CAPTULO I.1.10.

MTODOS DE LABORATORIO PARA ENSAYOS DE SENSIBILIDAD DE BACTERIAS FRENTE A ANTIMICROBIANOS

INTRODUCCION
La amplia propagacin de bacterias patgenas con resistencia mltiple a los antibiticos ha sido reconocida como un importante problema global para la sanidad animal y humana por la OIE y la Organizacin Mundial de la Salud. La aparicin de resistencias a antimicrobianos en diversas bacterias patgenas ha convertido a las pruebas de sensibilidad frente a estas sustancias en algo esencial cuando se emplean antimicrobianos con fines terapeticos. La resistencia de un patgeno frente a un antimicrobiano determinado permite predecir que el tratamiento no resultar eficaz, mientras que la sensibilidad del patgeno al mismo constituye una excelente base para elegir el tratamiento antibacteriano adecuado. Por tanto, el ensayo de sensibilidad frente a antimicrobianos es un importante componente de cualquier programa eficaz de tratamiento. Adems, en el caso de bacterias patgenas aisladas, las pruebas de sensibilidad inciden en las directrices generales que deben seguirse a nivel mundial para un uso prudente de los antimicrobianos en la produccin animal, y los veterinarios deberan tener en cuenta estos datos (1). Las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos son tambin la base del control epidemiolgico de las bacterias patgenas para el hombre y los animales. Tal control suministra un punto de partida para elegir adecuadamente un tratamiento emprico (primera lnea de terapia) y para detectar la aparicin y/o la diseminacin de cepas bacterianas resistentes as como los determinantes de la resistencia en diferentes especies de bacterias. La estandarizacin y homologacin de las diversas metodologas de ensayo de sensibilidad frente a antimicrobianos, utilizadas en el control epidemiolgico de la resistencia a compuestos antimicrobianos, constituyen un factor clave si se pretende comparar datos entre los diferentes programas nacionales e internacionales de seguimiento de los paises miembros de la OIE. Resulta esencial que los mtodos de ensayo de sensibilidad a antimicrobianos generen resultados reproducibles en laboratorios de uso diario y que los datos puedan ser comparables con los resultados obtenidos por un mtodo patrn de referencia conocido como la norma de oro. En ausencia de mtodos estandarizados o de procedimientos de referencia, los resultados de sensibilidad obtenidos en laboratorios diferentes no pueden compararse con fiabilidad.

Este Captulo contiene directrices metodolgicas para las pruebas de sensibilidad frente a antimicrobianos e incluye procedimientos para estandarizar y normalizar la interpretacin de los resultados de dichas pruebas.

1.

Requerimientos de las pruebas

Para lograr la estandarizacin de los mtodos de determinacin de la sensibilidad a antimicrobianos y la comparacin de sus resultados, hay que tener en cuenta los siguientes principios: i) ii) iii) Son cuestiones esenciales el uso de mtodos estandarizados y la homologacin de los datos sobre sensibilidad (incluyendo los criterios de interpretacin). Tanto los mtodos estandarizados como unos criterios similares de interpretacin deberan ser aceptados y usados por todos los laboratorios implicados. Todos los mtodos de determinacin de sensibilidad a antimicrobianos deberan dar lugar a resultados reproducibles.

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iv) v) vi) vii) Todos los datos han de poder describirse en trminos cuantitativos Resulta esencial establecer una red de laboratorios designados a nivel nacional o regional para coordinar las metodologas, interpretaciones y controles de calidad de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos. Los laboratorios de Microbiologa deberan llevar a cabo su trabajo dentro de un sistema interno de aseguramiento de la calidad. Los laboratorios deberan estar acreditados, siempre que sea posible, y participar en programas externos de mejora.

viii) La existencia de cepas bacterianas especficas para referencia y control de calidad resulta necesaria a fin de determinar el nivel de control de calidad, la seguridad y la mejora de las pruebas dentro de un mismo laboratorio, y entre varios laboratorios.

2.

Metodologa de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

Deben tenerse en cuenta las siguientes exigencias: i) ii) Las bacterias sometidas a ensayo deben aislarse en cultivo puro a partir de las muestras enviadas. El procedimiento para el aislamiento de cada bacteria en particular debe estar estandarizado, de modo que las bacterias analizadas puedan ser identificadas de forma correcta y lgica hasta el nivel de gnero y/o especie. Cuando sea posible, las bacterias aisladas deben ser guardadas para ulteriores anlisis (mediante liofilizacin o conservacin en fro entre -70 y -80C).

iii)

A su vez, se requiere la estandarizacin de los siguientes factores que influencian los ensayos de sensibilidad frente a antimicrobianos: i) ii) iii) iv) v) vi) vii) Una vez que se ha aislado la bacteria en cultivo puro, el inculo debe normalizarse para obtener resultados precisos de sensibilidad. La composicin de los medios slidos y lquidos utilizados (en cuanto a pH, catione timidina o timina, o el uso de medios de cultivo suplementados). El contenido de la sustancia antimicrobiana en la forma utilizada de suministro (en disco, tira o tableta). La composicin de los solventes y diluyentes empleados en la preparacin de las soluciones stock de antimicrobianos. Las condiciones de crecimiento e incubacin (tiempo, temperatura, tipo de atmsfera, por ejemplo presencia de CO2). Concentracin del agar como agente solidificante. Los criterios posteriores de interpretacin.

Por estos motivos, se debe destacar la especial importancia de los procedimientos normalizados y de los mtodos estandarizados, ya que slo puede lograrse una reproducibilidad adecuada mediante el uso de una metodologa modelada.

3.

Seleccin de la metodologa para determinar la sensibilidad al antimicrobiano

La seleccin de una metodologa apropiada para determinar la sensibilidad frente a los antimicrobianos debe estar basada en los siguientes principios: i) ii) iii) iv) v) vi) vii) Facilidad de realizacin Flexibilidad Adaptacin a sistemas automatizados o semiautomatizados Coste Reproducibilidad Fiabilidad Exactitud

viii) Preferencias nacionales e internacionales.

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4.

Mtodos de ensayo

Los tres mtodos que se citan a continuacin son los nicos que suministran resultados significativamente reproducibles: i) ii) iii) Difusin en disco Dilucin en medio lquido Dilucin en medio slido con agar

a)

Mtodo de difusin en disco

La difusin en disco hace referencia a la difusin que experimenta un agente antimicrobiano a una determinada concentracin a partir de discos, tiras o tabletas, que se depositan en un medio de cultivo slido que ha sido sembrado con un inculo bacteriano estandarizado. El mtodo de difusin en disco se basa en la determinacin de una zona de inhibicin del crecimiento que es proporcional a la sensibilidad de la bacteria frente al antimicrobiano presente en el disco. La difusin de un antimicrobiano en un medio de cultivo inoculado crea un gradiente de la sustancia antimicrobiana. Cuando su concentracin llega a ser tan diluida que no logra inhibir el crecimiento de la bacteria ensayada, termina la zona de inhibicin. Tericamente, el borde de esta zona de inhibicin se corresponde con la concentracin mnima inhibitoria (MIC) para esa combinacin concreta de bacteria y antimicrobiano. En otras palabras, la zona de inhibicin se correlaciona de modo inversamente proporcional con el valor de la MIC para la bacteria ensayada. En general, cuanto mayor es la zona de inhibicin, menor es la concentracin de antimicrobiano que se requiere para inhibir el crecimiento de los microorganismos. No obstante, esto depende tambin de la concentracin del antibitico en el disco y de su capacidad de difusin. Hay que advertir que las pruebas de difusin en disco basadas solamente en la presencia o ausencia de una zona de inhibicin, sin considerar su tamao, no son aceptables como ensayos para la sensibilidad a antimicrobianos desde el punto de vista metodolgico. Consideraciones sobre el uso de la tcnica de difusin en disco

La difusin en disco es fcil de realizar, reproducible, y no requiere disponer de una infraestructura cara. Sus principales ventajas son: i) ii) Bajo coste Facilidad para modificar los discos con los antimicrobianos de prueba cuando ello se requiere.

La medicin manual de las zonas de inhibicin puede llevar excesivo tiempo. Sin embargo, existen dispositivos automticos que permiten leer las zonas y que pueden integrarse en sistemas de procesamiento de datos y de informes de laboratorio. Se puede colocar hasta un mximo de 12 discos por cada placa de cultivo de 150 mm de dimetro y un mximo de 5 discos por placa de 100 mm. Independientemente del nmero de discos depositados sobre la superficie del medio solidificado con agar, stos deben de estar distribuidos de forma uniforme de modo que no estn a una distancia menor de 24 mm, desde el centro de un disco al centro de otro.

b)

Mtodos de dilucin en medio lquido y en medio slido

La finalidad de estos mtodos es determinar la concentracin ms baja del antimicrobiano ensayado que es capaz de inhibir el crecimiento de la bacteria analizada (MIC, concentracin mnima inhibitoria, que normalmente se expresa en microgramos/mililitro o miligramos/litro). Sin embargo, la MIC no siempre representa un valor absoluto. La "verdadera" MIC es un punto que se encuentra entre la concentracin ms baja del ensayo que inhibe el crecimiento de la bacteria y la siguiente concentracin ms baja del ensayo. El rango de los antimicrobianos debera: i) Abarcar tanto los criterios de interpretacin (sensibilidad, valor intermedio y resistencia) como los organismos de referencia para el control de calidad. Tener en consideracin las concentraciones de antimicrobiano que se pueden alcanzar in vivo para una combinacin especfica de antibitico y bacteria.

ii)

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Los mtodos para determinar la sensibilidad a antimicrobianos que se basan en diluciones parecen ser mas reproducibles y fciles de cuantificar que los basados en difusin. Sin embargo, los antibiticos se ensayan normalmente mediante diluciones en serie reduciendo la concentracin a la mitad, lo que puede originar datos inexactos en cuanto a la MIC. Cualquier laboratorio que pretenda usar un mtodo de dilucin y utilizar sus propios reactivos y diluciones de antibiticos debera tener la capacidad de obtener, preparar y mantener un stock de soluciones de antimicrobianos de pureza adecuada y generar diluciones de trabajo de modo regular. Por consiguiente, es importante que tales laboratorios usen organismos de control garantizado (ver ms adelante) para asegurar la precisin y estandarizacin en sus procedimientos. Dilucin en caldos de cultivo.

La dilucin en medio lquido es una tcnica en la que se prueba una suspensin normalizada de bacterias frente a varias concentraciones de un agente antimicrobiano (normalmente mediante diluciones seriadas que reducen la concentracin a la mitad) en un medio lquido estandarizado. El mtodo se puede realizar tanto en tubos con un contenido mnimo de 2 ml (macrodilucin) como en volmenes ms pequeos, utilizando placas de microtitulacin (microdilucin). Existen comercialmente en el mercado varios tipos de placas de microtitulacin que contienen antibiticos prediluidos dentro de los pocillos de las placas. El uso de lotes idnticos de estas placas de microtitulacin ayuda a eliminar errores potenciales que pueden surgir durante la preparacin y dilucin de los antimicrobianos. Dicho uso, junto a un protocolo normalizado, incluyendo cepas de referencia con control de calidad, puede facilitar la homologacin si se dispone de suficientes recursos financieros. Debido a que en la actualidad la mayor parte de las pruebas para antimicrobianos mediante microdilucin en medio lquido se preparan comercialmente, estas pruebas pueden considerarse menos flexibles que las basadas en dilucin en medio slido o en difusin en disco en cuanto a su capacidad para admitir cambios necesarios derivados del programa de control y seguimiento. Como la compra de la infraestuctura necesaria y el conjunto de antimicrobianos puede resultar costosa, esta metodologa no se suele elegir en laboratorios con presupuestos limitados. Dilucin en medio slido

La dilucin en medio slido implica la incorporacin de un agente antimicrobiano a concentraciones progresivamente crecientes en un medio solidificado con agar y la aplicacin de un inculo bacteriano definido a la superficie de la placa que contiene el agar. A menudo, los resultados derivados de estos ensayos se consideran como los estndares de oro en la determinacin del valor MIC para una determinada combinacin bacteria/antimicrobiano en una prueba concreta. Las ventajas de los mtodos de dilucin en medio slido son: i) ii) iii) iv) Un mayor control en la pureza de la bacteria ensayada. La capacidad de ensayar simultneamente varias bacterias en una misma placa de medio con agar. La mejora potencial en cuanto a la determinacin de valores MIC por extensin del rango de concentraciones del antimicrobiano. Posibilidad de semi-automatizar el procedimiento mediante la utilizacin de un replicador del inculo. Existen en el mercado unos replicadores de los inculos que pueden transferir entre 32 y 36 inculos bacterianos diferentes a cada una de las placas con medio slido.

Los mtodos de dilucin en medio slido tienen algunos inconvenientes, por ejemplo: i) ii) iii) Son muy laboriosos y requieren importantes recursos econmicos y tcnicos. Una vez que se preparan deben usarse en el trmino de una semana. Los puntos finales no son siempre fciles de determinar ni resulta fcil verificar la pureza del inculo.

La dilucin en medio slido se recomienda a menudo como un ensayo estandarizado para medir la sensibilidad a antimicrobianos de organismos difciles de cultivar, como es el caso de especies de Helicobacter y Campylobacter. Sin embargo, al menos en la prctica veterinaria, la microdilucin en medio lquido tambin funciona muy bien con organismos como Haemophilus, Campylobacter y Brachyspira, entre otros.

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Captulo I.1.10. Mtodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias frente a antimicrobianos c) Otras pruebas para determinar la sensibilidad a bacterias y la resistencia a antimicrobianos especficos
Las concentraciones mnimas inhibitorias de antimicrobianos para bacterias se pueden obtener, adems, mediante tiras de gradientes disponibles en el mercado que permiten la difusin de una concentracin preformada de antibitico. Sin embargo, el uso de tiras de gradientes puede ser muy caro y originar discrepancias en cuanto a MIC cuando sus resultados se comparan con los obtenidos mediante dilucin en medio slido (2). Cualquiera que sea el mtodo usado, los procedimientos deberan estandarizarse para lograr resultados exactos y reproducibles. Cada vez que se realiza una prueba de sensibilidad a antimicrobianos se necesita probar tambin los microorganismos de referencia con control de calidad para asegurarse de la exactitud de los datos. La eleccin apropiada en cuanto al sistema para determinar la sensibilidad depender, en ltimo trmino de las propiedades de crecimiento de la bacteria en cuestin. En circunstancias especiales, pueden resultar adecuados nuevos mtodos para la deteccin de fenotipos de resistencia particulares. Por ejemplo, pruebas basadas en cefalosporinas cromognicas (como nitrocefin) o pruebas equivalentes, pueden revelar resultados rpidos y fiables sobre determinacin de beta-lactamasas en algunas bacterias. De modo similar, puede detectarse un amplio espectro de actividad beta-lactamasa en algunas bacterias mediante mtodos estndar de sensibilidad por difusin en disco utilizando cefalosporinas especficas (cefotaxima y ceftazidima) en combinacin con un inhibidor de beta-lactamasas (como el cido clavulnico), y midiendo las zonas de inhibicin resultantes. Adems, la resistencia al cloranfenicol atribuible a la produccin de cloranfenicol-acetil transferasa se puede detectar en algunas bacterias mediante pruebas rpidas en un tubo o en papel de filtro en cuestin de 1-2 horas (4).

5.

Puntos crticos de sensibilidad y criterios de zona de inhibicin

El objetivo de una prueba de sensibilidad in vitro a los antimicrobianos es predecir el modo en que un patgenos bacteriano va a responder al agente antimicrobiano in vivo. Independientemente de si se usan mtodos de difusin o de dilucin, los resultados de estas pruebas in vitro clasifican las bacterias respecto a la accin de un antimicrobiano particular como resistentes, sensibles o con efecto intermedio. Los puntos crticos de sensibilidad a antimicrobianos los establecen organizaciones nacionales, sociedades profesionales o agencias reguladoras. Deberan consultarse los documentos pertinentes. No obstante, pueden existir notables diferencias entre diferentes pases en relacin con un mismo agente antimicrobiano. Como se ha indicado previamente, los resultados de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos deberan expresarse cuantitativamente: i) ii) como distribucin de concentraciones mnimas inhibitorias en miligramos por litro. como dimetros de zonas de inhibicin en milmetros.

Los dos siguientes factores son importantes para interpretar si una bacteria es sensible o resistente a un agente antimicrobiano: i) El desarrollo y establecimiento de intervalos de control de calidad, usando siempre que sea posible pruebas de difusin y pruebas de dilucin para microorganismos de control de calidad. Esto resulta esencial para validar el mtodo especfico de sensibilidad a antimicrobianos que se use. Las series de control de calidad para los microorganismos control deberan establecerse antes de determinar los puntos crticos de sensibilidad o resistencia. ii) La determinacin de criterios de interpretacin apropiados. Esto implica la generacin de tres distintos tipos de datos: distribucin poblacional de valores MIC para organismos relevantes parmetros farmacocinticos del agente antimicrobiano resultados de ensayos clnicos y experiencia

La interpretacin de los datos incluye la creacin de un diagrama de puntos a partir de la distribucin de la poblacin bacteriana (aislamientos bacterianos representativos), representando la zona de inhibicin frente al

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valor MIC para cada bacteria patgena. La seleccin de puntos crticos se basar en mltiples factores, incluyendo el anlisis de la lnea de regresin que correlaciones los valores MIC y los dimetros zonales de inhibicin, distribucin de poblaciones bacterianas, lmites de error, farmacocintica y, finalmente, la verificacin clnica. El desarrollo del concepto de "puntos crticos microbiolgicos", que se basa en las distribuciones poblacionales de la especie bacteriana concreta comprobada, puede ser mas adecuado para algunos programas de control. En este caso los aislamientos de bacterias que se desvan de la poblacin sensible normal se deberan considerar resistentes, y los cambios de sensibilidad en una combinacion especfica antimicrobiano/bacteria podran ser objeto de seguimiento (5).

6.

Directrices para las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

Se dispone actualmente de varias directrices a nivel mundial para las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos y para los correspondientes criterios de interpretacin de las pruebas. Entre otras, se incluyen las directrices y referencias publicadas por: Comit Nacional para Estndares de Laboratorios Clnicos (NCCLS) Sociedad Britnica de Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC) Comit de Antibiogramas de la Sociedad Francesa de Microbiologa (CASFM) Instituto Alemn de Normativas (DIN) Sociedad Japonesa de Quimioterapia (JSC) Werkgroep richtlijnen gevoeligheidsbepalingen (Sistema WRG, Pases Bajos) Hasta ahora, solo el NCCLS ha desarrollado protocolos para ensayos de sensibilidad de bacterias aisladas de animales y ha determinado criterios interpretativos (4). Sin embargo, existen protocolos y directrices disponibles de varias organizaciones y sociedades profesionales sobre pruebas de sensibilidad para especies bacterianas afines que causan infecciones en humanos. Es posible que se puedan adoptar tales directrices para las pruebas de sensibilidad de bacterias aisladas de animales pero cada pas debe evaluar sus propias directrices y pautas de estandarizacin. Adems, estn progresando determinados esfuerzos encaminados a homologar a escala internacional los puntos crticos de sensibilidad. Estos esfuerzos inciden principalmente en la adopcin de los estndares y directrices del NCCLS, que contempla la existencia de laboratorios con mtodos normalizados y valores de control de calidad que permiten establecer comparaciones sobre las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos y sobre los datos generados. Para los pases miembros de la OIE que no tienen mtodos de determinacin de sensibilidad estandarizados, la adopcin de las indicaciones y los estndares del NCCLS debera ser un paso inicial apropiado. Como primer paso hacia una comparacin de datos de seguimiento y control, se anima a los pases miembros a disear un programa homologado y estandarizado (6). Los datos procedentes de pases que usan otros diseos metodolgicos y de estudio pueden no ser directamente comparables (3,6). A pesar de esto, los datos acumulados a lo largo del tiempo en un determinado pas pueden servir al menos para permitir la deteccin de apariciones de resistencia microbiana o tendencias en la prevalencia de resistencias en dicho pas. No obstante, si se presentan juntos los resultados que se han obtenido con diferentes mtodos, debe demostrarse que es posible la comparacin de los resultados y que se puede alcanzar un consenso interpretativo. Ntese que esto podr llevarse a cabo ms fcilmente utilizando mtodos de determinacin de la sensibilidad a antimicrobianos que sean exactos y fiables, acoplados a un seguimiento operativo de los ensayos, y con el empleo por los laboratorios participantes de cepas bacterianas con control de calidad definido.

7.

Comparacin de resultados

Para determinar la comparacin de resultados que se originan en diferentes sistemas de vigilancia, los resultados deben ser cuantitativos y deben incluir informacin sobre los mtodos, organismos de control de calidad e intervalos de concentracin de antimicrobianos empleados, as como los criterios de interpretacin usados.

8.

Control de calidad y seguridad de calidad

Los laboratorios que realizan determinaciones de sensibilidad a antimicrobianos deberan establecer sistemas adecuados para lograr tanto control de calidad como seguridad de calidad. Deben verificarse los siguientes componentes: i) ii) precisin del procedimiento de ensayo exactitud del procedimiento de ensayo

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iii) iv) personal del laboratorio. funcionamiento de los reactivos apropiados

Tambin deberan respetarse las siguientes exigencias: i) ii) Estricto cumplimiento de las tcnicas estandarizadas junto a un control de calidad de los medios y reactivos. Mantener registro de: iii) los nmeros de lote de todos los materiales y reactivos adecuados las fechas de caducidad de todos los materiales y reactivos

Tambin debera comprobarse que las bacterias de referencia tienen el adecuado control de calidad vi) para asegurar la estandarizacin, independientemente del mtodo utilizado para determinacin de sensibilidad. Las cepas bacterianas de referencia tendran que ser catalogadas y caracterizadas por fenotipos estables y definidos en cuanto a sensibilidad a los antimicrobianos. Los laboratorios implicados en los ensayos deberan utilizar las cepas de referencia apropiadas con control de calidad. Las cepas de referencia deben mantenerse en cultivos stock de los que se puedan derivar subcultivos de trabajo y deben proceder de colecciones de cultivo nacionales o internacionales. Las cepas bacterianas de referencia deben mantenerse en laboratorios centrales o regionales designados al efecto. El mejor mtodo para analizar en su conjunto las realizaciones de cada laboratorio es ensayar las cepas bacterianas con control de calidad cada da que se lleven a cabo pruebas de sensibilidad. Como esto no siempre resulta fcil o econmico, la frecuencia de tales ensayos de control de calidad puede reducirse si el laboratorio demuestra que los procedimientos seguidos para determinar la sensibilidad son reproducibles. Si aparecen errores con los controles de calidad, el laboratorio tiene la responsabilidad de determinar las causas y repetir las pruebas. En caso de que no pueda determinar el origen de los errores, los ensayos de control de calidad deberan reiniciarse diariamente.

iv)

v)

vi)

vii)

viii) Cada vez que se inicie el empleo de un nuevo lote de medio de cultivo o de placas, y de forma peridica, se debera probar el comportamiento de las cepas de control de calidad en paralelo con las cepas bacterianas a estudiar. ix) Se debe tener en cuenta la adopcin de medidas adecuadas de bioseguridad cuando se reciban o se enven las cepas de referencia de control de calidad entre los laboratorios participantes. El empleo de tales cepas permitir la comparacin de los datos sobre la sensibilidad a antimicrobianos (fase de seguimiento).

9.

Pruebas externas de capacitacin

Para asegurar que los datos de sensibilidad que se describen son de hecho correctos, los pases miembros de la OIE deberan llevar a cabo pruebas de capacitacin externas (es decir, desarrolladas por una tercera parte). Estas pruebas de habilitacin pueden desarrollarse a nivel nacional. Se invita a que los laboratorios de pases miembros participen en comparaciones internacionales entre diferentes laboratorios. A este respecto, deberan tenerse en cuenta todas las especies bacterianas importantes. Cada pas debera designar o establecer laboratorios nacionales responsables de: i) verificar los programas de seguridad sobre la calidad de los laboratorios que participan en el control y seguimiento de las resistencias frente a los antimicrobianos suministrar a dichos laboratorios un lote de cepas de referencia. Crear una base de datos centralizada, disponible en Internet (p. ej. EARSS) que contenga los diferentes perfiles de resistencia para cada especie bacteriana.

ii) iii)

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REFERENCIAS
1. ANTHONY F., VAN VUUREN ACAR J., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELLFALL E.J., VOSE D., M. & WHITE D.G. (2001). Antimicrobial resistance: responsible and prudent use of antimicrobial agents in veterinary medicine. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, 829839.

2.

BROWN D.F. & BROWN L. (1991). Evaluation of the E-test, a novel method of quantifying antimicrobial activity. J. Antimicrob. Chemother., 26, 185190. LEEGARD T.M., CAUGANT D.A., FROHOLM L.O. & HOIB, E.A. (2000). Apparent differences in antimicrobial susceptibility as a consequence of national guidelines. Clin. Microbiol. Inf. Dis., 6, 290293. NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS) (2002). Document M31-A2. Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals, Approved Standard, Second Edition. document M31-A2. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA, 80 pp. RINGERTZ S., OLSSON-LILJEQUIST B., KAHLMETER G. & KRONVALL G. (1997). Antimicrobial susceptibility testing in Sweden II. Species-related zone diameter breakpoints to avoid interpretive errors and guard against unrecognised evolution of resistance. Scand. J. Infect. Dis. (Suppl.), 105, 812. THRELFALL E.J., FISHER I.S.T., WARD L., TSCHAPE H. & GERNER-SMIDT P. (1999). Harmonization of antibiotic susceptibility testing for Salmonella: Results of a study by 18 national reference laboratories within the European Union-funded Enter-Net group. Microb. Drug Resist., 5, 195199. WHITE D.G., ACAR J., ANTHONY F., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELFALL J.E., VOSE D., VAN VUUREN M., WEGENER H., & COSTARRICA L. (2001). Standardisation and harmonisation of laboratory methodologies for the detection and quantification of antimicrobial resistance. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, 849858.

3.

4.

5.

6.

7.

* * *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para Ensayos de sensibilidad a antimicrobianos (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)

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