sumario

Alergol Inmunol Clin 2001;16 (Extraordinario Nm. 2):137-157

Moderador: M. Fernndez Rivas Fundacin Hospital Alcorcn. Madrid

SESIN DE ACTUALIDAD ALIMENTOS TRANSGNICOS Y SU IMPLICACIN EN ALERGIA Alimentos transgnicos: por qu y cmo se desarrollan
INTRODUCCIN
La permanente necesidad de satisfacer la demanda de alimento, vestido y materias primas, ha sido la causa de que, desde la aparicin de la agricultura, la ganadera y la utilizacin de microorganismos en la produccin de alimentos (vino, cerveza, pan, yoghurt, queso) se cultivaran y seleccionaran los organismos vivos de mayor inters. El hombre buscaba en esa mejora biolgica obtener variedades que ofrecieran mayor rendimiento, calidad nutritiva, facilidad de cultivo y resistencia a agentes biticos y abiticos. La mejora biolgica actual hunde sus races en los experimentos realizados por Gregor Mendel en el siglo XIX, en los que concluy que los caracteres de los organismos vienen determinados por factores discretos heredables (genes). La seleccin de aquellas cepas de microorganismos (bacterias y levaduras) que mejor se adaptaban a los procesos de produccin y a los objetivos de calidad nutritiva y organolptica de los alimentos producidos, se ha mantenido de forma constante desde los albores de la civilizacin. Esta seleccin se comenz a realizar, y se realiz durante mucho tiempo, sobre mutantes naturales aparecidos de forma espontnea en la naturaleza, o sobre mutantes artificiales obtenidos con la ayuda de condiciones fsicas especiales o agentes qumicos que podan incrementar la tasa de mutacin y, por tanto, de aparicin de cepas con nuevos caracteres. El desarrollo de la microbiologa alcanzada en los siglos XIX y XX ha permitido el uso de tcnicas de mejora de microorganismos basadas en la biologa reproductiva y en la gentica de tales seres vivos, como la conjugacin o la transduccin vrica de genes (transferencia de genes entre especies a travs de un virus que es capaz de infectar a ambas). Con la llegada de la ingeniera gentica y de la biologa molecular en los ltimos 30 aos, otro tipo de estrategias y tcnicas estn siendo utilizadas para llevar a cabo la mejora gentica de las cepas. Un poco ms abajo veremos algunos ejemplos de este tipo, aplicados a las cepas utilizadas en la produccin de alimentos. El mtodo tradicional de produccin de cultivares mejorados se sustenta en el cruzamiento entre variedades, dentro de la misma especie o especies emparentadas y, por tanto, filogenticamente muy prximas. Los individuos sobresalientes, hbridos interespecficos o intergenricos, se seleccionan, y despus de
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BIAL-Arstegui. Departamento de I+D. Bilbao.

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numerosas tandas de cruzamiento y retrocruzamiento (introgresin), aunadas a laboriosas pruebas de campo, se obtiene una generacin portadora de la caracterstica deseada y a la que se reconoce como una nueva variedad. El principal factor limitante del proceso de produccin de hbridos vegetales reside en la incompatibilidad sexual entre especies seleccionadas como progenitoras. Si entre ellas media una gran divergencia gentica ser baja la probabilidad de obtener semillas viables de tal cruzamiento. En el caso de la mejora ganadera, los lmites de la produccin estable y heredable de nuevos caracteres mediante transferencia gnica natural, todava son ms estrechos, al estar restringidos a la reproduccin sexual entre individuos pertenecientes a variedades o razas de la misma especie. La ingeniera gentica permite el acceso y manipulacin directa de la informacin contenida en el ADN. Con esta tcnica se pueden, literalmente, cortar y sacar genes de su contexto gentico natural para llevarlos a otro sitio; pudindose incluso crear genes sintticos. Esta tcnica, tambin conocida como del ADN recombinante, rompe las barreras impuestas por la incompatibilidad sexual y nos deja introducir en plantas y animales genes, y por tanto caracteres o propiedades, provenientes no slo de otras especies vegetales y animales, muy alejadas desde el punto de vista de la evolucin, sino incluso genes de otros reinos biolgicos (hongos, virus o bacterias). En la mejora clsica, en cada cruzamiento, se obtiene una descendencia que combina miles de genes procedentes de los parentales, sin embargo, mediante ingeniera gentica se introducen slo uno o varios genes en cada transformacin. Los programas de fitomejoramiento actuales, apoyados en la ingeniera gentica, se proponen, igual que los de ayer, aumentar el rendimiento, diminuir las prdidas ocasionales por plagas y enfermedades y reducir los costos de produccin. Pero abrigan intereses ms ambiciosos en el mbito industrial, qumico y farmacutico. Esta visin de los caracteres y fenotipos de los seres vivos basada casi exclusivamente en los genes, olvidando la influencia del entorno y del contexto gentico, en el que se sitan (genoma del individuo) ha hecho que hoy en da gran parte de los investigadores que trabajan en mejora vegetal, as como la corriente financieramente ms importante de la agroeconoma, consideren la obtencin de plantas transgnicas (portadoras de un gen ajeno, forneo o heterlogo) como el medio ms verstil, preciso y de mayor potencialidad, para producir variedades vegetales mejoradas. Esta lnea de trabajo est siendo ampliamente criticada por algunos sectores del mundo de la biologa.
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ORGANISMO TRANSGNICO Y APLICACIONES. ANIMALES TRANSGNICOS

Un organismo transgnico u organismo genticamente modificado (OGM) es aquel ser vivo obtenido al introducir en una especie biolgica, de forma estable y heredable, un gen heterlogo mediante tcnicas de ADN recombinante. En cuanto a si el gen forneo debe ser de una especie diferente a la receptora o puede ser de la misma especie para que sea considerado organismo transgnico, se pueden encontrar todas las versiones, aqu pondremos el peso de la definicin en la tecnologa y metodologa de introduccin y no en el origen del gen. De este forma, en este texto, se consideran transgnicos a los organismos obtenidos con esta tecnologa, cualquiera que sea el origen del gen. Los mtodos utilizados para obtener los distintos organismos transgnicos sern especficos de cada tipo de ser vivo (bacterias, levaduras, plantas o animales), independientemente del fin buscado en la transgenia. La finalidad del proceso de transgenia la determinar el uso que se le d a la cualidad del carcter introducido con el gen, as habr transgenias con fines farmacuticos, medioambientales, fines de mejora agrcola (resistencia herbicidas, resistencia a plagas, tolerancia a condiciones estresantes de crecimiento) y todas ellas, dentro del mismo tipo de organismos, se obtendrn siguiendo un procedimiento o protocolo similar. Las potencialidades que esta nueva tecnologa tiene de modificar los organismos vivos se est aplicando o est en desarrollo su aplicacin, en muchos mbitos de las actividades del hombre distintas al campo de la alimentacin. Como ejemplo puede sealarse el uso de organismos modificados por ingeniera gentica en el campo del medio ambiente o de la empresa farmacutica. La biotecnologa medioambiental o biorremediacin es una tecnologa que pretende solucionar problemas medioambientales mediante el uso de organismos vivos. Algunos de estos organismos han sido obtenidos mediante tcnicas de ADN recombinante, as es el caso de ciertas variedades vegetales de la familia de las crucferas, que son utilizadas para absorber metales txicos a travs de sus races, sirviendo de descontaminadores de suelos. Se estn haciendo esfuerzos para producir, mediante ingeniera gentica, variedades vegetales que presenten unas composiciones y proporciones de polmeros de carbohidratos (almidn, celulosa, etc.) ptimas para, mediante fermentacin de los mismos con microorganismos genticamente modificados, obtener biocombustibles que permitan una produccin de energa ms limpia y sostenible. En el sector farmacutico se estn utilizando, desde hace tiempo, cultivos de levaduras y bacte-

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Fig. 1. A) Plsmido Ti natural B) Plsmidos usados en el sistema binario de transgnesis en plantas. LB: Extremo izquierdo left border. RB: Extremo derecho right border. ori: origen de replicacin del plsmido. genes tra: genes de transferencia. genes vir: genes de virulencia.

rias genticamente modificadas para la produccin de gran cantidad de frmacos, como por ejemplo la produccin de insulina y hormona de crecimiento humana en E. coli o la produccin de vacuna recombinante, basada en la protena de la cpside del virus de la hepatitis B, en la levadura Sacchaomyces cerevisiae. Sin embargo, la gran esperanza del futuro en este campo es convertir a los organismos superiores (plantas y animales) en fbricas productoras de frmacos, transformando las empresas farmacuticas en granjas (de ah el nombre de "Phrama" que se le ha dado). Algunos logros ya se han conseguido en este sentido, con la obtencin de plantas de tabaco en cuyas hojas se produce un anticuerpo monoclonal contra el agente de la caries dental (Streptococcus mutans); la obtencin por cientficos de Plant Genetic Systems de plantas transgnicas de colza que contiene el gen que codifica el neuropptido leuencefalina (consiguen de 10-200 g/hc cultivada, a partir de la semilla de colza); la obtencin por cientficos holandeses de la compaa Mogen International de plantas transgnicas que contienen el gen de la seroalbmina humana y producen 0,2 g/kg patata, o la obtencin de plantas que en sus hojas expresan la enzima humana glucocerebrosidasa (hGc), aconsejada para tratar la enfermedad cerebral de Goucher. En este punto hay que destacar la posible utilizacin de los alimentos vegetales como vehculos de vacunas (vacunas comestibles) que comentaremos al final de este texto. Animales transgnicos En este mismo campo, pero hablando del reino animal, se ha logrado obtener vacas, ovejas o cabras transgnicas que producen en la leche lactoferrina humana, factor IX antihemoflico humano, o activador tisular de plasmingeno humano respectivamente. De esta forma, una vez obtenido el animal transgnico adecuado (proceso hoy todava

complicado y de baja eficiencia), la produccin y obtencin del frmaco ser sencilla, barata y libre de los probables riesgos de infeccin asociados a los frmacos obtenidos por el mtodo convencional a partir de materia prima animal (como la sangre humana en el caso del factor IX de coagulacin humana). Y aqu es donde ponan el objetivo los padres cientficos de nuestra famosa oveja clnica "Dolly". El objetivo era una vez obtenido lo ms difcil, conseguir una oveja transgnica buena productora del frmaco en la leche, poder clonarla y llenar as el establo de nuestro casero de clones de la superproductora y crear un rebao clnico superproductor. Ya tenemos nuestra unidad de produccin de frmaco de forma cmoda y, sobre todo, lo ms importante, muy barata: a precio del pienso y el mantenimiento del ganado ovino. As apareci unos meses despus de conseguir la primera oveja clnica a partir de ncleos de clulas somticas diferenciadas, (la famosa oveja "Dolly" obtenida en febrero de 1997), la segunda famosa "Polly" (clnica y transgnica). Como vemos los intereses econmicos hacen funcionar la ciencia y la tecnologa a ritmos frenticos en nuestros das. Sin embargo, la utilizacin y comercializacin de animales transgnicos para la alimentacin, todava hoy no se ha producido. Por una parte, la mayor complicacin tcnica del proceso y de organizacin biolgica de los animales ha permitido, hasta la fecha, una muy baja eficiencia en el proceso, pero no debemos olvidar que, muy probablemente, los intentos con tal fin se hayan visto mermados debido a la alta polmica surgida, sobre todo en la sociedad europea, con la comercializacin de plantas transgnicas y, por tanto, de alimentos vegetales transgnicos. Asimismo hay que sealar las repercusiones ticas y sociales que la modificacin gentica de animales entraa. Hasta dnde haya podido llegar el desarrollo de variedades de animales con
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fines de alimentacin humana o animal, es algo que no es fcil de conocer, pues en el desarrollo de esta tecnologa hay mucha investigacin que no se publica, al estar protegida por altos intereses econmicos (mucho de esta investigacin se lleva a cabo en empresas privadas). (Cada noticia sobre ello, en un sentido u otro, hace tambalearse el valor de las acciones de las compaas biotecnolgicas, en un mercado de valores Nasdaq cada da ms voltil). De todas maneras es conocida la obtencin por cientficos de la Universidad de Pensilvania de cerdos transgnicos que portan mltiples copias del gen bovino que codifica la hormona del crecimiento. Estos animales ganan peso ms rpido que un cerdo normal, obteniendo un rendimiento mayor de su alimentacin y cumpliendo el objetivo que se buscaba al obtenerlos: mejora de crecimiento sin aumentar el consumo de pienso. Sorprendentemente (ste no era el objetivo buscado) presentan una caracterstica de gran inters nutritivo, hay una disminucin de la acumulacin de grasa subcutnea en el dorso del animal. En otras palabras, son cerdos con un menor contenido en grasa animal y, por tanto, ms adecuados para dietas bajas en colesterol. Pero, lamentablemente, estos cerdos transgnicos presentan graves problemas fsicos. Al nacer tienen peso inferior y manifiestan poco apetito y letargia, y al llegar a adultos, padecen de artritis, de poca fertilidad y de una alta incidencia de lceras. Todos estos trastornos pueden ser producidos por el exceso de hormonas en la sangre. La situacin es diferente en peces. Biotecnlogos de la Universidad de Maryland han descrito la creacin de carpas transgnicas que portan mltiples copias del gen de la hormona de crecimiento de la trucha y son un 20% ms grandes que las carpas normales. Estos animales no presentan ningn problema patolgico asociado a la sobreproduccin animal, y su carne posee las mismas caractersticas organolpticas que las carpas sin transformar. Recientemente cientficos de la Universidad de Singapore, el servicio pesquero norteamericano y la compaa canadiense Fisheries and Ocean han obtenido resultados similares trabajando con salmones. Como todava hoy en da no se contempla la obtencin de animales transgnicos con fines de alimentacin, sino ms bien para investigacin bsica (animales knock-out, modelos animales de enfermedades humanas), o para la empresa farmacutica, no vamos a explicar en este texto, de forma especfica, cmo se obtienen los animales transgnicos. Nos centraremos en ver cmo se preparan y para qu las levaduras y plantas transgnicas, que s se estn hoy da utilizando en el campo de la alimentacin humana. Slo decir que existen 4 formas bsicas de obtener animales transgnicos:
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a) Introduccin del gen forneo utilizando vectores derivados de retrovirus naturales que infecten "in vitro" las clulas del embrin en estado de mrula, y posterior implantacin del embrin transfectado en una hembra biolgicamente receptiva (nodriza). Como este mtodo, debido al origen de los vectores usados (virus de clulas eucariotas), puede dar problemas, y como existen otros mtodos alternativos, no se suele utilizar para obtener transgnicos con fines comerciales. b) Microinyeccin del gen forneo, en presentacin lineal, en el proncleo masculino (ncleo del espermatozoide) de un huevo fertilizado y posterior implantacin de los huevos transfectados en una hembra nodriza. (En los mamferos despus de que entra el espermatozoide al vulo, en la fertilizacin, tanto el ncleo del vulo como el del espermatozoide (proncleo masculino) permanecen separados. Slo despus de que el ncleo femenino ha completado la meiosis, y llega al estado de proncleo femenino, se produce la fusin de ncleos o cariogamia. c) Introduccin, por transfeccin, del gen forneo en clulas troncales totipotentes del blastocisto (embrioblastos, blastmeros) en cultivo, posterior introduccin de las clulas transfectadas en un blastocisto receptor y finalmente implantacin en el tero de una hembra nodriza. d) Introduccin, por transfeccin con liposomas, del gen heterlogo en clulas fetales (p.ej.fibroblastos) y posterior transferencia del ncleo de las clulas transfectadas a oocitos desnucleados (oocitos sin ncleo). (La introduccin de un ncleo al oocito desnucleado, es la tcnica que se utiliz para obtener a "Dolly").

OBTENCIN Y APLICACIN DE LEVADURAS TRANSGNICAS EN ALIMENTACIN

Obtencin de levaduras transgnicas Para estudiar cmo se utiliza la ingeniera gentica para obtener levaduras transgnicas, tomaremos el ejemplo de la levadura Saccharomyces cerevisiae, por ser ste el organismo ms estudiado entre las levaduras, y ser el que cuenta, actualmente, con ms posibilidades para ser modificado. Al trabajar con levaduras, tenemos la ventaja de que en su biologa se ha encontrado la existencia de plsmidos naturales, los cuales nos servirn para construir vectores plasmdicos, que utilizaremos en los procesos de incorporacin de nuevos genes en estos organismos (incorporando la nueva

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Tabla I. Mtodos para introducir ADN a clulas vegetales

MTODOS Transferencia mediante el plsmido Ti Biobalstica (Bombardeo con microproyectiles) Vectores vricos Transferencia directa del gen a protoplastos vegetales
(Electroporacin, Fusin con liposomas)

COMENTARIOS Mtodo excelente y de alta eficiencia que est indicado principalmente para plantas dicotiledneas. Usado con un amplio rango de plantas y tejidos. Sencillo y barato, pero ineficiente en obtener integraciones estables. Actualmente no es un mtodo efectivo de introducir ADN en plantas Slo es posible usarlo con aquellas plantas que se puedan regenerar a partir de protoplastos. Tiene una utilidad limitada ya que slo se puede inyectar una clula en cada experimento. Requiere la intervencin de personal altamente especializado.

Microinyeccin

actividad biolgica a la cepa). As, en el caso de Saccharomyces cerevisiae, se ha aislado un plsmido natural circular de 6,3 kb de 2m de circunferencia, que se conoce como el plsmido "crculo de 2 micrmetros" y que constituye la base para la construccin de distintos vectores de clonaje. En primer lugar, se elige uno de esos vectores y en l se clona y prepara "in vitro", mediante el uso de enzimas que actan sobre el ADN (enzimas de restriccin, fosfatasas, polimerasas, ligasas, etc.), la construccin adecuada a introducir en la levadura. Esta construccin debe estar organizada para que el gen forneo, que puede ser de organismos pertenecientes a otro reino biolgico, se exprese en Saccharomyces cerevisiae, por tanto, habr que rodear al gen del entorno gentico adecuado (secuencias promotoras de levaduras, secuencias terminadoras de levaduras, secuencias activadoras de levaduras, etc.). A continuacin se introduce el vector, mediante transformacin, al interior de la levadura. El proceso de transformacin se lleva a cabo al incubar las levaduras en presencia del vector, en un medio lquido que lleve sales de litio, tratamiento posterior con una solucin de PEG 4000 (polietilen-glicol), que favorece la penetracin del ADN, y un choque trmico para facilitar la entrada. Como el proceso de transformacin tiene una baja eficiencia, habr que seleccionar aquellas levaduras que hayan tomado el vector. Para ello se utiliza un gen marcador presente en el mismo, que permitir que slo se reproduzcan en un medio selectivo de incubacin (p.ej. medio sin leucina), aquellas levaduras que incorporaron el vector. As, por ejemplo, cuando el gen marcador es el gen LEU 2 (codifica la enzima -isopropilmalato deshidrogenasa que acta en la ruta metablica de sntesis de leucina) y la cepa utilizada es una cepa LEU 2 (auxotrofa para leucina), aquellas

levaduras que crezcan en un medio sin leucina indicar que han revertido su auxotrofa, gracias a la presencia del gen LEU 2 salvaje en su interior (presente en el vector). Se dice que una cepa es auxotrofa para una molcula cuando necesita sta para vivir pero no es capaz de sintetizarla, por lo tanto es imprescindible que la molcula est presente en el medio de crecimiento. En nuestro caso la cepa no puede sintetizar el aminocido leucina por presentar una mutacin en su gen LEU 2 y, por tanto, necesita que exista leucina en el medio de cultivo para crecer y reproducirse. De esta forma, el crecimiento en un medio sin leucina nos garantizar la presencia no slo de alelo LEU 2 salvaje, sino tambin del gen que nos interesaba introducir, por estar ambos genes en la misma construccin gentica (vector). Segn el tipo de vector utilizado en el proceso, el gen marcador y con l, el gen heterlogo a introducir, podrn llevar una vida autnoma, independiente del cromosoma de la levadura, o podrn insertarse en el cromosoma por un proceso de recombinacin homloga. Este proceso se produce a travs de las secuencias homlogas del alelo LEU 2 salvaje, presente en el vector, y del alelo LEU 2 mutado, presente en el cromosoma de la levadura. De esta forma el gen forneo, que permitir a la levadura realizar la actividad biolgica nueva que nos interesaba introducir en esta cepa, se podr localizar extracromosmicamente o en el interior del cromosoma prximo a la localizacin del loci del gen LEU 2. En aquellos casos en que el vector de clonaje lleve el segmento de ADN del plsmido 2m, que determina la replicacin autnoma del mismo, el vector podr subsistir extracromosmicamente, en caso contrario, se integrar en el cromosoma (vectores de integracin). Algunos vectores utilizados son quimeras mixtas, que llevan ADN de plsmidos bacterianos de E. coli y ADN de
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plsmido 2 m. Estos vectores, denominados vectores lanzadera (shuttle vectors), podrn, por tanto, ser biolgicamente viables y utilizados tanto en E. coli (organismo modelo y fcilmente utilizado en ingeniera gentica) como en Saccharomyces cerevisiae. En este caso la preparacin de la construccin gentica (la ingeniera gentica fina: clonaje del gen, colocacin de promotor adecuado, terminador adecuado, secuencias de regulacin, etc.) se realiza en E. coli y despus se introduce el vector, una vez preparado, en la cepa de Saccharomyces cerevisiae a transformar. Otros vectores pueden llevar en vez del origen de replicacin del plsmido 2 m, un fragmento de ADN que determine un origen de replicacin cromosmico de Saccharomyces cerevisiae (ARS: Autonomously replicating sequence). Estos vectores no son eficientemente segregados entre las clulas hijas en el proceso de la mitosis, pudindose perder en algunos casos sino se mantiene el medio selectivo. La estabilizacin de estos vectores ARS se puede lograr por la adicin de un centrmero o secuencia CEN (los centrmeros son secuencias de ADN del cromosoma que se necesitan para que se produzca una replicacin estable y una segregacin adecuada de los cromosomas en la mitosis y meiosis). Una variacin de los vectores CEN es el cromosoma artificial de levaduras (YAC: yeast artificial cromosome), en el que tras linearizar el vector se le aaden las secuencias de ADN de los extremos de los cromosomas de la levadura (los telmeros de esos cromosomas). La presencia de estas secuencias en el extremo de los YAC permite que se repliquen igual que si fuesen cromosomas propios de la levadura. Levaduras transgnicas y alimentacin A continuacin veremos slo algunos ejemplos de la posible utilizacin de levaduras transgnicas en alimentacin. La fabricacin de pan y cerveza se basa en el aprovechamiento industrial de la fermentacin alcohlica llevada a cabo por la levadura Sacharomyces cerevisiae a partir de los azcares produciendo etanol y carbnico. As, en el caso de la cerveza o el vino, la levadura transforma los azcares del mosto en alcohol, y en el pan produce el gas que hincha la masa primaria y produce la miga. Mejora gentica en la levadura panadera Cepa ms eficiente en la planificacin. Para producir pan basta con aadir a la harina de trigo o centeno proteasas, amilasas, y la levadura panadera. La levadura se inocula en la harina y la fermenta, produciendo gas carbnico que da el aspecto esponjoso al pan. En realidad es un proceso
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complejo, ya que en la harina hay varios azcares, como la sacarosa, la glucosa, la fructosa, y sobre todo la maltosa, la cual proviene de la degradacin del almidn presente en la harina. La levadura panadera consume primero la sacarosa y, despus, la glucosa y la fructosa, para, finalmente, asimilar la maltosa. Lo idneo sera que consumiera desde el principio la maltosa, ya que ste es el azcar mayoritario. En realidad, cuanto ms rpido consume una levadura panadera la maltosa antes se produce el pan. Para consumir la maltosa la levadura precisa dos enzimas: una maltosa permeasa que toma la maltosa de la harina y la introduce dentro de la clula, y una maltasa que la escinde. Cuando la levadura tiene un azcar ms sencillo del que alimentarse, como, por ejemplo, la glucosa, la sntesis de estas dos enzimas est reprimida. A nivel molecular, esa represin se ejerce en los promotores de los genes que codifican estas dos enzimas. Cuando al principio de la fermentacin panadera hay glucosa, los promotores de los genes que codifican la maltosa permeasa y la maltasa estn bloqueados y, como resultado, no hay produccin de estas enzimas. Cuando la glucosa se consume y bajan sus niveles, los promotores se desbloquean, se sintetizan las dos enzimas y comienza el consumo de maltosa. Los cientficos de la compaa holandesa Gist-Brocades construyeron una levadura panadera que consume la maltosa desde el principio de la fermentacin panaria. Para ello cambiaron los promotores de los genes que codifican la maltosa permeasa y la maltasa por otros promotores provenientes de genes que funcionaban con glucosa. Cambiaron las reglas del juego de la regulacin y construyeron una levadura panadera transgnica capaz de consumir maltosa desde el inicio del proceso industrial. El resultado es un aumento de la capacidad fermentativa y de la produccin de gas y, por lo tanto, una reduccin del tiempo de fermentacin. Esta levadura panadera recombinante, denominada levadura MAL, fue el primer fermento para alimentos que obtuvo el permiso de comercializacin en Europa, concretamente en el Reino Unido. Proceso de panificacin sin problemas de alergia ocupacional. Antes indicbamos que durante el proceso de planificacin, a la masa panadera se le aade la enzima amilasa con la intencin de favorecer la liberacin de maltosa. Evidentemente, es necesario hacerlo, porque la levadura panadera no produce esta enzima. Este aditivo se aade en forma de polvo que ataca las zonas hmedas de la piel y las mucosas de los profesionales del sector, produciendo irritaciones y procesos alrgicos. Es un problema de salud laboral frecuente, que puede dar lugar a bajas laborales permanentes. Recientemente, un grupo de biotecnlogos del Instituto de Agroqumica y Tecnologa de Alimentos (IATA)

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suelen contener impurezas y presentan una composicin variable entre los distintos lotes. La adicin exgena del enzima es, por lo tanto, una solucin relativa. Para llegar a una solucin final un equipo de cientficos finlandeses del Instituto VTT en Espoo y un equipo de biotecnlogos del IATA en Valencia, utilizando genes de una -glucanasa de Trichoderma reesei o Trichoderma longibrachiatum respectivamente, han diseado levaduras cerveceras capaces de secretar la -glucanasa al mosto, sin ninguna otra enzima contaminante. El resultado es perfecto: se produce una cerveza libre de -glucanos y con las mismas caractersticas organolpticas que las fabricadas con la levadura cervecera convencional. Produccin de cerveza "light". Los responsables del alto contenido calrico de la cerveza son una gran cantidad de dextrinas y almidn que estn presentes en el mosto original y no son asimilados por la levadura cervecera. Al no eliminarse durante la fermentacin permanecen en la cerveza aadiendo a sta una gran cantidad de caloras. La tendencia actual en la alimentacin es el consumo de productos con bajo contenido calrico, por lo que a los industriales cerveceros les interesa producir cervezas de esta caractersticas. Para ello aaden a los tanques de fermentacin una enzima denominada glucosamilasa, que rompe el almidn y las dextrinas, produciendo azcares ms sencillos, que son asimilados por la levadura cervecera. Como en el caso anterior, la adicin de este enzima conlleva impurezas, variabilidad, posibles alergias ocupacionales y, por supuesto, inversin econmica. Los biotecnlogos de la cervecera Bass, en el Reino Unido, han diseado una levadura cervecera transgnica que porta un gen proveniente de la levadura Saccharomyces diastaticus, que codifica una glucoamilasa. Mediante su uso, se produce una cerveza indistinguible de la original, pero con bajo contenido calrico. De forma similar, y en el mismo pas, los cientficos de la compaa BRL International han aadido al genoma de una levadura cervecera un gen proveniente de un hongo filamentoso que codifica una glucoamilasa. En este ltimo caso, ya se ha obtenido el permiso de comercializacin por parte de la autoridades inglesas.

Fig. 2. Representacin esquemtica de los mtodos ms utilizados para obtener plantas transgnicas.

del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas, en Valencia, ha construido una levadura panadera recombinante capaz de solventar este problema. Para ello han tomado un gen de Aspergillus oryzae que codifica una !-amilasa y lo han introducido en el genoma de una levadura panadera industrial. La nueva levadura es capaz de secretar directamente la enzima a la harina, produciendo un pan con excelentes caractersticas organolpticas. De esta forma, se obvia la adicin del enzima y, con ello, los problemas de salud laboral. Mejora gentica en la levadura cervecera La cerveza se produce por el crecimiento de la levadura sobre un mosto obtenido a partir de granos de cebada. Las compaas cerveceras se han distinguido por su grado de innovacin. De hecho, y en comparacin con otros procesos industriales de produccin de alimentos fermentados, hacer cerveza es un proceso muy controlado desde el punto de vista tecnolgico. Existen algunos aspectos oscuros que la nueva biotecnologa de alimentos se est encargando de resolver. Cepa que facilita la produccin. El mosto de cerveza contiene unos polmeros lineales de glucosa denominados -glucanos que provienen del grano de la cebada. Al final del proceso de fabricacin se debe llevar a cabo una filtracin industrial que, a menudo, se dificulta por problemas de colmatacin producidos por los -glucanos. Las prdidas econmicas que este proceso conlleva son numerosas. Se puede evitar aadiendo a los fermentadores una enzima denominada -glucanasas que rompe estos polmeros. Esta enzima se obtiene a partir de hongos filamentosos y se comercializa en forma de preparados que

OBTENCIN Y APLICACIN DE PLANTAS TRANSGNICAS

Obtencin de plantas transgnicas Los mtodos para producir plantas transgnicas estn sustentados en la naturaleza totipotente de las clulas somti143

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cas vegetales y en el desarrollo de tcnicas de regeneracin de plantas a partir de cultivos de tejidos, clulas y protoplastos. Cuando pequeos trozos de tejidos de plantas se colocan en medio slido de cultivo estril, las clulas proliferan formando un callo, si adems en el medio se encuentran presentes, en proporciones adecuadas, las hormonas vegetales auxina y citoquinina, se desarrollar un brote. ste se desarrolla a partir de clulas del callo que se dividen rpidamente. Asimismo, cuando a una clula vegetal se la aisla del tejido, se le puede inducir a que comience su divisin y a que todos sus genes se expresen en la correcta secuencia temporal para producir un organismo completo. Esta capacidad es a lo que se denomina totipotencia y es fundamental en los mtodos desarrollados para producir plantas transgnicas. En ciertas ocasiones, para determinadas especies vegetales, ser precisamente la falta de un mtodo de regeneracin de la planta entera a partir de una sola clula lo que limitar la posibilidad de obtener una planta transgnica. Los mtodos desarrollados para obtener una clula vegetal transformada se pueden dividir en 2 grupos principales: a) Mtodos de transferencia de ADN mediante vectores. Hablando de clulas vegetales, hasta la fecha, no se han podido obtener eficientes vectores vricos para transferirles genes. El nico mtodo a incluir en este grupo es el mtodo que primero y ms ampliamente se ha utilizado: mtodo basado en el uso de vectores plasmdicos derivados del plsmido Ti (inductor de tumores "tumor induction") de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. b) Mtodos de transferencia directa de ADN. Entre stos encontramos la biobalstica, la transformacin de protoplastos por mtodos qumicos y/o elctricos o fusin con liposomas, y la microinyeccin de ADN directamente a la clula. Transferencia de ADN basado en vectores derivados del plsmido Ti Biologa del Plsmido Ti. La bacteria Gram-negativa del suelo A. tumefaciens es un fitopatgeno oportunista que puede infectar ms de 330 gneros de plantas dicotiledneas. Cuando esta bacteria infecta a travs de una herida o incisin, generalmente en el tallo en un lugar prximo al suelo, tal infeccin distorsiona el proceso normal de reparacin de la herida. As, en vez de formar un callo que cubra la herida, las clulas de la zona proliferan hasta formar un tumor. Este tumor se origina como consecuencia de la transferencia de genes de la bacteria a la
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planta. Estos genes, algunos de los cuales sintetizan enzimas para la biosntesis de hormonas vegetales, quedarn establemente integrados en el cromosoma de la clula vegetal y, por tanto, heredadas por todas las clulas descendientes de sta. Esta transferencia de genes "transforma" la clula de la planta (esta clula est transformada en sentido doble, por una parte, en el argot del bilogo molecular, se dice transformada por haber integrado un gen nuevo en su cromosoma y, por otra, est biolgicamente transformada por haberse convertido en clula tumoral). Las clulas as transformadas sintetizan grandes cantidades de auxina y citoquinina, produciendo un crecimiento descontrolado que da lugar a la formacin de una agalla (tumor de la corona). Al igual que otras bacterias, A. tumefaciens lleva la mayor parte de sus genes en un cromosoma circular, pero algunas cepas tienen adems cierta dotacin gentica en un plsmido, llamado plsmido Ti o plsmido inductor de tumores. La transferencia de ADN ocurre slo despus de que la bacteria se ha aproximado por quimiotoxis a la zona de la herida y se ha adherido a la superficie de la clula vegetal. Parece ser que en la zona de la herida la planta libera al medio unos compuestos fenlicos que activan ciertos genes bacterianos presentes en el plsmido Ti (genes vir), los cuales sintetizarn las enzimas necesarias para cortar un fragmento de ADN del plsmido Ti (T-ADN "ADN que se transfiere") que ser transferido e integrado en el cromosoma de la clula vegetal. El T-ADN est flanqueado por 2 secuencias de ADN caractersticas: extremo derecho y extremo izquierdo, que son imprescindibles para que se produzca la transferencia del ADN que se encuentre comprendido entre ellas en el plsmido Ti, y estn constituidas por 2 secuencias repetidas imperfectas de 25 pares de bases. En este T-ADN se encuentran tanto los genes productores del tumor (antes comentados), como unos genes responsables de la sntesis de opinas. Las opinas son unas molculas particulares e inusuales que sintetizar, a partir de ahora, la clula vegetal transformada y sus descendientes, en el interior del tumor, para luego secretarlas. Se pueden utilizar como fuente de carbono y de nitrgeno por cualquier clula de A. tumefaciens que lleve los genes para el catabolismo de estas molculas. Dichos genes suelen ir alojados en el plsmido Ti, fuera de la zona T-ADN. La mayor parte de los otros organismos presentes en el suelo que han sido estudiados hasta la fecha, no son capaces de utilizar las opinas como fuente de carbono. De esta forma A. Tumefaciens consigue, a travs de transgnesis, y produciendo un tumor a la planta (grupo de clulas que ha perdido su funcin habitual

Alimentos transgnicos

Tabla II. Caracteres interesantes modificados por ingeniera gentica en las plantas de uso agrcola
Mejora en la lucha contra las plagas y malas hierbas Resistencia a virus Resistencia a bacterias Resistencia a hongos Resistencia a nemtodos Resistencia a insectos Tolerancia a herbicidas Mejora en propiedades Agronmicas Mejora en la tolerancia al estrs hdrico Mejora en la tolerancia a la salinidad del terreno Tolerancia a bajas temperaturas Mejora de las cualidades post-cosecha Retraso en la maduracin de frutos Retraso en la senescencia de flores Vegetales ms dulces Tomates con tejidos ms resistentes Patatas con mayor contenido en almidn Mejora en la calidad nutritiva Semillas con protenas con un mayor contenido de lisina y metionina Forraje con protenas con alto contenido en aminocidos con azufre.

Mejoras con otras finalidades Vacunas comestibles Alimentos vitaminados Alimentos hipoalrgnicos

y que se reproducen de una forma desmedida y desregulada), convertir una zona de la planta en una fbrica de opinas, compuestos que slo ella puede utilizar. Este es un fenmeno de transgnesis natural, similar a la transgnesis artificial que, como veremos ms adelante, est basada precisamente en ella. As, la bacteria acaba de convertir la planta en su fbrica de alimento, como el hombre la convierte en su fbrica de frmacos (anticuerpo monoclonal, albumina humana, etc.). Ya vemos que antes que nosotros, algn otro ser "menos evolucionado" haba ideado la forma de poner a la planta a trabajar para l, mediante un mecanismo, a nuestro parecer, realmente sofisticado. Este es un ejemplo ms de los muchos que uno puede encontrar estudiando la vida en el planeta, en los que se demuestra que hablando de biologa es difcil "inventar" algo que funcione y no haya sido diseado anteriormente por la evolucin. Transgnesis con vectores derivados del plsmido Ti. De qu forma se puede utilizar el sistema natural, arriba descrito, para transferir a la planta un gen heterlogo de inters antropocntrico? Existen 2 sistemas de transferencia, uno de ellos es el sistema binario por estar compuesto por 2 plsmidos y el otro es el sistema de cointegrados. Aqu comentaremos el binario por ser el ms utilizado actualmente. En el sistema binario, al ser el plsmido Ti muy grande y poco manejable, se divide en 2 plsmidos menores: uno de ellos al que le falta el T-ADN y lleva los genes vir (plsmido "desarmado"), siendo el otro el verdadero vector para clonar el gen forneo, y que lleva los extremos del fragmento T-ADN (extremo derecho y extremo izquierdo), que son imprescindibles para que funcione el sistema y exista transferencia (plsmido Mini-T). Por tanto, el plsmido "desarmado" funcionar

como plsmido colaborador (helper), que aportar las protenas de los genes vir necesarias para que exista la transferencia (complementacin en trans). Para que el sistema funcione es imprescindible que ambos plsmidos se encuentren a la vez en el interior de una clula de A. tumefaciens. a) La primera fase implica la manipulacin molecular del ADN. Los genes presentes en el fragmento T-ADN, que son inductores del tumor (unos 7 genes), han sido retirados al construir el vector de clonaje derivado del plsmido Ti (plsmido Mini-T), y en su sitio se clonar el gen forneo que se desee introducir (para ello se utilizan enzimas que actan sobre el ADN: enzimas de restriccin, polimerasas, ligasas, etc). Entre las secuencias caractersticas de los extremos del T-ADN se colocar el gen heterlogo y un gen marcador, que se utilizar como mtodo de seleccin de las clulas transformadas. Vamos a suponer que este gen sea un gen que confiere resistencia a antibiticos, por ser ste un sistema muy utilizado (p.ej. el gen neo que sintetiza la neomicn fosfotransferasa y confiere resistencia a la kanamicina). Ambos genes debern contar con sus secuencias promotoras, terminadoras, activadoras, etc, adecuadas, propias de clulas vegetales, que es donde se pretende que se expresen estos genes. En la actualidad se intenta utilizar un gen marcador que suponga otra caracterstica distinta a la resistencia a los antibiticos, con la finalidad de evitar la posible difusin de este tipo de genes a otros organismos vivos que se desarrollen en proximidad a la planta transgnica (bacterias y hongos del suelo, otras especies de plantas), o a las bacterias presentes en el intestino de organismos consumidores de dichas plantas. Hoy en da no se sabe si la probabilidad de que ocurra esta transferencia gentica horizontal es lo suficientemente significativa como
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B. Bartolom

para tener transcendencia en la gentica evolutiva de otros organismos, implicando la difusin de los genes utilizados en este proceso (genes de resistencia antibiticos, genes de tolerancia a herbicidas, genes de resistencia a insectos, etc.) a otros seres vivos. El plsmido Mini-T as preparado, se introducir en la cepa adecuada de A. tumefaciens. que contenga en su interior el plsmido "desarmado" del sistema binario. b) En la segunda fase, la bacteria A. tumefaciens con los dos plsmidos en su interior ser cultivada en presencia de pequeos trozos de tejido de hojas o de raz. La bacteria se aproximar por quimiotaxis a las clulas vegetales de los bordes de los trozos del tejido, y gracias a la expresin de los genes vir (genes de virulencia), presentes en el plsmido "desarmado", se llevar a cabo la transferencia del ADN comprendido entre los 2 extremos caractersticos presentes en el otro plsmido (plsmido MiniT). La transferencia se produce en forma de cadena sencilla de la molcula de ADN inter-extremos, por accin de cortes en una sola hebra, en ambos extremos. Esta molcula de hebra sencilla de ADN se encuentra protegida de la degradacin por protenas (protenas vir) que la transportan al interior de la clula vegetal, entrando hasta el ncleo de la misma. En algn momento de la transferencia el fragmento se transforma en cadena doble y as se integra, aparentemente al azar, en varios puntos del genoma vegetal. All permanecer y ser duplicado cada vez que el genoma se replique y la clula se divida. El plsmido Mini-T, que permanece en A. tumefaciens, mientras tanto, habr reparado el sector de hebra sencilla que le dej el T-ADN al ser transferido llevando el gen heterlogo y un gen neo. No todos los genes que se insertan de esta forma en el cromosoma se expresan correctamente, se ha observado que en clulas vegetales existen mecanismos especficos de silenciamiento de genes por metilacin (metilacin de ADN dependiente de la dosis de ARN) que pueden evitar su expresin. Asimismo, si el gen se inserta en una zona inactiva del cromosoma, esta regin inactiva prxima silenciar el gen, por tanto, si buscamos una buena expresin del gen es conveniente que ste se inserte en zonas activas del cromosoma. A continuacin los trozos de tejido se transfieren a un medio de cultivo con 2 antibiticos y con hormonas vegetales de crecimiento. Uno de los antibiticos matar la bacteria A. tumefaciens, que ya no la necesitamos, y el otro (p.ej. kanamicina) matar las clulas vegetales presentes en el tejido que no estn transformadas, al no haber integrado el gen marcador neo (ni el gen forgeno de nuestro inters). Las
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hormonas permitirn el crecimiento de las clulas transformadas para dar lugar a la formacin de pequeos callos. c) En la tercera fase, algunos trozos del callo se pueden transferir a un medio que induce la formacin de tallos (se consigue con altos niveles de citoquinina) y, a continuacin, estos tallos se trasplantarn a un medio preparado hormonalmente para la formacin de races. Este mtodo es el que ms se ha utilizado y con el que ms variedades distintas de plantas se han podido transformar, entre las cuales podemos sealar verduras (lechuga, esprrago, remolacha, rbano, pepino, zanahoria, brcoli), plantas con inters en floricultura (clavel, petunia, crisantemo), frutas (albaricoque, ciruela, ctricos, manzana, melocotn, kiwi, fresa, frambuesa, meln), legumbres (soja), cereales (arroz, maz, trigo sarraceno) y especias (hinojo, mostaza, apio). Transferencia directa de ADN Como el mtodo derivado del plsmido Ti funciona muy bien con plantas dicotiledneas (legumbres), pero no as con monocotiledneas -donde se encuentran plantas tan importantes para la alimentacin humana y animal como los cereales (arroz, trigo, maz, centeno)- se desarrollaron mtodos alternativos. As se han desarrollado varios mtodos para poder introducir el ADN directamente al interior de la clula vegetal, atravesando la barrera de la pared y la membrana de la clula vegetal, sin la ayuda de vectores biolgicos. Como estos mtodos son esencialmente artificiales, no presentan restricciones biolgicas que limiten su uso a determinadas especies vegetales (No ha sido hasta hace poco -ao 96- que se ha conseguido obtener plantas transgnicas monocotiledneas (arroz, maz) con vectores Ti, lo que ha llevado a pensar que la incapacidad de lograrlo anteriormente, radicaba ms en la dificultad de cultivar clulas de monocotiledneas y, por tanto, de seleccionar clulas transformadas de monocotiledneas, que en la incompatibilidad biolgica del sistema). Biobalstica. Este mtodo es, quizs, el ms verstil para introducir el ADN a las clulas vegetales. En este mtodo el ADN a transferir en forma lineal o ms frecuentemente incorporado en un vector de clonaje (gen heterlogo + gen marcador de seleccin), se precipita sobre unas pequeas partculas o microproyectiles de tungsteno u oro (1-4 m de dimetro), de forma que las recubra totalmente. A continuacin las partculas se disparan sobre el tejido vegetal, con una pistola de plvora (inicialmente era as), gas comprimido (helio) o descarga elctrica, a unas

Alimentos transgnicos

A)
150

C)
140
7% SUPERFICIE TOTAL TRANSGNICOS NO-TRANSGNICOS

ALGODN 12% COLZA 6% ....SEGN TIPO SOJA 58%

100

72
36%

MAZ 23%
34
16%

50

25
11%

0 SOJA MAZ ALGODN COLZA

B)
25

RESISTENCIA A INSECTOS 19%

AMBAS 7% ...SEGN CARCTER

25,8
TOLERANCIA A HERBICIDAS

20

RESISTENCIA A INSECTOS AMBAS

TOLERANCIA A HERBICIDAS 74% 74%

15

10,3
10

1,4

5,3
5

6,8 2,1
SOJA MAZ

1,7 1,5 2,1

ALGODN

2,8

COLZA

Fig. 3. A) Extensin cultivada de los cultivos transgnicos (TG) ms comunes y porcentaje con respecto a la extensin total cultivada de cada especie vegetal. B) Extensin cultivada de cada tipo de transgenia en los cultivos transgnicos ms comunes. C) Porcentaje de los principales cultivos transgnicos con respecto a la superficie total de plantas transgnicas cultivadas (Fuente: Clive James, ISAAA Briefs N 21, Global Status of Commercialized Transgenic Crops: 2000. www.isaaa.org).

velocidades suficientes para penetrar en el interior de la clula atravesando la pared. El material sobre el que se dispara pueden ser protoplastos, tejidos del meristema vegetal (zona de crecimiento de la planta), embriones vegetales o tejidos diferenciados (como trozos de hojas). A continuacin habr que seleccionar la clula transformada en medio selectivo, aprovechando la caracterstica del gen marcador introducido con el gen forneo, y regenerar la planta entera al cultivar la clula en codiciones adecuadas. De esta forma se ha podido obtener, no slo insercin del gen en cromosomas del ncleo, sino tambin en el cromosoma circular presente en el cloroplasto y en la mitocondria. Con este mtodo se han transformado distintas variedades de cereales y gimnospermas. Entre las plantas transformadas se pueden sealar el lamo, arndano, caa de azcar, maz, papaya, soja, tabaco y trigo. Uso de protoplastos (electroporacin, liposomas). Las clulas vegetales cuentan con una pared vegetal constituida por polmero de carbohidratos (celulosa y hemicelulosa) que rodean la membrana plasmtica y que dificultan enormemente la entrada de ADN sin la colaboracin de vectores biolgicos (plsmidos o virus). Por tanto, para facilitar dicha entrada se preparan clulas vegetales a las que por tratamiento enzimtico (celulasa y pectinasa) se las ha desprovisto de su pared, obtenindose clulas vegetales solo con membrana plasmtica, que se denominan protoplastos. Los protoplastos, una vez transformados, podrn reconstruir la pared y en condiciones adecuadas de cultivo regenerar una planta entera. La entrada del ADN al

interior del protoplasto se consigue colocando el protoplasto en presencia del ADN a introducir (gen heterlogo + gen marcador en forma lineal; vector Ti o vector bacteriano con gen heterlogo + gen marcador) en un medio con PEG o polivinil-alcohol o calcio y con un alto PH, estas condiciones favorecen la entrada del ADN. Tambin la alta temperatura y descargas elctricas (electroporacin) favorecen considerablemente el proceso. En ocasiones se logra introducir el ADN mediante la fusin de un protoplasto con un liposoma que lleva encapsulado en su interior el ADN heterlogo, al poner ambas entidades en un medio con PEG, compuesto que favorece la fusin (El liposoma es una vescula artificial creada por una bicapa de fosfolpidos, similar a la membrana plasmtica). Es un mtodo poco usado y de baja eficiencia, pero con l se han conseguido transformar protoplastos de arroz, canola, ctricos, fresa, maz, tabaco y soja. En estos mtodos, el estado en que se encuentren los protoplastos, tales como la fase de su ciclo celular, tambin parece tener importancia. Las condiciones ptimas son particulares de cada especie vegetal. La integracin en el genoma de la planta parece suceder de forma aleatoria y debido a un mecanismo de recombinacin ilegtima ( no-homloga). Microinyeccin. En este mtodo se microinyecta el ADN, mediante un capilar de vidrio, al interior de la clula. Si la microinyeccin es en el ncleo, la eficiencia de transformacin es ms alta que si se hace en el citoplasma (igual ocurre en clulas animales). Parece que la transferencia del ADN del citoplasma al ncleo supone una barrera en el proceso de transformacin. En este caso el uso de un gen marcador para llevar a cabo la seleccin de la clula transformada, no es esencial. Este mtodo slo se puede utilizar con clulas para las cuales se tengan desarrolladas eficientes mtodos de cultivo. Se han conseguido transformar clulas de canola y arroz. Plantas transgnicas y alimentacin En el campo de la agricultura con fines de alimentacin humana y/o animal, se han obtenido plantas transgnicas con distintos objetivos. Como sabemos, la productividad de cualquier cosecha, as como la calidad de la misma, est muy condicionada por una serie de organismos vivos que conviven y compiten con ella (malas hierbas), y otros que la parasitan (virus, bacterias, hongos, nemtodos, insectos) que en algunas ocasiones se convierten en verdaderas plagas. Para superar estos problemas, se han desarrollado plantas transgnicas que presen147

B. Bartolom

tan resistencia a dichos parsitos o que toleran ciertos herbicidas constituyendo estos 2 tipos de transgenia, en la actualidad, prcticamente el 99,9% de cultivos transgnicos comerciales (Fig. 3). Poniendo el punto de mira en las caractersticas de los frutos y semillas, se han obtenido desde plantas cuyos frutos maduran de forma controlada, hasta semillas con mayor calidad nutritiva (diettica). Finalmente, para ampliar la superficie de terrenos cultivables, se han obtenido plantas que soportan temperaturas ms bajas y plantas que crecen en suelos ridos o salinos, superando de esta forma las rigurosidades climtolgicas y las condiciones edafolgicas extremas de los suelos. Todas estas aplicaciones desarrolladas durante los ltimos aos, han llevado a concluir que los genticos moleculares deben trabajar codo con codo con los bilogos vegetales que conocen y desarrollan las tcnicas de cruzamiento y seleccin de hbridos, para poder obtener productos con transformaciones estables y comercialmente vlidos. Por lo que se supone que estas nuevas tecnologas no van a desplazar, al menos de momento, a las tcnicas convencionales, sino ms bien a colaborar con ellas. Las estrategias biolgicas utilizadas para lograr los fenotipos adecuados con el uso de esta tecnologa son principalmente 3. La primera, que es la ms directa, se basara en el uso de la actividad de la protena codificada por el gen introducido para lograr el fenotipo buscado. La segunda hace uso del fenmeno de silenciamiento de genes por co-supresin, fenmeno que se da en ciertas ocasiones cuando existen varias copias de un mismo gen en el genoma del organismo. De esta forma se puede lograr la reduccin de la sntesis de una protena en la planta, al introducir a la misma algn gen homlogo al gen que la codifica. Una tercera va es la llamada ARN "antisentido" (antisense RNA), en esta estrategia tambin se busca la reduccin de la sntesis de una determinada protena y, por tanto, la reduccin de la actividad que sta lleva a cabo. El efecto se logra al introducir en la planta el gen que codifica la protena cuya sntesis se quiere inhibir pero de forma que se exprese en orientacin invertida (en sentido contrario) a la normal. De esta forma, la transcripcin del gen introducido origina un ARN mensajero que es complementario al ARN mensajero del gen diana. Ambos ARN mensajeros, al encontrarse en el mismo citoplasma, hibridan, con lo cual el ARN mensajero que codifica la protena cuya sntesis se quiere inhibir queda capturado en este hbrido, y no puede ser traducido, bajando la sntesis de dicha protena. Antes de ver algunos ejemplos de plantas transgni148

cas, hay que recordar que siempre que se vaya a transferir un gen para obtener un organismo transgnico, habr que rodearlo de las secuencias adecuadas (promotores, terminadores, activadores, etc.) reconocidas por el organismo donde se pretenda expresar. Por eso, en el apartado siguiente, se sobreentiende que los genes obtenidos en otros reinos diferentes al de las plantas, se introducen en ellas con las construcciones adecuadas: se retiran sus promotores y terminadores y se ponen estos mismos elementos pero de reconocimiento en plantas. Estos elementos podrn ser obtenidos del genoma de las propias plantas o, muy a menudo, del genoma de virus de plantas, por ser stos elementos de fuerte actividad, como es el caso del muy utilizado promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). A veces esta tecnologa sirve para transferir un gen, y con l el fenotipo que ste suponga, de una variedad salvaje de una especie vegetal, a otra variedad de esa misma especie vegetal, que se haya seleccionado por sus buenas caractersticas de crecimiento y productividad, pero que no presente dicho fenotipo. Este gen puede significar un carcter monognico interesante como resistencia a insectos, tolerancia a la sequa, etc. Esto se hace en mejora clsica mediante cruzamientos, con lo cual puede llevar muchos aos conseguirlo, mediante transgnesis se logra en un perodo de tiempo mucho ms breve. Plantas con resistencia a plagas Plantas resistentes a microorganismos. Los virus, bacterias y hongos son microorganismos que afectan gravemente la productividad de los cultivos agrcolas. Se han conseguido plantas transgnicas que muestran menos sntomas patolgicos por accin de los virus, introduciendo, en el genoma de la planta, genes del propio virus agresor o, en ocasiones, de virus filogenticamente prximos (proteccin cruzada). Parece ser que la expresin de la protena vrica, en unos casos, y la simple presencia de ARN vrico en otros, consigue los efectos comentados. Los mejores resultados se han conseguido introduciendo el gen de la protena de cpside del virus, as se han logrado plantas tolerantes a virus, entre otras, de las siguientes especies: tabaco, tomate, alfalfa, patatas y arroz. La prctica de introducir regiones del genoma de virus en el genoma de vegetales o animales, que se realiza, entre otras ocasiones: para lograr plantas resistentes a virus, en la utilizacin de promotores vricos de expresin fuerte (p.ej. promotor 35S CaMV), o en uso de vectores vricos para la transformacin de clulas eucariotas, est siendo criticada, debido a la posible aparicin de nuevos patgenos, generados por

Alimentos transgnicos

procesos de recombinacin entre provirus o virus inactivos presentes en el genoma de los organismos eucariotas que se van a modificar y las nuevas regiones vricas introducidas en sus clulas. Muchas bacterias fitopatgenas producen toxinas que inhiben rutas del metabolismo primario de la planta causando la muerte celular y produciendo graves prdidas en importantes cosechas. Se han obtenido plantas transgnicas que expresan unas protenas de la familia de las defensinas o similares (cercopina B, sarcotoxina, etc.) que se han mostrado resistentes a infecciones por bacterias. Los genes que codifican estas protenas, de pequeo tamao, se encuentran en la naturaleza en el genoma tanto de insectos como de animales o vegetales. En contraste con la situacin de los virus, los hongos s se pueden eliminar con productos qumicos, pero esta estrategia puede ocasionar problemas ecolgicos. Para proteger a las plantas del ataque de estos organismos la biotecnologa potencia los mecanismos de defensa naturales. As ocurre con la manipulacin de la produccin de las protenas denominadas de respuesta a patgenos (protenas PR: se activa su expresin por el ataque de microorganismos), capaces de afectar al organismo invasor o de activar rutas de transduccin de seales responsables de iniciar mecanismos generales de defensa. Se ha logrado obtener plantas resistentes a hongos introduciendo genes de quitinasas y/o glucanasas -enzimas que degradan la pared de la clula del hongo- as como de otras toxinas vegetales (tioninas y osmotinas), todas ellas protenas PR procedentes de clulas de otras plantas o tambin de bacterias. Plantas resistentes a insectos. Las plantas pueden verse sometidas a plagas de insectos cuyas larvas son devastadoramente voraces. Todas las plantas presentan mecanismos de defensa, ms o menos eficaces, contra los insectos por medio de compuestos propios de su metabolismo secundario. Las dos estrategias ms usadas para proteger a las plantas del ataque de insectos son: utilizar genes de bacterias que codifican toxinas para los insectos o utilizar genes de plantas que codifican inhibidores proteicos de enzimas digestivas de los insectos (proteasas y amilasas). Hoy en da se conocen ms de 40 genes de plantas o bacterias que producen toxinas para insectos y algunos de ellos se han introducido en el genoma de plantas cultivadas de inters econmico. Como ejemplo de la primera estrategia vamos a sealar el uso de una toxina de la bacteria aerobia y esporulado-

ra Bacillus thuringiensis. Hay docenas de cepas diferentes de dicha bacteria que afectan a grupos de insectos distintos. Todas ellas comparten la caracterstica de que sus esporas contienen cristales de una protena txica para insectos, la protena parasporal o "-endotoxina. La ventaja, para nuestros intereses, de estas toxinas de Bacillus thuringiensis es que no son txicas para mamferos ni pjaros. Algunas de ellas son bastante especficas y se ha utilizado esta caracterstica para clasificarlas, as la toxina Cry I es especfica de lepidpteros, Cry III de colepteros y Cry IV de dpteros. En todos los casos la toxina cristalina es modificada en el intestino medio de la larva del insecto y de esta forma se transforma en txica. Esta protena, as modificada, se une a las clulas del epitelio del intestino causando la lisis de dicha clulas, y destruyendo el epitelio intestinal. Estas toxinas ya se utilizaban como bio-insecticidas, bien utilizando las esporas enteras o purificando la toxina a partir de ellas. Sin embargo, de esta forma, la accin de la toxina estaba limitada slo a las superficies de las plantas y no al interior de los tejidos, que muchas ocasiones son atacados por los endoparsitos. Adems las condiciones climatolgicas limitaban mucho su efecto: poda ser lavada, por efecto de la lluvia, retirndola del lugar de uso o poda ser degradada rpidamente. Esto llev, en el ao 1987, a 3 compaas simultneamente (Monsanto, Agracetus y Plant Genetic System) a crear plantas transgnicas (tomate, tabaco) que expresaban la pro-toxina o la toxina y eran resistentes a larvas de lepidpteros. Con esta estrategia se han obtenido distintas plantas transgnicas resistentes a insectos, entre ellas: algodn, maz, arroz, patatas, soja, brcoli y canola. La estrategia result tan atractiva que para el ao 1992 ya haba un buen nmero de compaas trabajando en el tema, entre ellas: Abbot, Agracetus, Agrigenetics, Boehringer-Mannheim, Ciba-Geigy, DuPont, Ecogen, ICI, Mitsubishi, Monsanto, Mycogen, Plant Genetic System, Sandoz (Ciba-Geigy y Sandoz se fusionaron constituyendo Novartis). Las plantas con este tipo de resistencia se denominan con la terminacin BT de Bacillus thuringiensis, as maz-BT, algodn-BT, etc. En Espaa el nico cultivo transgnico sembrado con fines comerciales es un mazBT. Hay otros cultivos transgnicos sembrados, pero no con fines comerciales, sino con fines de investigacin o como pruebas de campo para su posible explotacin comercial. La expresin potente y generalizada (en todos los tejidos de la planta) de este tipo de toxinas, puede provocar la aparicin de procesos y mecanismos de proteccin de los insectos hacia la toxina. As se conocen insectos que se han
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hecho resistentes a algunas de la toxinas, siendo ste un problema a la hora de utilizar dichos compuestos como insecticidas. Es por ello que actualmente se estn buscando promotores especficos de tejido, para conseguir una expresin localizada, slo en aquellos tejidos que sean susceptibles de infeccin. Se est probando con promotores de floema (donde succionan los fidos), promotores que se activan por aparicin de heridas o promotores propios del polen. En cuanto al uso de inhibidores de proteasas y !-amilasas, para obtener plantas transgnicas con resistencia a insectos, se han utilizado los genes del inhibidor de tripsina obtenida del guisante (CpTI), de los inhibidores I y II de proteasas obtenidos del tomate y del inhibidor I de proteasas de la patata, obtenindose plantas de tabaco y arroz resistentes a sus plagas. Asimismo se ha usado el gen del inhibidor de !-amilasa de semillas de alubia (!AI), que inhibe la actividad !-amilasa de insectos y otros animales pero no la de las plantas, para obtener guisantes resistentes a insectos a los cuales eran sensibles. Plantas tolerantes a herbicidas Aproximadamente un 10% de la produccin agrcola global anual se pierde como consecuencia del crecimiento de malas hierbas en los cultivos, a pesar del enorme gasto (10 mil millones $) que se realiza en los ms de 100 herbicidas qumicos que se utilizan. Pero, adems del gasto, los herbicidas presentan otras limitaciones: muchos no discriminan las malas hierbas de la cosecha y otros hay que aplicarlos antes de que las malas hierbas aparezcan y mantienen su efecto durante largo tiempo. La obtencin de plantas cultivadas tolerantes a herbicidas puede permitirnos superar algunos de estos problemas. Hay varias maneras de manipular biolgicamente a las plantas para convertirlas en tolerantes a herbicidas: a) inhibir la toma del herbicida, b) que la planta superproduzca la protena diana del herbicida (generalmente una enzima) para que, aun en presencia del mismo, haya molculas de la protena diana no afectadas por el herbicida y, por tanto, disponibles para llevar a cabo su accin, c) reducir la afinidad de la protena diana por el herbicida, d) obtener plantas que degraden el herbicida. Las 3 ltimas estrategias han sido utilizadas en transgnesis. Se han obtenido plantas transgnicas tolerantes al herbicida glifosato utilizando la tercera estrategia. Se eligi el glifosato por ser un herbicida que presenta caractersticas adecuadas: amplio espectro de actuacin (elimina 76 de las 78 peores malas hierbas conocidas); es degradado por microorganismos del suelo rpidamente, dando lugar a pro150

ductos no txicos y adems presenta una baja toxicidad para el hombre y su ganadera. Sin embargo, es precisamente su amplio espectro de actuacin y, por tanto, su efecto negativo sobre la biodiversidad, lo que est siendo criticado desde algunos sectores. Asimismo, en algunos crculos de investigadores se cuestiona su inocuidad y su carcter no txico. El glifosato es un inhibidor de la enzima 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) que acta en la sntesis de aminocidos aromticos, tanto en plantas como en bacterias. Se han utilizado alelos del gen que codifican la enzima EPSPS de cepas de Salmonella typhimurium y E. coli que resisten al glifosato, para introducirlos en plantas de tabaco, petunia, algodn, patata, tomate, maz y soja, y obtener plantas tolerantes al herbicida. El glifosato es el conocido herbicida Roundup comercializado por Monsanto. En cuanto a la estrategia de destoxificacin, tenemos un ejemplo muy comn, el del herbicida fosfinotricina, que es el comercializado con el nombre de Basta por Hoescht AG (actual Aventis). Este herbicida, que tambin es de amplio espectro, acta inhibiendo la enzima glutamina sintetasa necesaria para la sntesis de aminocidos y asimilacin de nitrgeno en las plantas. La inhibicin de dicha enzima conlleva una acumulacin de amonio en el interior de la planta, como el amonio es txico por encima de ciertos niveles, la planta termina muriendo. Algunas especies de Streptomyces llevan un gen, denominado bar, que codifica una enzima la cual inactiva la fosfinotricina por acetilacin. Varios grupos han utilizado el gen bar para conseguir, mediante transgnesis, por Agrobacterim o por bombardeo de genes, plantas de tabaco, tomate, patata, alfalfa, trigo y arroz, tolerantes al herbicida. Modificacin de las caractersticas de frutos y semillas Maduracin controlada de los frutos. Como otros procesos de desarrollo de las plantas, la senescencia est controlada por hormonas. El proceso de maduracin de un fruto, como el tomate, se inicia con la produccin por sus clulas de un gas denominado etileno. En los vegetales el etileno es una hormona que produce una serie de respuestas como la sntesis de poligolacturonidasas, la produccin de pigmentos rojos o el desarrollo de aromas especficos. La poligolacturonidasa degrada las paredes de las clulas vegetales produciendo el ablandamiento del tomate. Cientficos de Calgene en Davis, California, suprimieron en un 90% la expresin de esta enzima, mediante la estrategia ARN antisentido, obteniendo tomates que se pueden dejar en la planta ms tiempo que un tomate normal sin que se ablanden en exceso. Su aspecto es idntico al de los tomates normales pero, al no

Alimentos transgnicos

sufrir el ablandamiento, es ms resistente a los daos mecnicos producidos durante la recogida en el campo, o en el proceso de embalaje y transporte. A este tomate se le denomina FlavrSavr, aunque su marca comercial es Mc Gregor, y fue el primer alimento transgnico que obtuvo el permiso de comercializacin. Hay varios tipos de tomates transgnicos en los que se ha reducido la produccin de etileno, retardando su proceso de maduracin. Los dos ltimos pasos de la sntesis de etileno implican la sntesis de ACC (cido carboxlico 1-aminociclopropano) por la enzima ACC-sintasa y posteriormente su conversin en etileno por accin de ACC-oxidasa. Cientficos de la Universidad de Nottingham, en el Reino Unido, y de la Universidad de Berkeley, en California, han conseguido reducir la expresin de ambas enzimas mediante la estrategia de ARN antisentido, logrando una drstica reduccin en la produccin de etileno acompaada de un retraso en la maduracin (de 1 semana a 4 semanas). Biotecnlogos franceses han obtenido melones con una copia antisentido del gen de la ACC sintasa, logrando melones de maduracin lenta. Cientficos de la empresa Monsanto han conseguido reducir la sntesis de etileno y retraso en la maduracin, al introducir en el tomate un gen bacteriano que codifica una enzima que degrada la molcula de ACC, el precursor del etileno. Con estas estrategias se pueden dejar los frutos en la planta ms tiempo y se pueden recoger cuando estn empezando a tomar el color rojo, de esta forma se pueden transportar y llevar a las verduleras una semana antes de que se empiecen a ablandar y ponerse rojos. Esto evita el tener que recoger los tomates verdes y tener que tratarlos con etileno para que maduren. Adems no necesitan refrigeracin en el transporte, ya que el proceso de maduracin acontecer lentamente durante el transporte. Modificacin en la calidad de los alimentos. En los ltimos aos se han obtenido plantas transgnicas en las que se ha modificado la composicin bioqumica de sus frutos o semillas. Se han conseguido modificar, tanto la composicin de los cidos grasos de sus triglicridos y fosfolpidos, como las caractersticas y cantidad de su almidn o sus protenas. Modificacin de las protenas. La produccin de plantas transgnicas cuyas semillas presenten protenas de alto valor nutritivo es un objetivo importante en alimentacin. El incremento en la proporcin de ciertos aminocidos como la lisina (Lys), la tirosina (Try), la metionina (Met) y la cistena (Cys) en la composicin de las protenas ingeridas, ser beneficioso no slo para el hombre sino tambin para animales monogstricos (cerdos, pollos). Los

cereales suelen ser pobres en Lys y Tyr, y las semillas de legumbres pobres en aminocidos que contengan azufre como la Met y la Cys. En el hombre, el enriquecimiento de las protenas en ciertos aminocidos puede ser especialmente beneficioso para vegetarianos, en riesgo de presentar una dieta pobre en aminocidos esenciales. Tambin se puede beneficiar la industria de alimentacin animal, al no tener que aadir aminocidos esenciales exgenos para suplementar la dieta del ganado. Tampoco hay que olvidar que la alimentacin animal influye en la calidad y cantidad de los productos obtenidos a partir de ellos, as se ha descrito que las ovejas pueden incrementar su produccin de lana con una alimentacin rica en Met y Cys (hay que recordar que la lana es una protena animal con alta proporcin de aminocidos con azufre). Hay tres maneras fundamentales de modificar la calidad de las protenas presentes en las semillas. Una es conseguir que la planta exprese una protena nueva en la semilla que sea rica en los aminocidos de inters (Lys, Tyr, Met, Cys). Otra sera introducir, por sustitucin o adicin, los aminocidos de inters en la composicin de una protena que ya existe en la semilla, sin que vare la biologa de la misma. La ltima posibilidad es incrementar los niveles del aminocido de inters en estado libre, esperando que conlleve un incremento en la sntesis de las protenas que contengan ese aminocido. La primera estrategia se ha llevado a cabo transfiriendo a plantas de tabaco, soja, canola y alubias el gen de la albmina 2S de la nuez del Brasil (protena con alto contenido en Met). Esta protena es un alergeno mayor de la nuez del brasil y al ser expresada en soja se comprob que mantena su carcter alergnico. Por tanto su transgnesis en semillas con inters agrcola quedar destinada a la alimentacin animal. En el caso que se exprese en semillas para uso en alimentacin humana, es de esperar que sea advertido en la etiqueta de presentacin del alimento. La segunda estrategia se ha realizado introduciendo los aminocidos de inters en zonas hipervariables de una protena presente en la semilla. Al producirse estas sustituciones de aminocidos en una zona hipervariable de la protena, generalmente la protena no suele modificar su biologa ni su localizacin celular. Con objetivos puestos en la industria textil, cientficos australianos han obtenido variedades de alfalfa y trbol que expresan la albmina 2S de semillas de girasol (rica en Met). De esta forma aumentan la presencia de aminocidos ricos en azufre en la dieta de las ovejas para aumentar la productividad de lana de las mismas.
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B. Bartolom

Alimentos con valor aadido Vacunas comestibles. Las vacunas han hecho milagros en la lucha contra las enfermedades infecciosas. La ltima generacin de vacunas comerciales suelen consistir en preparaciones, compuestas y fundamentalmente, por protenas antignicas separadas de los genes del agente infeccioso. Pero estas vacunas son caras (en parte porque se producen en cultivos de bacterias o clulas animales), hay que purificarlas y deben conservarse refrigeradas. Una posibilidad para evitar estos problemas sera expresar estas protenas en alimentos que nos sirviesen a modo de vacunas comestibles. Cientficos de la Universidad de Loma Linda, en California, han conseguido obtener plantas de tomate y patatas que sintetizan protenas del virus de Norwalk, de E. coli enterotxica, de V. cholerae (organismos todos ellos implicados en diarreas, dando cuenta de unos 3 millones de muertes de nios, sobre todo en pases en vas de desarrollo). En 1997 los voluntarios que ingirieron trozos de patatas crudas peladas, que contenan la subunidad B de enterorotoxina de E. coli , presentaron respuestas inmunitarias sistmicas y en la mucosa. Se ha observado reactividad inmunitaria en 19 de 20 personas que comieron patata con vacuna contra el virus de Norwalk; y 2 de 3 voluntarios que ingirieron lechuga transgnica con un antgeno de hepatitis B presentaron respuesta sistmica. Alimentos con vitaminas. "Arroz dorado". La deficiencia de vitamina A produce ceguera y trastornos inmunitarios, que contribuyen a la muerte de ms de un milln de nios cada ao, en pases de Asia, frica e Iberoamrica. El arroz constituye un medio ptimo para aportar la vitamina requerida. No hay que olvidar que esa gramnea alimenta a un tercio de la poblacin mundial. Pero las variedades naturales carecen de vitamina A. cientficos suizos y alemanes acaban de producir un arroz, modificado genticamente, que sintetiza beta-caroteno, un pigmento que el organismo convierte en vitamina A. Por la coloracin que presenta se le ha denominado "arroz dorado". Se van a comenzar los estudios para introducir los beta-carotenos en especies de arroz populares en zonas deprimidas. Pero el arroz dorado no est todava listo para su comercializacin, quedan pendientes muchas pruebas, incluidos los anlisis para comprobar si el organismo humano absorbe bien el -caroteno de la planta. Se espera que las pruebas duren, por lo menos, hasta el ao 2003. Hace unos meses, se inform de la creacin de un tomate que contiene un gen capaz de triplicar la cantidad de caroteno habitual. Asimismo es de sealar un proyecto
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internacional centrado en el incremento del contenido de vitaminas y minerales en el arroz y en otros cuatro vegetales: trigo, maz, alubias y mandioca. A este tipo de alimentos se les ha llamado "alicamentos", debido a su carcter mixto de alimento y medicamento. Alimentos "hipoalergnicos". Un alergeno mayor de la semilla de arroz es una albmina de 16 kDa que pertenece a la familia de los inhibidores de la ! -amilasas/tripsina. Cientficos japoneses, mediante la estrategia del ARN antisentido, han conseguido producir un arroz que presenta una expresin muy baja de dicha protena en sus granos, consiguiendo un arroz "hipoalergnico". Para finalizar veamos algunas cifras que nos indican la rpida expansin que ha tenido esta tecnologa en los ltimos aos. Las primeras pruebas de campo con cultivos transgnicos se realizaron con tabaco hacia 1986 en Francia y Estados Unidos. Desde entonces, se han modificado por ingeniera gentica ms de 70 especies de plantas; 56 de ellas han pasado ya a los ensayos en campo. Durante 1991 y 1992, en Holanda y Canad se realizaron ms de 10 pruebas de campo con cultivares transgnicos de patata, y existe informacin sobre cultivares transgnicos de tomate en Mxico en 1986, tabaco en Cuba en 1990 y maz en Argentina en 1991. El primer cultivo transgnico (tabaco resistente a virus) se comercializ en China a principios de 1993. En 1994, el tomate con retraso en la maduracin FavrSavrTM fue el primer alimento transgnico en ser cultivado para destino en alimentacin humana, se cultiv en EE.UU. En total, hasta 1997 se haban llevado a cabo en todo el mundo 3.647 pruebas de campo con cultivos transgnicos, principalmente de maz (28%), canola (18%), patata (10%), tomate (9,5%), soja (7,5%) y algodn (2,5%). Todos ellos han pasado ya la fase de comercializacin. Durante 1997 se sembraron ya cultivos transgnicos en ms de 1,3 millones de hectreas en los Estados Unidos, en tanto que el total mundial de rea agrcola cubierta por plantas transgnicas super los 15 millones de hectreas, llegando a ser ms de 44 millones de hectreas en el ao 2000, comparable a la superficie de la Espaa peninsular. Cuatro pases se reparten el 94% de la produccin mundial de transgnicos: EE.UU. 68%, Argentina 23%, Canad 7% y China 1%. En el ao 2000 los cultivos de soja, maz, algodn y colza representaron la mayor parte de la superficie total de cultivos transgnicos. Las caractersticas introducidas por transgnesis en estos cultivos fueron la resistencia a insectos (plantas-BT) y/o la tolerancia a herbicidas (glifosato o fosfinotricina). Desde 1998 se

Alimentos transgnicos

est plantando en Europa (Espaa, Francia y Alemania) maz transgnico BT. En Espaa, el nmero de ensayos de campo de cultivos transgnicos en 1993 fue de 3, llegando a 144 en 1998. Las comunidades autnomas que ms cultivos experimentales realizaron entre 1993-1999 fueron Andaluca (155), Castilla y Len (78), Catalua (48), Castilla-la Mancha (42) y Aragn (42).

GLOSARIO DE TRMINOS
Gen. En gentica clsica: unidad fsica y funcional fundamentalmente de la herencia biolgica. En biologa molecular se suele utilizar para denominar a una secuencia de ADN compuesta de una regin que se transcribir y unas secuencias reguladoras que harn posible su transcripcin (secuencia promotora y terminadora). La transcripcin puede dar origen, segn el tipo de genes a un ADN mensajero (ARNm), a un ARN transparente (ARNt), o a un ARN ribosmico (ARNr). Plsmido. Molcula circular extracromosmica de DNA que se suele encontrar de forma natural en bacterias o levaduras, necesita la organizacin biolgica del organismo en el que se encuentra para replicarse y perpetuarse, y su replicacin se realiza de forma independiente a la del cromosoma del hospedador. En general los plsmidos llevan en su secuencia genes cuya expresin modifica el fenotipo del organismo hospedador, aportndole alguna ventaja evolutiva en el medio en que dicho organismo se multiplica (resistencia a antibiticos, resistencia a metales pesados, etc.). Algunos plsmidos o partes de ellos se suelen utilizar en ingeniera gentica para obtener diferentes tipos de vectores, llamados, en este caso, vectores plasmdicos. Vector: Construccin quimrica formada por secuencias naturales y artificiales de ADN de distintos orgenes, que se puede perpetuar en el interior de una clula hospedadora (procariota o eucariota) y que se utiliza en ingeniera gentica para manipular y manejar de forma cmoda un gen o fragmento de ADN. En general los vectores derivan de entidades genticas naturales como plsmidos o virus, denominndose vectores plasmdicos o vricos respectivamente. Existen vectores especficos para trabajar en los distintos tipos de seres vivos (bacterias, levaduras, clulas animales o vegetales). Tambin existen vectores lanzadera ("shuttle vectors"), con los que se puede trabajar en varios organismos, independientemente del nivel de organizacin de los mismos (procariota o eucariota). Existen vectores especficos, diseados para realizar distintos cometidos:

vectores para clonar (vectores de clonaje), vectores para expresar protenas (vectores de expresin), vectores para secuenciar un fragmento de ADN, etc. Clonar: Insertar un fragmento de ADN, habitualmente un gen, en un vector gentico preparado a partir de plsmidos, fagos o virus, y perpetuarlo por replicacin, al situarlo en un sistema biolgico adecuado y capaz de reproducirse (bacteria o clula eucariota). Transformacin y transfeccin: Proceso de entrada de un fragmento de ADN forneo en la clula, que en general supone un cambio en el fenotipo de la misma. Cuando esto ocurre se dice que la clula ha sido transformada o la clula est transformada. Cuando el proceso tiene lugar en una clula animal se suele llamar transfeccin, para diferenciarlo del significado que tiene la clula transformada en organismos animales (clula tumoral con crecimiento desregulado). Promotor de un gen: Secuencia de ADN a la cual se une la ARN polimerasa haciendo que sta inicie la transcripcin en el punto adecuado. La RNA polimerasa es una enzima que sintetiza ARN, sea ste mensajero, transferente o ribosmico. La secuencia promotora se suele situar por delante del punto de inicio de la transcripcin del gen (se dice en posicin "upstream" o 5del gen). Terminador de un gen: Secuencia de ADN que provoca el final de la transcripcin de un gen y se encuentra al final del mismo (se dice en posicin "downstream" o 3del gen). Tambin se le conoce por terminador de la transcripcin. Los promotores y terminadores no son todos cualitativamente iguales. Hay promotores fuertes que son muy bien reconocidos, como tales, por la ARN polimerasa, por lo que provocarn una gran sntesis de ARN mensajero y, por tanto, si no existe otro mecanismo de regulacin, alta produccin de protena. Los hay dbiles cuya presencia, en general, ocasiona el efecto contrario, y los hay de carcter intermedio. Hay terminadores fuertes que son muy bien reconocidos, como tales, por el sistema biolgico en el que se encuentran, de tal forma que cuando ellos estn presentes, casi siempre que la RNA polimerasa llega hasta donde ellos estn finaliza la transcripcin. Los hay dbiles, que muy a menudo, aunque estn presentes, no finaliza la transcripcin cuando la RNA polimerasa llega hasta donde ellos estn. Y los hay tambin de carcter intermedio. Tanto los promotores como los terminadores estn diseados para ser reconocidos por los sistemas biolgicos del organismo donde naturalmente se encuentran. En general, estos elementos reguladores de control reproducen su actividad biolgica natural tanto ms fidedignamente cuanto ms parecido sea el entorno biolgico donde se les sita

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sumario
C. Bindslev-Jensen

al de su entorno natural. De esta manera un promotor que en la naturaleza se encuentra controlando un gen en un procariota, realizar muy mal su funcin (promover la transcripcin del gen) si lo introducimos en un organismo eucariota o viceversa. Si se quiere expresar adecuadamente un gen procariota (bacteriano) en una clula eucariota (levadura, animal o vegetal), deber retirarse su promotor natural y colocar dicho gen bajo el control de un promotor y terminador cuyo entorno de actividad natural sea eucariota y viceversa. Esto supone que se puede hablar a "groso modo" de promotores y terminadores procariotas, y promotores y terminadores eucariotas (los habr de levaduras, de plantas y de animales. Los promotores y terminadores de los genes de los organismos parsito (virus eucariotas y bacterifagos o fagos -as llamados a los virus bacterianos) sern reconocidos por el sistema biolgico del organismo parasitado, por ser ste su contexto natural de actuacin. Por tanto, un promotor o un terminador de un virus eucariota ser similar a un promotor y un terminador de un gen de su hospedador y asimismo ocurrir para el caso de los fagos y las bacterias.

9. Rifkin J. El siglo de la biotecnologa. Ed. Crtica/Marcambo 1999. 10. Izquierdo Rojo M. Ingeniera gentica. Ed. Pirmide 2000. 11. Riechman J. Cultivos y alimentos transgnicos. Una gra crtica. Libras la catarata 2000. 12. Mae-Wan Ho. Ingeniera gentica Sueo o pesadilla? Ed Gedisa 2001. 13. Anderson L. Transgnicos. Ingeniera gentica, alimentos y nuestro medio ambiente. GAIA Proyecto 2050-2001. 14. Nordlee JA, Taylor SL, Townsend JA, Thomas LA, Bush RK. Identification of Brazil-nut allergen in transgenic soybeans. The New England Journal of Medicine 1996 14; 334: 688-692. 15. Tada Y, Nakase M, Adachi T, Nakamura R, Shimada H, Takahashi M, Fujimura T, Matsuda T. Reduction of 14-16 kDa allergenic proteins in transgenic rice plants by antisense gene. FEBS Lett 1996; 12; 391: 341-345. 16. Mikkelsen TR, Hauser TP , Bagger Jorgensen R. La huda de los genes. Mundo Cientfico. Abril 1997. 17. Ronald PC. Creacin de un arroz resistente a las enfermedades. Investigacin y Ciencia. Enero 1998. 18. Miller RV. Intercambio de genes bacterianos en la naturaleza. Investigacin y Ciencia. Marzo 1998. 19. Nieto-Jacobo MF, Guevara-Garca A, Herrera-Estrella L. Plantas transgnicas. Investigacin y Ciencia. Enero 1999. 20. Dossier OMG Organismos Modificados Genticamente. Mundo Cientfico. Marzo 2000.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M. Recombinant DNA. 2 edicin. 1992. 2. Chispeels MJ, Sadava DE. Plants, genes and agriculture. Jones and Bartlett Publisher 1994. 3. Glick BR, Pasternak JJ. Molecular Biotechnology. Principle and Application of Recombinant DNA. ASM Press 1994. 4. Ramn D. Los genes que comemos. Algar Editorial 1996. 5. Galun E, Beiman A. Transgenic plants. Imperial College Press 1997. 6. VVAA Coord., Durn A, Riechman J. Genes en el laboratorio y en la fbrica. Ed. Trotta 1998. 7. Grace ES. La biotecnologa al desnudo. Ed. Anagrama 1998. 8. Garca Olmedo F. La tercera revolucin verde. Ed. Debate 1998.

21. Langridge W.H.R. Vacunas comestibles. Investigacin y Ciencia. Nov. 2000. 22. Domingo JL. Gmez M. Riesgos sobre la Salud de los alimentos modificados genticamente: una revisin bibliogrfica. revista Espaola de Salud Pblica 2000;74. 23. Wolfenbarger LL, Phifer PR. The ecological risks and benefits of genetically engineered plants. Science 2000; 15; 290: 20882093. 24. Wal JM. OGM y alergias: constatar o predecir? Mundo Cientfico. Marzo 2001. 25. Taylor SL, Hefle SL. Will genetically modified foods be allergenic? J Allergy Clin Inmunol 2001; 107: 765-771. 26. Brown K. Plantas transgnicas y ecosistemas. Investigacin y Ciencia. Junio 2001. 27. Hopkin K. Productos transgnicos e ingesta. Investigacin y Ciencia. Junio 2001.

C. Bindslev-Jensen
Allergy Center Odense University Hospital, University of Southern Denmark.

Assessment of allergenicity of genetically modified foods. The FAO/WHO 2001 decision tree
Introduction of foreign proteins into foods carry the risk of introducing new -and to the food allergic patient potential dangerous - allergenic proteins into the foood in question1. Already in1996, a decision tree for assessing potential allergenicity was launched2. This decision tree both focused on in vitro and in vivo assessment (skin Prick test followed by double-blind, placebo-controlled foodchallenge (DBPCFC)) with the insert protein. Later that century possible unethi-

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Assessment of allergenicity of genetically modified foods

Fig. 1. The 2000 FAO/WHO decision tree.

cal aspects of assessing allergenicity of genetically modified organisms (GMOS) became increasingly clear to the public and therefore new models for assessment were launched. The European Academy of Allergology and Clinical Immunology Task Force on Risk Assessment of Genetically modified foods were in the progress of developing such a new decision tree when the FAO/WHO decision tree was launched after a joint meeting in Rome, January this year. The major differences between the original decision tree (modified during a joint FAO/WHO meeting in rome in the year 2000, fig 1) and the newly developed tree (fig 2) are the following3. The steps are equal whether or not the protein in question is commonly or less commonly allergenic. Both proteins from foods known to be allergenicand from foods not known to be allergenic must be assessed for sequence similarity to known allegens stabilityto digestion must be assessed in a standardisedmanner no in vivo assessment is required in the 2001 decision tree development of suitable animal models for risk assessment are encouraged in the 2001 model.

Te steps in the 2001 FAO/WHO decision tree (relevant references are given in3):

SEQUENCE HOMOLOGY
The amino acid sequences of all allergens in the protein databases are obtained and thereafter a complete set of 80-amino acid length sequences derived from the expressed protein is prepared. This is followed by a comparison using the FASTA programme. Cross reactivity is considered if more than 35% identity in the amino acidsequences is found or if identity of 6 contigous amino acids is obtained. The above criteria does not imply cross reactivity per se.

SPECIFIC SERUM SCREENING

Screening of IgE binding using sera from patients allergic to the source of the gene. Number of sera depends
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C. Bindslev-Jensen

rium, Trichophyton, Invertebrae: mites, shrimp; Vertebrae: milk, fish; Bacteriae: no known examples).

PEPSIN RESISTANCE
In contrast to previous approaches, a standardised assessment of pepsin stability is now recommended. Purified expressed protein should be subjected to pepsin degradition under Standard Operating Procedures and Good Laboratory Practice.

ANIMAL MODELS
Animal models are currently being developed, none are, however, at their present level of validation suitable for substitution. Therefore, at present animal models provide additional information on potential allergenicity of novel proteins, but they do not reflect all aspects of IgEmediated food allergies in humans.

EVALUATION OF RESULTS OBTAINED DURING THE VARIOUS STEPS OF THE DECISION TREE
Any positive outcome in sequence homology testing, specific serum screening or targeted serum secrening depicts possible allergenicity of the insert protein (absolute allergenicity), whereas the results obtained in the pepsin degradation model and in the animal models depicts the relative propabality of allergenicity.

Fig. 2. The 2001 FAO/WHO decision tree.

CONCLUSIONS
The newly developed FAO/WHO 2001 decision tre for assessment of allergenicity of genetically modified foods offers several advantages in comparison to the previous models. It is important to emphasize, however, that a test system giving a 100 per cent certainly of lack of allergenicity does not exist at present and also that the present decision tree does not include assessment of e.g. any sensitizing potential of a novel protein. The new decision tree is, on the other hand, much more feasible an enables fast and efficient assessment provided collaboration between independent researchers and the producers in established. The European Academy of Allergology and Clinical

on availability, the patients are diagnosed a ccording to EAACI guidelines4. Specific serum screening is in all cases followed by targeted serum screening.

TARGETED SERUM SCREENING

Random serum screening is discouraged, instead a targeted approach is recommended, where the insert protein is assessed using sera with specific IgE to foods of similar nature and origin as the insert protein (monocot: grass, rice; Dicot: tree pollen, peanut; Mould: Cladospo156

sumario
Assessment of allergenicity of genetically modified foods

Immunology Task Force on Risk Assessment of Genetically Modified Foods are currently preparing a Position paper with comments and suggestions to the FAO/WHO 2001 decision tree.

2. Bindslev-Jensen C. Allergy risks of genetically engineered foods.Allergy 1998; 53: 58-61. 3. Taylor S, Metcalfe D, Aalberse R, Bindslev-Jensen C, Helm R, Hill D. Evaluation of allergenicity of genetically modified foods. Report of Joint FAO/WHO Expert consultation on allergenicity of foods derived from biotechnology 22-24 January 2001. Food and Agriculture Orgnization of the United Nation (FAO), Rome, Italy. http://www.fao.org/WAICENT/FAOINFO/ECONOMIC/ESN/gm/biotece.htm 4. Bruijnzeel-Koomen C, Ortolani C, Aas K, Bindslev-Jensen C, Bjorksten B, Moneret-Vautrin D, Wuthrich B. Adverse reactions to food. European Academy of Allergology and Clinical Immunology Subcommittee. Allergy 1995; 50(8): 623-635.

REFERENCES
1. Metcalfe DD, Astwood JD, Townsend R, Sampson HA, Taylor SL, Fuchs RL. Assessment of the allergenic potential of foods derived from genetically engineered crop plants. Crit Rev Food Sci Nutr 1996; 36 Suppl: S165-186.

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