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Adopte: 7 septembre 2009

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PROJET DE LIGNE DIRECTRICE DE L'OCDE POUR LES ESSAIS DE PRODUITS CHIMIQUES

tudes combines de toxicit chronique et de cancrogense INTRODUCTION 1. Les Lignes directrices de l'OCDE pour les essais de produits chimiques (LD) sont priodiquement revues la lumire des progrs scientifiques, des nouvelles pratiques d'valuation ainsi que de considrations relatives au bien-tre animal. La LD 453 initiale a t adopte en 1981. Sa rvision a t juge ncessaire afin de tenir compte des volutions rcentes dans le domaine du bientre animal, ainsi que des nouvelles exigences rglementaires (1) (2) (3) (4) (5). La mise jour de la LD 453 a t effectue en parallle avec la rvision des LD 451 (tudes de cancrogense) et 452 (tudes de toxicit chronique) dans le but d'obtenir des informations additionnelles partir des animaux utiliss dans ltude, et de fournir des prcisions concernant le choix des doses. La prsente Ligne directrice vise les essais portant sur une large gamme de produits chimiques, dont des pesticides et des produits chimiques industriels. Il convient toutefois de noter que certains aspects et certaines dispositions peuvent diffrer pour les produits pharmaceutiques (voir la Confrence internationale sur l'harmonisation, thme S1B : valuation de la cancrognicit des produits pharmaceutiques). 2. La plupart des tudes de toxicit chronique et de cancrogense tant menes sur des espces de rongeurs, la prsente Ligne directrice est destine sappliquer principalement des tudes ralises avec ces espces. S'il s'avrait ncessaire de mener de telles tudes avec des non-rongeurs, il conviendrait d'appliquer, moyennant des modifications appropries, les principes et procdures dcrits dans la prsente Ligne directrice et dans la LD 409 - Toxicit orale doses rptes - non-rongeurs : 90 jours (6), comme indiqu dans le Document d'orientation de l'OCDE sur llaboration et la conduite des tudes de toxicit chronique et de cancrogense (7). 3. Les trois principales voies d'administration utilises dans les tudes de toxicit chronique et de cancrogense sont la voie orale, la voie cutane et l'inhalation. Le choix de la voie d'administration dpend des caractristiques physiques et chimiques de la substance dessai et de la voie d'exposition prdominante chez lhomme. Des informations complmentaires sur le choix de la voie d'exposition sont fournies dans le Document d'orientation No. 116 (7). 4. La prsente Ligne directrice porte principalement sur l'exposition par voie orale, la voie la plus communment utilise dans les tudes de toxicit chronique et de cancrogense. Bien que des tudes long terme utilisant lexposition par voie cutane ou par inhalation puissent aussi tre ncessaires pour valuer le risque pour la sant humaine et/ou exiges en vertu de certains rgimes rglementaires, ces deux voies d'exposition ncessitent des dispositifs techniques d'une grande complexit. De telles tudes devront tre conues au cas par cas, encore que la prsente Ligne directrice, qui porte sur la caractrisation et l'valuation de la toxicit chronique et de la cancrognicit par voie orale, puisse fournir les bases d'un protocole d'tude par voie cutane et/ou inhalation, notamment en ce qui concerne les recommandations relatives aux dures de traitement, aux paramtres cliniques et pathologiques, etc. Il existe des documents d'orientation de l'OCDE sur l'administration exprimentale de substances par inhalation (7) (8) et par voie cutane (7). Les LD 412 (9) et 413 (10), ainsi que le Document d'orientation de lOCDE sur les essais de toxicit aigu par inhalation (8), sont tout particulirement consults lors de la conception d'tudes long terme portant
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sur une exposition par inhalation. La LD 410 (11) est consulte dans le cas d'un essai portant sur la voie cutane. 5. L'tude combine de toxicit chronique et de cancrogense donne des lments d'information sur les risques pour la sant susceptibles de dcouler d'une exposition rpte pendant une priode pouvant couvrir la vie entire de l'espce considre. L'tude fournit des informations sur les effets toxiques de la substance, y compris sur son pouvoir cancrogne, et peut indiquer les organes cibles et la possibilit daccumulation dans ces organes. Elle peut aussi donner une estimation de la dose sans effet nocif observ pour ce qui est des effets toxiques et, dans le cas de substances cancrognes non gnotoxiques, des rponses tumorales. Cette estimation permet dtablir les critres de scurit concernant l'exposition humaine. De plus, il convient daccorder une attention particulire lobservation clinique des animaux afin dobtenir le plus dinformations possibles. 6. Les objectifs des tudes de toxicit chronique et de cancrogense couvertes par la prsente Ligne directrice pour les essais sont les suivants : Identification des proprits cancrognes d'un produit chimique susceptibles d'augmenter les risques de noplasmes, la frquence de survenue de noplasmes malins ou la diminution du temps ncessaire leur apparition, par rapport aux groupes tmoins concurrents; Identification du temps d'apparition de noplasmes; Identification de la toxicit chronique dun produit chimique; Identification d'un ou de plusieurs organes cibles de la toxicit chronique et de la cancrogense; Caractrisation de la relation dose-effet; Identification dun niveau de dose sans effet nocif observ (DSENO) ou du point de dpart pour ltablissement d'une dose de rfrence (DR); Extrapolation des effets cancrognes aux niveaux dexposition humaine correspondant de faibles doses; Prvision des effets de toxicit chronique aux niveaux reprsentatifs de l'exposition humaine; Obtention de donnes permettant de vrifier les hypothses concernant le mode d'action (2) (7) (12) (13) (14) (15).

REMARQUES PRLIMINAIRES 7. Pour caractriser et valuer la cancrognicit potentielle et la toxicit chronique d'un produit chimique, le laboratoire charg de ltude prend en compte toutes les informations disponibles sur la substance dessai avant de raliser l'tude, afin de pouvoir orienter celle-ci de manire tester plus efficacement les proprits toxicologiques de la substance, et faire le moins possible appel aux animaux. La connaissance du mode d'action d'un agent cancrogne suspect et sa prise en compte (2) (7) (12) (13) (14) (15) sont particulirement importantes puisque la conception optimale de l'essai peut diffrer selon que la substance est ou n'est pas un agent cancrogne gnotoxique connu ou suspect. Des informations complmentaires sur certains aspects du mode d'action peuvent tre trouves dans le Document d'orientation No. 116 (7). 8. Les informations utiles pour concevoir ltude sont notamment: l'identit, la structure chimique et les proprits physico-chimiques de la substance dessai; les informations ventuelles sur son mode daction; les rsultats de toutes les tudes de toxicit in vitro ou in vivo menes et notamment des essais de gnotoxicit; l'utilisation (les utilisations) prvue(s) et le potentiel dexposition humaine; les donnes (Q)SAR disponibles et les donnes toxicologiques (par exemple
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mutagnicit, gnotoxicit et pouvoir cancrogne) relatives aux substances structurellement apparentes; les donnes toxicocintiques disponibles (dose unique et doses rptes, si ces donnes existent) et les rsultats d'autres tudes doses rptes. La dtermination de la toxicit chronique et du pouvoir cancrogne nest effectue qu'aprs obtention des premiers rsultats d'essais de toxicit doses rptes mens sur 28 jours et/ou 90 jours. Les essais d'initiation-promotion de cancers court terme peuvent aussi livrer des informations utiles. Il convient denvisager ladoption dune approche par tapes pour ltude exprimentale de cancrogense entreprise dans le cadre de l'valuation globale des effets nocifs potentiels d'un produit chimique (16) (17) (18) (19). 9. Les mthodes statistiques les plus appropries pour l'analyse des rsultats, compte tenu du plan exprimental et des objectifs de ltude, sont identifies avant le dbut de l'tude. Il convient notamment de dterminer si les statistiques doivent prendre en compte l'ajustement en fonction de la survie, l'analyse des risques de tumeurs cumules lis la dure de survie, l'analyse du temps ncessaire l'apparition d'une tumeur et l'analyse effectue en cas de mort prmature des animaux d'un ou de plusieurs groupes. On trouvera des indications concernant les analyses statistiques appropries, ainsi que des rfrences cls des mthodes statistiques reconnues au plan international, dans le Document d'orientation No. 116 (7), ainsi que dans le Document d'orientation n 35 sur l'analyse et l'valuation des tudes de toxicit chronique et de cancrogense (20). 10. Lors de la ralisation d'une tude de cancrogense, il est recommand de toujours suivre les principes et considrations noncs dans le Document d'orientation de l'OCDE No. 19 sur la reconnaissance, l'valuation et lutilisation des signes cliniques comme effets observs thiquement acceptables dans les exprimentations animales menes des fins d'valuation de la scurit (21). Le paragraphe 62 de ce document, en particulier, stipule ce qui suit : Dans les tudes comportant l'administration de doses rptes, lorsqu'un animal prsente des signes cliniques progressifs de dtrioration de son tat, une dcision deuthanasier ou non l'animal est prise en connaissance de cause. Cette dcision met en balance des facteurs tels que la valeur des informations pouvant tre obtenues en maintenant l'animal dans l'tude dune part, et ltat gnral de celui-ci dautre part. Si la dcision est prise de poursuivre l'essai sur cet animal, la frquence des observations est augmente selon les besoins. Il est aussi possible, sans toutefois nuire l'objectif de l'essai, dinterrompre l'administration de la substance dessai pour soulager la douleur ou la dtresse de lanimal, ou de rduire la dose teste. 11. On trouvera des informations dtailles et une discussion sur les principes dterminant le choix des doses pour les tudes de toxicit chronique et de cancrogense dans le Document d'orientation No. 116 (7), ainsi que dans deux publications de l'Institut international des sciences de la vie (22) (23). La stratgie de base pour le choix des doses dpend du ou des principaux objectifs de l'tude (paragraphe 6). En choisissant des niveaux de doses appropris, il convient de trouver un quilibre, entre d'une part, l'identification des dangers et, d'autre part, la caractrisation des rponses aux faibles doses et leur pertinence. Cet quilibre est particulirement ncessaire dans le cas de l'tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (LD 453) considre ici. 12. Il convient dexaminer lopportunit de raliser cette tude combine de toxicit chronique et de cancrogense (LD 453) plutt que de raliser sparment une tude de toxicit chronique (LD 452) et une tude de cancrogense (DL 451). L'essai combin permet une meilleure efficacit en temps et en cots, et un moindre recours aux animaux, par rapport la conduite de deux essais spars, et ne compromet pas la qualit des donnes de la phase chronique ou de la phase de cancrogense. Lors de la ralisation d'une telle tude combine, il convient toutefois de respecter les principes dterminant le choix de la dose (paragraphes 11 et 22 26) et il est galement reconnu que certains cadres rglementaires peuvent imposer la conduite d'tudes spares. On trouvera dans le Document d'orientation No. 116 (7) des indications supplmentaires sur les moyens de concevoir de manire 3
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optimale ltude combine de toxicit chronique et de cancrogense afin de rduire le nombre danimaux utiliss et en rationalisant les diverses procdures exprimentales. 13. Les dfinitions utilises dans le contexte de la prsente Ligne directrice figurent dans le Document d'orientation No. 116 (7). PRINCIPE DE L'ESSAI 14. L'tude comprend deux phases parallles: une phase chronique et une phase de cancrogense (dont les dures respectives font lobjet des paragraphes 34 et 35). La substance dessai est normalement administre par la voie orale, mais la voie inhalatoire ou la voie cutane peuvent aussi tre appropries. Durant la phase chronique, la substance tester est administre quotidiennement plusieurs groupes d'animaux dexprience des doses progressives, raison d'un niveau de dose par groupe, en gnral pendant une priode de 12 mois, bien que des dures plus longues ou plus courtes puissent aussi tre choisies en fonction des exigences rglementaires (voir paragraphe 34). Cette dure est suffisamment longue pour permettre aux effets de toxicit cumule de se manifester, tout en vitant les effets perturbateurs des changements lis au vieillissement. Un ou plusieurs sacrifices en cours d'tude peuvent aussi tre prvus, par exemple 3 et 6 mois, auquel cas des groupes d'animaux supplmentaires pourront tre inclus dans ltude (voir paragraphe 20). Durant la phase de cancrogense, la substance est administre quotidiennement diffrents groupes d'animaux pendant la plus grande partie de leur vie. Au cours des deux phases, les animaux sont observs attentivement pour dceler dventuels signes de toxicit et le dveloppement de lsions noplasiques. Les animaux qui meurent ou sont sacrifis en cours dessai sont autopsis et, au terme de l'essai, les animaux survivants sont sacrifis et autopsis. DESCRIPTION DE LA MTHODE Choix des espces animales 15. La prsente Ligne directrice traite principalement de la caractrisation et de l'valuation de la toxicit chronique et de la cancrognicit chez les rongeurs (paragraphe 2). Le recours des espces autres que des rongeurs peut tre envisag si les donnes disponibles laissent escompter une meilleure prdiction des effets de la substance sur la sant humaine. Dans ce cas, le choix de l'espce est justifi. L'espce de rongeur prfre est le rat, mais dautres rongeurs comme la souris peuvent tre utiliss. Bien que le recours la souris dans les tudes de cancrogense puisse ne prsenter qu'un intrt limit (24) (25) (26), certains programmes rglementaires actuels exigent tout de mme la conduite d'essais de cancrogense sur la souris. Les rats et les souris sont les modles exprimentaux choisis de prfrence, en raison de leur dure de vie relativement courte, de leur utilisation frquente dans les tudes pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilit l'induction de tumeurs et de la disponibilit de souches suffisamment caractrises. Ces caractristiques permettent d'obtenir une grande quantit d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Sil savrait ncessaire de raliser des tudes de toxicit chronique et de cancrogense avec des espces de nonrongeurs, le plan et la conduite de ltude devraient suivre les principes dcrits dans la prsente Ligne directrice ainsi que dans la LD 409, Toxicit orale doses rptes - non-rongeurs : 90 jours (6). Des informations additionnelles sur le choix des espces et des souches sont disponibles dans le Document d'orientation No. 116 (7). 16. Il convient d'employer des animaux adultes sains, de souches communment utilises dans les laboratoires. L'tude combine de toxicit chronique et de cancrogense sera effectue de prfrence sur des animaux de mme souche et de mme provenance que ceux utiliss dans ltude (les tudes) de toxicit prliminaire(s) de plus courte dure. Si toutefois ces animaux sont rputs ne
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pas rpondre aux critres de survie gnralement admis dans les tudes long terme (voir le Document d'orientation No. 116 (7)), il convient denvisager d'utiliser une souche d'un animal dont le taux de survie permette de raliser une tude long terme. Les femelles sont nullipares et non gravides. Conditions d'hbergement et d'alimentation 17. Les animaux peuvent tre logs individuellement ou dans des cages en petits groupes du mme sexe, lhbergement individuel n'tant envisager que dans des cas scientifiquement justifis (27) (28) (29). Les cages sont places de faon telle que l'influence ventuelle de leur disposition sur les rsultats de l'tude soit rduite au minimum. La temprature du local des animaux dexprience est de 22 C ( 3C). L'humidit relative est d'au moins 30 % et nexcde pas de prfrence 70 % en dehors des moments o le local est nettoy, l'idal tant qu'elle soit comprise entre 50 et 60 %. L'clairage est artificiel, alternant 12 heures de lumire et 12 heures dobscurit. Le rgime alimentaire peut tre un rgime classique de laboratoire avec eau potable satit. Il satisfait tous les besoins nutritionnels de l'espce tudie, et la teneur en contaminants alimentaires susceptibles d'influer sur les rsultats de l'essai (rsidus de pesticides, polluants organiques persistants, phyto-strognes, mtaux lourds et mycotoxines, par exemple) est aussi faible que possible. Des donnes analytiques sur les teneurs en nutriments et en contaminants alimentaires sont recueillies rgulirement, au moins au dbut de l'tude et lors des changements de lots; ces donnes figurent dans le rapport final. Des donnes analytiques sur l'eau de boisson utilise lors de l'tude sont de mme fournies. Le choix du rgime alimentaire peut tre influenc par la ncessit d'assurer un mlange convenable de la substance dessai et de satisfaire les besoins nutritionnels des animaux lorsque la substance est administre dans la nourriture. Prparation des animaux 18. Il convient d'utiliser des animaux sains, acclimats aux conditions de laboratoire depuis au moins 7 jours et n'ayant jamais t soumis auparavant des protocoles exprimentaux. Dans le cas des rongeurs, l'administration de la substance commence ds que possible aprs le sevrage et l'acclimatation, et de prfrence avant l'ge de 8 semaines. Lespce, la souche, la provenance, le sexe, le poids et lge des animaux dexprience sont prciss. Au dbut de l'tude, la variation de poids des animaux de chaque sexe est minimale et nexcde pas 20 % du poids moyen de tous les animaux tudis, et ce pour chaque sexe sparment. Les animaux sont affects de manire alatoire aux diffrents groupes (tmoins et traits). Aprs la randomisation, les poids moyens des groupes de chaque sexe ne prsentent pas de diffrences significatives. En cas de diffrences statistiquement significatives, la phase de randomisation est rpte dans la mesure du possible. Chaque animal reoit un numro d'identification unique et en est marqu de manire permanente par tatouage, implant de micropuce ou toute autre mthode approprie PROTOCOLE Nombre et sexe des animaux 19. Il convient dutiliser des animaux des deux sexes. Leur nombre est suffisant pour permettre une valuation biologique et statistique complte. Pour les rongeurs, chaque groupe de dose (comme dfini au paragraphe 22) et chaque groupe tmoin concurrent prvu pour participer la phase de cancrogense de l'tude comprend donc au moins 50 animaux de chaque sexe. Selon le but de l'tude, il sera possible d'augmenter la puissance statistique des principales estimations en rpartissant les animaux de manire diffrencie et non gale en nombre dans les divers groupes de dose, avec plus de 50 animaux dans les groupes faibles doses pour estimer par exemple la cancrognicit aux faibles 5
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doses. Il convient toutefois de noter qu'une augmentation modre de la taille d'un groupe entranera une augmentation relativement faible de la puissance statistique de l'tude. Chaque groupe de dose (comme dfini au paragraphe 22), et chaque groupe tmoin concurrent prvu pour participer la phase de toxicit chronique de l'tude, comprend au moins, dans le cas des rongeurs, 10 animaux de chaque sexe. On notera que ce nombre est plus faible que celui prconis dans l'tude de toxicit chronique de la LD 452. L'interprtation des donnes obtenues partir de ce nombre rduit d'animaux par groupe dans la phase de toxicit chronique de la prsente tude combine s'appuie cependant sur les donnes provenant des animaux plus nombreux tudis lors de la phase de cancrogense de ltude. Dans les tudes utilisant des souris, il peut tre ncessaire de prvoir des animaux supplmentaires dans chaque groupe trait lors de la phase de toxicit chronique pour pouvoir effectuer tous les examens hmatologiques requis. On trouvera des donnes complmentaires sur la conception statistique de l'tude et le choix de niveaux de doses permettant d'optimiser la puissance statistique dans le Document d'orientation No. 116 (7). Sacrifices en cours d'tude, groupes satellites et animaux sentinelles 20. Ltude peut prvoir le sacrifice danimaux en cours d'tude, par exemple 6 mois pour la phase de toxicit chronique, afin de recueillir des donnes sur la progression des altrations non noplasiques et des donnes mcanistiques, si cela est scientifiquement justifi. Si lon dispose dj de ces donnes, obtenues antrieurement lors d'tudes de toxicit doses rptes sur la substance dessai, les sacrifices en cours d'tude peuvent ne pas tre scientifiquement justifis. Les animaux tudis pendant la phase de toxicit chronique de l'tude, normalement sur une dure de 12 mois (paragraphe 34), fournissent les donnes correspondant aux sacrifices en cours d'tude pour la phase de cancrogense, ce qui rduit le nombre total d'animaux tudis. Des groupes satellites peuvent aussi tre constitus pour la phase de toxicit chronique afin de contrler la rversibilit des ventuelles altrations toxicologiques induites par le produit chimique tudi. Ces investigations pourront ne porter que sur les doses maximales de ltude et sur le groupe tmoin. Un groupe supplmentaire d'animaux sentinelles (gnralement 5 animaux de chaque sexe) peut tre inclus si ncessaire pour le suivi de l'tat pathologique au cours de l'tude (30). On trouvera des indications supplmentaires sur les sacrifices en cours d'tude et sur le recours des animaux satellites et sentinelles, ainsi que sur la limitation du nombre total d'animaux tudis, dans le Document d'orientation No. 116 (7). 21. Si linclusion danimaux satellites et/ou des sacrifices en cours dessai sont prvus, le nombre d'animaux dans chaque groupe de dose prvu cet effet sera normalement de 10 animaux de chaque sexe, et le nombre total d'animaux tudis devra tre augment du nombre d'animaux devant tre sacrifis avant lachvement de ltude. Les animaux destins tre sacrifis en cours d'tude et les animaux satellites sont normalement sujets aux mmes observations que ceux soumis la phase de toxicit chronique de l'tude principale, notamment en ce qui concerne le poids corporel, la prise d'aliments et d'eau, les mesures hmatologiques et de biochimie clinique, et les examens pathologiques. Toutefois, des dispositions peuvent aussi tre prises (dans les groupes d'animaux sacrifis en cours d'tude) pour limiter ces observations des mesures essentielles spcifiques telles que la neurotoxicit ou l'immunotoxicit. Groupes de dose et dosages 22. Le Document d'orientation No. 116 (7) donne des indications sur tous les aspects du choix des doses et des carts entre les doses. Il convient dutiliser au moins trois doses et un groupe tmoin, aussi bien pour la phase de toxicit chronique que pour la phase de cancrogense. Les niveaux de doses seront gnralement bass sur les rsultats d'tudes plus court terme doses rptes, ou d'tudes prliminaires de dtermination des concentrations, et devront prendre en compte toutes les
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donnes toxicologiques et toxicocintiques existantes relatives la substance teste ou aux matires apparentes. 23. Pour la phase de toxicit chronique de l'tude, une tude complte portant sur trois niveaux de doses peut ne pas tre considre comme indispensable s'il est possible danticiper qu'un essai dose unique, quivalant au moins 1 000 mg/kg de poids corporel/jour, ne produira probablement pas deffets indsirables. La dcision est fonde sur les rsultats d'tudes prliminaires et sur labsence probable de toxicit de la substance dessai, compte tenu des donnes disponibles sur des substances structurellement apparentes. Une limite de 1 000 mg/kg de poids corporel/jour peut sappliquer sauf si lexposition humaine indique quil est ncessaire de recourir un niveau de dose plus lev. 24. moins de contraintes dues la nature physico-chimique ou aux effets biologiques de la substance dessai, le niveau de dose le plus lev est choisi de manire permettre didentifier les principaux organes cibles et les effets toxiques de la substance tout en vitant la souffrance, une toxicit svre ou une forte morbidit ou ltalit chez les animaux tests. La plus forte dose est normalement choisie pour provoquer une manifestation de toxicit, par exemple un ralentissement de la prise de poids corporel (d'environ 10 %). Toutefois, en fonction des objectifs de l'tude (voir paragraphe 6), on pourra choisir un niveau de dose maximal plus faible que la dose qui provoque des signes de toxicit, par exemple une dose entranant un effet ngatif proccupant mais dont limpact sur lesprance de vie ou le poids corporel reste faible. 25. Les niveaux de doses et les intervalles entre les doses peuvent tre choisis de manire pouvoir tablir une relation dose-rponse et, selon le mode d'action de la substance tester, une DSENO ou tout autre rsultat escompt de l'tude, notamment une DR (voir le paragraphe 27). Les facteurs prendre en compte dans le choix des faibles doses sont notamment la pente attendue de la courbe dose-rponse, les doses qui provoquent des changements mtaboliques importants ou qui modifient notablement le mode daction toxique, le niveau auquel on peut prvoir un seuil, ou celui auquel on peut prvoir de fixer un point de dpart pour une extrapolation aux faibles doses. Le principal objectif lors de la ralisation dune tude combine de cancrogense et de toxicit chronique sera la collecte d'informations des fins d'valuation des risques de cancrogense, et les donnes sur la toxicit chronique seront normalement un objectif subsidiaire. Il conviendra de s'en souvenir lors du choix des niveaux de doses et des intervalles entre les doses pour l'tude. 26. Les intervalles entre les doses dpendront des objectifs de l'tude et des caractristiques de la substance dessai, et ne peuvent donc pas tre prescrits de manire dtaille dans la prsente Ligne directrice, mais des intervalles correspondant un facteur 2 ou 4 sont souvent les plus appropris entre les doses dcroissantes, et l'inclusion d'un quatrime groupe dessai est souvent prfrable la fixation de trs grands intervalles (correspondant par exemple un facteur de plus de 6 10) entre les doses. En gnral, les facteurs suprieurs 10 sont vits, et leur utilisation est justifie. 27. Comme le prcise le Document d'orientation No. 116 (7), les facteurs prendre en compte dans le choix des doses sont notamment les suivants : Non-linarits ou points d'inflexion connus ou supposs de la courbe dose-rponse; Toxicocintique et gammes de doses auxquelles l'induction mtabolique, la saturation ou la non-linarit entre les doses internes et externes surviennent ou non; Lsions prcurseurs, marqueurs d'effets ou indicateurs du droulement de processus biologiques cls sous-jacents; 7
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Aspects principaux (ou prsums) du mode d'action, par exemple doses auxquelles une cytotoxicit commence se manifester, les dosages hormonaux sont perturbs, les mcanismes homostatiques sont dpasss, etc.; Rgions de la courbe dose-rponse ncessitant une estimation particulirement prcise, par exemple dans le domaine de la DR prvue ou d'un seuil prsum; Prise en compte des niveaux prvus d'exposition humaine, en particulier lors du choix des doses moyennes et faibles.

28. Le groupe tmoin sera un groupe non trait ou un groupe recevant le vhicule si la substance est administre dans un vhicule. Exception faite de ladministration de la substance dessai, les animaux du groupe tmoin sont traits de la mme manire que ceux des groupes dessai. Si un vhicule est employ, on administrera au groupe tmoin le plus grand volume de vhicule utilis pour les groupes traits. Si la substance dessai est incorpore aux aliments et entrane une diminution sensible de la prise de nourriture lie une moindre apptence de celle-ci, il pourra tre utile dutiliser un groupe tmoin supplmentaire nourri en parallle, qui constituerait un tmoin plus appropri. Prparation des doses et administration de la substance dessai 29. La substance tester est normalement administre par voie orale, soit dans la nourriture ou l'eau de boisson, soit par gavage. Des informations complmentaires sur les voies et mthodes d'administration figurent dans le Document d'orientation No. 116 (7). La voie et le mode d'administration dpendent de la finalit de l'tude, des proprits physico-chimiques de la substance dessai, de sa biodisponibilit ainsi que de la voie et du mode prdominants d'exposition humaine. Il convient de justifier le choix de la voie et du mode d'administration. Dans lintrt des animaux, le gavage oral nest normalement choisi que pour les substances pour lesquelles cette voie et ce mode d'administration correspondent une voie d'exposition potentielle raisonnable chez l'homme (produits pharmaceutiques, par exemple). Dans le cas des produits chimiques alimentaires ou environnementaux, notamment les pesticides, l'administration se fait dordinaire via le rgime alimentaire ou l'eau de boisson. Toutefois, dans certains contextes, tels que lexposition professionnelle, l'administration par d'autres voies peut tre plus approprie. 30. Si ncessaire, la substance dessai est dissoute ou mise en suspension dans un vhicule appropri. Il convient de prendre en compte les caractristiques suivantes du vhicule et des autres additifs, sil y a lieu : effets sur l'absorption, la rpartition, le mtabolisme ou la rtention de la substance dessai ; effets sur les proprits chimiques de la substance dessai susceptibles de modifier sa toxicit; et effets sur la prise d'aliments ou d'eau, ou sur ltat nutritionnel des animaux. Il est recommand, chaque fois que les circonstances le permettent, denvisager en premier lieu lutilisation dune solution ou dune suspension aqueuse, puis celle dune solution ou dune mulsion dans une huile (par exemple huile de mas), et en dernier lieu celle dune solution dans d'autres vhicules. Les caractristiques de toxicit des vhicules autres que l'eau sont connues. Il convient de disposer de donnes sur la stabilit de la substance dessai et sur l'homognit des solutions ou rations contenant les diffrentes doses (selon les cas) dans les conditions d'administration (nourriture, par exemple). 31. Il importe de veiller ce que les quantits de substances administres dans les aliments ou l'eau de boisson n'interfrent pas avec la nutrition ou avec l'quilibre hydrique. Dans les tudes de toxicit long terme faisant intervenir une administration par voie alimentaire, la concentration du produit chimique dans les aliments ne dpasse normalement pas 5 % de la ration totale, afin dviter les dsquilibres nutritionnels. Si la substance dessai est incorpore la nourriture, on peut utiliser soit une concentration alimentaire constante (mg/kg d'aliment ou ppm) soit un niveau de dose constant
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par rapport au poids corporel de l'animal (mg/kg de poids corporel), calcul sur une base hebdomadaire. La solution choisie est spcifie. 32. En cas d'administration par voie orale, les animaux reoivent une dose quotidienne de la substance dessai ( raison de 7 jours par semaine) et ce pendant une priode de 12 mois (phase chronique) ou de 24 mois (phase de cancrogense) pour les rongeurs (voir aussi les paragraphes 33 et 34). Tout autre rgime de dosage, par exemple une administration 5 jours par semaine, donne lieu une justification. En cas d'administration par voie cutane, les animaux reoivent normalement le traitement pendant au moins 6 heures par jour, 7 jours par semaine, comme le spcifie la LD 410 (11), et ce pendant une priode de 12 mois (phase chronique) ou de 24 mois (phase de cancrogense). L'exposition par inhalation est ralise pendant 6 heures par jour, 7 jours par semaine, mais il est possible, si cela se justifie, de limiter lexposition 5 jours par semaine. La priode d'exposition est normalement de 12 mois (phase chronique) ou de 24 mois (phase de cancrogense). Si des espces de rongeurs autres que le rat sont exposes nez seul , il est possible dajuster la dure maximale dexposition en fonction du stress propre ces espces. Le choix d'une dure d'exposition infrieure 6 heures par jour fait lobjet dune justification. Voir aussi ce sujet la LD 412 (9). 33. Lorsque la substance dessai est administre aux animaux par gavage, l'opration est pratique aux mmes moments de la journe au moyen d'une sonde gastrique ou d'une canule d'intubation approprie. Normalement, une dose unique sera administre une fois par jour mais lorsque, par exemple, le compos chimique est un irritant local, il pourra tre envisag de maintenir la dose journalire en la fractionnant (deux fois par jour). Le volume maximal de liquide pouvant tre administr en une fois dpend de la taille de l'animal dexprience. Le volume est maintenu aussi faible que possible et nexcde normalement pas 1 ml/100 g de poids corporel pour les rongeurs (31). Il convient de minimiser la variabilit du volume test en ajustant la concentration pour obtenir un volume constant tous les niveaux de doses. Les substances potentiellement corrosives ou irritantes sont l'exception et leur dilution permettra d'viter tout effet local svre. Lessai nest pas men des concentrations susceptibles d'tre corrosives ou irritantes pour le tube digestif. Dure de l'tude 34. Si la priode d'administration et la dure de la phase chronique de cette tude sont normalement de 12 mois, le plan de l'tude permet une application des essais de dure plus courte (6 9 mois par exemple) ou plus longue (18 24 mois), pour rpondre aux exigences de rgimes rglementaires particuliers ou obtenir des donnes mcanistiques spcifiques. Les dviations par rapport une dure dexposition de 12 mois font lobjet de justifications, surtout dans le cas de dures plus courtes. Le traitement de tous les groupes de doses affects cette phase est interrompu au moment prvu pour l'valuation de la toxicit chronique et de lsions pathologiques non noplasiques. Les groupes satellites inclus pour contrler la rversibilit des ventuelles altrations toxicologiques induites par la substance chimique teste sont maintenus sans traitement, pendant une priode d'au moins 4 semaines et d'au plus un tiers de la dure totale de l'tude, aprs la cessation de l'exposition. 35. La dure de la phase de cancrogense de cette tude sera normalement de 24 mois pour les rongeurs, ce qui correspond la majeure partie de la dure de vie normale des animaux utiliss. Elle peut tre allonge ou raccourcie selon la dure de vie de la souche de l'espce animale utilise, mais ce changement de dure fait lobjet dune justification. Pour certaines souches particulires de souris, par exemple AKR/J, C3H/J ou C57BL/6J, une dure de 18 mois peut tre plus approprie. On trouvera ciaprs des informations sur la dure, la clture de l'tude et la survie; d'autres considrations, relatives notamment l'acceptabilit d'une tude de cancrogense estime ngative du fait de la survie des animaux, figurent dans le Document d'orientation No. 116 (7): 9
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La clture de l'tude est envisage lorsque le nombre de survivants des groupes soumis aux plus faibles doses ou du groupe tmoin tombe en dessous de 25 pour cent; La clture de l'tude nest pas dclenche par la mort prmature des animaux du seul groupe ayant reu la dose la plus leve; La survie des animaux est prise en considration sparment pour chaque sexe; L'tude nest pas prolonge au-del du point o les donnes pouvant tre tires de l'tude ne sont plus suffisantes pour permettre une valuation statistiquement valable.

OBSERVATIONS (PHASE DE TOXICIT CHRONIQUE) 36. Tous les animaux sont soumis un examen quotidien, gnralement en dbut et en fin de journe, fins de semaine et jours fris compris, pour dterminer la morbidit et la mortalit. Des observations cliniques gnrales sont effectues au moins une fois par jour, de prfrence au(x) mme(s) moment(s) de la journe, en tenant compte du moment o l'on prvoit que les effets des diffrentes doses atteindront leur intensit maximale aprs administration par gavage. 37. Tous les animaux font lobjet dobservations cliniques dtailles au moins une fois avant la premire exposition (pour permettre des comparaisons intra-individuelles), la fin de la premire semaine de ltude, et une fois par mois ensuite. Les observations respectent un protocole qui rduit au minimum les variations entre observateurs et les rend indpendantes du groupe test. Ces observations sont effectues hors de la cage o sont logs les animaux, de prfrence dans une enceinte normalise et heures fixes. Elles sont soigneusement consignes, de prfrence en utilisant un systme de cotation explicitement dfini par le laboratoire qui ralise l'essai. Les conditions d'observation demeurent aussi constantes que possible. Les observations portent notamment sur les symptmes suivants (sans que cette liste soit exhaustive) : modifications de ltat de la peau, de la fourrure, des yeux et des muqueuses, apparition de scrtions et dexcrtions, et ractions neurovgtatives (par exemple, scrtion de larmes, horripilation, variation du diamtre pupillaire, respiration anormale). Il convient galement de consigner les changements dans la dmarche, la posture et les ractions la manipulation, ainsi que la prsence de mouvements cloniques ou toniques et les comportements strotyps (par exemple, toilettage excessif, parcours circulaires rptitifs) ou bizarres (par exemple, automutilation, marche reculons) (32). 38. Avant la premire administration de la substance dessai, tous les animaux font lobjet dun examen ophtalmologique effectu laide dun ophtalmoscope ou de autre appareil appropri. lissue de l'tude, cet examen est ralis de prfrence sur tous les animaux, mais au moins sur ceux du groupe trait la dose la plus leve et du groupe tmoin. Si des altrations oculaires lies au traitement sont dtectes, tous les animaux sont examins. Si lanalyse structurale ou d'autres observations suggrent une toxicit oculaire, il faut augmenter la frquence des examens oculaires. 39. Dans le cas de substances ayant prsent un potentiel d'induction d'effets neurotoxiques lors d'essais antrieurs de toxicit doses rptes sur 28 et/ou 90 jours, une vrification de la ractivit sensorielle diffrents types de stimuli (32) (stimuli auditifs, visuels ou proprioceptifs, par exemple) (33) (34) (35) et une valuation de la force de prhension (36) ainsi que de l'activit motrice (37) pourront tre menes en option. Elles seront ralises avant le dbut de l'tude et tous les 3 mois par la suite, jusqu' 12 mois inclusivement, ainsi qu' la fin de l'tude (si celle-ci dure plus de 12 mois). On trouvera dans les rfrences bibliographiques susmentionnes une description plus dtaille des modes
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opratoires. Toutefois, dautres modes opratoires que ceux figurant dans ces rfrences sont galement utilisables. 40. Dans le cas de substances ayant prsent un potentiel d'induction d'effets immunotoxiques lors d'essais antrieurs de toxicit doses rptes sur 28 et/ou 90 jours, d'autres examens sur cet effet peuvent tre mens en option la fin de l'tude. Poids corporel, prise daliments et d'eau, et efficacit alimentaire 41. Tous les animaux sont pess au dbut du traitement, au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. La prise daliments et lefficacit alimentaire sont aussi mesures au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Lorsque la substance est administre dans leau de boisson, la prise d'eau est aussi mesure au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Il peut galement tre utile de mesurer la prise deau dans les tudes o celleci est modifie. Hmatologie et biochimie clinique 42. Dans les tudes faisant intervenir des rongeurs, des examens hmatologiques sont effectus sur tous les animaux dexprience (10 mles et 10 femelles par groupe) 3, 6 et 12 mois, ainsi qu' la fin de l'tude (si celle-ci dure plus de 12 mois). Si des souris sont utilises, il peut tre ncessaire de constituer des groupes satellites afin de pouvoir effectuer tous les examens hmatologiques requis (voir paragraphe 19). Dans les tudes faisant intervenir des non-rongeurs, les chantillons seront prlevs sur un plus petit nombre d'animaux (par exemple 4 animaux de chaque sexe par groupe dans les tudes chez le chien), des stades intermdiaires et la fin de l'tude, de la mme manire que chez les rongeurs. Il ne sera pas ncessaire deffectuer des examens 3 mois, chez les rongeurs comme chez les autres animaux, si aucun effet sur les paramtres hmatologiques n'a t observ lors d'une tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables. Les chantillons de sang sont prlevs en un point dtermin, par exemple par ponction cardiaque ou au niveau du sinus rtro-orbitaire, sous anesthsie. 43. Les investigations portent sur les paramtres suivants (38): numration leucocytaire totale et diffrentielle, numration rythrocytaire et plaquettaire, concentration dhmoglobine, hmatocrite (volume cellulaire sanguin aprs centrifugation), volume corpusculaire moyen (VCM), hmoglobine corpusculaire moyenne (HCM), concentration dhmoglobine corpusculaire moyenne (CHCM), temps de prothrombine et temps de thromboplastine partielle active. D'autres paramtres hmatologiques tels que les corps de Heinz et autres anomalies morphologiques rythrocytaires ou la mthmoglobine peuvent tre tudis si ncessaire en fonction de la toxicit de la substance. Dans lensemble, il convient d'adapter l'approche suivie l'effet observ et/ou attendu d'une substance donne. Si la substance exerce un effet sur le systme hmatopotique, des numrations rticulocytaires et une cytologie mdullaire peuvent tre galement indiques mais nont pas tre pratiques de manire systmatique. 44. Des analyses de biochimie clinique, visant tudier les principaux effets toxiques sur les tissus, et en particulier sur le rein et le foie, sont effectues partir dchantillons de sang prlevs sur tous les animaux tudis (10 mles et 10 femelles par groupe) des intervalles de temps semblables ceux spcifis pour les examens hmatologiques. Si des souris sont utilises, il peut tre ncessaire de constituer des groupes satellites afin de pouvoir effectuer toutes les analyses de biochimie clinique ncessaires. Dans les tudes faisant intervenir des non-rongeurs, les chantillons seront prlevs sur un plus petit nombre d'animaux (par exemple 4 animaux de chaque sexe par groupe dans les tudes chez 11
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le chien), des stades intermdiaires et la fin de ltude, de la mme manire que chez les rongeurs. Des examens 3 mois, chez les rongeurs comme chez les autres animaux, sont superflus si aucun effet sur les paramtres de biochimie clinique n'a t observ lors d'une tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables. Il est recommand de faire jener les animaux ( l'exception des souris) pendant la nuit qui prcde la prise de sang1. Les investigations portent sur les paramtres suivants (38): glucose, ure (azote urique), cratinine, protines totales, albumine, calcium, sodium, potassium, cholestrol total, au moins deux enzymes rvlatrices des effets hpatocellulaires (alanine aminotransfrase, aspartate aminotransfrase, glutamate dshydrognase, acides biliaires totaux) (39) et au moins deux enzymes rvlatrices des effets hpatobiliaires (phosphatase alcaline, gammaglutamyl transfrase, 5'-nuclotidase, bilirubine totale, acides biliaires totaux) (39). D'autres paramtres de chimie clinique, tels que les triglycrides jeun, des hormones spcifiques et la cholinestrase peuvent tre mesurs si ncessaire en fonction de la toxicit de la substance. Dans lensemble, il convient d'adapter l'approche suivie l'effet observ et/ou attendu d'une substance donne. 45. Des analyses d'urine sont effectues partir dchantillons prlevs sur tous les animaux tudis (10 mles et 10 femelles par groupe) des intervalles de temps semblables ceux spcifis pour les examens hmatologiques et de chimie clinique. Il ne sera pas ncessaire deffectuer des dosages 3 mois si les analyses d'urine pratiques dans le cadre d'une tude antrieure mene sur 90 jours des niveaux de doses comparables nont rvl aucun effet. La liste suivante de paramtres tudier fait partie d'une recommandation d'experts relative aux tudes de pathologie clinique (38) : aspect, volume, osmolalit ou poids spcifique, pH, protines totales et glucose. D'autres mesures, notamment la recherche de corps ctoniques, d'urobilinogne, de bilirubine et de sang occulte, peuvent aussi tre ralises. L'tude d'autres paramtres peut aussi s'avrer ncessaire pour largir les recherches sur l'effet ou les effets observs. 46. On considre gnralement que dans les tudes portant sur des chiens, il est ncessaire de dterminer les variables hmatologiques et de biochimie clinique de base avant le dbut du traitement, mais que ce nest pas indispensable dans les tudes portant sur des rongeurs (38). Toutefois, si lon ne dispose pas de donnes historiques de base appropries (voir paragraphe 58), il convient denvisager d'en obtenir. Pathologie Autopsie macroscopique 47. Tous les animaux de ltude font normalement l'objet d'une autopsie macroscopique complte et dtaille, comprenant un examen attentif de la surface externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavits crnienne, thoracique et abdominale et de leurs contenus. Toutefois, des dispositions peuvent aussi tre prises (dans les groupes d'animaux sacrifis en cours d'tude ou les groupes satellites) pour limiter ces observations des mesures essentielles spcifiques telles que la neurotoxicit ou l'immunotoxicit (voir paragraphe 21). Il nest pas ncessaire que ces animaux fassent Pour un certain nombre de dosages effectus sur le srum ou le plasma, et plus particulirement pour le dosage du glucose, il est prfrable de faire jener les animaux durant la nuit qui prcde la prise de sang. En labsence de jene, la variabilit des rsultats est en effet plus grande, et risque de masquer des effets plus subtils ainsi que de rendre l'interprtation plus difficile. En revanche, le jene peut modifier le mtabolisme gnral des animaux et, en particulier dans les tudes d'alimentation, perturber l'exposition quotidienne la substance dessai. Tous les animaux sont valus dans le mme tat physiologique et il sera donc prfrable de programmer les valuations dtailles ou neurologiques pour un autre jour que celui des prlvements de biochimie clinique.
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lobjet dune autopsie, ni des procdures ultrieures dcrites dans les paragraphes qui suivent. Lautopsie des animaux sentinelles pourra devoir tre effectue au cas-par-cas, la discrtion du directeur de l'tude. 48. Il convient de dterminer le poids des organes de tous les animaux hormis ceux mentionns dans la dernire partie du paragraphe 47. Les glandes surrnales, le cerveau, les pididymes, le cur, les reins, le foie, les ovaires, la rate, les testicules, la thyrode (pese aprs fixation, avec les glandes parathyrodes) et l'utrus de tous les animaux (except ceux trouvs moribonds et/ou ayant t sacrifis en cours d'tude) sont dbarrasss, le cas chant, de tout tissu adhrent et pess ltat frais ds que possible aprs la dissection, pour prvenir la dessiccation. 49. Les tissus suivants sont conservs dans le milieu de fixation le plus appropri, la fois pour le type de tissu et pour lexamen histopathologique prvu (40) (lexamen des tissus indiqus entre crochets est facultatif):
toutes les macroscopiques aorte [bulbe olfactif] lsions ganglions lymphatiques (superficiels et profonds) glande coagulante glande de Harder muscle squelettique nerf priphrique [voies respiratoires suprieures dont nez, cornets et sinus paranasaux] il (dont rtine) sophage rein [sternum] testicule

ccum cerveau (segments d'encphale, de cervelet et de bulbe rachidien/pont) cur col utrin clon [dents] duodnum pididyme estomac (pr-estomac, estomac glandulaire) [fmur avec articulation]

glande lacrymale (exorbitale) glande mammaire (obligatoire pour les femelles et, si visible la dissection, aussi pour les mles) glande salivaire glande surrnale hypophyse ilon jjunum [langue] moelle pinire (niveaux cervical, msothoracique et lombaire) segment de moelle osseuse et/ou moelle osseuse frachement ponctionne

thymus thyrode

ovaire pancras parathyrode Peau poumon prostate rate

trache [uretre] [urtre] utrus (col inclus) vagin vsicule biliaire (pour les espces autres que le rat) vsicule sminale

rectum

vessie urinaire

foie

Dans le cas des organes allant par paires, par exemple les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont prservs. Les observations, notamment cliniques, peuvent amener examiner d'autres tissus. Tous les organes considrs comme des organes cibles potentiels du fait des proprits connues de la substance dessai sont aussi conservs. Dans les tudes portant sur une 13
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administration par la voie cutane, il y a lieu dexaminer les organes figurant sur la liste tablie pour la voie orale et de procder un prlvement et une conservation spcifiques de la peau provenant du site d'application. Dans les tudes par inhalation, la liste des tissus des voies respiratoires conservs et examins est conforme aux recommandations des LD 412 (8) et 413 (9). Pour les autres organes et tissus (outre les tissus des voies respiratoires spcifiquement conservs), il convient d'examiner les organes de la liste tablie pour la voie orale. Histopathologie 50. Des informations sont disponibles sur les meilleures pratiques en matire de conduite des tudes de pathologie toxicologique (40). Au minimum, les examens devront porter sur les tissus suivants : Tous les tissus prlevs dans le groupe dose leve et le groupe tmoin; Tous les tissus prlevs sur les animaux morts ou sacrifis au cours de l'tude; Tous les tissus prsentant des anomalies macroscopiques; Tissus des organes cibles, ou tissus prsentant des altrations dues au traitement dans le groupe dose leve, prlevs sur tous les animaux de tous les autres groupes de doses; Dans le cas des organes allant par paires, comme les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont examins.

OBSERVATIONS (PHASE DE CANCROGENSE) 51. Un examen de la morbidit ou de la mortalit est effectu quotidiennement chez tous les animaux, gnralement en dbut et en fin de journe, fins de semaine et jours fris compris. Une recherche de signes spcifiques significatifs sur le plan toxicologique est aussi effectue une fois par jour. Dans le cas d'une tude par gavage, les animaux sont examins immdiatement aprs l'administration de la dose. Une attention particulire devra tre accorde au dveloppement de tumeurs, et le moment dapparition, la localisation, les dimensions, laspect et la progression de chaque tumeur nettement visible ou palpable sont consigns. 52. Tous les animaux sont pess au dbut du traitement, au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. La prise daliments et lefficacit alimentaire sont aussi mesures au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Lorsque la substance est administre dans leau de boisson, la prise d'eau est aussi mesure au moins une fois par semaine pendant les 13 premires semaines, puis au moins une fois par mois. Il peut galement tre utile de mesurer la prise deau dans les tudes o celleci est modifie. Hmatologie, biochimie clinique et autres mesures 53. Afin d'obtenir le plus possible d'informations de l'tude, surtout en ce qui concerne le mode d'action de la substance, il peut tre utile deffectuer des prlvements sanguins afin de procder des analyses hmatologiques et de biochimie clinique, mais la dcision concernant ces prlvements appartient au directeur de l'tude. Des analyses d'urine peuvent tre aussi appropries. Les donnes obtenues sur les animaux tudis dans la phase de toxicit chronique, normalement d'une dure de 12 mois (voir paragraphe 34), renseignent sur ces paramtres. On trouvera des informations complmentaires sur l'intrt de tels prlvements pour une tude de cancrogense dans le Document d'orientation No. 116 (7). Les ventuels prlvements sanguins sont recueillir la fin de l'tude, juste avant ou pendant le sacrifice des animaux. Ils sont effectus en un point dtermin, par exemple par
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ponction cardiaque ou au niveau du sinus rtro-orbital, sous anesthsie. Des talements sanguins peuvent aussi tre prpars en vue d'un examen, notamment si la moelle osseuse semble tre l'organe cible, bien que l'utilit dun tel examen pour l'valuation du potentiel cancrogne/oncogne pendant la phase de cancrogense ait t mise en question (38). PATHOLOGIE Autopsie macroscopique 54. Tous les animaux de ltude l'exception des sentinelles et autres animaux satellites (voir paragraphe 20), font lobjet dune autopsie macroscopique complte et dtaille, comprenant un examen attentif de la surface externe du corps et de tous les orifices ainsi que des cavits crnienne, thoracique et abdominale et de leurs contenus. Lautopsie des sentinelles et autres animaux satellites peut tre effectue au cas-par-cas, la discrtion du directeur de l'tude. La pese des organes ne fait normalement pas partie d'une tude de cancrogense car les changements lis l'ge ou, dans des phases plus avances, au dveloppement de tumeurs rendent superflues les donnes relatives au poids des organes. Ces donnes peuvent toutefois prsenter un grand intrt pour les valuations fondes sur le poids de la preuve, notamment en ce qui concerne le mode d'action. Si ces donnes font partie d'une tude satellite, elles sont collectes dans lanne suivant le dbut de l'tude. 55. Les tissus suivants sont conservs dans le milieu de fixation le plus appropri, la fois pour le type de tissu et pour lexamen histopathologique prvu (40) (lexamen des tissus indiqus entre crochets est facultatif) :
toutes les macroscopiques aorte [bulbe olfactif] lsions ganglions lymphatiques (superficiels et profonds) glande coagulante glande de Harder muscle squelettique nerf priphrique [voies respiratoires suprieures dont nez, cornets et sinus paranasaux] il (dont rtine) sophage rein [sternum] testicule

ccum cerveau (segments d'encphale, de cervelet et de bulbe rachidien/pont) cur col utrin clon [dents] duodnum pididyme estomac (pr-estomac, estomac glandulaire) [fmur avec articulation]

glande lacrymale (exorbitale) glande mammaire (obligatoire pour les femelles et, si visible la dissection, aussi pour les mles) glande salivaire glande surrnale hypophyse ilon jjunum [langue] moelle pinire (niveaux cervical, msothoracique et lombaire) segment de moelle

thymus thyrode

ovaire pancras parathyrode Peau poumon prostate rate

trache [uretre] [urtre] utrus (col inclus) vagin vsicule biliaire (pour les espces autres que le rat) vsicule sminale

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foie

osseuse et/ou moelle osseuse frachement ponctionne

Dans le cas des organes allant par paires, par exemple les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont prservs. Les observations, notamment cliniques, peuvent amener examiner d'autres tissus. Tous les organes considrs comme des organes cibles potentiels du fait des proprits connues de la substance dessai sont aussi conservs. Dans les tudes portant sur une administration par la voie cutane, il y a lieu dexaminer les organes figurant sur la liste tablie pour la voie orale et de procder un prlvement et une conservation spcifiques de la peau provenant du site d'application. Dans les tudes par inhalation, la liste des tissus des voies respiratoires conservs et examins est conforme aux recommandations des LD 412 (8) et 413 (9). Pour les autres organes et tissus (outre les tissus des voies respiratoires spcifiquement conservs), il convient d'examiner les organes de la liste tablie pour la voie orale. Histopathologie 56. Des informations sont disponibles sur les meilleures pratiques en matire de conduite des tudes de pathologie toxicologique (40). Au minimum, les examens histopathologiques devront porter sur les tissus suivants : Tous les tissus prlevs dans le groupe dose leve et le groupe tmoin; Tous les tissus prlevs sur les animaux morts ou sacrifis au cours de l'tude; Tous les tissus prsentant des anomalies macroscopiques, notamment des tumeurs; Lorsque des altrations histopathologiques dues au traitement sont observes dans le groupe dose leve, ces mmes tissus sont examins chez tous les animaux de tous les autres groupes de doses; Dans le cas des organes allant par paires, comme les reins ou les glandes surrnales, les deux organes sont examins.

RSULTATS ET RAPPORT (CANCROGENSE ET TOXICIT CHRONIQUE) Rsultats 57. Des donnes sont recueillies pour chaque animal sur tous les paramtres valus. En outre, toutes les donnes sont rsumes sous forme de tableaux synoptiques indiquant, pour chaque groupe exprimental, le nombre d'animaux au dbut de l'essai, le nombre d'animaux trouvs morts au cours de l'essai ou euthanasis, le moment de la mort ou du sacrifice, le nombre d'animaux prsentant des signes de toxicit, la description des signes de toxicit observs, ainsi que le moment de lapparition, la dure et la gravit de tous les effets toxiques observs, le nombre d'animaux prsentant des lsions, les types de lsions et le pourcentage d'animaux prsentant chaque type de lsion. Les tableaux rcapitulatifs prsentent les moyennes et les carts-types (pour les donnes recueillies en continu) pour les animaux prsentant des effets toxiques ou des lsions, ainsi qu'une cotation des lsions. 58. Les donnes de contrle historiques peuvent faciliter linterprtation des rsultats de ltude, par exemple lorsque les donnes provenant des tmoins concurrents semblent diverger de manire significative de donnes rcentes obtenues sur des animaux tmoins issus de la mme installation dessai/colonie dlevage. Si elles sont values, les donnes de contrle historiques manent du
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mme laboratoire, portent sur des animaux du mme ge et de la mme souche, produits dans les cinq ans prcdant l'tude en question. 59. Si possible, les rsultats numriques sont valus l'aide d'une mthode statistique approprie et largement reconnue. Les mthodes statistiques et les donnes analyser sont choisies au moment de la conception de l'tude (paragraphe 9). Ce choix permet doprer des ajustements en fonction de la survie, si ncessaire. 60. Le rapport d'essai mentionne les informations suivantes:

Substance dessai: tat physique, puret et proprits physico-chimiques; donnes d'identification; provenance de la substance; numro de lot; certificat d'analyse chimique;

Vhicule(le cas chant): justification du choix du vhicule (s'il est autre que l'eau); Animaux dexprience: espce/souche utilise et justification du choix fait; nombre, ge et sexe des animaux au dbut de l'essai; provenance, conditions d'encagement, rgime alimentaire, etc.; poids de chaque animal au dbut de l'essai;

Conditions exprimentales: justification de la voie d'administration et du choix des doses; le cas chant, mthodes statistiques utilises pour analyser les donnes; dtails concernant la formulation de la substance dessai ou son incorporation dans les aliments; donnes analytiques sur la concentration obtenue, la stabilit et l'homognit de la prparation; voie d'administration et dtails concernant l'administration de la substance dessai; pour les tudes par inhalation, mention de la voie d'entre (nez seul ou corps entier); doses relles (mg/kg de poids corporel/jour) et, le cas chant, facteur de conversion en dose relle de la concentration de la substance dessai (en mg/kg ou en ppm) dans les aliments ou l'eau de boisson; dtails concernant la qualit de lalimentation et de leau de boisson; Rsultats (les rsultats comprendront des donnes gnrales sous forme de tableaux synoptiques et des donnes propres chaque animal) Rsultats gnraux 17
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Donnes sur la survie; Poids corporel/variations du poids corporel; Prise d'aliments, calculs de l'efficacit alimentaire, si effectus, et prise d'eau, le cas chant; Donnes toxicocintiques (si disponibles); Opthalmoscopie (si disponible); Hmatologie (si disponible); Chimie clinique (si disponible); Rsultats cliniques Signes de toxicit; Incidence (et, si elle est value, svrit) de toute anomalie observe; Nature, svrit et dure des observations cliniques (transitoires ou permanentes);

Donnes relatives aux autopsies Histopathologie Observations deffets histopathologiques non noplasiques; Observations deffets histopathologiques noplasiques; Corrlation entre les observations macroscopiques et microscopiques; Description dtaille de tous les rsultats histopathologiques lis au traitement et chelle d'valuation de la svrit; Rapport sur lanalyse ventuelle des lames par des pairs; Poids corporel lissue de lessai; Poids des organes et leur rapport au poids corporel, le cas chant; Rsultats dautopsie; incidence et svrit des anomalies;

Traitement statistique des rsultats, le cas chant; Discussion des rsultats, notamment: Examen de toutes les approches de modlisation; Relations dose-rponse; Donnes de contrle historiques; Examen de toutes les informations concernant le mode d'action; Dtermination des DR, DSENO et DMENO (dose minimale avec effet nocif observ); Applicabilit des rsultats l'tre humain;

Conclusions

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RFRENCES 1. 2. OCDE (1995), Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing, (Rome, 1995), document de travail interne, Direction de lenvironnement, OCDE, Paris. EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment Forum U.S. Environmental Protection Agency Washington, DC

3. Combes RD, Gaunt, I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32, 163-208. 4. arlow SM, Greig JB, Bridges JW et al (2002). Hazard identification by methods of animalbased toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145-191. 5. Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characterization of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206, 437-445. 6. OCDE (1998), Toxicit orale doses rptes - non-rongeurs : 90 jours, Ligne directrices No. 409, Lignes directrices de lOCDE pour les essais de produits chimiques, OCDE, Paris. 7. OCDE (2009), Draft Guidance Document on the design and conduct of chronic toxicity and carcinogenicity studies, Series on Testing and Assessment No. 116, disponible sur: www.oecd.org/env/testguidelines. 8. OCDE (2009) Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Series on Testing and Assessment No. 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OCDE, Paris. 9. OCDE (2009), Toxicit doses rptes par inhalation: tude sur 28 jours, Ligne Directrice No. 412, Lignes directrices de lOCDE pour les essais de produits chimiques, OCDE, Paris. 10. OCDE (2009), Toxicit subchronique par inhalation : tude sur 90 jour, Ligne Directrice No. 413, Lignes directrices de lOCDE pour les essais de produits chimiques, OCDE, Paris. 11. OCDE (1981), Toxicit cutane doses rptes - tude 21/28 jours, Ligne Directrice No. 410, Lignes directrices de lOCDE pour les essais de produits chimiques, OCDE, Paris. 12. Boobis, A.R., Cohen, S.M., Dellarco, V., McGregor, D., Meek, M.E., Vickers, C., Willcocks, D. & Farland, W. IPCS Framework for analyzing the Relevance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. in Toxicol, (2006) 36:793-801. 13. Cohen, S.M., Meek, M.E., Klaunig, J.E., Patton, D.E., and Fenner-Crisp, P.A. (2003) The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33:581-589 14. Holsapple, M.P., Pitot, H.C., Cohen, S.N., Boobis, A.R., Klaunig, J.E., Pastoor, T., Dellarco, V.L. & Dragan, Y.P. (2006) Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89:51-56. 15. Meek, E.M., Bucher, J.R., Cohen, S.M., Dellarco, V., Hill, R.N., Lehman-McKemmon, L.D., Longfellow, D.G., Pastoor, T., Seed, J. & Patton, D.E. (2003) A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33:591-653. 16. Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR et al (2006). Agricultural Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Crit. Rev. Toxicol. 36, 1-7. 17. Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T et al (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Crit. Rev. Toxicol. 36, 9-35. 19
OCDE, (2009)

http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?deid=116283&CFID=1267360&CFTOKEN=65052793&jsessioni d=9830b2c4116e3d8fbbf017414e1a782e7f79TR

453

OECD/OCDE

18. Doe JE, Boobis AR, Blacker A et al (2006). A Tiered Approach to Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36, 37-68. 19. Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM et al (2006). A Tiered Approach to Life Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Crit. Rev. Toxicol. 36, 69-98. 20. OCDE (2002), Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies, Srie sur les essais et valuations n 35 et Srie sur les pesticides n 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OCDE, Paris. 21. OCDE (2000), Guidance Document No. 19 on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, Srie sur les essais et valuations No.19, ENV/JM/MONO(2000)7, OCDE, Paris. 22. Rhomberg, LR, Baetcke, K, Blancato, J, Bus, J, Cohen, S, Conolly, R, Dixit R, Doe, J, Ekelman, K, Fenner-Crisp, P, Harvey, P, Hattis, D, Jacobs, A, Jacobson-Kram, D, Lewandowski, T, Liteplo, R, Pelkonen, O, Rice, J, Somers, D, Turturro, A, West, W, Olin, S. Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: Approaches to Dose Selection. Crit Rev. Toxicol. 37 (9) 729 - 837 (2007). 23. ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (Ed.). ILSI Press, Washington, DC. 24. Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN and Lumley CE (1994) The utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of pharmaceuticals. The Toxicologist 14(1):214. 25. Usui T, Griffiths SA et Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. In D'Arcy POF & Harron DWG (d.). Proceedings of the Third International Conference on Harmonisation. Queen's University Press, Belfast. pp 279-284. 26. Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter, F (1997). The Significance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect 105:11961203 27. Directive 86/609/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions lgislatives, rglementaires et administratives des Etats membres relatives la protection des animaux utiliss des fins exprimentales ou dautres fins scientifiques. Journal officiel, 29, L358, 18 dcembre 1986. 28. National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory animals. NIH Publication No. 86-23. Washington D.C., US. Dept. of Health and Human Services. 29. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft fr Versuchstierkunde, December, 1989). Publication on the Planning and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-06-9. 30. GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft fr Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in various housing systems. http://www.gv-solas.de/auss/hyg/hyg-p7_e.html 31. Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology, 21:15-23. Available at: http://www.ff.up.pt/farmacologia/pdf/good_practice_lab_animals.pdf 32. IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document No. 60. 33. Tupper, D.E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003. 34. Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol.Environ. Health, 9, 691-704.
OCDE, (2009)

20

OECD/OCDE

453

35. Moser, V.C., McDaniel, K.M., Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol., 108, 267-283. 36. Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T. (1979). A Method for the RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236. 37. Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609. 38. Weingand K, Brown G, Hall R et al. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol., 29: 198-201. 39. EMEA (draft) document Non-clinical guideline on drug-induced hepatotoxicity (Doc. Ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006) 40. Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK et al. (2004). Best Practices Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32, 126-131.

21

OCDE, (2009)