Man Proc Serologico p65

Manual de procedimientos para el diagnstico serolgico de las zoonosis parasitarias
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS ZOONOSIS PARASITARIAS
Elaboracin: Elizabeth Luz Snchez Roman Biloga, Maestra en Ciencias Laboratorio de Zoonosis Divisin de Parasitologa Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud Csar Gabriel Nquira Velarde Mdico, Doctor en Medicina Divisin de Parasitologa Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud Emilia Silvia Vega Chirinos Biloga Laboratorio de Leishmaniasis y Enfermedad de Chagas Divisin de Parasitologa Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud
MPR-CNSP-006
Instituto Nacional de Salud
Colaboradores: Eduardo Ayala Sulca Bilogo Laboratorio de Zoonosis Divisin de Parasitologa Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud Rosalina Reyes Bocanegra Tecnlogo Medico Laboratorio de Zoonosis Divisin de Parasitologa Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud Sonia Medina Alvarez Tcnico de Laboratorio Laboratorio de Zoonosis Divisin de Parasitologa Centro Nacional de Salud Pblica Instituto Nacional de Salud
Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

Snchez Roman, Elizabeth Luz Manual de procedimientos para el diagnstico serolgico de las zoonosis parasitarias / Elaborado por Elizabeth Luz Snchez Roman, Csar Gabriel Nquira Velarde y Emilia Silvia Vega Chirinos. -- Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2002. 57 p. : 30 cm. -- (Serie de Normas Tcnicas; 32) 1. ZOONOSIS /parasitologa 2. TESTS SEROLOGICOS 3.TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS DIAGNOSTICOS I. Elizabeth Luz Snchez Roman II. Csar Gabriel Nquira Velarde III. Emilia Silvia Vega Chirinos IV. Instituto Nacional de Salud (Per) V. Per. Ministerio de Salud
ISBN 9972 857 21 2 ISSN 1607 - 4904 Hecho el Depsito Legal N 1501012002-1007 Ministerio de Salud, 2002 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 431-0410 Instituto Nacional de Salud, 2002 Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Telf.: 471-9920 Fax 471-0179 e-mail: postmaster@ins.sld.pe Pgina Web: www.ins.sld.pe Publicacin aprobada con R.J. N 118 2002 Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.
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II
INTRODUCCIN
SECCIN 1: GENERALIDADES 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Objetivo Campo de aplicacin Responsabilidades Documentos de referencia Definiciones y abreviaturas
CONTENIDO
V
1 1 1 1 1 2 5 5 5 6 7 11 11 11 13 13 13 13 14 14 14 18 18 20 20 20 20 20 20 21 24 24 25 25 25 25 27 27 27 28 28
SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 2.1 2.2 2.3 Del personal de laboratorio Del ambiente del laboratorio Accidentes
SECCIN 3: OBTENCIN DE MUESTRAS SECCIN 4: CONSERVACIN Y ENVO DE MUESTRAS 4.1 Conservacin 4.2 Envio de muestras SECCIN 5: TCNICA DE INMUNOBLOT PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS Y CISTICERCOSIS HUMANA 5.1 Fundamento 5.2 Equipos e intrumentos 5.3 Materiales y reactivos 5.4 Muestra 5.5 Antgenos 5.6 Procedimiento 5.7 Lectura 5.8 Resultados SECCIN 6: TCNICA DE DOBLE DIFUSIN PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS Y FASCIOLOSIS HUMANA 6.1 Fundamento 6.2 Equipos e instrumentos 6.3 Materiales y reactivos 6.4 Muestra 6.5 Antgenos 6.6 Procedimiento 6.7 Lectura 6.8 Resultados SECCIN 7: TCNICA DE ENSAYO INMUNOENZIMTICO (ELISA) PARA EL DIAGNSTICO DE CISTICERCOSIS HUMANA 7.1 Fundamento 7.2 Equipos e instrumentos 7.3 Materiales y reactivos 7.4 Muestra 7.5 Antgenos 7.6 Procedimiento 7.7 Lectura 7.8 Resultados
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III
SECCION 8: TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA PARA EL DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSIS 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 Fundamento Equipos e instrumentos Materiales y reactivos Muestra Antgenos Procedimiento Lectura Resultados
30 30 30 30 32 32 32 33 33 34 34 34 34 36 36 36 38 38 39
SECCION 9: TCNICA DE HEMAGLUTINACIN INDIRECTA PARA EL DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSIS 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 Fundamento Equipos e instrumentos Materiales y reactivos Muestra Antgenos Procedimiento Lectura Resultados
BIBLIOGRAFA
ANEXOS
ANEXO A: ANEXO B: ANEXO C: ANEXO D: ANEXO E: ANEXO F: ANEXO G: ZOONOSIS PARASITARIAS MATERIALES PARA OBTENCIN DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA BOBLE DIFUSIN PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA ELISA PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA IFI PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA HEMAGLUTINACION INDIRECTA 41 50 51 54 55 56 57
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IV
INTRODUCCIN
Las zoonosis parasitarias son infecciones transmitidas de los animales al hombre y viceversa. Estas infecciones son ms frecuentes en las zonas ganaderas, sin embargo, algunas zoonosis como la toxoplasmosis estn tambin difundidas en animales domsticos, de abasto y silvestres. En nuestro pas, las zoonosis parasitarias ms importantes son la hidatidosis, la cisticercosis, la toxoplasmosis y la fascioliosis, con tasas de prevalencia muy altas, comparadas con otros pases y con el agravante que han dejado de ser exclusivamente rurales para encontrarse actualmente casos autctonos de zonas urbanas. El diagnstico de estas zoonosis necesita para su confirmacin de exmenes de laboratorio. Como la demostracin directa del parsito no siempre es posible por las caractersticas de estas infecciones, se necesita de exmenes serolgicos, por lo que es conveniente conocer las metodologas apropiadas para cada uno. Este manual tiene como finalidad uniformizar los procedimientos de diagnstico serolgico de las principales zoonosis parasitarias estandarizados en el Laboratorio de Zoonosis de la Divisin de Parasitologa del Centro Nacional de Salud Pblica del Instituto Nacional de Salud, esperando que pueda convertirse en una herramienta til para la capacitacin del personal que integran los laboratorios de la red nacional y de otros laboratorios del pas.
Los Autores
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VI
SECCIN 1
GENERALIDADES 1.1 OBJETIVO Establecer los procedimientos para realizar el diagnstico serolgico de las principales zoonosis parasitarias: hidatidosis, cisticercosis, toxoplasmosis y fasciolosis (Anexo A). 1.2 CAMPO DE APLICACIN Se aplica en laboratorios de establecimientos de salud que cuenten con personal calificado, instalaciones, equipos y materiales idneos para llevar a cabo el diagnstico serolgico de las zoonosis parasitarias (hidatidosis, cisticercosis, fasciolosis y toxoplasmosis) a partir de muestras de pacientes hospitalizados y ambulatorios. 1.3 1.3.1 RESPONSABILIDADES El Centro Nacional de Salud Pblica (CNSP) a travs de su Direccin Ejecutiva de Laboratorios de Referencia es responsable de autorizar la elaboracin, revisin y actualizacin del presente manual, de acuerdo a los procedimientos aprobados por el Instituto Nacional de Salud (INS). Los jefes o responsables de los laboratorios de salud deben asegurar el control de calidad interno, la idoneidad del personal, equipos, materiales, reactivos e instalaciones. El personal de los establecimientos de salud son responsables de planificar las acciones, organizar, controlar y cumplir las disposiciones contenidas en el presente manual. El personal mdico, tcnico y operativo son responsables de seguir las especificaciones tcnicas contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientos especficos indicado. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Instituto Nacional de Salud. Manual de Procedimientos de Laboratorio para la Obtencin y Envo de Muestras (1). Serie de Normas Tcnicas N 15. Segunda Edicin. 1997. Instituto Nacional de Salud. Normas de Bioseguridad. Serie de Normas Tcnicas N 18. Segunda Edicin. 1997. Instituto Nacional de Salud. Manual de Procedimientos Tcnicos para el Diagnstico Serolgico de la Hidatidosis Humana. Serie de Normas Tcnicas N 22. 1997. Centro Panamericano de Zoonosis. Prueba de Doble Difusin Arco 5 para el diagnstico de la hidatidosis humana. Nota Tcnica N 22. 1979.
1 Instituto Nacional de Salud
1.3.2
1.3.3
1.3.4
1.4 1.4.1.
1.4.2.
1.4.3.
1.4.4.
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1.5 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4
DEFINICIONES Y ABREVIATURAS ALVC: antgeno de lquido vesicular de cisticerco. ATLH: antgeno total de lquido hidatdico. ATF: antgeno total de Fasciola. anticuerpo: protenas (inmunoglobulinas especficas) producidas por el organismo en respuesta al ingreso de una sustancia extraa (antgeno). antgeno: sustancia extraa al organismo que induce la respuesta del sistema inmune. cercaria: estado juvenil en los tremtodos digenticos producidos por multiplicacin asexuada dentro de un esporoquiste o de una redia. cisticerco: forma larvaria (metacstodo) en la familia Taeniidae constitudo por una vescula llena de lquido que contiene un solo escolex invaginado. dAB: 3,3 diaminobenzidine. dilucin: mezcla de una sustancia con una o ms partes de otra (diluyente) que no altera las caractersticas de la primera y reduce su concentracin. enfermedad: proceso mrbido con sntomas definidos que afecta a todo el organismo o parte del mismo. enzima: protena que acta como catalizador orgnico sobre un sustrato especfico. estrbilo: toda la cadena de progltides de la tenia, excluyendo el esclex y el cuello. esclex: Porcin de la cabeza de una tenia que le sirve como rgano de fijacin para adherirse a la pared intestinal. helminto: nombre genrico de los vermes parsitos y que abarca acantocfalos, nemtodos, cstodos y tremtodos. hexacanto: larva con seis ganchitos que emergen de los huevos de los eucstodes. hidtide: larva (metacstodo) del gnero Echinococcus de aspecto vesicular, llena de lquido y de protoeclices. hospedero: organismo en el o sobre el cual vive un parsito. hospedero accidental: hospedero circunstancial para un parsito.
1.5.5 1.5.6
1.5.7
1.5.8 1.5.9
1.5.10
1.5.11 1.5.12 1.5.13
1.5.14
1.5.15 1.5.16
1.5.17 1.5.18
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1.5.19 1.5.20 1.5.21 1.5.22 1.5.23 1.5.24 1.5.25 1.5.26 1.5.27 1.5.28 1.5.29
hospedero definitivo: hospedero en el cual el parsito alcanza su madurez sexual. hospedero intermediario: hospedero en el cual el parsito desarrolla parte de su ciclo evolutivo, sin alcanzar su madurez sexual. identidad inmunolgica: indica determinantes antignicos idnticos. infeccin: penetracin y mutiplicacin de un microorganismo en un husped, independientemente de la presentacin de sntomas y/o patologa. inmunoglobulinas: protena con actividad de anticuerpo especfico responsable de la inmunidad humoral. Existen cinco clases distintas IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. kDa: kilodaltons. larva: progenie en la evolucin de los helmintos y artrpodos de aspecto muy diferente del estado adulto. Mr: masa relativa. miracidio: larva ciliada que emerge del huevo de los tremtodes. oncsfera: huevo de cstodo que contiene el embrin hexacanto. ooquiste: forma qustica que contiene el cigoto resultante de la esporogonia en los Apicomplexa y los cuales pueden estar cubiertos por una envoltura translcida (Isospora) o estar desnudos (Plasmodium). OPD: O-phenylediamine. PBS: solucin buffer fosfato. PBS-T: solucin buffer fosfato-Tween. PBS-T-L: solucin buffer fosfato-Tween-leche. progltida: segmento de la estrbila de los cstodos, que contiene los rganos reproductores masculinos y femeninos. protoesclices: escolex juvenil que nace a partir de brotes internos (yemacin) en el quiste hidatdico. quiste hidatdico: estado larval de la tenia del gnero Echinococcus que consiste en una vescula grande que posee una membrana germinal interna desde la cual los escolex y los quiste hijos avanzan para proyectarse en la vescula. quiste multilocular: quiste que contienen muchas cavidades. quiste unilocular: quiste que contiene slo una cavidad.
1.5.30 1.5.31 1.5.32 1.5.33 1.5.34
1.5.35 1.5.36
1.5.37 1.5.38
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1.5.39 1.5.40 1.5.41
redia: estado larval de los tremtodos digenticos y que se forma por reproduccin asexual dentro de un miracidio. SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida y sulfato dodecil de sodio. ttulo serolgico: cantidad de suero necesaria para producir una reaccin biolgica con otra sustancia, medida generalmente como la mxima dilucin del suero testigo que an mantiene dicha reactividad. trofozotos: forma vegetativa activa y que se alimenta entre los protozoarios. zoonosis: enfermedad de animales transmisibles a los seres humanos.
1.5.42 1.5.43
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SECCIN 2
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Es un conjunto de medidas preventivas destinados a proteger la salud y seguridad del personal durante su trabajo en los laboratorios donde se manipulan productos biolgicos. Los principales productos biolgicos que se procesan en las pruebas de diagnstico inmunolgico de las zoonosis parasitarias son suero sanguneo y, en ocasiones, lquido cefalorraqudeo. Los laboratorios donde se realizan estas pruebas diagnsticas son de nivel de bioseguridad 2, esto implica las siguientes medidas: 2.1. 2.1.1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la hepatitis B. Al momento de extraer la sangre, debe vestir mandil, amarrarse el cabello largo o usar gorro y evitar tener brazaletes y collares. Usar guantes, jeringas y agujas descartables o vacutainers. Nunca utilizar slo la aguja para la extraccin de sangre y evitar pipetear fludos. Manipulacin y eliminacin de sangre y sus productos La extraccin, centrifugacin y separacin de los sueros debe realizarse usando guantes descartables. Las agujas usadas no deben devolverse al capuchn de plstico sino colocarlas en leja, junto con las jeringas, en un recipiente metlico o resistente al calor para su esterilizacin en autoclave, luego de lo cual se procede a eliminarse. El operador es responsable de desinfectar el rea de trabajo, antes y despus de cada sesin de trabajo, con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante, dejndolos actuar durante 30 minutos. El cogulo y suero innecesarios, deben eliminarse en un recipiente con desinfectante (por ejemplo: leja). Antes de lavarlos, los tubos de prueba, pipetas y lminas de microscopio pueden descontaminarse sumergindolos en una mezcla sulfo-crmica o en leja. DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO Las paredes y pisos deben ser lisos, de preferencia paredes enchapadas con maylica y pisos de marmolina o cemento, que faciliten la limpieza con soluciones desinfectantes. Los pisos deben limpiarse todos los das con soluciones desinfectantes (pinosan, cresol, entre otros). No se debe barrer en seco ni encerar.
2.1.2.
2.1.3.
2.1.4. 2.1.4.1. 2.1.4.2.
2.1.4.3.
2.1.4.4.
2.1.4.5.
2.2 2.2.1
2.2.2
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2.2.3
Slo se deben eliminar en el sistema de desage los agentes biolgicos y qumicos, previamente descontaminados, neutralizados o inactivados. El ambiente debe ser amplio, con suficiente iluminacin, adecuada ventilacin y con servicios de agua, luz y gas funcionando satisfactoriamente. Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material slido de fcil limpieza y con superficies lisas, impermeables y resistentes a las sustancias corrosivas. ACCIDENTES Inoculacin accidental, cortes o abrasiones, quemaduras pequeas La persona accidentada debe lavarse las zonas afectadas y concurrir al servicio mdico ms cercano para el tratamiento adecuado del problema.
2.2.4
2.2.5
2.3 2.3.1
2.3.2
Ingestin de material posiblemente peligroso La persona acudir al servicio mdico ms cercano para el tratamiento adecuado.
2.3.3
Contacto con material sospechoso de poder contener virus de la hepatitis B o virus de la inmunodeficiencia humana, dengue, fiebre amarilla, influenza, entre otros. Lavarse la zona afectada con agua y jabn, favoreciendo el sangrado de la lesin. De ser necesario, cubrir la herida con un apsito. Concurrir al servicio mdico ms cercano para determinar la gravedad y la posible contaminacin con sangre. Informar del accidente a las autoridades competentes. Tomar una muestra inicial del trabajador la que ser examinada serolgicamente para hepatitis B, VIH, dengue y fiebre amarilla, entre otros. Examinar, de la misma manera, una muestra del material con que se contamin el personal. Si la serologa de VIH del trabajador es negativa, este examen debe repetirse mensualmente hasta el sexto mes. La continuidad de la serologa negativa indicar que el trabajador no se contamin.
2.3.3.1
2.3.3.2
2.3.3.3 2.3.3.4
2.3.3.5 2.3.3.6
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SECCIN 3
OBTENCIN DE MUESTRAS El suero sanguneo es el material biolgico que comnmente se solicita para los exmenes de las zoonosis parasitarias. Estas muestras se obtienen de sangre venosa, siguiendo el procedimiento que se indica a continuacin. 3.1 3.2 Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesita para obtener la muestra (Anexo B). Si el paciente se encuentra en el laboratorio, haga que se siente de manera que el brazo quede colocado paralelamente a la mesa de trabajo, apoyndolo en un pequeo cojn bajo el codo y manteniendo la palma de la mano hacia arriba (Figura N1).
Figura N 1. Posicin del paciente para la obtencin de la muestra srica.
3.3 3.4
Si el paciente se encuentra en cama, extienda el brazo del paciente en una posicin descansada. El sitio ms adecuado para la extraccin de sangre es la vena que se encuentra en el pliegue anterior del codo, en el punto donde es ms gruesa y visible (Figura N 2).
Figura N 2. Zona de venopuncin (pliegue anterior del codo).
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3.5 3.6
Coloque la ligadura alrededor del brazo y sujete firmemente los extremos. Con la mano izquierda, tire del extremo de la ligadura cruzndola y a continuacin introduzca este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura. De acuerdo a la Figura N 3, sta se deber ajustar slo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de sangre por la arteria.
Figura N 3. Ligadura del brazo.
3.7 3.8 3.9
Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas. Con el dedo ndice de la mano izquierda palpe la vena en que introducir la aguja. Desinfectar la zona de la piel donde se realizar la puncin con un pedazo de algodn embebido en alcohol yodado (Figura N 4).
Figura N 4. Asepsia de zona de venopuncin.
3.10 3.11
Tomar la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba, introducindola en el centro de la vena sin titubeos, 1-1,5 cm aproximadamente (Figura N 5).
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Figura N 5. Introduccin de aguja de venopuncin.
3.12
Con la mano izquierda tire hacia atrs el mbolo de la jeringa, muy lentamente. Deber extraer la sangre en la jeringa, hasta completar 5mL, si no obtiene sangre intntelo nuevamente. Verificar la ubicacin de la aguja dentro de la vena. Retirar la ligadura tirando del extremo doblado al haber completado el volumen de sangre requerido. (Figura N 6)
3.13
Figura N 6. Retiro de aguja de venopuncin.
3.14
Aplicar un pedazo de algodn seco sobre la zona por donde se punz la piel. Saque la aguja con un movimiento rpido. Pedir al paciente que presione, firmemente, el algodn durante tres minutos, con el brazo extendido. Luego de extrada la sangre por venopuncin, retire la aguja de la jeringa y colquela en un depsito de metal (para autoclavar); vierta, lentamente, la sangre en un tubo de prueba sin anticoagulante y tpelo. Deje reposar el tubo con la sangre en posicin vertical, en una gradilla, por un lapso de 30 minutos a 2 horas, centrifugar la sangre de 2000 a 2500 r.p.m. durante 5 minutos. Si no dispone de centrfuga, la sangre se puede dejar varias horas en la refrigeradora; el suero se separar del cogulo.
3.15 3.16
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3.17 3.18 3.19
Destapar el tubo y aspirar el suero con una pipeta de Pasteur. Depositar el suero en un tubo limpio y seco, as estar listo para realizar la prueba. Si se remitiese la muestra a otro laboratorio, coloque el suero en viales de plstico con tapa rosca o en frasco de Weathon o tipo penicilina estril de X mL de capacidad, colocando inmediatamente la tapa y sellando con parafilm o cera. Codificar el frasco de inmediato (Figura N 7).
3.20
Figura N 7. Codificacin de la muestra.
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SECCIN 4
CONSERVACIN Y ENVO DE MUESTRAS 4.1 CONSERVACIN Las muestras contenidas en viales o frasquitos pueden conservarse en refrigeracin (4C) por perodos cortos (hasta 1 da) y deben congelarse (Freezer 0C). Si se requiere conservarlas por mayor tiempo, utilizar un equipo a - 20C. 4.2 4.2.1 ENVO DE LAS MUESTRAS Cuando las muestras no pueden ser procesadas en el mismo laboratorio o cuando se desea una confirmacin diagnstica, estas son enviadas a otro laboratorio. Para efectuar el envo de las muestras de suero se deben seguir los siguientes pasos: Colocar los frasquitos con las muestras, rotulado apropiadamente, en una bolsa plstica y luego acondicionarlas en un contenedor secundario (recipiente de plstico) rodeado de hielo seco o cubos de hielo. El recipiente secundario debe ser colocado en una caja de tecnopor u otro material que conserve temperaturas bajas. Se debe adjuntar la ficha epidemiolgica envuelta en una bolsa plstica o mica. Cerrar y sellar hermticamente la caja trmica. En caso de ser enviado al Laboratorio Referencial Nacional, rotular la caja trmica con los siguientes datos:
4.2.2 4.2.2.1
4.2.2.2
4.2.2.3 4.2.2.4 4.2.2.5
URGENTE INSTITUTO NACIONAL DE SALUD LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL Calle Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara - Lima Telfono : 471-9920; Fax 471-2529 Contiene: MATERIAL BIOLGICO PERECIBLE
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Figura N 8. Embalado ideal de sustancias infecciosas para el envo por correo (segn O.M.S.)
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SECCIN 5
TCNICA DE INMUNOBLOT PARA EL DIAGNOSTICO DE HIDATIDOSIS Y CISTICERCOSIS HUMANA 5.1 5.1.1 FUNDAMENTO Este mtodo permite observar la reaccin de los anticuerpos presentes en el suero de los pacientes frente a protenas antignicas del lquido de quiste hidatdico (ATLH) de E. granulosus o protenas antignicas del lquido vesicular de cisticerco (ALVC) de T. solium. Los componentes proticos de los parsitos son separados por electroforesis y despus transferidos a una membrana de nitrocelulosa, la membrana es incubada con el suero problema y luego con antiIgG humano marcado con una enzima. Si el suero tiene anticuerpos, al agregar un sustrato cromgeno adecuado, se origina un producto insoluble que precipita formando bandas en las zonas de las protenas antignicas. EQUIPOS E INSTRUMENTOS Balanza de precisin Potencimetro Refrigeradora Congeladora a 80C Sistema de electroforesis vertical Sistema de electroforesis de transferencia de protenas Rotador elctrico Micropipetas de 1-10 L Micropipetas de 10-100 L Micropipetas de 200-1000 L Micropipeta multicanal de 50 200 L MATERIALES Y REACTIVOS Nitrocelulosa con poros de 0,22 m Placas de plstico divididas en compartimentos Gel de poliacrilamida (Anexo C) Anti-IgG humano (molcula total) marcado con peroxidasa (titulado)
5.1.2
5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 5.2.9 5.2.10 5.2.11 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4
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5.3.5 5.3.6 5.3.7 5.3.8 5.3.9 5.3.10 5.3.11 5.3.12 5.3.13 5.3.14 5.4
Estndar de peso molecular Estndar de peso molecular pre-teido Perxido de hidrgeno 30% Buffer fosfato salino (PBS) (Anexo C) Buffer de lavado (PBS -Tween 20) (Anexo C) Solucin de bloqueo (PBS -Tween-Leche) (Anexo C) Cromgeno: 3,3 diaminobenzidina (DAB) Suero control positivo a quiste hidatdico Suero control positivo a cisticerco Sueros control negativo MUESTRA Suero problema o lquido cefalorraqudeo
5.5 5.5.1
ANTGENOS Antgeno total de lquido de quiste hidatdico (ATLH) liofilizado para diagnstico de hidatidosis El antgeno es reconstituido con buffer Tris/HCl 0,05M; pH 8,0 (Anexo C) en concentracin de 50 mg de peso seco por mL, luego centrifugado a 15 000 rpm por 30 minutos a 4C. El sobrenadante es conservado a - 70C hasta el momento de su uso.
5.5.2
Antgeno total de lquido vesicular de cisticerco (ALVC) liofilizado para diagnstico de cisticercosis El antgeno es reconstituido con buffer Tris/HCl 0,05M; pH 8,0 (Anexo C) al volumen original, luego centrifugado a 15 000 rpm por 30 minutos a 4C. El sobrenadante es conservado a - 70C hasta el momento de su uso.
5.6 5.6.1 5.6.1.1
PROCEDIMIENTO Etapa I: Separacin de las protenas del antgeno por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) La separacin de las protenas, componentes antignicos por SDS-PAGE es realizada siguiendo la metodologa descrita por Tsang et al. (1983-1986), empleando un sistema discontinuo en el gel de separacin y en el gel de empaquetamiento. Un sistema vertical (Mini-Protean II Electroforesis Cel, BIO-RAD) resulta apropiado para realizar la separacin de las protenas.
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5.6.1.2
Tratamiento de antgenos Los extractos antignicos parasitarios en este caso, ATLH y ALVC, son mezclados separadamente volumen a volumen con una solucin de tratamiento (Anexo C). Los antgenos son entonces sometidos a 100C en bao mara por 5 minutos.
5.6.1.3 a. b. c. d. e. f. g. 5.6.1.4 a. b. c.
Preparacin del gel de separacin para el modelo Mini Protean II, BIO-RAD Usar 2 placas de vidrio de 73 mm de alto x 102 mm de ancho x 1mm de espesor y 2 espaciadores de plstico de 0,75 mm de espesor. Limpiar las placas de vidrio con alcohol y secarlas. Montar las placas, empleando los espaciadores untados con una capa fina de vaselina neutra para unir las placas. Preparar el gel en la concentracin de 15% segn la frmula (Anexo C). Encajar las placas en un soporte. Con auxilio de una jeringa colocar el gel en el espacio de las placas montadas hasta 65 mm de altura e inmediatamente completar con agua destilada. Dejar polimerizar el gel a temperatura ambiente por 30 minutos. Aplicacin del gel de empaquetamiento para el modelo Mini Protean II, BIO-RAD Eliminar el agua destilada de la parte superior del gel, con ayuda de una jeringa. Secar con papel filtro la superficie del gel de separacin. Preparar el gel de empaquetamiento como se indica (Anexo C). Colocar el gel de empaquetamiento preparado sobre el gel de separacin e inmediatamente insertar un peine preparativo de 0,75 mm de espesor, dejando un espacio de 0,5 cm entre el fondo del peine y el gel de separacin. Dejar polimerizar el gel a temperatura ambiente por 30 minutos. Preparacin de la electroforesis Retirar el peine y lavar las cavidades que deja con Buffer Tris-Glicina-SDS (Anexo C). Aplicar en la cavidad del gel de empaquetamiento la solucin antignica del parsito: ATLH 40L de solucin en concentracin de 4g/L de protenas. En caso de ALVC, 50 L de solucin antignica y la concentracin es de 1g/L de protenas. En las cavidades del extremo derecho de los geles, colocar 5 L de protenas del estndar de peso molecular y 3l del estndar de peso molecular preteido.
d. 5.6.1.5 a. b.
c.
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d. 5.6.1.6 a. b. c. d.
Adicionar aproximadamente 200 mL de buffer de corrida en el recipiente superior y 300 mL del mismo buffer en el recipiente inferior de la cubeta, para iniciar la corrida electrofortica. Corrida electrofortica Conectar los terminales elctricos en la fuente de poder. La electroforesis se efecta a 15 mA por gel. Prestar atencin al colorante marcador de corrida. Cuando los complejos SDS-protenas entran uniformemente en el gel de separacin o de corrida, la corriente es aumentada a 30 mA por gel. Desconectar el sistema cuando el colorante marcador de corrida alcanza la base del gel de separacin (Figura N 9).
Figura N 9. Equipo para electroforesis en gel de poliacrilamida y perfil protico de antgenos.
5.6.2 5.6.2.1
Etapa II: Transferencia de proteinas del gel de poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa Las protenas antignicas son transferidas electroforticamente del gel para la membrana de nitrocelulosa con poros de 0,22 m, empleando un recipiente de electroforesis. Preparacin de la transferencia En un recipiente conteniendo buffer de transferencia (Anexo C) se coloca el gel sobre una membrana de nitrocelulosa. Estos, a su vez, se colocan entre dos hojas de papel filtro embebidas en el mismo buffer. El conjunto de gel, nitrocelulosa y papel filtro se coloca entre dos esponjas de 3mm de espesor y a su vez todo este conjunto queda preso en una pieza plstica con perforaciones en ambos lados (Figura N 10). Enseguida, este conjunto se encaja en una cmara de transferencia, con el gel colocado hacia el ctodo y la membrana de nitrocelulosa hacia el nodo.
5.6.2.2 a.
b.
c.
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5.6.2.3
a.
Electrotransferencia La electrotransferencia se efecta a una corriente, variando de 1,5 Amperios a 10C al inicio, hasta
2,05 Amperios a 35C al final del proceso, manteniendo el voltaje constante de 55 Voltios por una hora.
b.
Finalizada la electrotransferencia, retirar la membrana de nitrocelulosa y lavar 5 veces por 5 minutos cada una, con buffer fosfato salino (PBS) 0,01M, pH 7,2. (Anexo C) conteniendo 0,3% de Tween 20 (PBS-T) (Anexo C) y una lavada ms con PBS sin Tween. Cortar la tira de nitrocelulosa que contiene los patrones de peso molecular y colorear con solucin al 1% de tinta China. A continuacin, cortar la membrana de nitrocelulosa conteniendo las protenas del antgeno, en tiras de 3mm de ancho, y guardar a 20C entre hojas de papel filtro humedecidos en PBS hasta el momento de su uso.
c. d.
N.C. : Nitrocelulosa
Figura N 10. Transferencia del antgeno del gel a nitrocelulosa mediante electroforesis.
5.6.3 5.6.3.1 5.6.3.2
Etapa III: Reaccin inmunoenzimtica Emplear placas de plstico divididas en compartimentos. Colocar tiras de nitrocelulosa conteniendo el antgeno hidatdico o antgeno de cisticerco (segn requerimiento de diagnstico) en los compartimentos de las placas (Figura N 11).
Figura N 11. Placa de incubacin para la reaccin en las tiras de nitricelulosa.
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5.6.3.3
Incubar las tiras en 1 mL. de PBS-T conteniendo 5% de leche descremada (PBS-TL) (Anexo C) por 30 minutos a temperatura ambiente y en agitacin. Descartar el PBS-TL y colocar los sueros problema diluidos a 1:100 (en PBS-TL) en volumen de 1 mL e incubar por 1 hora a temperatura ambiente y en agitacin. Lavar las tiras 5 veces por 5 minutos cada una con PBS-T. Adicionar una solucin de anti-IgG humano marcado con peroxidasa diluido a 1:1000 en PBS-TL e incubar por 1hora a temperatura ambiente y en agitacin. Lavar las tiras 5 veces por 5 minutos cada una con PBS-T y una vez ms con PBS solo. Revelar la reaccin adicionando una solucin de 5 mg de 3,3 diaminobenzidina (DAB), 10l de H2O2 (30%) por cada 10 ml de PBS. Luego de visualizar las bandas, lavar las tiras varias veces con agua deionizada. Dejar secar las tiras a temperatura ambiente y en oscuridad. LECTURA Consiste en visualizar en las tiras de nitrocelulosa la presencia o ausencia de bandas de precipitacin. En caso de presencia de bandas, anotar sus respectivas masas relativas (Mr) expresadas en unidades de kilodaltons (kDa).
5.6.3.4
5.6.3.5 5.6.3.6
5.6.3.7 5.6.3.8
5.6.3.9 5.6.3.10 5.7
5.8 5.8.1
RESULTADOS El criterio de positividad para el diagnstico de hidatidosis es el reconocimiento de uno o ms pptidos antgnicos de Mr entre 21 y 31 kDa por anticuerpos especficos presentes en el suero del paciente (Figura N 12).
Figura N 12. Bandas de precipitacin Ag-Ac en el inmunoblot. Observar bandas de 21 a 31 kDa
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5.8.2
El criterio de positividad para el diagnstico de cisticercosis es el reconocimiento de uno o ms pptidos antignicos de Mr 13,14,17,18,23,24,31,35 kDa por anticuerpos especficos presentes en el suero del paciente (Figura N 13).
Figura N 13. Bandas de precipitacin Ag-Ac en el inmunoblot . Observar bandas de 13 a 35 kDa
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SECCIN 6
TCNICA DE DOBLE DIFUSIN PARA EL DIAGNSTICO DE HIDATIDOSIS Y FASCIOLOSIS HUMANA 6.1 FUNDAMENTO Es una reaccin de precipitacin antgeno - anticuerpo en un medio semislido (gel), que consiste en detectar en el suero del paciente anticuerpos contra antgenos parasitarios. En este caso, los antgenos de la forma larvaria de Echinococcus granulosus y de la forma adulta de Fasciola hepatica. 6.2 6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 6.2.7 6.2.8 6.2.9 6.2.10 6.2.11 6.2.12 6.3 6.3.1 6.3.2 6.3.3 6.3.4 6.3.5
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EQUIPOS E INSTRUMENTOS Refrigeradora Estufa de 37C Balanza Potencimetro Centrfuga Reloj para control de tiempo Micropipeta de 20 - 200 L Lpiz con punta de diamante Sacabocados para corte de 1 mm de dimetro Sacabocados para corte de 2 mm de dimetro Sacabocados para corte de 6 mm de dimetro Sacabocados para corte de 10 mm de dimetro MATERIALES Y REACTIVOS Lminas porta-objetos Pipetas Pasteur Pipeta de 5 mL Placas petri 150 x 20 mm Frasco Coplin
6.3.6 6.3.7 6.3.8 6.3.9 6.3.10 6.3.11 6.3.12 6.3.13 6.3.14 6.4
Papel filtro (Whatman N 1) Pizeta de 500 mL Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,4 (Anexo D) Solucin colorante (Anexo D) Solucin decolorante (Anexo D) Gel de Agar Noble (Anexo D) Gel de Agarosa (Anexo D) Suero control positivo a quiste hidatdico Suero control positivo a Fasciola heptica MUESTRA Suero problema
6.5 6.5.1
ANTGENOS Antgeno total de lquido hidatdico de Echinococcus granulosus Resuspender 50 mg ATLH, liofilizados en 1 mL de PBS y conservar en congelacin a -20C o a 4C hasta 10 das.
6.5.2
Antgeno total de Fasciola heptica Resuspender 50 mg ATP, liofilizados en 1 mL de PBS y conservar en congelacin a -20C a 4C hasta 10 das.
6.6 6.6.1 6.6.2
PROCEDIMIENTO Utilizar lminas portaobjetos de 2,5 x 7,5 cm. sumergidas en alcohol, limpias y secas. Rotular en un extremo de las lminas con lpiz punta de diamante, el nmero y fecha correspondiente (Figura N 14).
Figura N 14. Datos de la lmina porta-objetos
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6.6.3
Sobre una superficie nivelada, colocar en la lmina con ayuda de una pipeta, 3,5 mL del gel (Anexo D) licuado en bao mara (Figura N 15).
Figura N 15. Colocacin del gel sobre la lmina.
6.6.4 6.6.5 6.6.6
Dejar solidificar el gel a temperatura ambiente durante 10 minutos. Colocar la lmina en cmara hmeda y dejar enfriar por 15 minutos a 4C. Retirar la lmina de la cmara hmeda y colocarla sobre el diagrama de corte correspondiente (Figura N 16).
DD5 DD2
Figura N 16. Plantilla tamao natural para el corte de agar, A: DD5 y B: DD2.
6.6.7
Cortar en el gel los orificios, utilizando los sacabocados con los dimetros correspondientes. Para DD5: sueros problema (10 mm), suero control positivo (6 mm) y antgeno (1 mm); y para DD2: sueros problema (6 mm), suero control positivo (6 mm) y antgeno (2 mm). (Ver Figura N 17). Retirar los geles cortados con una esptula fina evitando daar los bordes de los orificios.
Figura N 17. Perforacin de los orificios en el gel.
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6.6.8 6.6.9
Colocar la lmina en cmara hmeda. Llenar los orificios respectivos utilizando pipetas Pasteur. Para DD5: sueros problema (150 l), suero control positivo (50 l) y antgeno (3 l); y para DD2: sueros problema (50 l), suero control positivo (50 l) y antgeno (6 l). No debe haber burbujas en su interior (Figuras N 18 y 19) y el nivel superior debe ser convexo respecto a la superficie del agar.
Figura N 18. llenado del orificio del antgeno. (Fuente: OPS).
Carga correcta
Carga insuficiente
Figura N 19. Llenado de los orificios de 6 mm con suero control y 10 mm con suero problema. (Fuente: OPS).
6.6.10
Dejar difundir el antgeno y los anticuerpos en el agar de la lmina a temperatura ambiente durante 4048 horas (Figura N 20).
Figura N 20. Difusin de las muestras en cmara hmeda
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6.6.11
Finalizada la difusin, sumergir la lmina en Buffer fosfato salino (PBS), pH 7,4, a temperatura ambiente por 36 horas. Durante este perodo, se cambiar 5 veces la solucin de lavado (PBS), en los dos primeros lavados, eliminar de los orificios los posibles precipitados que pudiesen haber, para lo cual, con ayuda de una pipeta se rociar con PBS a presin moderada. Concluido el lavado, sumergir la lmina en agua destilada por 10 minutos. Envolver la lmina en papel filtro Watman N 1 previamente humedecido en agua destilada. Dejarla secar en estufa a 37C por 18 horas. Retirar cuidadosamente el papel que envuelve la lmina, humedecindolo con agua destilada, en caso necesario. Sumergir en solucin colorante (Anexo D), durante 15-20 minutos y observar la banda de precipitacin entre antgeno y suero control; de no existir, dejar la lmina ms tiempo en la solucin y continuar este paso. Escurrir la lmina, enjuagar con agua de cao y volver a escurrir. Sumergir en solucin decolorante (Anexo D) durante 20-30 minutos, hasta obtener una decoloracin satisfactoria en la lmina y apreciar claramente la banda entre el antgeno y el suero control. LECTURA La lectura consiste en observar el nmero de bandas de precipitacin entre los orificios de los sueros problemas y el antgeno. Verificar si alguna de ellas presenta identidad inmunolgica con la banda formada entre el orificio del antgeno y el suero control positivo (Figuras N 21 y 22). La prueba es vlida cuando se observa la banda de precipitacin entre el antgeno y el suero control positivo; en caso contrario, la prueba carece de valor y debe repetirse el ensayo.
6.6.12 6.6.13 6.6.14 6.6.15 6.6.16
6.6.17 6.6.18 6.7 6.7.1
6.7.2
Figura N 21. Las muetras aplicadas en los orificios 1,2 y 4 presentan bandas de identificacin del arco 5.
Figura N 22. Las muestra aplicadas en los orificios 1 y 2 presentan bandas de identificacin del arco 2.
6.8
RESULTADOS Informar la presencia (positivo) o ausencia (negativo) del Arco 5 en caso de Hidatidosis, arco 2 en caso de Fasciolosis. Adems, anotar el nmero total de bandas observadas.
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SECCIN 7
TCNICA DE ENSAYO INMUNOENZIMATICO (ELISA) PARA EL DIAGNSTICO DE CISTICERCOSIS HUMANA 7.1 FUNDAMENTO La tcnica de ELISA emplea como antgeno lquido vesicular de cisticerco de Taenia solium, adheridos a soportes inertes (placa de microtitulacin) y ligado a una anti gamaglobulina humana marcada con enzima, como detectora de la reaccin antigeno-anticuerpo (Figura N 23). 7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6 7.2.7 7.2.8 7.2.9 7.2.10 7.2.11 7.3 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.3.4 7.3.5 7.3.6 7.3.7
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EQUIPOS E INSTRUMENTOS Lector ELISA Lavador de placas ELISA Estufa de incubacin 37C Refrigeradora Congeladora a -80C Congeladora a -20C Potencimetro Balanza de precisin Micropipetas de 5-50 L Micropipeta multicanal de 50-200 L Puntas para micropipetas 10-200 L MATERIALES Y REACTIVOS Placas de microtitulacin con fondo plano, sensibilizadas con antgeno de cisticerco de Taenia solium. Anti IgG humano (cadena especfico) marcado con peroxidasa Perxido de hidrgeno 30% Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2 (Anexo E) Buffer de lavado (PBS-Tween 0,05%) (Anexo E) Solucin de bloqueo (PBS-Tween 0,05%-BSA 1%) (Anexo E) Cromgeno: Orto-phenilendiamina (OPD)
ELISA
Figura N 23. Prueba de Elisa.
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7.3.8 7.3.9 7.3.10 7.4
cido sulfrico 2,5 M (Anexo E) Suero control positivo a cisticerco Suero control negativo a cisticerco MUESTRA Suero problema o lquido cefalorraqudeo
7.5
ANTGENOS Antgeno total de lquido vesicular de cisticerco (ALVC) en concentracin de 1g de protenas/L, diluido 1/500 en buffer Tris/HCl 0,01 M, pH 7,5.
7.6 7.6.1
PROCEDIMIENTO Sensibilizar las placas de microtitulacin colocando 100 mL de ALVC (item 7.5) en el fondo de los pozos de la placa excepto en los pozos del blanco (Figura N 24 A). Cubrir las placas de microtitulacin con tapa o parafilm para evitar la evaporacin, incubar a 37C por 1 2 horas y luego colocar a 4C durante toda la noche. Retirar del refrigerador las placas de microtitulacin sensibilizada ALVC y dejar que tome la temperatura ambiente. Lavar los pozos de las placas adicionando a cada uno de ellos 200 L de PBS- Tween 0,05%, utilizando lavador de microplacas. Repetir el lavado por 5 veces. En el ltimo lavado eliminar por completo el lquido residual, invirtiendo la placa sobre papel absorbente (aplicar golpes firmes). Bloquear los sitios inespecficos mediante la adicin de 100 L de PBS-Tween 0,05%, BSA 1% en cada pozo. Incubar en estufa a 37C por 30 minutos. Lavar los pozos de la placa al igual que en 7.6.4 y 7.6.5. Siguiendo el esquema de distribucin de sueros (Figura N 24 A) aadir en los pozos respectivos lo siguiente: Suero control positivo SCP: diluido 1/500 (en solucin diluyente, ver Anexo E). Suero control negativo SCN: diluido 1/500 (en solucin diluyente, ver Anexo E). Suero problema SP: diluido a partir de 1/500 (en solucin diluyente, ver Anexo E).
7.6.2
7.6.3
7.6.4
7.6.5
7.6.6
7.6.7 7.6.8 7.6.9
7.6.9.1 7.6.9.2 7.6.9.3

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7.6.10 7.6.11 7.6.12 7.6.13 7.6.14 7.6.15 7.6.16 7.6.17 7.7
Cubrir la microplaca e incubar a 37C por 1 hora. Descartar el contenido de los pozos de la microplaca sobre un recipiente conteniendo hipoclorito de Sodio al 5%, mediante inversin de la microplaca. Lavar los pozos de la microplaca al igual que en 7.6.4 y 7.6.5. Colocar 100 mL en cada pozo de AntiIgG humano diluido 1/1000. Incubar en estufa a 37C por 1 hora. Lavar los pozos de la microplaca al igual que en 7.6.4 y 7.6.5. Colocar 100 L en cada pozo de una solucin de sustrato, (Anexo E). Dejar en oscuridad a temperatura ambiente por 15 minutos. Detener la reaccin adicionando 25 L de cido sulfrico 2,5M en cada pozo (Anexo E). LECTURA Para que la reaccin tenga validez, los controles deben reaccionar como tales (Figura 24 B).
7.7.1
Con lector de ELISA La presencia o ausencia de anticuerpos anti-cisticerco de Taenia solium se determina relacionando la absorbancia de la muestra a 490 nm respecto al valor de corte. Se ha definido el valor de corte (VC) como el punto de cruce entre el promedio de las lecturas de los sueros controles no reactivos (CN) y reactivos + dos desviaciones estndar (DS). VC = CN + 2 DS Reactivo: muestras con absorvancias mayores al valor de corte. No reactivos: muestras con absorvancias menores al valor de corte.
7.7.2
Lectura visual Si no se cuenta con lector de ELISA, la lectura se realiza observando el viraje de color: Reactiva: Muestras con coloracin amarilla mas intensa que la del control negativo. No reactiva: muestras que no presentan coloracin o que sean igual o menor que la del control negativo.
7.8
RESULTADO Positivo: Se detecta la presencia de anticuerpos contra antgenos de cisticerco de Taenia solium lectura reactiva. Negativo: No se detecta la presencia de anticuerpos contra antgenos de cisticerco de Taenia solium lectura no reactiva.
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CP: SUERO CONTROL POSITIVO CN: SUERO CONTROL NEGATIVO B: BLANCO
S1 - S5: SUEROS PROBLEMA
Figura N 24A. Esquema de la distribucin de sueros.
B
S1 S2 S3 S4 S5
CONTROLES
1/500 1/1000 1/2000 1/4000 1/8000 1/16000 1/32000 1/64000
REACTIVO NO REACTIVO
Figura 24B. Placa de Reaccin de Elisa.
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SECCIN 8
TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) PARA EL DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSIS 8.1 FUNDAMENTO La tcnica de inmunofluorescencia indirecta, emplea como antgeno trofozoitos de Toxoplasma gondii fijados en lminas, sobre la que se realiza la reaccin antgeno-anticuerpo. La formacin de este complejo es evidenciada por una anti gamaglobulina humana marcada con fluorescena (Figura N 25). 8.2 8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 8.2.5 8.2.6 8.2.7 8.2.8 8.3 8.3.1 8.3.2 8.3.3 8.3.4 8.3.5 8.3.6 8.3.7 8.3.8 8.3.9 8.3.10
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EQUIPOS E INSTRUMENTOS Microscopio de fluorescencia Estufa a 37C Balanza Potencimetro Refrigeradora Congeladora a 70C Reloj cronmetro Secador o ventilador MATERIALES Y REACTIVOS Placas para microtitulacin, fondo en U Micropipetas de 5-50 mL Puntas DE 10 200 mL Koplin Pizetas Papel toalla o secante Laminilla cubre objetos de 24x48 mm Cmara hmeda Lminas IFI impregnadas con Toxoplasma gondii Suero Control Positivo a Toxoplasma gondii
IFI
Figura N 25. Prueba de Inmunofluorescencia Indirecta
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8.3.11 8.3.12 8.3.13 8.3.14 8.3.15 8.3.16 8.3.17 8.3.18 8.4
Suero control negativo a Toxoplasma gondii Anti-IgG humano marcado con Isoticianato de fluorescena (FITC) Buffer fosfato salino pH 7,4 (Anexo F) Solucin diluyente de suero (Anexo F) Solucin diluyente de conjugado (Anexo F) Glicerina tamponada pH 8,5 (Anexo F) Agua destilada Solucin de Azul de Evans (Anexo F) MUESTRA Suero problema
8.5
ANTGENOS Trofozoitos de Toxoplasma gondii cultivados en exudado peritoneal de ratones y tratados con formol al 2%, son impregnados en lminas IFI a concentracin de 40 parsitos por campo microscpico y observados a 40X de aumento.
8.6 8.6.1 8.6.2
PROCEDIMIENTO Retirar del congelador las lminas impregnadas con el antgeno y dejarlas secar a temperatura ambiente o con ayuda de un secador elctrico. Siguendo el esquema de distribucin de sueros, aadir en las reas circulares de la lmina IFI lo siguiente (Figura N 26).
Figura N 26. Suero control positivo CP: 15 L diluido 1/16 (en solucin diluyente). Suero control negativo CN: 15 L diluido 1/16 (en solucin diluyente). Suero problema SP:15 L diluido a partir de 1/16 (en solucin diluyente).
8.6.3 8.6.4
Colocar la lmina en cmara hmeda e incubar a 37C por 30 minutos. Lavar las lminas con PBS por 3 veces consecutivas por 10 minutos cada una, la primera vez con ayuda de una pizeta, la segunda y tercera por inmersin en frasco cplin y en agitacin.
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8.6.5 8.6.6
Escurrir los bordes de la lmina con papel filtro y dejar secar a temperatura ambiente. Agregar 15 mL de anti-IgG humano marcado con fluorescena (titulado y diluido en solucin diluyente de conjugado) en cada rea circular e incubar a 37C por 30 minutos.Lavar y secar como en 8.6.4 y 8.6.5. Colocar gotas de glicerina bufferada y sobre ella una laminilla. Observar en microscopio de fluorescencia a 40X de aumento. LECTURA Revisar al microscopio de fluorescencia los sueros controles de referencia. En el suero de referencia positiva debe observarse toda la superficie del parsito de un color verde amarillento fluorescente (Figura N 26A) y en el suero control negativo se observar el parsito de color rojizo opaco (Figura N 26B).
8.6.7 8.6.8 8.7
Figura N 26A. Suero Positivo.
Figura N 26B. Suero Negativo.
8.8
RESULTADOS POSITIVO: Se detecta presencia de anticuerpos anti Toxoplasma gondii evidenciados por la fluorescencia del parsito (color verde amarillento) NEGATIVO: No se detecta presencia de anticuerpos anti Toxoplasma gondii evidenciado por ausencia de florescencia del parsito (color rojizo opaco).
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SECCIN 9
TCNICA DE HEMAGLUTINACION INDIRECTA (HAI) PARA EL DIAGNSTICO DE TOXOPLASMOSIS 9.1 FUNDAMENTO Esta tcnica emplea glbulos rojos de carnero tratados con cido tnico como soporte del antgeno de Toxoplasma gondii. Los glbulos rojos sensibilizados con el antgeno aglutinan formando una malla cuando se les enfrenta a un suero que contiene los anticuerpos correspondientes (Figura N 27). 9.2 9.2.1 9.2.2 9.2.3 9.2.4 9.2.5 9.3 9.3.1 9.3.2 9.3.3 9.3.4 9.3.5 9.3.6 9.3.7 9.3.8 9.3.9 9.3.10 9.3.11 9.3.12 9.3.13
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EQUIPOS E INSTRUMENTOS Balanza Potencimetro Refrigeradora Congeladora a 70C Reloj para control de tiempo MATERIALES Y REACTIVOS Placas de microtitulacin con fondo U Micropipetas de 5 a 50 l Micropipeta multicanal de 5 a 50 l Puntas para micropipetas 10 200 l Solucin Alsever (Anexo G) Sangre de carnero Suero fisiolgico (Anexo G) Buffer fosfato salino pH 7,2 (ver Anexo G) Buffer fosfato salino pH 6,4 (ver Anexo G) cido tnico (Anexo G) Solucin diluyente (Anexo G) Suero control Positivo a Toxoplasma gondii Suero control Negativo a Toxoplasma gondii
HAI
Figura N 27. Prueba de Hemaglutinacin Indirecta.
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9.4
MUESTRA Suero problema inactivado a 56C en bao mara por 30 minutos.
9.5
ANTGENOS Es un extracto antignico de Toxoplasma gondii preparados a partir de parsitos cultivados en exudado peritoneal de ratones.
9.6 9.6.1 9.6.1.1
PROCEDIMIENTO Suspensin de hemates Obtener sangre estril de carnero mediante puncin de la vena yugular en un recipiente tambin estril conteniendo igual volumen de Alsever. Lavar los glbulos rojos por 3 veces con suero fisiolgico, centrifugando a 3000 r.p.m. durante 10 minutos. Preparar una suspensin de glbulos rojos al 2,8% en buffer fosfato pH 7,2. Ejemplo: Para preparar 5mL de suspensin de glbulos rojos, tomar 0,14 mL del sedimento de glbulos rojos y resuspenderlo en 4,86 mL de buffer fosfato, pH 7,2.
9.6.1.2
9.6.1.3
9.6.2 9.6.2.1 9.6.2.2 9.6.2.3 9.6.2.4 9.6.3 9.6.3.1
Adsorcin de anticuerpos heterfilos A 0,2 mL de suspensin de glbulos rojos, adicionar 0,2 mL de suero problema. Incubar a 37C por 30 minutos (bao mara). Mantener a 4C por 2 horas. Centrifugar a 2 000 r.p.m. por 10 minutos. Separa los sueros adsorbidos de los glbulos rojos. Tanizacin de los glbulos rojos Mezclar 5 mL de glbulos rojos con 5 mL de una solucin de Acido Tnico 1/20,000 e incubar a 37C por 10 minutos. Centrifugar a 2 000 r.p m. por 7 minutos. Decantar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 10 mL de buffer fosfato pH 7,2. Centrifugar a 2 000 r.p.m. por 7 minutos.
9.6.3.2 9.6.3.3 9.6.3.4 9.6.3.5

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9.6.3.6 9.6.3.7 9.6.4 9.6.4.1 9.6.4.2 9.6.4.3 9.6.4.4 9.6.4.5 9.6.4.6 9.6.4.7 9.6.4.8 9.6.4.9 9.6.4.10 9.6.5 9.6.5.1 9.6.5.2 9.6.5.3 9.6.5.4
Descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en 5 mL de solucin salina. Sensibilizacin de los glbulos rojos tanizados con antgeno de T. gondii Tubo N1: colocar 5 mL de antgeno ( diluido 1/20 en buffer fosfato pH 6,4) Adicionar 5 mL de suspensin de glbulos rojos tanados Tubo N2 (control): colocar 5 mL de buffer pH 6,4 Incubar los tubos en Bao Mara a 37C durante 20 minutos Centrifugar a 2 000 r.p.m. por 10 minutos Eliminar el sobrenadante Lavar el sedimento con 10 mL de solucin diluyente Centrifugar a 2 000 r.p.m. Descartar el sobrenadante Resuspender el sedimento en 5 mL de solucin diluyente Hemaglutinacin Rotular una placa de microtitulacin para realizar diluciones de los sueros, incluyendo los sueros controles positivo y negativo. Iniciar en la dilucin 1/16 hasta1/2048. Colocar en los pozos de la fila A 75 L de la solucin diluyente (Anexo G) y 50 L de la misma solucin en los pozos de las filas B,C,D,E,F,G,H. Agregar a cada pozo de la fila A, 25 L del suero a evaluar, homogenizar aspirando y expeliendo varias veces con la pipeta. Luego realizar diluciones sucesivas. Con la ayuda de una micropipeta multicanal tomar 50 L de la dilucin 1/16 de cada suero a evaluar y verterlo en los pozos de la fila siguiente, homogenizar y repetir igual con la siguiente fila, teniendo cuidado de descartar las puntas. Agregar 50 Lde la solucin de glbulos rojos sensibilizados con antgeno de T. gondii en cada pocillo. Agitar con suaves golpes en los bordes de la placa. Dejar la placa en reposo sobre una superficie plana. Realizar la lectura a la hora y a las 24 horas.
9.6.5.5 9.6.5.6 9.6.5.7 9.6.5.8

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9.7
LECTURA (Figura N 28) La reactividad del suero (positivo), se manifiesta por la formacin de una malla homognea de bordes irregulares que cubren al 50-100% del fondo del pocillo, en tanto, la falta de reactividad (negativo) se manifiesta por la sedimentacin de glbulos rojos en forma de botn en el fondo del pocillo. Se considera positiva la muestra a partir de la dilucin 1/32 y se informa con el ttulo de la ltima dilucin positiva.
9.8
RESULTADOS POSITIVO: Cuando se detecta la presencia de anticuerpos contra Toxoplasma gondii. Ttulo segn lectura. NEGATIVO: Ausencia de anticuerpos contra Toxoplasma gondii.
MUESTRAS
S1 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 S2 S3 S4 S5 S6 S7 C+ C-
REACTIVO (positivo) NO REACTIVO (negativo)

Figura N 28. Placa de Reaccin de Hemaglutinacin Indirecta
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BIBLIOGRAFA
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ANEXO A ZOONOSIS PARASITARIAS Las zoonosis parasitarias ms importantes en el pas son: Hidatidosis, Cisticercosis, Toxoplasmosis y Fasciolosis. HIDATIDOSIS Es una infeccin parasitaria del hombre y de algunas especies de animales, que tiene como agente etiolgico la larva (hidtide) de cstode del gnero Echinococcus (RUDOLPHI, 1801). Cuatro especies del gnero Echinococcus pueden infectar al hombre: E. granulosus, E. multilocularis, E. oligarthrus, E. vogeli. De stas, E. granulosus, es la especie de mayor importancia desde el punto de vista de salud pblica y de produccin animal. Ciclo de transmisin del E. granulosus (Figura A1) El E. granulosus tiene dos hospederos: el definitivo y el intermediario. El hospedero definitivo es el perro, en cuyo intestino se encuentra la forma adulta. Los hospederos intermediarios son mamferos hervboros, incluyendo al hombre en quienes se encuentra la forma larvaria. En el hospedero definitivo, el adulto se encuentra fijo a las vellosidades de la mucosa del intestino delgado. Las progltidas grvidas, conteniendo varias centenas de huevos, son eliminadas con las heces del animal a medida que se desprenden del estrbilo y contaminan el suelo, los vegetales y el agua. Los huevos conteniendo la oncsfera (o embrin hexacanto), son ingeridos por los hospederos intermediarios a travs de la vegetacin, a partir del suelo contaminado o el agua de bebida. Cuando la oncsfera es liberada en el intestino delgado de este hospedero, atravieza la mucosa intestinal y penetra en los vasos sanguneos y linfticos, a travs de las cuales llega al hgado, de all a los pulmones y otros rganos donde va ha desarrollarse la hidtide o larva. En el hgado o en los pulmones, rganos donde preferentemente se localizan los embriones, la gran mayora es destruda por la respuesta inmune del hospedero. Aquellos que sobreviven evolucionan a una hidtide. Si las vsceras del hospedero intermediario, conteniendo las larvas o hidtides, son dadas al perro, los esclices se desarrollarn en su intestino dando origen a la forma adulta de E. granulosus. El hombre es un hospedero intermediario accidental y no cumple ningn papel en el ciclo evolutivo, sin embargo, es el principal responsable en perpetuar la infeccin, ya que alimenta a los perros por costumbre o por necesidad, con vsceras portadoras de quistes. Patogenia En la mayora de los casos de infeccin humana, el desarrollo del quiste hidatdico es asintomtico. La infeccin por los huevos de E. granulosus, generalmente se da en la infancia y la sintomatologa slo se manifiesta tardamente, esto es, en la edad adulta, cuando el quiste hidatdico ha alcanzado un mayor tamao. Las manifestaciones clnicas de la hidatidosis se relacionan con el estado fsico del quiste e integridad de sus membranas, as como de su localizacin y tamao. Generalmente el crecimiento del quiste, puede manifestarse sobre la forma de masas palpables, deformacin de rganos, adems de alteraciones funcionales. En casos de localizacin pulmonar los signos y sntomas frecuentemente incluyen tos, dolor torxico, hemoptisis o dsnea. Cuando la localizacin es heptica o abdominal puede haber dolor, masas palpables, ictericia, hepatomegalia y/o esplenomegalia. Los casos de localizacin sea producen destruccin de trabculas, necrosis y fractura espontnea. Cuando la localizacin es en rganos vitales, como sistema nervioso central, corazn y riones, el pronstico es grave.
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Figura N A1. CICLO DE TRANSMISIN DE Echinococcus granulosus: 1. Hospedero definitivo del parsito (perro); 1a. Verme adulto; 1b. Progltida grvida; 1c. Huevos en el medio ambiente; 2. Desarrollo del quiste en el hospedero intermediario (ovino); 2a. Quiste hidatdico; 2b. Protoesclisis invaginado; 2c. Protoesclisis evaginado. 3. Hospedero intermediario accidental (hombre). Fuente: GOMES DE MORAES et al. 1971, modificado.
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Diagnstico laboratorial La hidatidosis es una infeccin parasitaria humana, cuyo diagnstico de laboratorio es principalmente inmunoserolgico. Sin embargo son utilizados exmenes microscpicos dirigidos a la bsqueda de esclex en orina, esclices y/o fragmentos de membrana en la expectoracin brnquica y lquidos pleurales y abdominales extrados por puncin del quiste. Siendo importante resaltar la contraindicacin de la puncin del quiste, por el riesgo de diseminacin hidatdica, de consecuencias imprevisibles y choque anafilctico con riesgo de vida para el paciente. El diagnstico serolgico de la hidatidosis se basa en la deteccin de anticuerpos circulantes o clulas sensibilizadas contra los antgenos del quiste hidatdico. Los mtodos ms utilizados para el diagnstico son: Doble Difusin Arco 5 (DD5) considerado de REFERENCIA, en las reas endmicas de los pases de Amrica del Sur y el INMUNOBLOT o WESTERN BLOTTING que muestra alta sensibilidad y especificidad. CISTICERCOSIS Es una zoonosis parasitaria producida por la larva (cisticerco) de la Taenia solium. Tanto el cerdo como el hombre la adquieren al ingerir alimentos contaminados con huevos de la tenia. Ciclo de transmisin de la Taenia solium (Figura N A2) El hombre es el nico hospedero definitivo por contener la tenia adulta; y el cerdo, el hospedero intermediario ms conocido y que contiene la larva. El hombre puede ser hospedero intermediario accidental. El parsito adulto habita en el tubo digestivo del ser humano, donde se mantiene firmemente adherido a la pared intestinal, mediante sus ventosas y ganchos. Las progltidas grvidas se separan del extremo distal de la tenia y son expulsados con las heces. Cada progltida contiene miles de huevecillos que se liberan en el ambiente y que pueden permanecer viables durante largo tiempo. En lugares donde la eliminacin de excretas es inadecuada, los cerdos se alimentan con heces humanas e ingieren los huevos de T. solium. Una vez ingeridos por el cerdo, las oncsferas (embriones hexacantos) atraviezan la pared intestinal y entran al flujo sanguneo, desde donde son transportados a los tejidos del animal, principalmente msculos estriados y cerebro. En dichos tejidos, las oncsferas evolucionan y se transforman en larvas (cisticerco). Cuando el hombre ingiere carne de cerdo mal cocida y contaminada con cisticerco, las larvas se evaginan en el intestino delgado, el escolex se adhiere a la pared intestinal, y el cuerpo del parsito comienza a crecer y a formar progltides. Por otra parte, el hombre puede tambien convertirse en huesped intermediario de la T. solium al ingerir sus huevecillos; bajo estas circunstancias se desarrolla la cisticercosis humana. Patogenia El periodo entre la infeccin inicial y la aparicin de los sntomas es muy variable; ste puede ser de algunos meses o de varios aos. La expresin clnica de la cisticercosis es polimrfica; la enfermedad puede ser desde asintomtica hasta incapacitante y, en ocasiones, mortal; y el cuadro clnico depende de si la cisticercosis es subcutnea, muscular u ocular. Cuando afecta al Sistema Nervioso Central las manifestaciones dependen del nmero, localizacin y estado evolutivo del parsito; las ms comunes son cuadros convulsivos confundido como epilepsias de inicio tardo, parlisis de pares craneales, hemiplejia, alteraciones visuales, cefalea, entre otros.
Figura N A2. CICLO DE TRANSMISIN DE Taenia solium: A: EL SER HUMANO ES EL NICO HOSPEDERO DEFINITIVO, B: EL CERDO ES EL HOSPEDERO INTERMEDIARIO HABITUAL Fuente: OMS-OPS 1993
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Diagnstico laboratorial Existen varias pruebas destinadas a la deteccin de anticuerpos anticisticerco en suero y LCR, entre las que destacan, el ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA) y el Inmunoblot. TOXOPLASMOSIS La toxoplasmosis causada por Toxoplasma gondii, esporozoario intracelular obligado del grupo Apicomplexa, es una zoonosis parasitaria mundialmente extendida. Se calcula que 50% de la poblacin mundial est parasitada por T. gondii, siendo mucho menor la proporcin de enfermos por el parsito. Ciclo de transmisin del Toxoplasma gondii (Figura N A3) El hospedero definitivo es el gato y otros felinos en los cuales se desarrolla el ciclo sexual, y los hospederos intermediarios son una variedad de animales vertebrados domsticos y silvestres, e incluye accidentalmente al hombre, en quienes se desarrolla el ciclo asexual. Ciclo sexual Ocurre en la capa epitelial de la mucosa del intestino delgado del gato. Este se infecta al ingerir vsceras de animales, principalmente ratones, que tienen quistes tisulares conteniendo los trofozoitos del parsito. Los trofozoitos al ser liberados de los quistes por los jugos digestivos del estmago e intestinos invaden las clulas del epitelio donde se multiplican por dos mecanismos, la divisin binaria y la endodiogenia, dando lugar a nuevos trofozoitos que invadirn a otras clulas; luego de varios ciclos de reproduccin, algunos trofozoitos se diferencian en gametocitos masculinos y femeninos que fecundan en la luz intestinal dando lugar a huevos o zigotes, que se rodean de una membrana qustica que se llaman ooquistes, los que al inicio contiene un esporoblasto (ooquiste inmaduro). Este esporoblasto se divide y se rodea de una membrana qustica esporoquistes, y en cada esporoquiste se desarrollan 4 esporozoitos (ooquiste maduro). Son estos ooquistes los que se eliminan con las heces del gato y constituyen las formas infectantes para el hombre y otros animales domsticos. Ciclo asexual ste se desarrolla, en parte, en las clulas epiteliales de la mucosa intestinal del gato, como se ha mencionado arriba, y en especial en los tejidos de gran variedad de animales, incluyendo al hombre. El hombre y los animales pueden infectarse al ingerir ooquistes maduros , que se encuentran en las heces del gato, o al ingerir vsceras que contienen tejidos con quistes de T. gondii. Los jugos digestivos digieren las cubiertas de los quistes y/o ooquistes dejando libres los trofozoitos, los que penetran la mucosa intestinal para alcanzar la circulacin general y localizarse en los tejidos, con preferencia de algunos rganos como ganglios, retina ocular, cerebro, msculo etc. Los trofozoitos se introducen en las clulas de los tejidos respectivos donde comienzan a reproducirse por divisin binaria ( formas intracelulares) o con el transcurso del tiempo se va desarrollando, alredeor de los trofozotos , una membrana qustica que permite la reproduccin y el desarrollo de los trofozotos en su interior, en forma lenta, bradizotos o rpida taquizotos, segn el estado inmunitario del hospedero.
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Figura N A3. CICLO DE TRANSMISIN DE Toxoplasma gondii Fuente: LEGUIA,G. Y CASAS, E. 1999
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Patogenia El T. gondii es un parsito intracelular que puede invadir cualquier rgano, sin embargo, las localizaciones que suelen dar sintomatologa con mayor frecuencia son: ganglios, ojos y cerebro. La localizacin ganglionar se caracteriza por agrandamiento de estos, siendo frecuente el compromiso de los ganglios del cuello. Tpicamente hay poca sintomatologa general, debiendo hacerse el diagnstico diferencial con tumores como los linfomas. La localizacin ocular se caracteriza por inflamacin de los tejidos intraoculares, principalmente retina, coroides, uvea, etc. La corioretinitis es la lesin ms frecuente. La localizacin cerebral puede ser una inflamacin difusa o localizada que ha cobrado importancia en los ltimos tiempos, por ser una complicacin de los pacientes VIH positivos, siendo un parsito oportunista del SIDA. La transmisin congnita es una posibilidad poco frecuente, y cuando ocurre, dependiendo del momento de la gestacin en que haya pasado el parsito, puede presentarse abortos espontneos, y observarse desde recin nacidos asintomticos, hasta cuadros de hidrocefalia, corioretinitis y calcificaciones cerebrales. Diagnstico Laboratorial El diagnstico parasitolgico indirecto, mediante la demostracin de anticuerpos o antgeno circulante, constituye el mtodo ms adecuado para la confirmacin diagnstica. Las pruebas serolgicas (Hemaglutinacin Indirecta HAI, Inmunofluorescencia Indirecta IFI e inmunoensayo ELISA) son las ms usadas y tienen alta sensibilidad y especificidad, pero la interpretacin de sus resultados debe hacerse en forma cuidadosa, en relacin con la evaluacin clnica del paciente. FASCIOLOSIS Esta parasitosis llamada tambien distomatosis heptica, es una zoonosis producida por Fasciola hepatica, comn en animales hervvoros y ocasionalmente en el hombre. Ciclo de transmisin de la Fasciola heptica (Figura N A4) Los parsitos adultos se localizan en los conductos biliares de los animales y el hombre, en tanto los huevos salen al intestino con la bilis y son eliminados con las materias fecales . Para embrionar es indispensables que caigan en agua dulce , en la cual dan origen a la primera forma larvaria que sale a travs del oprculo, el miracidio ciliado, que nada libremente en el agua e invade un caracol del gnero Lymnaea en el cual se reproduce y forma esporoquiste, redias y cercarias , esta ltima tiene el cuerpo redondeado y cola no bifurcada, las cercarias abandonan el caracol, nadan en el agua para buscar plantas a las que se adhieren y se transforman en metacercarias de aproximadamente 0.5 mm, redondeada y cubierta de una membrana gruesa. Estas metacercarias se encuentran dentro del tejido vegetal, de modo que no son eliminados con el lavado de las plantas parasitadas, adems que tambin pueden enquistarse en la superficie del agua, encerrando pequeas burbujas de aire, que les permite mantenerse flotando. Los hospederos definitivos se infectan al ingerir estas plantas contaminadas de las cuales los berros y hortalizas de tallo corto comestibles son las principales fuentes de infeccin humana. En el intestino delgado se libera el parsito inmaduro, que atraviesa la pared intestinal , el peritoneo y la cpsula heptica, para luego buscar los canales biliares en donde se desarrolla a adulto en 3 a 4 meses. El parsito adulto puede vivir en los canales biliares por varios aos.
Figura N A4. CICLO DE TRANSMISIN DE Fasciola heptica: A.Huevo embrionado, A 1. Miracidio B. Esporocisto, C. Redias, D. Cercaria, E. Metacercaria (forma infectante), F. Forma juvenil, G. Forma adulta del parsito. Fuente: COLIN JOHNSTONE, 1999.
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Patogenia En la fasciolosis se distinguen tres presentaciones clnicas: La forma aguda o invasiva que corresponde a la migracin de las fasciolas jvenes a travs del parnquima heptico produciendo lesiones traumticas y necrticas que se traducen clnicamente por hepatomegalia dolorosa, fiebre y eosinofilia alta que puede orientar el diagnstico. La forma crnica que corresponde a la localizacin del parsito adulto en los conductos biliares. La Fasciola adulta produce alteraciones inflamatorias, en las mucosas y una reaccin fibrtica pericanalicular, responsables de los cuadros clnicos de colangitis, colecistitis y colelitiasis. La foma extraheptica que ocurre durante la migracin de las larvas en la cavidad peritoneal, pudiendo producir localizaciones aberrantes en diferentes partes del organismo y cuya sintomatologa vara segn el rgano afectado. Diagnstico laboratorial El modo ms frecuente de establecer el diagnstico etiolgico es el hallazgo de los huevos del parsito en la bilis contenido duodenal o materias fecales. Sin embargo, durante la fase aguda de la fasciolosis humana no es posible efectuar el diagnstico parasitolgico, ya que no hay eliminacin de huevos. Las pruebas inmunolgicas son tiles en esta fase de la infeccin, siendo las reacciones serolgicas ms utilizadas la tcnica de doble difusin del Arco 2, ELISA e inmunoblot.
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ANEXO B
MATERIALES PARA OBTENCIN DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA Segn el procedimiento que emplee: Tubos vacutainer estriles. Jeringa descartable de 5 mL.
Agujas descartables 20 x 1G. Ligaduras de 2,5 mm de dimetro. Algodn Alcohol yodado Depsito de metal (tarros) para descartar las agujas. Frasco de vidrio de boca ancha (para colocar solucin de leja, para jeringas. Leja al 3-5%. Gradillas Mascarillas (opcional) Guantes Cuaderno de registro
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ANEXO C
PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT C.1 C.1.1 PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT Buffer Tris/HCl 0,05M, pH 8,0 Tris NaCl Agua desionizada q.s.p Ajustar pH 8,0 con HCl concentrado. C.1.2 Solucin de tratamiento de muestra Tris/HCl 2 Mercapto-Etanol Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) C.1.3 Solucin colorante marcador de corrida Azul de bromofenol 0,05 g Glicerol 8,00 mL Tris/HCl 0,5 M pH 8,0 1,00 mL Agua deionizada 1,00 mL Diluir la muestra V/V con la solucin de tratamiento y hervirlo por 10 minutos. Adicionar solucin marcador de corrida 3 ml por cada 100 ml de la muestra. C.1.4 Solucin stock de poliacrilamida Acrilamida N N bis-acrilamida Agua deionizada q.s.p 14,60 g 0,40 g 50,00 mL 0,95 mL 0,05 mL 0,02 g 0,60 g 0,60 g 100,00 mL
Pesar los reactivos en tubo de plstico. Colocar el tubo en agua caliente para ayudar a disolver, luego esperar hasta que se enfrie y completar el volumen. Conservar a 4C. C.1.5 Buffer de gel de enpaquetamiento 0,5 M, pH 6,8 Tris 0,5 M Agua deionizada
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6,00 g 100,00 mL
C.1.6
Buffer de gel de separacin o de corrida 1,5 M pH 8,8 Tris 1,5 M Agua deionizada 18,15 g 100,00 mL
C.1.7
Solucin de persulfato de amonio (APS) al 10% Persulfato de amonio Agua deionizada Alicuotar y conservar a 20C 10,00 g 100,00 mL
C.1.8
Solucin de Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% SDS Agua deionizada Conservar a 4OC o a temperatura ambiente 10,0 g 100,0 mL
C.1.9
Buffer de corrida (superior/inferior) Tris 0,05 M Glicina 0,192 M SDS a 10% Agua deionizada 30,0 g 14,4 g 10,0 mL 1000,0 mL
Tabla C1. Frmula de concentracin de gel de empaquetamiento y de separacin o de corrida al 12% y 15%
Solucin Empaquetamiento 40% Solucin Stock poliacrilamida Buffer de gel inferior o de separacin Buffer de gel superior o de enpaquetamiento SDS 10% Agua desionizada Persulfato de amonio APS al 10% Temed 1,33 mL 2,5 mL 100 L 6,1 mL 50 L 5 L
Gel Separacin 12% 4,8 mL 3,6 mL 120 L 3,6 mL 60 L 4 L 15% 6 mL 4,5 mL 120 L 1,5 mL 60 L 4 L
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C.2 C.2.1
PREPARACIN DE BUFFER PARA LA TRANSFERENCIA Buffer de transferencia Tris (0,5 M) Metanol Agua deionizada Ajustar pH 9,18 con HCl concentrado 102,8 g 400,0 mL 2000,0 mL
C.3 C.3.1
PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA REACCIN IMUNOENZIMATICA Buffer fosfato salino 0,01M, pH 7,2 (PBS) A.- NaH2P04.H2O NaCl Agua deionizada q.s.p B.- Na2HPO4.7H2O NaCl Agua deionizada 37,00g 8,76 g 1000,00 mL 2,68 g 8,76 g 1000,00 mL
Adicionar la solucin A sobre la solucin B hasta alcanzar el pH 7,2 C.3.2 Buffer de lavado Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,3% C.3.3 Buffer de bloqueo y diluyente Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,3% + Leche descremada al 5% C.3.4 Solucin reveladora Buffer Fosfato Salino 3,3' diaminobenzidina tetracloridrato Perxido de hidrgeno 10,0 mL 5 mg 10 mL
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ANEXO D
PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA DOBLE DIFUSIN D.1 SOLUCIN SALINA TAMPONADA (SST) 0,1M, pH 7,4 Solucin Fisiolgica (NaCl 0.85 %) Fosfato de Potasio dibsico (K2HPO4) Ajustar pH 7,4 con solucin KH2PO4 0,1 M D.2 GEL DE AGAR NOBLE Solucin salina tamponada Agar Noble Mertiolate 100,00 mL 1,20 g 0,01 g 900,00 mL 100,00 mL
Consevar el gel a 4C D.3 SOLUCION COLORANTE Amido Schwarz (Negro Amido) Acido actico Glacial Agua destilada c.s.p. 0,10 g 20,00 mL 1000,00 mL
Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo perfectamente cerrado. D.4 SOLUCION DECOLORANTE Alcohol etlico de 95 Acido actico glacial Agua destilada c.s.p. 400,00 mL 100,00 mL 1000,00 mL
Conservar a temperatura ambiente en frasco perfectamente cerrado.
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ANEXO E
PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA ELISA E.1. TRIS-HCl 0,01M, pH 7,5 Trisma-HCl anhidro Trisma base anhidro Agua destilada q.s.p. E.2 BUFFER FOSFATO SALINO 0,01M, pH 7,2 (PBS) A.- NaH2P04.H2O NaCl Agua deionizada q.s.p B.- Na2HPO4.7H2O NaCl Agua deionizada 1,37 g 8,76 g 1000,00 mL 2,68 g 8,76 g 1000,00 mL 0,12 g 0,02 g 100,00 mL
Adicionar la solucin A sobre la solucin B hasta alcanzar el pH 7,2 E.3 BUFFER DE LAVADO Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,05% E.4 BUFFER DE BLOQUEO Y DILUYENTE Buffer Fosfato Salino +Tween 20 al 0,05% + Seroalbmina bovina al 1% E.5 SOLUCIN ESTABILIZADORA PARA EL SUSTRASTO cido Ctrico Na2HPO4 anhidro Agua destilada q.s.p. 3,00 g 10,70 g 100,00 mL
Ajustar el pH a 5. Antes de su uso, completar a 8 mL de las solucin estabilizadora del sustrato hasta 25 mL con agua destilada. E.6 SOLUCIN DEL SUSTRATO Solucin estabilizadora para el sustrato Orto- phenilendiamine Perxido de hidrgeno al 30% E.7 cido Sulfrico 2,5 M cido Sulfrico Agua destilada 1,4 mL 8,6 mL 25,0 mL 10,0 mg 10 mL
MPR-CNSP-006
55
ANEXO F
PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA IFI F.1 BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) pH 7,2, 0,01M Na2HPO4 NaH2PO4 NaCl Agua destilada c.s.p. F.2 1,42 g 1,20 g 8,2 g 1000,00 mL
BUFFER FOSFATO DILUYENTE (PBS+Tween 80 al 1%) PBS Tween 80 99,0 mL 1,0 mL
F.3
SOLUCIN DE AZUL DE EVANS (SOLUCION STOCK) Azul de Evans PBS + Tween 80 Conservar en refrigeracin a 4C Preparar la solucin de trabajo antes de usarla Solucin stock PBS Tween 80 1,0 parte 9,0 partes 10,0 mg 100,0 mL
F.4
BUFFER CARBONATO BICARBONATO 0,5M pH 9,5 Solucin A Na2HCO3 Anhidro Agua destilada cs.p. Solucin B NaHCO3 Anhidro Agua destilada cs.p Agregar la Solucin A sobre la solucin B, hasta pH 9,5 5,3 g 100,0 mL 4,2 g 100,0 mL
F.5
GLICERINA TAMPONADA Glicerina bidestilada Buffer Carbonato-Bicarbonato 0,5M, pH 9,5 9,0 mL 1,0 mL
MPR-CNSP-006
56
ANEXO G
PREPARACIN DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA HEMAGLUTINACION INDIRECTA G.1 SOLUCIN DE ALSEVER Glucosa anhidra Cloruro de Sodio Citrato de Sodio cido Citrico Agua destilada G.2 BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) 0,15 M Solucin 1 KH2PO4 Agua destilada Solucin 2 Na2HPO4 Agua destilada PBS pH 7,2 Solucin 1 Solucin 2 NaCl Agua destilada PBS pH 6,4 Solucin 1 Solucin 2 NaCl Agua destilada G.3 G.4 SOLUCIN DILUYENTE Suero humano negativo al 1% en PBS pH 7,2 CIDO TANICO SOLUCION STOCK cido Tnico Solucin salina Solucin de trabajo: 1/20000 cido Tnico Solucin stock Solucin salina 10,0 mL 1,0 mL 100,0 mL 20,0 mL 2,04 g 100,00 mL 2,13 g 100,00 mL 7,0 mL 18,0 mL 2,1 g 250,0 mL 18,4 mL 6,7 mL 2,1 g 250,0 mL 18,66 g 4,18 g 8,0 g 0,55 g 1000,00 mL
MPR-CNSP-006
57
ARTES Y DISEOS LASER S.R.Ltda. Teodoro Crdenas 124 - B Santa Beatriz Lima 01 - Per Telf.: 470-6172 Telefax: 472-4525
Abril 2002 Tiraje: 3,000 ejemplares
MPR-CNSP-006
58

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Manual de procedimientos para el diagnstico serolgico de las zoonosis parasitarias

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO DE LAS ZOONOSIS PARASITARIAS

Instituto Nacional de Salud

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Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

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1.5 1.5.1 1.5.2 1.5.3 1.5.4

1.5.11 1.5.12 1.5.13

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1.5.30 1.5.31 1.5.32 1.5.33 1.5.34

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1.5.39 1.5.40 1.5.41

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2.1.4. 2.1.4.1. 2.1.4.2.

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Figura N 1. Posicin del paciente para la obtencin de la muestra srica.

Figura N 2. Zona de venopuncin (pliegue anterior del codo).

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Figura N 3. Ligadura del brazo.

3.7 3.8 3.9

Figura N 4. Asepsia de zona de venopuncin.

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Figura N 5. Introduccin de aguja de venopuncin.

Figura N 6. Retiro de aguja de venopuncin.

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3.17 3.18 3.19

Figura N 7. Codificacin de la muestra.

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4.2.2.3 4.2.2.4 4.2.2.5

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5.6 5.6.1 5.6.1.1

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Figura N 9. Equipo para electroforesis en gel de poliacrilamida y perfil protico de antgenos.

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5.6.3 5.6.3.1 5.6.3.2

Figura N 11. Placa de incubacin para la reaccin en las tiras de nitricelulosa.

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5.6.3.9 5.6.3.10 5.7

Figura N 12. Bandas de precipitacin Ag-Ac en el inmunoblot. Observar bandas de 21 a 31 kDa

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Figura N 13. Bandas de precipitacin Ag-Ac en el inmunoblot . Observar bandas de 13 a 35 kDa