGCTCCA - 3
WBAC 2 5- CCCGGGAACGTATTCACCGCG -3
628 pb
aprox.
1050 pb
aprox.

Fuente: Lpez, et. al, 2003
21
Metodologa

Se llevaron los iniciadores liofilizados a la concentracin deseada segn la reaccin.
Se prepar una mezcla con cloruro de Magnesio, Buffer de reaccin (Tris-HCl), dNTPs
(dATP,dCTP,dTTP,dGTP), la pareja de iniciadores en la concentracin adecuada,
enzima de restriccin o Taq Polimerasa, y la muestra de ADN. Adems en otro tubo se
prepar un blanco en el que se mezclaron los componentes sin el ADN para ser
comparado al visualizar los resultados (Anexo 1, Tablas 3 y 5).
Se programaron en el termociclador los ciclos de temperatura segn los iniciadores
utilizados, y el tamao del fragmento a amplificar. Cada pareja de iniciadores trabaja
con temperaturas de desnaturalizacin y anillamiento diferentes (Ausubel, et al, 2005).
Los productos de PCR fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa
al 2% (Anexo 2, Tablas 3 y 4).

Anlisis de restriccin

Se seleccionaron dos enzimas que permitieran diferenciacin por patrones de
restriccin entre especies (Alu I, y HpyCH4V), por medio de bsquedas en la
aplicacin informtica REBsites. Para el anlisis bioinformtico de los fragmentos de
digestin esperados, se recuperaron las secuencias disponibles del ADN del gen 16S
ribosomal de las diferentes especies estudiadas con el sistema de recuperacin de
secuencias del Instituto Europeo de Bioinformtica. Se amplificaron y se digirieron los
fragmentos in silico utilizando las enzimas de digestin disponibles en las aplicaciones
Digestion of DNA sequences y REBsites. Posteriormente se estandariz en el
laboratorio la restriccin con estas enzimas, visualizando los productos mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%. Debido a que present un patrn de
restriccin ms definido, se eligi la enzima Alu I para el anlisis de restriccin de las
cepas. Para confirmar los resultados obtenidos se digirieron algunas muestras que
presentaban patrones similares con la enzima HpyCH4V. Finalmente se secuenciaron
algunas muestras para confirmar la identificacin.

22
Resultados y Anlisis

3. RESULTADOS Y ANLISIS

Tras realizar la digestin con cada una de las enzimas de restriccin (Alu I y
HpyCH4V) a cada uno de las cepas, se encontr que varios tenan un patrn de
bandeo en comn, lo cual nos indicaba que poda pertenecer a la misma especie. Por
esta razn se agruparon estos aislamientos con letras (restriccin con Alu I), y
nmeros (restriccin con HpyCH4V), segn especies con las que reflejaran una alta
similitud, segn los patrones predichos por Bioinformtica (Anexo 3) para cada una de
las especies de estudio, segn la identificacin bioqumica previa. Algunos de las
cepas presentaron un patrn que no correspondan a ninguna de las especies
estudiadas.

Tabla 3. Patrones de restriccin enzimtica con la enzima Alu I y HpyCH4 V de una
regin codificante de la subunidad 16s del ARN ribosomal de BAL
Enzima de
restriccin
Patrn de
bandeo
Bandas (pb) Observaciones
A 594, 214, 200, 111.
Es el patrn de la cepa de referencia L.
plantarum WS4174
B 567, 207.
Similar al patrn A, se diferencia por la
ausencia de la banda 112 pb esperada.
C 540, 202, 160, 106. Enterococcus faecalis
D
390, 265, 207, 150, 106,
40.
Similar al patrn C, presenta una banda
adicional de 265 pb.
E 636, 254, 207, 100.
Es el patrn de la ATCC 4356 L.
delbtueckii
F 360, 235, 207, 106 Patrn nico
G 500, 265, 207, 106. Patrn nico
H 635, 305, 211, 103. Enterococcus faecalis
Otros patrones
800, 207, 105.
390, 207, 150.
207, 131.
Alu l
110

1 320, 245, 205, 195, 65.
Patrn de la cepa de referencia L.
plantarum WS4174
2 330, 255, 220, 150, 80, 52. Enterococcus faecalis
3 330, 255, 220, 80, 52.
Similar al patrn 2, no presenta la
banda 150 pb.
4 308, 295, 255, 88, 61. Patrn de la ATCC 4356 L. delbtueckii
5 393, 320, 263, 72.
Patrn predicho por bioinformtica para
L. paracasei
6 265, 207, 198, 140, 97, 78. Patrn nico
7 265, 207, 198, 140, 78.
Similar al patrn anterior, no se
visualiza la banda de 97 pb.
HpyCH4 V
8 317, 215, 205, 193 Patrn nico

23
En algunos casos el mismo aislamiento se corri en ms de una ocasin para
verificacin, presentando algunas leves variaciones. Cada fila en la tabla representa la
corrida de un gel con el tamao de las bandas obtenidas, con respecto a un patrn de
comparacin (ATCC, o cepas conocidas), para verificacin.

En la Tabla 4 se observa el anlisis general de los perfiles de restriccin de las
muestras estudiadas con la tcnica de PCR-RFLP. Se agruparon las cepas segn la
especie a la que pertenecan segn la identificacin molecular. En algunas de las
cepas la identificacin mediante las enzimas de restriccin correspondi con la
identificacin bioqumica anterior, sealando que se confirmaba la especie a la que
pertenecan, como es el caso de los aislamientos 236 (L. paracasei), y el 1 (L.
plantarum).

Tabla 4. Anlisis general de los perfiles de restriccin de las muestras estudiadas con la
tcnica de PCR-RFLP
Patrn de restriccin
No. Muestra
Alu I HpyCH4V
Identificacin por el sistema API Observaciones
L. plantarum
WS4174
A 1 -
204 A 6 L. plantarum 1
97 A L. plantarum 1
236 A MP 8 L. paracasei paracasei 1
272 A 7 L. paracasei paracasei 1
10 A MP 6 L. acidophilus 3
206 A MP 5 Leuconostoc lactis
40 A OP Lactobacillus brevis 1
279 A L. paracasei paracasei 1

1 B MP L. plantarum 1
97 B L. plantarum 1
121 B MP L. plantarum 1

Enterococcus
faecalis
C 2 -
2 C 2 L. pentosus
47 C L. plantarum 1
67 C L. plantarum 1
105 C OP L. plantarum 1
120 C 3 L. plantarum 1
238 C L. plantarum 1
187 C L. plantarum 1
156 C Lactococcus lactis 2
403 C Sin identificacin
200 C L. paracasei paracasei 1
393 C L. rhamnosus
207 C OP
Leuconostoc mesenteroides
cremoris

116 D L. plantarum 1
24

L. delbrueckii
ATCC 4356
E 4 -

292 F L. plantarum 1
2 bandas de
diferencia
con el patrn C
233 G L. paracasei paracasei 1
2 bandas de
diferencia
con el patrn C

235 H OP L. plantarum 1

Otros patrones
Banda de alto
peso, patrn no
claro.
157 L. plantarum 1 Patrn nico.
205 L. paracasei paracasei 1 Patrn nico..
muestras a las que se repiti la digestin enzimtica.
MP: aislamiento ubicado en el mismo patrn que presentaba,
OP: aislamiento ubicado en otro patrn.

En otros aislamientos los patrones de bandeo de la restriccin mostraron que
pertenecan a una especie diferente a la anteriormente definida por medios
bioqumicos, y en otros aislamientos el patrn no era suficientemente claro por lo que
se repiti la digestin enzimtica, como por ejemplo el aislamiento 207, que por
identificacin bioqumica (API) se haba clasificado como Leuconostoc mesenteroides
cremoris,, pero en el primer corrido no se encontr patrn comn con ninguna especie,
y al repetirse el corrido con Alu I se encontr que corresponda a al patrn de
Enterococcus faecalis.

Tras varias repeticiones de la digestin enzimtica y corridos electroforticos, se
concluyeron los resultados de la identificacin como se muestra en la lista de
aislamientos (Tabla 4). Las cepas que muestran patrones que no son concordantes
con ninguna especie estudiada, muestran que las especies son producto de la
variacin gentica debida a mutaciones que alteran las secuencias de aminocidos, y
por lo tanto las de nucletidos en el ADN de las especies. Las cepas que mostraron
correspondencia con la identificacin previa, confirman los resultados obtenidos
anteriormente, pero por otro lado las especies que fueron identificadas de manera
diferente por tcnicas moleculares, confirman la especificidad del mtodo basado en la
secuencia de ADN.

Se ha reportado anteriormente la poca confiabilidad en la identificacin por medio de
API 50 CHL, (Nigatu, 2000), y esta identificacin lo ratifica, pues es una tcnica que
no toma en cuenta las mutaciones que puede sufrir una especie bacteriana. Ya que
API es una tcnica basada en la digestin de azcares especficos para cada especie,
es vulnerable al error de resultados, pues las especies que han sufrido variacin
gentica pueden en un determinado momento desarrollar afinidad por azcares que
tiene alta disponibilidad en el medio, como mtodo de adaptacin. De esta forma las
especies evolucionan, y estas mutaciones en su ADN se convierten en caractersticas
favorables de supervivencia. Por esta razn se presentaron en los resultados patrones
que eran semejantes a otros y se diferenciaran por una o dos bandas, aunque no
correspondieran a ninguna especie reportada en el GenBank. Adems la prueba de

25
API carece de referencias para Enterococcus faecalis, por lo que las cepas
pertenecientes a esta especie fueron identificadas de manera diferente por esta
tcnica bioqumica. Por estas razones, las tcnicas de identificacin molecular se han
convertido en protocolo por excelencia en la identificacin de especies.

26
Conclusiones

4. CONCLUSIONES

Se logr la estandarizacin de los protocolos necesarios para la clasificacin de
bacterias acido lcticas por mtodos de Biologa Molecular: extraccin de ADN,
amplificacin de ADN por PCR y uso de enzimas de restriccin.

Se implementaron los protocolos establecidos para la identificacin, y de esta forma se
hizo una clasificacin preliminar de las bacterias cido lcticas. Adems se
implement la herramienta de anlisis bioinformtico para la clasificacin de las cepas
estudiadas.

Se compararon los resultados obtenidos por tcnicas de Biologa Molecular con los
obtenidos por pruebas bioqumicas, demostrando la especificidad de los mtodos
moleculares.

Solo un 16.13% (5 de 31 aislamientos previamente identificados por API) correspondi
a la identificacin bioqumica.

Se identificaron 3 de 5 cepas que no haban podido clasificarse por medio de la prueba
de API.

Se inici el banco de ADN que podr ser usado para futuras investigaciones en este
campo.

27
Conclusiones

RECOMENDACIONES

Para lograr mayor especificidad en los resultados se recomienda usar ms enzimas de
restriccin de manera que se tengan ms patrones de comparacin que permitan
mayor discriminacin entre especies.

Tambin se recomienda el uso de ms cepas de referencia, de manera que haya ms
cepas estndar contra los cuales comparar las cepas de estudio, y de esta forma se
puedan identificar todos los perfiles de restriccin obtenidos, y por lo tanto, todas las
especies aisladas.

Para futuras investigaciones se aconseja confirmar los resultados obtenidos por medio
de la secuenciacin de los fragmentos de ADN, de manera que haya mayor
confiabilidad en dichos resultados, y se pueda descartar errores de interpretacin.

28

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Identification of Lactobacillus Isolates from the Gastrointestinal Tract,Silage, and Yoghurt by
16S- 23S rRNA Gene Intergenic Spacer Region Sequence Comparisons.

Torriani, S., Zapparoli, G., Dellagio, F., 1999. Use of PCR-Based Methods for Rapid
Differentiation of Lactobacillus delbrueckii sups. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. lactis.

Zhong, W., Millsap, K., Bialowska-Hobrzanska, H. Reid,G., 1998.Differentiation of
Lactobacillus Species by Molecular Typing.

Rivera, O., Maldonado, I. Universidad de Puerto Rico. Curso Biologa General, Laboratorio
12. En: http://www.uprm.edu/biology/cursos/biologiageneral/EnzimasDNA.htm>[ Consulta: Septiembre
2006 ]

http://industry.biomerieux-usa.com/industry/food/api/index.htm [ Consulta: Septiembre 2006 ]

http://www.promega.com/catalog/country_select.asp?/enotes/applications/ap0063.htm&ckt=2

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ [ Consulta: Enero 2006 ]

http://tools.neb.com/REBsites/index.php3 [ Consulta: Febrero 2006 ]

http://www.idtdna.com/ [ Consulta: Enero 2006 ]

30

ANEXOS

31

ANEXO 1

PROTOCOLO PARA LA AMPLIFICACIN POR PCR DE LA REGION V3
V9 DEL GEN QUE CODIFICA PARA LA SUBUNIDAD 16S RIBOSOMAL

Tabla 1. Iniciadores
Inciadores Secuencia Fragmento
WLAB 2 5- TCGAATTAAACCACATGCTCCA - 3
WBAC 2 5- CCCGGGAACGTATTCACCGCG -3
628 pb
aprox.
1050 pb
aprox.

Fuente: Lpez, et. al. 2003

1. PCR Amplificacin 628 pb
Iniciadores HDA1- WLAB2

Amplifican regin V3 a V6 del gen que codifica para la regin 16S de ADN ribosomal.

- Programacin Termociclador

Tabla No. 2. Ciclos de temperatura PCR 628 pb.

Temperatura Tiempo
95C 5 min
92C 1 min
59C 1.5 min
72C 1 min
72C 10 min

- Volmenes de reaccin

Tabla No. 3. Volmenes de reaccin de PCR 628 pb.
Fuente: (Integrated DNA Technologies)
Reactivo
Concentracin
inicial
Concentracin
final
Volumen requerido
para 1 muestra (l)
Buffer 10x 1x 2,5
Cloruro de Magnesio 50 mM 2 mM 1
dNTPs 10 mM 0.6 mM 1,5
Iniciador A 50 M 4 M 1
Iniciador B 50 M 4 M 1
Taq Polimerasa 2.5 u/l 0.1 u 0.5
Agua - - 14
ADN - - 3
Volumen total - - 25

32

2. PCR Amplificacin 1050 pb
Iniciadores HDA1 WBAC2

Amplifican regin V3 a V9 del gen que codifica para la regin 16S de ADN ribosomal.

- Programacin termociclador

Tabla No. 4. Ciclos de temperatura PCR 1050 pb.
Temperatura Tiempo
95C 5 min
92C 1 min
63C 1.5 min
72C 1 min
72C 10 min

- Volmenes de reaccin

Tabla No. 5. Volmenes de reaccin PCR 1050 pb
Fuente: (Integrated DNA Technologies)
Reactivo Conc. Inicial Conc.final
Vol. Reaccin
Muestra
Buffer 10x 1x 2,5 l
Cloruro de Magnesio 50 mM 2 mM 1 l
dNTPs(oligonucletidos) 10 mM 0.6 mM 1,5 l
Iniciadores 50 M 4 M 2 l ( 1 l c/u.)
Taq Polimerasa 5 u/l 0.1 u 0.5 l
Agua - - 14 l
ADN - - 3 l
Cantidad total - - 25 l
.
Procedimiento.

1. Preparar las mezclas segn los volmenes de reaccin indicados en las Tablas No.
3, y No. 5, en un tubo Eppendorf de 0.2 ml.

2. Preparar un blanco o control negativo de reaccin paralelamente, con todos los
reactivos excepto el ADN, y adicionar un control positivo a la reaccin (cepa conocida
de control).

3. Llevar al termociclador (iCycler Termal Cycler, Bio-Rad) segn la programacin
para cada fragmento a amplificar, indicada en las Tablas No. 2 y No. 4.
33

Consideraciones generales:

- Los iniciadores y reactivos de PCR deben manipularse con cuidado en un rea
aislada exclusivamente para esta parte del procedimiento, pues son altamente
susceptibles de contaminacin, y deben almacenarse a la temperatura indicada en el
inserto.

34

ANEXO 2
PROTOCOLOS ELECTROFORESIS

PROTOCOLO ELECTROFORESIS EN GEL DE ACRILAMIDA

1. Preparacin.

Tabla No. 1. Preparacin de gel acrilamida al 12%.
Reactivo Volumen
Agua 3 ml
Acrilamida 29.2 g/Bisacrilamida 0.8 g 2.4 ml
TBE 10X 0.6 ml
TEMED 10 l
Persulfato de Amonio 10% 0.1 ml
( Ausubel, et. al, 2005., Current Protocols in Molecular Biology.)

Procedimiento.

1. Ensamblar los vidrios de la cmara de electroforesis (Mini PROTEAN II
Electrophoresis Cell, Bio-Rad), colocando el ms grande atrs y el ms
pequeo adelante, y sujetarlos con el soporte de prensa.

2. Colocar la tirilla de espuma en la parte inferior de la base, y colocar el
soporte con los vidrios sobre la espuma. Sujetarlos con la prensa en la parte
superior de la base.

3. Verificar que no haya escape de lquido usando agua, y luego retirarla por
un lado y con ayuda de papel filtro.

4. Preparar la mezcla segn las indicaciones de la Tabla No. 1, y servir entre
los vidrios hasta el tope, verificando que no se escape el lquido por la parte
inferior de los vidrios.

Nota: es recomendable agregar como ltimo reactivo el Persulfato de
amonio, ya que este acelera el proceso de polimerizacin.

5. Colocar el peine entre los vidrios inmediatamente para que se formen los
pozos en el gel, y dejar polimerizar durante 20 minutos.

2. Montaje en cmara.
Tabla No. 2. Preparacin mezcla para pozos electroforesis vertical.
Muestra Buffer corrida
6 l ADN 2 l
0.5 l Marcador de peso molecular 1.5 l

35

Procedimiento.

1. Retirar el peine con cuidado y retirar los vidrios de la base.

2. Colocar los vidrios juntos en un espacio del soporte interior de la cmara,
con el vidrio ms grande adelante(hacia el exterior de la cmara) y el ms
pequeo atrs( hacia el interior de la cmara). Si slo se va a montar un
juego de los vidrios, colocar la presa de plstico como barrera en el otro
espacio del soporte.

3. Llenar con buffer TBE 1X el espacio en el soporte interior que queda
formado por los dos juegos de vidrios o los vidrios y la presa, hasta el tope.
Verificar que no haya escape de lquido por la parte inferior antes de
completar en montaje.

4. Llenar los pozos con la mezcla segn las indicaciones de la Tabla No. 2.

5. Colocar el soporte dentro de la cmara, y llenar sta hasta la mitad de su
volumen con buffer TBE 1X.

6. Colocar la tapa de la cmara y conectarla a la fuente, y correr la
electroforesis a 80V durante 160 minutos.

3. Visualizacin.

1. Apagar el equipo y retirar el soporte con los vidrios. Retirar los vidrios del
soporte, y con ayuda de la cua, separarlos con cuidado.

2. Despegar con cuidado el gel del vidrio, y sumergirlo en una solucin de
Bromuro de etidio 10 ml/ Agua 100 ml, durante 15 minutos.

3. Retirar el gel de la solucin y colocarlo en la bandeja para la visualizacin
y la toma de la foto con luz ultravioleta.

36

PROTOCOLO ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

1. Preparacin.

Tabla No. 3. Preparacin gel agarosa al 2%.
Reactivo Cantidad
Agarosa 1 g
Buffer TBE 1X 50 ml
Bromuro de etidio 5 l
( Ausubel, et. al, 2005., Current Protocols in Molecular Biology.)

Tabla No. 4. Preparacin gel agarosa al 1%.
Reactivo Cantidad
Agarosa 0.5 g
Buffer TBE 1X 50 ml
Bromuro de etidio 5 l
Fuente: ( Ausubel, et. al, 2005., Current Protocols in Molecular Biology.)

Procedimiento.

1. Colocar la cama de plstico de la cmara de electroforesis horizontal (Mini
Ready Sub-Cell GT Cell, Bio-Rad)sobre el soporte y ajustarlo de manera
que quede firme entre las paredes del soporte.

2. Preparar la mezcla para el gel segn las indicaciones de la Tabla No. 3, y
calentar en el microondas durante 1 minuto.

3. Dejar enfriar un poco, y servir en la cama. Colocar el peine
inmediatamente, y dejar gelificar durante 40 minutos.

2. Montaje.

Tabla No. 5. Preparacin mezcla pozos electroforesis horizontal.
Muestra Buffer corrida
3 l ADN 2 l
1 l Marcador de peso molecular 2 l

37

Procedimiento.

1. Retirar con cuidado el peine, y retirar la cama del soporte.

2. Colocar la cama en la cmara horizontal, y llenar sta con Buffer TBE 1X
hasta que cubra por completo el gel.

3. Servir la mezcla en cada pozo segn las indicaciones de la Tabla No. 4.

4. Colocar la tapa de la cmara y conectarla a la fuente de energa.

5. Poner a correr la electroforesis a 80 V, durante 90 minutos.

3. Visualizacin.

1. Apagar el equipo y retirar el gel de la cmara.

2. Colocar el gel sobre la bandeja para la visualizacin y toma de foto del con
luz ultravioleta del equipo de fotodocumentacin (GelDoc XR, Bio-Rad).

3. Elegir la opcin en el tablero, de luz ultravioleta (UV).

4. Abrir el programa Quantity One (GelDoc XR, Bio-Rad), y elegir la opcin
GelDoc XR.

5. Cuando aparezca la imagen ntida, presionar la opcin Freeze, y guardar
el archivo para su respectivo anlisis.

38

ANEXO 3

PROTOCOLO PARA EL ANLISIS BIOINFORMTICO DE LAS ESPECIES
DE BAL

1. Anlisis de fragmento amplificado con los iniciadores dados.

1. Ir al vnculo (o link) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ y buscar la opcin de alineamiento
local por BLAST, o ir directamente al vnculo 130.14.29.110/BLAST/ para iniciar la
bsqueda.

2. Abrir la opcin que dice Nucleotide- nucleotide BLAST (blastn) .

3. Escribir la secuencia de los iniciadores en el espacio Search, y la especie en el
campo Limited by entrez query y en el campo junto a este seleccionar la opcin
Bacteria (ORGN).
Ejemplo: Los iniciadores : ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
CCCGGGAACGTATTCACCGCG
La especie : Lactobacillus plantarum. (Ver figura 2).

Nota: La secuencia del segundo iniciador debe escribirse en trminos de su inverso
complementario. Ejemplo: Para la secuencia de
WBAC2:CCCGGGAACGTATTCACCGCG, se escribe
CGCGGTGAATACGTTCCCGGG.

4. Hacer clic en el botn que dice: BLAST en la parte inferior de la pgina.

5. Hacer clic en el botn Format! de la pgina que se abre inmediatamente despus
de llevar a cabo el punto 4.

6. Observar en la pgina de resultados las franjas de colores. Cada franja corresponde
a un resultado, y su color y continuidad de la lnea determinan el porcentaje de
alineamiento o similitud con la secuencia ingresada en el cuadro de bsqueda. Las
franjas de color rojo representan resultados con mayor porcentaje de similitud (mayor
o igual a 200%).

7. Hacer clic sobre una de las franjas que representan mejores resultados. Esto llevar
al nmero de acceso del resultado. Hacer clic sobre el nmero de acceso.

8. Observar la pgina de resultados del nmero de acceso que contiene la informacin
y la secuencia de ADN especfica de la especie buscada. Elegir la opcin FASTA en
la esquina superior izquierda de la pgina para efectos de uso de la secuencia en
Word.

39

2. Anlisis de restriccin in silico de los fragmentos amplificados.

1. Ir a la aplicacin http://tools.neb.com/REBsites/index.php3 para restriccin
enzimtica.

2. Pegar la secuencia del fragmento amplificado en el espacio indicado.

3. Seleccionar la opcin Defined oligonucleotide sequences.

4. Escribir en el campo Name el nombre de la enzima y en el campo a la derecha
Oligonucleotide sequence escribir la secuencia de reconocimiento o de corte.
Ejemplo: Nombre enzima: HpyCH4V y secuencia de oligonucletidos : TG'CA.

5. Hacer clic en el botn Submit.

6. En la pgina de resultados, seleccionar la opcin 2% agarose para la simulacin
del corrido electrofortico en un gel de agarosa al 2%.

7. Copiar la imagen y abrir como imagen desde otro programa ( Photo Editor, Photo
Shop, etc.)

40

ANEXO 4

PROTOCOLO DIGESTIN CON ENZIMAS DE RESTRICCIN

Tabla No. 1. Preparacin mezcla de reaccin digestin.
Reactivo Volumen
Buffer reaccin 2.5 l
Enzima 0.2 l
Agua 21.3 l
ADN 1 l

1. Preparar la mezcla de reaccin segn las indicaciones de la Tabla No. 1, en
tubos Eppendorf de 0.2 ml.

2. Preparar un blanco o control negativo de reaccin paralelamente, con todos
los reactivos excepto el ADN.

3. Poner los tubos Eppendorf en la incubadora a 37C durante 14 horas.

4. Retirar de la incubadora y almacenar a -2C.

Nota: La enzima debe ser manipulada con cuidado, y debe procurase
mantenerla en fro durante su uso, y almacenarla rpidamente a -2C despus
de usarse.

41

ANEXO 5

PROTOCOLOS PARA LA EXTRACCIN DEL ADN GENMICO DE
BACTERIAS CIDO LCTICAS (BAL)

Extraccin con el estuche Wizard Genomic DNA Purification, Promega

El aislamiento y purificacin del ADN son pasos crticos en el anlisis por RFLP. El
ADN debe estar suficientemente libre de impurezas que inhiban a las enzimas de
restriccin y lleven a la digestin parcial o a que no haya corte. Los procedimientos de
aislamiento o extraccin de ADN varan dependiendo de la especie bacteriana. El ADN
genmico se asla fcilmente de bacterias Gram-negativas con un pretratamiento con
lisozima seguido lisis con un detergente no inico. Es difcil lisar bacterias Gram-
positivas con el mtodo de lisozima y detergente. Algunas Gram-positivas se pueden
lisar eficientemente con pretratamiento de las clulas con enzimas lticas especficas
(Satz, Komblihtt, 2003.)

Crecimiento de las cepas de BAL en medio lquido
1. Colocar la perla criognica de cada aislamiento en un tubo de ensayo con 5 ml de
medio lquido MRS.
2. Colocar tubos con perlas en incubadora a 37C durante 48 horas.
3. Llevar tubos al vortex para homogenizar y distribuir la suspensin generada por el
crecimiento bacteriano.
4. Pasar el contenido de los tubos a tubos para centrfuga, y centrifugar a 11000 rpm
durante 5 minutos.
5. Descartar el sobrenadante y pasar el residuo concentrado a tubos Eppendorf de 1.2
l.

PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIN DEL ADN GENMICO DE BAL

1. Adicione 1 ml del cultivo incubado durante toda la noche a un tubo de
microcentrfuga estril 1.5 ml y centrifugue a 13000 rpm por 2 min.
2. Remueva el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 480 l de EDTA 50 Mm.
3. Adicione 120 l de lisozima (10 mg/ml) a la solucin.
4. Incube la muestra a 37C en bao serolgico durante 30-60 minutos.
5. Centrifugue por 2 min. A 13000 rpm y remueva el sobrenadante.
42

6. Adicione 600 l de solucin de lisis nucleica y resuspenda con la pipeta
suavemente.
7. Incube a 80C en bao serolgico durante 5 min. Y deje enfriar hasta temperatura
ambiente.
8. Adicione 3 l de solucin de Rnasa al lisado celular y homogenice la solucin
invirtiendo el tubo 5 veces aproximadamente.
9. Incube la muestra a 37C en bao sexolgico durante 15-60 minutos.
10. Adicione 200 l de solucin de precipitacin de protenas y agite en el vrtex por
20 seg.
11. Coloque las muestras en una nevera con hielo por 5 min.
12. Centrifugue a 13000 rpm por 3 min.
13. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5
ml estril que contenga 600 l de isopropanol a temperatura ambiente.
Nota: evite el contacto de la punta de la micropipeta con el sedimento ya que puede
contaminar la solucin de ADN con protenas, para evitarlo deje parte del
sobrenadante en el tubo original.
14. Centrifugue a 13000 rpm por 2 min.
15. Descarte el sobrenadante cuidadosamente por pipeteo y drene el lquido restante
sobre papel absorbente.
16. Adicione 600 l de etanol al 70 % a temperatura ambiente e invierta el tubo para
lavar el sedimento de ADN.
17. Centrifugue a 13000 rpm por 2 min, descarte el sobrenadante cuidadosamente por
pipeteo y drene el tubo sobre papel absorbente. Deje secar el sedimento de los tubos
al lado de un mechero (en condiciones de esterilidad).
18. Adicione 100 l de la solucin de rehidratacin al tubo e incube a 4C durante toda
la noche.
Nota: puede rehidratar rpidamente el ADN incubndolo a 65C en bao serolgico
durante 1 hora agitando el tubo suavemente de manera peridica.
19. Almacene el ADN a 4C.

Observaciones:
- Todo el material que utilice debe estar estril.
- Se debe incluir un control negativo y un control positivo (cepa conocida) en cada
corrido de extraccin.
43

EXTRACCIN ADN BACTERIANO CON EL ESTUCHE COMERCIAL DE
INVITROGEN

Lisis bacteriana
1. Colocar clulas de cultivo fresco de BAL en centrifugacin, a 13000 rpm durante 5
minutos. De manera alternativa se puede mezclar el cultivo completo de 100 l o una
colonia en medio slido con el buffer de resuspensin con Rnasa A, como se explica
en el siguiente paso.
2. Resuspender el sedimento en una solucin previamente preparada que contiene 5
l de Rnasa A y 100 l del buffer de resuspensin por muestra, agite en vrtex. La
suspensin celular debe quedar homognea.
3. Incubar la muestra a 37C en bao sexolgico por 10 minutos.
Nota: durante este paso mezcle 500 l del buffer de lisis con 10 l de solucin de
proteinasa K para cada muestra.
5. Adicionar 500 l del buffer de lisis/proteinasa K a cada muestra y homogenice la
solucin por inversin del tubo.

6. Incubar por 10 minutos a 55C en bao serolgico.

Fijacin (neutralizacin) del ADN
1. Agitar en el vrtex el tubo con las perlas magnticas.
2. Adicionar 40 l de las perlas a la muestra incubada (paso 7 lisis).
3. Mezclar sin formar burbujas.
4. Adicionar 300 l del buffer fijador (neutralizador) y mezclar usando 5-6 pulsos cortos
(1-2 seg) en el vrtex.
5. Incubar a temperatura ambiente por 1 minuto.
6. Colocar la muestra en la gradilla magntica por 1 min o hasta que las perlas formen
una lmina.
7. Sin retirar el tubo de la gradilla, remueva el sobrenadante con la micropipeta sin
interferir con la lmina de perlas.

Lavado del ADN
1. Remover el tubo que contiene las perlas de la gradilla magntica.
2. Adicionar 1 ml del buffer de lavado al tubo y mezcle suavemente sin formar
burbujas.
3. Colocar la muestra en la gradilla magntica por 1 minuto o hasta que las perlas
formen una lmina.
4. Remover el sobrenadante sin retirar el tubo de la gradilla.
5. Repetir el anterior procedimiento ( Pasos 1- 5 de lavado de ADN).

44

Elusin del ADN
1. Retirar el tubo que contiene las perlas de la gradilla magntica.
2. Adicionar 200 l del buffer de elusin al tubo y mezclar sin formar burbujas.
3. Incubar a temperatura ambiente por 5 min.
4. Colocar la muestra en la gradilla magntica por 1 min o hasta que las perlas formen
una lmina.
5. Sin retirar el tubo de la gradilla remover el sobrenadante que contiene el ADN y
ponerlo en un tubo estril para microcentrfuga.
6. Descartar las perlas.

Extraccin mecnica
1. Colocar tubos con muestra de clulas frescas suspendidas en medio lquido en
temperatura de ebullicin (92C aprox.) durante 45 minutos.
2. Pasar tubos inmediatamente a bao de hielo y dejarlos all durante 15 minutos.
3. Adicionar 500 l de etanol al 70% y centrifugar durante 5 minutos a 8000 rpm.
4. Retirar y descartar el sobrenadante.
5. Resuspender las clulas en 200 l de agua.

45

EVALUACIN DE LA CALIDAD Y CANTIDAD DEL ADN GENMICO EXTRADO A
PARTIR DE BAL

Cuantificacin del ADN
1. En una celda de espectrofotmetro colocar agua desionizada o buffer TE 1x como
blanco.
2. Colocar 1 ml de buffer TE1x en una celda para espectrofotmetro y 1 l de muestra
del ADN.
3. Medir la absorbancia a 260 y 280 nm para cada muestra.
4. Frmulas para los clculos de concentracin y calidad del ADN:
Factor de dilucin =Volumen total celda/ Volumen muestra
Concentracin del ADN =Factor dilucin X Factor conv a ng/l (50) X Lectura 260 nm
Relacin 260/280 nm=lectura 260 nm / lectura 280 nm
Ejemplo:
Lectura 260 nm=0.140
Lectura 280 nm=0.075
Factor de dilucin =1001/1
Concentracin ADN: (1001)(50)(0.140)=7007.0 ng/l
Relacin 260/280 nm: 0.140/0.075 =1.87
La relacin 260/280 nm se emplea para establecer la presencia de contaminantes en
el extracto del ADN; los valores entre 1.8 y 2.0 indican una adecuada pureza del ADN
(buena calidad de la extraccin).

Referencias.
Manual del II Curso Internacional de Biologa Molecular Aplicada a la Medicina.
Diseo de Oligonucletidos, optimizacin de la PCR y long PCR. Colegio Mayor de
Nuestra Seora del Rosario, 1997.

Evaluacin de la calidad del ADN por visualizacin en agarosa
1. Preparar gel de agarosa al 1% (ver protocolo preparacin electroforesis en gel de
azarosa).
2. Sembrar los pozos con 3l de extracto de ADN, y 2l de buffer de corrida.
3. Dejar correr durante 45 minutos.
4. Visualizar en el equipo de fotodocumentacin, y ver que haya un corrido limpio, y
que no haya fluorescencia en el pozo, que indica la presencia de ARN.

46

REACTIVOS NECESARIOS
Extraccin Wizard

Materiales y equipos
Microcentrfuga (13000 rpm)
Bao serolgico a 80C y 37C.
Vrtex.
Nevera con hielo
Mechero
Papel absorbente

Reactivos
Isopropanol a temperatura ambiente
Etanol al 70% a temperatura ambiente
EDTA 50 Mm pH 8.0
Lisozima de clara de huevo Sigma-Aldrich a una concentracin de 10 mg/ml (se
requiere 1.2 mg por muestra).

-Solucin o Buffer de lisis nuclica: Tris 0.2 M (24.228g/L agua), EDTA 0.05 M
(18.612 g/L agua), NaCl 2M (116.8856 g/L agua), CTAB 2% (0.02g/L agua)
Sarkosyl 5% (50g /L agua).
-Solucin de rehidratacin: Tris- HCl 10mM (1.5759g/L agua) (pH 7.4), EDTA 1mM
(0.3722 g/L agua) (pH 8.0)
-RNasa A: disolver 4mg/ml en la solucin de rehidratacin hervir por 10 min para
remover la DNasa contaminante y almacenar en alcuotas a 20C.
- Solucin de precipitacin de protenas: CTAB (10g/L agua)/NaCl

Extraccion DNA Invitrogen

Materiales
Solucin fresca de lisozima, 50 mg/ml en agua.
Magna Rack (gradilla magntica).
Tubos microcentrfugos estriles de 1.5 ml.
Vrtex.
Pipetas ajustables y puntas estriles.
Baos de agua, o incubadoras.
RNasa A en buffer de resuspensin.
Proteinasa K.

47

Perlas magnticas.
Buffer fijador.
Buffer de lisis.
Buffer de lavado.
Buffer de elucin.
- Solucin fijadora: agregar 477.65 g de guanidina HCl y 9.09 g de acetato de potasio
a 500 ml de agua y mezclar y disolver. Ajustar el pH a 4.2 con cido actico, y llevar a
1 litro con agua, y esterilizar por filtrado. Almacenar a 4C.
- Buffer resuspensin: Tris Cl pH 8.0 (disolver 121 g de Tris base en 800 ml de agua,
ajustar pH con HCL concentrado y llevar a 1 litro), EDTA 10 mM (3.7224 g/L agua),
100 mg RNasa A. Almacenar a 4C.
- Buffer de lavado: 166.6 ml de Tris Cl pH 7.5, 166.6 ml de NaCl 100mM
(5.84428g/L agua), 666.6 ml de etanol 100%(final 80%). Almacenar a temperatura
ambiente.
- Solucin de lisis: NaOH 0.2M (9.199g/L agua) / SDS 1% (m/v)
-Buffer de elucin: Tris- HCl 10mM (15.759g/L agua)pH 8.5
(Frmulas de los buffers y soluciones tomados del Current Protocols in Molecular
Biology, 2005).

Evaluacin de Calidad y cantidad de ADN genmico

-TE : 1ml Tris 1M (pH 8.0) (TRIS 10mM), 0.1 ml EDTA 0.5M (EDTA 1mM). Llevarlo a
100 ml con agua destilada y estrilizar en autoclave a 121 libras por 15 minutos.

48

ANEXO 6

RESULTADOS DE LA APLICACIN DE LA TCNICA DE PCR-RFLP
EN LA IDENTIFICACIN DE BAL

- Lactobacillus plantarum 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Carril Muestra Identificacin
bioqumica
a
Porcentaje de
identificacin
b
1 No. 47 L. plantarum 1 99.1
3 L. plantarum WS4174
c

4 Marcador de peso 10 pb -
5 No. 204 L. plantarum 1 89
9 Control negativo
Extraccin
-
10 Control negativo PCR -
a
Sistema API V5.0,
b
Porcentaje reportado por el sistema.
c
Cepa de referencia.

Similitud calculada mediante el coeficiente de Dice.

Carril 1 2 3 4 5 6
1 100.0 77.7 41.1 42.1 25.9 43.5
2 77.7 100.0 51.9 41.7 40.9 45.8
3 41.1 51.9 100.0 89.6 77.6 40.8
5 42.1 41.7 89.6 100.0 66.5 31.7
6 25.9 40.9 77.6 66.5 100.0 50.5
8 43.5 45.8 40.8 31.7 50.5 100.0

49

Identificacin de la similitud entre aislamientos mediante agrupaciones utilizando la
matriz UPGMA

Se encontraron los mismos patrones para el anlisis in silico como in vitro para la cepa
de referencia de L. plantarum. Se present concordancia entre los datos del Sistema
API y los de la tcnica molecular para 2 de los aislamientos estudiados (muestras de
los carriles 5 y 6). En las cepas 47 y 67 (carril 1 y 2), de las 3 bandas esperadas, 2
concordaron y una tuvo un peso similar a la banda restante esperada, adems
presentaron otra banda adicional y alta similitud entre stos lo que podra sugerir un
patrn electrofortico perteneciente a la especie L. plantarum pero diferente al de la
cepa de referencia, estos datos sugeriran variacin a nivel especie para estas
muestras.

El aislamiento del carril 8 presenta un patrn electrofortico diferente al patrn de
referencia, lo que podra corresponder a otro microorganismo.

50

- Lactobacillus plantarum No. 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
bioqumica
a
Porcentaje de
identificacin
b
1 1 L. plantarum 1 99.9
c

4 MPM 10 pb -
7 MPM 200 -
9 Blanco extraccin -
10 Blanco PCR -
a
Sistema API V5.0,
b
c
Cepa de referencia.


Carril 1 2 3 5 6 8
1 100.0 45.7 63.4 38.0 19.5 68.5
2 45.7 100.0 34.7 45.3 77.1 56.4
3 63.4 34.7 100.0 43.9 34.3 48.0
5 38.0 45.3 43.9 100.0 50.1 28.4
6 19.5 77.1 34.3 50.1 100.0 41.0
8 68.5 56.4 48.0 28.4 41.0 100.0

51

matriz UPGMA

Las cepas analizadas no mostraron una estrecha concordancia entre los datos del
sistema API y la PCR-RFLP. La cepa del carril 1 no present una de las 3 bandas
esperadas segn el patrn de la cepa de referencia, pero las 2 bandas restantes
concordaron con el peso esperado, para el aislamiento del carril 5, 3 de las 5 bandas
concordaron con el patrn de referencia y present 2 bandas adicionales. En 2
aislamientos (carril 2 y 6), de las 3 bandas esperadas, 2 concordaron y una tuvo un
peso similar a la banda restante esperada, adems presentaron otra banda adicional y
alta similitud entre stos lo que podra sugerir un patrn electrofortico perteneciente a
la especie L. plantarum pero diferente al de la cepa de referencia. En el aislamiento del
carril 8 (392) se visualizan productos parciales de digestin que impiden identificar con
claridad el patrn de bandeo.
Estos resultados muestran diferencias variables en los sitios de restriccin para estos
aislamientos, lo que podra sugerir variaciones a nivel de especie.

52

- Lactobacillus plantarum No. 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
bioqumica
a
Porcentaje de
identificacin
b
1 No. 2 L. pentosus 94.2
9 Control negativo Extraccin -
a
Sistema API V5.0,
b
c
Cepa de referencia.


Carril 1 2 3 5 6 8
1 100.0 69.1 43.2 83.6 41.3 79.6
2 69.1 100.0 73.9 83.5 68.7 89.9
3 43.2 73.9 100.0 55.5 88.9 64.3
5 83.6 83.5 55.5 100.0 52.1 94.6
6 41.3 68.7 88.9 52.1 100.0 60.3
8 79.6 89.9 64.3 94.6 60.3 100.0

53

matriz UPGMA

La cepa del carril 1 identificado por el sistema API como L. pentosus no present el
patrn predicho por bioinformtica, solo concord con este en una banda de las 3 que
present. Los patrones de los carriles 2, 5 y 8 mostraron alta similitud entre si,
compartiendo las dos bandas que presentaron, se visualiz una banda comn con el
patrn de referencia y otra banda de menor peso que la esperada. La similitud
observada para estas cepas fue del 56% al 74% y el porcentaje de identificacin por el
sistema API vari del 68% a 90%. Para la muestra del carril 6, de las 3 bandas
esperadas, 2 concordaron y una tuvo un peso inferior a la banda restante esperada,
sin embargo present una gran similitud con el patrn de referencia de L. plantarum, lo
que puede sugerir variacin a nivel de especie de esta BAL.

54

- Lactobacillus paracasei No. 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9
bioqumica
a
Porcentaje de
identificacin
b
1 No. 272 L. paracasei 99.9
2 No. 205 L. paracasei paracasei 1 99.9
3 ATCC L. delbrueckii
c
-
6 Enterococcus faecalis
c
-
a
Sistema API V5.0,
b
c
Cepas de referencia.


Carril 1 2 3 5 6
1 100.0 55.3 17.3 89.8 85.9
2 55.3 100.0 11.1 40.3 32.4
3 17.3 11.1 100.0 17.4 18.0
5 89.8 40.3 17.4 100.0 92.3
6 85.9 32.4 18.0 92.3 100.0

55

Agrupaciones identificadas con la tcnica de PCR-RFLP.

Para realizar la comparacin de las bandas se utiliz el patrn de bandeo predicho por
bioinformtica para L. paracasei (carril 6), con lo cual se obtuvo alta concordancia para
la muestra 236 y 272. Se debe corroborar el resultado de la muestra 205 ya que no se
aprecian bandas claramente.

- Lactobacillus paracasei No. 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
56

bioqumica
a
Porcentaje de
identificacin
b
1
No. 116 L. plantarum 1 90.3
c
-
8 No. 393 L. rhamnosus 99.2
a
Sistema API V5.0,
b
c
Cepa de referencia.


Carril 1 2 3 5 6 8
1 100.0 56.3 41.3 77.6 0.0 0.0
2 56.3 100.0 27.7 44.1 0.0 0.0
3 41.3 27.7 100.0 46.4 0.0 0.0
5 77.6 44.1 46.4 100.0 0.0 0.0
6 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0
8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0

Agrupaciones identificadas con la tcnica de PCR-RFLP

57

Las cepas de los carriles 1 y 2 podran corresponder a un perfil diferente de L.
plantarum y L. paracasei respectivamente; se observan muchos productos parciales
de digestin. La muestra del carril 5 (233), present un patrn diferente a los
observados y se diferenci en 2 bandas con respecto al patrn Enterococcus faecalis.
En el carril 6 no se observaron productos evidentes de restriccin, solo una banda alta
que podra corresponder a la banda de 1050 pb, lo que podra deberse a una ausencia
de restriccin bien sea por la tcnica o por caractersticas inherentes al aislamiento. El
carril 8 correspondiente a L. rhamnosus no produjo ningn producto de digestin. Es
de resaltar que L. plantarum, L. paracasei y L. rhamnosus (las 3 presuntas especies
bacterianas analizadas en este gel), presentan por bioinformtica patrones muy
similares de restriccin.

- Lactococcus lactis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
bioqumica
a
Porcentaje de
identificacin
b
1 10 L. acidophilus 3 96.2
2 156 Lactococcus lactis lactis 1 78.7
3 Enterococcus faecalis
c
-
10 Blanco PCR -
a
Sistema API V5.0,
b
Porcentaje reportado por el sistema
c
Cepa de referencia.

58


Carril 1 2 3 5 6 8
1 100.0 36.5 47.4 24.6 25.6 11.5
2 36.5 100.0 63.4 69.1 79.4 48.8
3 47.4 63.4 100.0 56.4 53.8 59.6
5 24.6 69.1 56.4 100.0 89.8 73.8
6 25.6 79.4 53.8 89.8 100.0 64.5
8 11.5 48.8 59.6 73.8 64.5 100.0


El patrn de la cepa de referencia ATCC 4356 de L. acidophilus no concord con el
esperado por bioinformtica ya que solo 2 de 5 bandas coincidieron; sta cepa
presenta variaciones en los sitios de restriccin de los segmentos de ADN estudiados
de la subunidad 16S del RNAr, lo que evidencia un patrn electrofortico diferente
para una misma especie. El patrn de la muestra No. 10 (carril 1) no concord con el
patrn predicho por bioinformtica para L. acidophilus ni con el observado para la cepa
Enterococcus faecalis utilizada y mostr un patrn concordante con el esperado para
L. plantarum WS4174, el cual es igual al predicho por bioinformtica para L. paracasei,
L. rhamnosus y L. pentosus. Las cepas de los carriles 2, 5, 6, y 8 identificados por el
sistema API como Lactococcus lactis, presentaron el mismo patrn electrofortico que
la cepa de referencia ATCC 4356 de L. acidophilus, lo que podra corresponder a
cepas de la misma especie. No se encontr una alta similitud (calculada por el
coeficiente de Dice) para estos aislamientos, sin embargo, visualmente presentan el
mismo patrn electrofortico.

59

- Muestras para identificacin No. 1 (mezclas)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Carril Muestra
1 No. 401
2 No. 402
a
4 Marcador de peso 10 pb
5 No. 403
6 No. 406
7 Marcador de peso 200 pb
8 ATCC 12315 L. delbrueckii
a
9 Blanco extraccin
10 Blanco PCR
a
Cepas de referencia.

Similitud calculada mediante el coeficiente de Dice, con respecto al patrn de
referencia L. plantarum WS4174.

Carril 1 2 3 5 6 8
1 100.0 58.6 41.4 45.6 40.9 0.0
2 58.6 100.0 0.0 13.5 11.0 0.0
3 41.4 0.0 100.0 40.9 50.4 0.0
5 45.6 13.5 40.9 100.0 78.0 0.0
6 40.9 11.0 50.4 78.0 100.0 0.0
8 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0

60


La muestra del carril 1 tiene 2 de 3 bandas concordantes con el patrn de restriccin
esperado para L. plantarum, L. paracasei y L. rhamnosus, la tercer banda pesa 655 pb
a diferencia de la esperada para estas especies (525 pb). La muestra del carril 2
presenta una banda alta no concordante con ninguno de los patrones observados en
el estudio, lo que podra corresponder a otra especie. Las muestras de los carriles 5 y
6, tienen el mismo patrn de Enterococcus faecalis y presentan alta similitud entre
stas. La muestra del carril 8 no se analiz ya que el corrido electrofortico no se
visualiza adecuadamente.

61

- Mezclas para identificacin No. 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
bioqumica
a
Porcentaje de
identificacin
b
1 40 Lactobacillus brevis 1 99.5
2 206 Leuconostoc lactis 99.9
3 ATCC 12315 L. delbrueckiii -
5 207 Leuconostoc
mesenteroides cremoris
97.9
6 232 Lactobacillus delbrueckii
delbrueckii
57.5
8 332 Sin identificacin
10 Blanco PCR -
a
Sistema API V5.0,
b
c
Cepa de referencia.


Carril 1 2 3 5 6 8
1 100.0 0.0 74.3 100.0 82.9 0.0
2 0.0 100.0 14.5 0.0 24.2 24.6
3 74.3 14.5 100.0 74.3 70.9 4.7
5 100.0 0.0 74.3 100.0 82.9 0.0
6 82.9 24.2 70.9 82.9 100.0 20.4
8 0.0 24.6 4.7 0.0 20.4 100.0

62

Agrupaciones identificadas con la tcnica de PCR-RFLP.

El patrn de la cepa de referencia ATCC 12315 de L. delbrueckii no concord con el
esperado por bioinformtica presentando variaciones en los sitios de restriccin de los
segmentos del ADN estudiados, esto evidencia un patrn electrofortico diferente para
una misma especie. Las muestras de los carriles 1 y 5, muestran slo una banda alta,
patrn electrofortico de restriccin no esperado para ninguna de las especies en
estudio, estas dos muestras presentan una significativa similitud. La muestra del carril
2 muestra el patrn esperado para L. plantarum, L. paracasei y L. rhamnosus. La
muestra del carril 8, muestra un patrn similar al de Enterococcus faecalis.
La muestra del carril 6, muestra un porcentaje de alta similitud con el patrn de la
ATCC 12315 de L. delbueckii, lo que confirma que esta cepa pertenece a esta
especie.

63

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