DETERMINACIN DE NITRGENO Y PROTENAS

Mtodos no extractivos Determinaci n de Prote!nas tota"es# Determinaci n de" nitr $eno tota" %or e" Mtodo de &'e"da(" )Mtodo de Re*erencia+ A%"icaciones# A"imentos en $enera" Como consec,encia de s, estr,ct,ra a -ase de amino.cidos individ,a"es/ e" contenido en nitr $eno de "as %rote!nas var!a s "o entre ,nos "!mites m,0 estrec(os )12 a 1345 en %romedio 164+7 Para "a determinaci n ana"!tica de" contenido en %rote!na tota"/ se determina %or "o $enera" e" contenido de nitr $eno )N+ tras e"iminar "a materia or$.nica con .cido s,"*8rico )mtodo de &'e"da("+/ ca"c,".ndose *ina"mente e" contenido de %rote!na con a0,da de ,n *actor )en $enera" * 9 6/:2+7 Se as,me ;,e e" SO < ;,e se *orma d,rante e" tratamiento a a"tas tem%erat,ras se adiciona como .cido de =e>is a" $r,%o N? de" en"ace %e%t!dico )-ase de =e>is+ de "a %rote!na/ *orm.ndose e" corres%ondiente .cido amidos,"* nico/ e" ;,e %osteriormente se trans*orma en s,"*ato am nico %or de$radaci n7 E" s,"*ato am nico se determina a contin,aci n/ tras "i-eraci n de" N?< 0 desti"aci n/ %or medio de ,na va"oraci n .cido@-ase7 Como en e" tratamiento &'e"da(" de a"imentos no se determinan s "o %rote!nas o amino.cidos "i-res/ sino tam-in .cidos n,c"eicos 0 sa"es de amonio 0 tam-in nitr $eno "i$ado de com%,estos or$.nicos o vitaminas/ e" nitr $eno "i$ado or$.nico se ex%resa como Anitr $eno tota" ca"c,"ado como %rote!naA o como A%rote!na tota"A )N x *+7 No o-stante/ como %or "o $enera" "os a"imentos s "o contienen cantidades traBa de com%,estos arom.ticos nitro$enados 0 de vitaminas/ e" error as! cometido se considera des%recia-"e7 C,ndamento# =a s,stancia a investi$ar se somete a ,n tratamiento oxidativo con .cido s,"*8rico concentrado en %resencia de ,na meBc"a cata"iBadora )"as sa"esD xidos met."icos sirven %ara e" trans%orte de ox!$eno con *ormaci n intermedia de ox!$eno naciente5 e" s,"*ato %ot.sico sirve %ara e"evar e" %,nto de e-,""ici n/ a"canB.ndose tem%erat,ras de <EE@FEEGC d,rante "a di$esti n+7 De" s,"*ato am nico *ormado se "i-era e" amon!aco %or tratamiento a"ca"ino 0 ste se trans%orta con a0,da de ,na desti"aci n en corriente de va%or a ,n reci%iente con .cido - rico 0 se rea"iBa ,na tit,"aci n con ,na so",ci n va"orada de .cido s,"*8rico7 E" contenido en %rote!na de "a m,estra se ca"c,"a teniendo en c,enta e" contenido medio en nitr $eno de "a %rote!na en c,esti n7 Reactivos# ?:SOF conc7 %7a7 )H34+ Cata"iBador# &:SOF o Na:SOF an(idro I C,SOF7 2 ?:O %7a7 )re"aci n 1E#1+ NaO? FE4 So",ci n ?<JO< F4 So",ci n ?:SOF E/: N Indicador Mortimer# E/E164 ro'o de meti"o/ E/E3<4 verde de -romocreso" en etano" Determinaci n# a) Digestin# Co"ocar "a cantidad adec,ada de m,estra )de ac,erdo a" contenido estimado de nitr $eno+ entre E/1 0 F $ con ,na %recisi n de 1 m$/ en ,n -a" n &'e"da(" de 2EE m"7 A$re$ar 1 c,c(aradita de cata"iBador/ %er"as de vidrio 0 12@:E m" de ?:SOF conc7 Todo e" materia" de-e estar s,mer$ido en e" .cido %ara ;,e no (a0a %rdidas de nitr $eno7 Conectar e" -a" n a "a tram%a de a$,a 0 ca"entar "a meBc"a s,avemente (asta ;,e cese e" des%rendimiento de es%,ma5 ",e$o ca"entar enr$icamente (asta com%"etar "a di$esti n de "a materia or$.nica )no se o-servan %art!c,"as car-onosas sin oxidar 0 e" "!;,ido ;,eda trans"8cido 0 de co"or d-i"mente

verdoso o aB,"@verdoso+7 =a di$esti n demanda entre 1 0 : (s7 En*riar 0 a$re$ar c,idadosamente a" menos 1EE m" de a$,a7 -+ Destilacin# Presentar e" -a" n con "a m,estra di$erida a ,n re*ri$erante %or medio de ,na tram%a adec,ada7 Pre%arar ,n er"enme0er con :2@2E m" de ? <JO< F4 )so-re e" c,a" se va a reco$er e" N? < desti"ado+ 0 $otas de indicador Mortimer )co"or ro'o+/ 0 co"ocar"o a "a sa"ida de" re*ri$erante c,idando ;,e e" extremo de" mismo ;,ede s,mer$ido en "a so",ci n .cida7 Antes de conectar com%"etamente e" -a" n se va a$re$ando con c,idado "a cantidad necesaria de so",ci n de NaO? FE4 como %ara ne,tra"iBar e" .cido s,"*8rico/ %rimero sin a$itar %ara ;,e se ,-i;,e en e" *ondo/ 0 ,na veB a$re$ado todo/ conectar -ien e" -a" n/ a$itar %ara "o$rar "a meBc"a )e" medio se (ace *,ertemente a"ca"ino ;,e se detecta %or *ormaci n de ,n %reci%itado %ardo osc,ro/ dis%ersado %or e*ecto de "a e-,""ici n+ 0 sim,"t.neamente se comienBa e" ca"entamiento a e-,""ici n de" contenido de" -a" n7 E" indicador vira a aB," c,ando em%ieBa a desti"arse e" N?< %or arrastre en corriente de va%or7 Se si$,e desti"ando (asta ""e$ar a a%roximadamente :EE m" en e" er"enme0er co"ector )"os %rimeros 12E m" de desti"ado contienen $enera"mente "a tota"idad de" N?<+7 Kna veB a"canBado dic(o vo",men/ se retira e" er"enme0er en',a$ando dentro de" mismo e" extremo de" re*ri$erante con AD/ %ara no %erder nitr $eno 0 ",e$o se a%a$a e" ca"entamiento7 c+ Valoracin# E" desti"ado se va"ora con so",ci n de ?:SOF E7: N/ (asta "o$rar e" vira'e de" indicador Mortimer a" co"or inicia" ro'o7 d+ Blanco# Se de-e rea"iBar ,n -"anco de reactivos/ si$,iendo "as mismas indicaciones %ero sin co"ocar m,estra en e" -a" n7 C."c,"os# Prote!na tota" 4 9 )LM0estra @ LJ"anco+ x NAcido x E7E1F x C x 1EED$M,estra Siendo LM,estra m" de .cido $astados en "a va"oraci n de "a m,estra LJ"anco m" de .cido $astados en "a va"oraci n de" -"anco NAciodo norma"idad de" .cido s,"*8rico E7E1F %eso de" me; de nitr $eno/ en $ C *actor de conversi n de nitr $eno a %rote!na $m,estra %eso en $ de "a m,estra

En "os c."c,"os %ara convertir nitr $eno a %rote!nas/ ,sar e" *actor 6/:2 %ara carnes/ 2/M %ara cerea"es 0 so'a 0 6/<3 %ara "ec(e 0 derivados7 Determinaci n de Nitr $eno -.sico vo".ti"@ ndice de %,tre*acci n A%"icaci n# carne vac,na/ %escado C,ndamento# E" %? de m8sc,"o de %escado *resco est. entre 6/6 0 6/3 )"o conserva en e" momento de "a m,erte+7 Des%,s de m,erto se ac,m,"a .cido ".ctico/ %rovocando ca!da de %?/ %ero como en e" m8sc,"o (a0 com%,estos con car.cter -,**er/ no %ermiten ;,e se vea ese descenso7 Por descom%osici n de" m8sc,"o se ac,m,"an amon!aco/ dimeti"amina 0 trimeti"amina7 Si en ese momento se %rod,ce contaminaci n -acteriana/ entonces comenBar. a s,-ir e" %? )%rimero "entamente 0 r.%ido a" *ina"+/ en condiciones extremas de deterioro %,ede ""e$ar a M/2@3/E7 Oc,rre ,n %roceso de a,to"isis ;,e ""eva a" amino.cido# R@C?@N?:@COO?
Decar-oxi"asas Aminooxidasas 2

CO: I R@C?:@C?:@N?:

N?<

R@C?:@COO?
)a"$,nos son vo".ti"es 0 arrastra-"es %or a$,a+

?a0 acci n so-re e" xido de trimeti"amina ;,e existe en a"$,nos %eces de a$,a sa"ada7 E" ".ctico en e" m8sc,"o es red,ctor 0 act8a so-re e" O9N)C?<+< )%rec,rsor+7 C?< I ?@C@O? I COO?
Enzimas

I : O9N)C?<+<
microbianas

C?< I : N)C?<+< I COO? I CO: I ?:O

-.sico vo".ti" vo".ti"

Se sa-e ;,e se %rod,ce "a ?N)C?<+: %ero no se conoce e" %rec,rsor7 Reactivos# M$O %,ro A$ente anties%,mante )%,ede ser a"co(o" oct!"ico o ,n anties%,mante si"iconado+ Acido - rico :4 Indicador Mortimer# E/E164 ro'o de meti"o/ E/E3<4 verde de -romocreso" en etano" ?:SOF E/E:N NstandariBadoN )%re%arado %or di",ci n de ?:SOF E/1 N+ Determinaci n# Co"ocar en ,n -a" n &'e"da(" 1E a 12 $ de m,estra %re%arada exactamente %esada 0 a$re$ar : $ de M$O/ <EE m" de a$,a desti"ada/ ,nas $otas de anties%,mante 0 ,nos troBos de %orce"ana %orosa o %iedra % meB7 Insta"ar e" -a" n en e" a%arato de desti"aci n7 Poner en ,n er"enme0er de 2EE m"/ 2E m" de so",ci n de .cido - rico a" :4 0 F $otas de indicador7 Conectar e" a%arato 0 co"ocar e" er"enme0er de manera ;,e e" extremo de" re*ri$erante ;,ede s,mer$ido en "a so",ci n de .cido - rico7 Ca"entar e" -a" n &'e"da(" de modo ta" ;,e e" "!;,ido contenido entre en e-,""ici n en exactamente 1E min7 Desti"ar d,rante :2 min exactos/ manteniendo "a misma intensidad de ca"entamiento7 En',a$ar e" re*ri$erante con a$,a desti"ada reco$iendo tam-in en e" er"enme0er7 Tit,"ar e" desti"ado con ?:SOF E/E: N7 Ex%resar e" res,"tado como m$ de nitr $eno -.sico vo".ti" %or 1EE $ de m,estra7 Determinaci n de Nitr $eno no %roteico Pesar con exactit,d E/2@1 $r de m,estra 0 dis%ersar"a en 1E m" de a$,a desti"ada7 A$re$ar 1E m" de .cido tric"oroactico :F4/ (omo$eneiBar 0 centri*,$ar7 Tomar ,na a"!c,ota de so-renadante "!m%ido 0 determinar N %or e" mtodo de &'e"da("7 Determinaci n de Nitr $eno ."ca"i ".-i"# Mtodo de &o*ran0i )1H2E7 Mi"c(>issensc(a*ts/ 21@2F Lo"7 :+7 Determinaci n de %rote!nas en "ec(e %or desti"aci n directa7

C,ndamento# Es ,n mtodo r.%ido -asado en "a "i-eraci n de amon!aco c,ando "a "ec(e es ca"entada a e-,""ici n en so",ci n a"ca"ina7 =a ma0or %arte de" amon!aco "i-erado %roviene de "a r.%ida (idr "isis de $",tamina 0 as%ara$ina7 Determinaci n# co"ocar en ,n -a" n &'e"da(" 1E m" de "ec(e/ :E m" de JaC" : 1E 4 ),sar %ro%i%eta+ 0 ME m" de NaO? <:47 Desti"ar d,rante 6 min )exactamente medidos a %artir de" inicio de "a e-,""ici n+/ reco$iendo so-re 1EE m" de JO <?< : 47 Tit,"ar e" desti"ado con SOF?: E71N/ ,sando como indicador 6 a 3 $otas de ,na so",ci n E7E16 4
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de ro'o de meti"o 0 E7E3< 4 de verde de -romocreso" en a"co(o"7 Ca"c,"ar e" %orcenta'e de %rote!na )%D%+ ,ti"iBando ,na c,rva de ca"i-raci n ;,e re"aciona e" 4 %rote!nas con "os m" de SOF?: E71N $astados7 C,rva de ca"i-raci n# se o-tiene si$,iendo e" %rocedimiento anterior %ero con m,estras de "ec(e con contenidos de %rote!na conocidos7 Para o-tener "as distintas m,estras de "ec(e se %arte de ,na "ec(e entera a "a ;,e se "e midi e" 4 de %rote!nas %or e" mtodo de &'e"d(a"5 con esta "ec(e se (acen di",ciones o se a$re$a case!na %ara o-tener "as concentraciones %roteicas deseadas7 E" contenido de %rote!nas ;,e c,-ra e" ran$o de "a c,rva de ca"i-raci n/ de-e ser de 1 a F 4 )%Dv+7 NOTA# Act,a"mente "os an."isis en "ec(e se rea"iBan si$,iendo "a metodo"o$!a es%eci*icada en "as normas IDC/ de "a Cederaci n Internaciona" de =ec(er!a )CI=+7 Para "a determinaci n de" contenido de %rote!nas se ,ti"iBa e" mtodo de &'e"d(a"/ ,ti"iBando .cido - rico %ara reco$er e" desti"ado7 Mtodos extractivos co"orimtricos a+ Mtodo de Ji,ret C,ndamento# =os %o"i%%tidos )"a m!nima ,nidad de reacci n es e" tri%%tido+ reaccionan con ,na so",ci n di",ida de s,"*ato c8%rico )C,:I+ en medio *,ertemente a"ca"ino/ mostrando ,na co"oraci n aB," caracter!stica7 Reactivos# Solucin A# tartrato de sodio 0 %otasio7F ?:O @@@@@13/E6 $ C,SOF72?:O @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ 6/EE $ &I @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ :/EE $ NaO? : N @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@ FE m" ="evar a :EE m" con a$,a desti"ada Solucin B: 1E $ de &I en 16E m" de NaO? : N7 Solucin C: )%re%arar"a en e" momento+ 1E m" de So",ci n A I 3 m" de So",ci n J I a$,a desti"ada %ara com%"etar 1EE m"7 Determinaci n# En t,-os de ensa0o a%ro%iados co"ocar 1 m" de so",ci n de %rote!na )E/EMm$@1/2m$+/ 1m" de NaO? :N/ : m" de reactivo C 0 1 m" de a$,a desti"ada7 A$itar 0 de'ar <E min a tem%erat,ra am-iente7 =eer "a a-sor-ancia a 2F2 nm7 Se de-e (acer cada veB ,n -"anco 0 ,na c,rva de ca"i-raci n7 -+ Mtodo de Jrad*ord Ran$o# E/: a :E$D:E" )E7E1@1$D"+ Reactivos# So",ci n co"orante# Diso"ver 1EE m$ de Serva J",e G )Serva/ Oest-,r0/ NY+ o Coomassie Jri""iant J",e G@:2E en ,na meBc"a de 1EE m" de .cido *os* rico 324 0 2E m" de etano" H247 Kna veB ;,e e" co"orante se diso"vi com%"etamente/ ""evar a 1 "itro con a$,a desti"ada *r!a7 NaO? 1M Procedimiento# Prender e" es%ectro*ot metro 12 min antes de ,sar"o7 Poner FE " de m,estra en ,n t,-o de (em "isis7 A$re$ar 2E" de NaO? :M )a"ternativamente/ e" NaO? %,ede a$re$arse a" reactivo de co"or en "a re"aci n 2E "Dm"+7 A$re$ar 1 m" de reactivo de co"or e inc,-ar 2 min7 Medir "a a-sor-ancia a 2HE nm en c,-etas de vidrio o %o"iestireno7 c+ Mtodo de =o>r0 Se -asa en "a reacci n de" reactivo de Co"in@Cioca"te, con "as %rote!nas7 Si -ien e" mecanismo de reacci n no est. -ien di",cidado/ se sa-e ;,e "a tirosina/ 0 en menor extensi n "a ciste!na/ "a cistina/ "a (istidina 0 "as ,niones %e%t!dicas/ reaccionan
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red,ciendo a" mo"i-dato a aB," de mo"i-deno7 =a reacci n tam-in %,ede %rod,cirse en %resencia de t,n$stato/ %ara $enerar aB," de mo"i-deno 0 t,n$steno7 E" com%"e'o da ,n co"or aB," caracter!stico ;,e se mide a MF2@M2E nm7 =os iones C,:I en medio a"ca"ino *aci"itan "a reacci n de red,cci n de" reactivo de Co"in *ormando ,n com%"e'o con "a ,ni n %e%t!dica a travs de" nitr $eno invo",crado en e" en"ace 0 red,cindose a C, 1I7 E" C,1I 0 "os resid,os invo",crados red,cen entonces a" reactivo de Co"in $enerando e" co"or caracter!stico7 Inter*erencias @ Ceno"es exce%to nitro*eno"es 0 otras s,stancias red,ctoras )merca%toetano"/ ditiotreito"/ etc+ %or red,cci n de" reactivo de Co"in7 @ G"icina# %or dismin,ir "a intensidad de" co"or desarro""ado7 @ S,stancias o -,**ers ;,e acidi*i;,en e" medio7 @ A$entes ;,e"antes de" co-re7 Ran$o# E7E2@E7F m$Dm" Reactivos# Na:CO< :4 en NaO? E71N# So",ci n A C,SOF72?:O 17E4 Tartrato de Na 0 & :4 So",ci n de Co"in# Reactivo de Co"in Cioca"tea, di",ido con a$,a desti"ada 1#1 Determinaci n# Se meBc"an en e" momento de "a determinaci n vo"8menes i$,a"es de "a so",ci n de C,SOF 0 de "a de" tartrato7 A esta meBc"a "a ""amaremos so",ci n J7 APadir 1m" de "a so",ci n J a 2E m" de "a so",ci n A/ %ara o-tener "a so",ci n AIJ7 Se %re%ara "a di",ci n de "a m,estra ;,e corres%onda ):EE "+ a "a ;,e se "e adiciona 1m" de so",ci n AIJ7 A$itar -ien 0 de'ar re%osar 1E min7 Pasado este tiem%o a$re$ar 1EE " de" reactivo de Co"in di",ido7 A$itar -ien 0 de'ar re%osar <E min7 =eer a-sor-ancia a M2Enm Determinaci n de Nitr $eno am!nico# Mtodo de Sorensen A%"icaci n# Sirve %ara determinar N am!nico en m,estras "!;,idas o extractos7 *ina"idad es %oder determinar "a concentraci n de amon!aco o $r,%os amino "i-res amino.cidos/ %%tidos 0 %rote!nas7 Es 8ti" %ara dosar amino.cidos "i-res en ',$os *r,ta/ e" $rado de (idr "isis de ,na %rote!na/ o amonio des%,s de "a destr,cci n materia or$.nica en e" mtodo de &'e"da("/ etc7 =a de de de

Determinaci n# Ne,tra"iBar 1E m" de m,estra con NaO? E/1 N ,sando *eno"*ta"e!na como indicador7 Es im%ortante no excederse en e" a$re$ado de NaO?/ detenerse en e" %,nto en ;,e a%arece ,na d-i" co"oraci n rosada ;,e %ersiste %or <E se$7 Otra %osi-i"idad es ,ti"iBar ,n %?metro 0 ""e$ar a %? 37 A$re$ar 1E m" de *ormo" ne,tra"iBado recientemente con *eno"*ta"e!na 0 tit,"ar de inmediato "a acideB "i-erada con NaO? E/1 N (asta ver e" %,nto *ina"7 Tomar este 8"timo va"or %ara e" c."c,"o de N am!nico 0 e" %rimero %ara e" c."c,"o de "a acideB7 C."c,"o# $ 4N 9 LNaO? NNaO? E/E1F x 1EED%eso de m,estra Determinaci n de amino.cidos arom.ticos# mtodo de ?,"" Reactivos# todos los reactivos deben estar a una T > 3 C @ Rvo Co"in@Cico"to,# 1 vo" CC ).cido *os*omo"!-dico@.cido *os*ot8n$stico+ I : vo" AD @ CO<Na: 124 I ?exameta*os*ato s dico :4 Determinaci n# MeBc"ar E72 m" de m,estra con 1 m" de CO <Na:@?exameta*os*ato 0 es%erar 2 min7 =,e$o a$re$ar E7< m" de Rvo CC7 Es%erar 2 min 0 "eer "a a-sor-ancia a 62E nm7
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C,rva de ca"i-raci n# Con tirosina como %atr n %re%arar so",ciones de di*erente concentraci n 0 a$re$ar e" vo",men necesario de TCA 1:4 como %ara tener ,na concentraci n *ina" de 347 Centri*,$ar 0 so-re "os so-renadantes a%"icar "a tcnica descri%ta anteriormente7

Extracci n de Prote!nas A contin,aci n se %resentan a"$,nos %rotoco"os com,nmente ,ti"iBados %ara "a extracci n de %rote!nas de distintos %rod,ctos a"imenticios7 Prod,ctos c.rneos7 - ?omo$eneiBar 1 $ de m8sc,"o %icado con 1E/E m" de -,**er Tris@?C" E/E< M/ %? 9 M/E7 - Centri*,$ar a MEEE $ )12 min/ F GC+7 Se%arar e" so-renadante7 - Re%etir e" tratamiento anterior so-re e" %e""et7 - MeBc"ar "os dos so-renadantes o-tenidos7 =a so",ci n res,"tante constit,0e "a *racci n de !rote"nas e#tra"bles en agua $%EA& $!rote"nas sarco!l'smicas *,ndamenta"mente+7 - Tratar e" %e""et remanente ",e$o de "os dos %asos de extracci n %revios con 1E/E m" de -,**er Tris@?C" E7E< M conteniendo &C" E/6 M/ %? 9 M7 - Centri*,$ar )MEEE $/ 12 min/ F GC+ 0 se%arar e" so-renadante7 - Re%etir e" tratamiento anterior so-re e" %e""et7 - MeBc"ar "os dos so-renadantes# se o-tiene "a *racci n de !rote"nas e#tra"bles con sal $%ES& $!rote"nas mio(ibrilares *,ndamenta"mente+7 ?arina de so'a7 - Tratar 1 $ de (arina de so'a des$rasada con 1E/E m" de a$,a a"ca"iniBada con NaO? 1 N a %? 9 37 - A$itar d,rante 1 ( en a$itador ma$ntico a tem%erat,ra am-iente7 - Centri*,$ar a 1EEEE $ )12 min/ F GC+7 Se%arar e" so-renadante# *racci n de %rote!nas so",-"es7 ?arina de tri$o ), otros cerea"es+7 Tratar 6:2 m$ de (arina con 1E/E m" de -,**er Tris@?C" FE mM con :4 SDS/ %? 6737 Inc,-ar d,rante ,na (ora a tem%erat,ra am-iente en a$itador ma$ntico7 Centri*,$ar a 12EEE $ )1E min/ F GC+7 Se%arar e" so-renadante7

Electro(oresis en geles de !oliacrilamida con SDS $SDS)%A*E& =a com%osici n %o"i%e%t!dica de ,n extracto %roteico %,ede ser eva",ada mediante ,na e"ectro*oresis/ -asada en "a ca%acidad de mi$raci n de ,na %art!c,"a car$ada -a'o "a acci n de ,n cam%o e"ctrico7 A %?s di*erentes a" %I/ "as %rote!nas se enc,entran car$adas 0 se m,even *rente a "a *,erBa im%,"sora $enerada %or ,n cam%o e"ctrico7 Se$8n "a "e0 de StoQes "as %art!c,"as se movi"iBar.n a ,na ve"ocidad de*inida se$8n s, tamaPo/ car$a 0 viscosidad de" medio7 En "as e"ectro*oresis %roteicas se ,ti"iBan so%ortes estr,ct,rados "os c,a"es adem.s act8an como tamiB/ "imitando as! "a movi"idad de "as %rote!nas de ac,erdo a s, tamaPo7 E" $e" de %o"iacri"amida es e" so%orte mas com8nmente ,ti"iBado %or s, a"ta re%rod,ci-i"idad/ esta-i"idad )%?/ tem%erat,ra/ *,erBa i nica+/ inercia ;,!mica 0 %orosidad contro"a-"e7 =a %o"imeriBaci n de "a acri"amida si$,e ,n mecanismo de radica"es "i-res c,0o iniciador es e" %ers,"*ato de amonio con e" N/ N/ NR/ NR tetrameti"eti"enodiamina )TEMED+ act,ando como cata"iBador7 =a %orosidad de" $e" se contro"a mediante "a re"aci n entre "a acri"amida 0 "a N/ NR@ meti"eno@-is@acri"amida/ "a c,a" act8a como entrecr,Bador/ 0 "a concentraci n de am-os com%,estos7 En e" caso de "as e"ectro*oresis desnat,ra"iBantes/ "a %rote!na tratada con SDS/ deter$ente ani nico/ %ierde s, estr,ct,ra c,aternaria 0 terciaria/ 0 "os %o"i%%tidos ;,e *orman "as s,-,nidades de %rote!nas m,"timricas/ 0 "as %rote!nas monomricas se car$an ne$ativamente de manera ,ni*orme se%ar.ndose de ac,erdo a s, tamaPo7 Reactivos 0 e;,i%o J,**er de e"ectrodo# Tris)(idroximeti"+aminometano@?C" )Tris@?C"+ :2 mM/ $"icina 1H: mM )%? 3/<+/ con dodeci" s,"*ato de sodio )SDS+ E/1 4 %Dv7 J,**er de $e" stacQin$ )Fx+# Tris@?C" 2EE mM )%? 6/3+ con SDS E/F 4 %Dv5 NR/NR/NR/NR/ tetrameti"eti"enodiamina )TEMED+ E/F 4 vDv7 J,**er de $e" se%arador )Fx+# Tris@?C" 1/2 M )%? 3/3+ con SDS E/F 4 %Dv5 NR/NR/NR/NR/ tetrameti"eti"enodiamina )TEMED+ E/F 4 vDv7 J,**er de m,estra %ara e"ectro*oresis desnat,ra"iBante# Tris@?C" 6:/2 mM )%? 6/3+/ sacarosa 12 4 vDv/ SDS :4 %Dv/ EDTA :2 mM 0 aB," de -romo*eno" E/E2 4 %Dv con o sin :@merca%toetano" ):@ME+ 24 vDv/ %ara o-tener condiciones red,ctoras o no red,ctoras/ res%ectivamente7 E" :@ME red,ce en"aces dis,"*,ro 0 desarma estr,ct,ras m,"timricas esta-i"iBadas %or ,niones cova"ente de $r,%os tio"es de ciste!nas7 So",ci n de acri"amida@-isacri"amida# <E $ de arc(i"amida 0 E/3 $ de -isacri"amida se ""evan a ,n vo",men *ina" de 1EE m= con a$,a desti"ada7 =,e$o se *i"tra 0 se a"macena en *rasco co"or carame"o7 E;,i%o de e"ectro*oresis# Mini Protean II )JIO@RAD =i*e Sciences/ EE7 KK7+ con se%aradores entre %"acas de 1 mm de es%esor7 Pre%araci n de "as m,estras 0 siem-ra En e" caso de extractos %roteicos/ "os mismos ser.n meBc"ados con -,**er m,estra7 Si se trata de m,estras s "idas "as mismas ser.n directamente so",-i"iBadas en -,**er m,estra 1x7 En e" caso de m,estras tratadas con :@ME/ ser.n ca"entadas a 1EE GC d,rante < min,tos7 =as meBc"as se centri*,$ar.n a 1:7EEE $ d,rante 1E min a :E GC7 En "os distintos $e"es de %o"iacri"amida se sem-raron entre 2 S= 0 :2 S= de m,estra %or ca""e o < S= de so",ci n %atr n %ara tener ,na concentraci n detecta-"e 0 -,ena reso",ci n con "a tinci n con Coomasie Jri""iant J",e R@:2E7 Pre%araci n de" $e"/ siem-ra 0 corrida Se %re%arar.n $e"es de se%araci n con ,na concentraci n de arcri"amida de" 1: 4 %Dv 0 ,n $e" de concentraci n o stacQin$ de F 4 %Dv/ de ac,erdo con Para 1 $e" de 1mm# @Ge" se%arador )M m" en tota"+# Acri"7 StocQ :7M< m" 1:4 J,**er $e" )Fx+ 17M2 m"
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A$,a Pers,"*ato 1E4 TEMED

:72: m" :2 " M "

@Ge" de stacQin$ ): m" en tota"+# Acri"7 StocQ E7:6 m" F4 J,**er stacQin$ )Fx+ E72 m" A$,a 17:F m" Pers,"*ato 1E4 :: " TEMED :72 " Se sem-rar. ,n vo",men de m,estra en -,**er m,estra ta" ;,e conten$a entre :E 0 <E S$ de %rote!na7 =a corrida se rea"iBar. a vo"ta'e constante de <E mL/ contro"ando ;,e "a tem%erat,ra de "a c,-a no s,%ere "os <2 GC7 Tinci n =os $e"es ser.n *i'ados 0 co"oreados en ,na misma eta%a en so",ci n de Coomasie Jri""iant J",e R E/1H: 4 %Dv en a$,a@metano"@acido actico )1E#1E#F+ d,rante ,n tiem%o ma0or a 1/2 ( 0 ser.n deco"orados en so",ci n a$,a@etano"@.cido actico )62#:2#1E+ con s,cesivos cam-ios a tem%erat,ra am-iente (asta o-tener "a reso",ci n deseada7