14 1 INTRODUO

Doenas gastroentricas compem grande parte da casustica da clnica mdica de pequenos animais, cujos sinais clnicos tpicos so evidenciados atravs de vmitos e diarrias (BURROWS et al, 1995). Desde a dcada de 1970, as enterites virais so consideradas uma das causas mais comuns de diarria infecciosa em ces com menos de 6 meses de idade. Dentre os principais agentes virais causadores de diarrias em animais esto o parvovrus (CPV), o coronavrus (CCV) e o rotavrus (CRV) (HOSKINS, 1997). A Parvovirose Canina, por sua freqncia de ocorrncia aliada grande resistncia viral no meio ambiente, tem se destacado, dentre as demais, por apresentar altas taxas de morbidade e mortalidade (OTTO et al, 2001). No incio, os sinais clnicos desta enfermidade so inespecficos e incluem anorexia, prostrao, letargia e febre, progredindo para vmito e diarria sanguinolenta de odor ptrido, e conseqentemente desidratao,

emagrecimento e hipoproteinemia (MACINTIRE & CARR, 1997). Diversos testes sorolgicos podem ser utilizados para o diagnstico da doena, no entanto o hemograma associado ao histrico e sinais clnicos do paciente so muitas vezes, na prtica, os principais dados obtidos para delinear a suspeita clnica e o protocolo teraputico (HOSKINS, 2004). Como agravante, as enterites virais, por intermdio da replicao viral e destruio seletiva de clulas epiteliais, freqentemente, podem estar associadas a quadros clnicos de septicemia por bactrias Gram negativas da microbiota intestinal (LEGEAY, 2001). Nesses casos, as manifestaes clnicas e patolgicas so em grande parte resultado da atuao das endotoxinas

15 bacterianas, as quais comumente propiciam o agravamento do quadro clnico, aumentando a possibilidade de ocorrncia de choque endotxico e bito (CARTER et al, 1995). O desconhecimento de dados referentes s identificaes de bactrias Gram negativas predominantes nas enterites caninas e da sensibilidade dessas cepas frente aos antimicrobianos, levam muitos clnicos a utilizarem antibiticos de amplo espectro ou a associaes destes. Tal procedimento pode apresentar pouca ou nenhuma eficcia, alm de propiciar o surgimento de cepas resistentes a esses medicamentos (HAGIWARA et al, 1996).

16 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GERAIS

Isolar e identificar atravs de anlises microbiolgicas os gneros de bactrias Gram negativas, pertencentes Famlia Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae em 50 amostras de fezes diarricas de ces com gastroenterite infecciosa.

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Avaliar a sensibilidade e resistncia bacteriana in vitro das cepas isoladas frente a 20 diferentes antibiticos de uso clnico, com o objetivo de sugerir a utilizao de frmacos antimicrobianos ou associaes desses nas gastroenterites infecciosas.

17 3 REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 ASPECTOS GERAIS DAS ENTERITES VIRAIS

Nas enterites virais a diarria representa a principal alterao clnica, sendo resultado da perda do equilbrio hidroeletroltico no lmen intestinal e levando produo de fezes lquidas ou pastosas, com a presena ou no sangue (MINS et al, 1995; TAMS, 1996). Alteraes de motilidade intestinal, pH, cidos biliares, dieta, superfcie de mucosa e capacidade de oxigenao podem ser fatores complicadores na manuteno da adequada relao simbitica entre a microbiota intestinal e o hospedeiro (STROMBECK & GUILFORD, 1991). A partir da dcada de 1970, principalmente devido ao surgimento panzotico da Parvovirose Canina as enterites virais tornaram-se as causas mais comuns de diarria infecciosa em ces (HOSKINS, 1997). Em estudos realizados por HOMEM et al (1999), utilizando microscopia eletrnica para deteco de partculas virais em fezes caninas, das 33 amostras de fezes diarricas e no diarricas examinadas, em 75% observou-se a presena de partculas virais. Outras pesquisas somente com fezes diarricas de ces envolvendo a mesma tcnica e nmero de amostragem maior que 100, realizadas por AMO et al (1999) e STANN et al (1984), demonstraram 31% e 25% de positividade para enterite viral, respectivamente. A enterite viral devido a sua prpria natureza, uma condio infectocontagiosa influenciada por determinados fatores de transmisso, relacionados a manuteno dos agentes infecciosos na populao animal e no meio

18 ambiente (HOMEM et al, 1999). A manifestao clnica e patolgica da doena so influenciadas pela idade, "escore" corporal, "status" imunitrio, virulncia do agente viral, carga infecciosa, rota da infeco, composio da microbiota intestinal do hospedeiro, condies debilitantes e estressantes, bem como infeces intercorrentes (MCADARAGH et al, 1982). Sabe-se tambm que associaes infecciosas podem ocorrer com relativa freqncia em um mesmo processo gastroentrico, agravando o quadro clnico (EVERMANN et al, 1988). Embora a participao de agentes infecciosos bacterianos e parasitrios no deva ser desprezada no contexto das enterites caninas, os principais agentes virais causadores das mesmas so o parvovrus, o coronavrus e o rotavrus canino; porm outras viroses tm sido incriminadas como causadoras de enterites, tais como: calicivirose, adenovirose, herpesvirose, enterovirose, astrovirose e infeces provocadas pelo vrus da parainfluenza (HOSKINS, 2004). Com relao ao locus de ao destrutiva de alguns destes vrus no epitlio entrico sabe-se que o rotavrus, parvovrus e coronavrus so enterotrpicos, sendo que o rotavrus e o coronavrus invadem o pice e a poro medial das vilosidades, respectivamente, enquanto que o parvovrus promove a destruio total das criptas e das vilosidades intestinais (FIGURA 1) (MURPHY et al, 1999).

19

FIGURA 1: PATOGNESE DA DIARRIA INFECCIOSA. (A) BACTRIAS ENTEROTOXIGNICAS NO INVASIVAS; (B) ATROFIA DAS VILOSIDADES DEVIDO A INFECO VIRAL NO PICE DAS VILOSIDADES (EX: CORONAVRUS E ROTAVRUS); (C) COLAPSO DA MUCOSA INTESTINAL POR INFECO VIRAL (EX: PARVOVRUS) FONTE: HOSKINS (1999).

3.2 PARVOVIROSE CANINA

A Parvovirose Canina, por sua alta morbidade e mortalidade aliada grande resistncia do vrus no meio ambiente, tm se destacado dentre os demais enterovrus (POLLOCK & CARMICHAEL, 1979; OTTO et al, 2001). O primeiro parvovrus canino (parvovrus tipo 1 ou CPV-1) foi isolado em 1967 das fezes de ces sadios, sendo denominado minuto vrus canino devido seu tamanho diminuto (CARR et al, 1997). Aps as pandemias de 1977-78, o parvovrus notabilizou-se por causar enterite hemorrgica aguda, altamente contagiosa e prevalente mundialmente, sendo designado de parvovrus tipo 2 (CPV-2)(BURROWS et al, 1995; SHERDING, 1998). Esta variante pode ter sido proveniente do vrus da panleucopenia felina, bem como adquirida de

20 espcies selvagens como lontra, ces do mato, coiotes ou raposas (CARR et al, 1997). Durante os ltimos 20 anos, o vrus canino sofreu alteraes genticas, desenvolvendo novas cepas virais, que o capacitaram a replicar-se e disseminar-se de modo mais eficiente. Em 1980, a cepa original do parvovrus tipo 2 desdobrou-se no subtipo 2a, surgindo em 1984 uma outra variante, designada subtipo 2b (HOSKINS, 2004). O parvovrus tipo 2 mostrou-se extremamente estvel e resistente s influncias ambientais adversas, podendo permanecer vivel em objetos inanimados, como roupas, bebedouros e comedouros, pisos, gaiolas e canis por mais de 5 meses. A inativao do vrus no ambiente pode ser realizada com eficcia utilizando-se hipoclorito de sdio, formol ou glutaraldedo (HOSKINS, 1997). O parvovrus tipo 2 altamente contagioso, tendo como principal forma de contagio a mucosa oronasal atravs do contato direto ou indireto com fezes contaminadas; pessoas, fmites, insetos e roedores tambm podem servir como vetores virais. A doena acomete os ces de qualquer raa, idade ou sexo, sendo mais freqente em filhotes de 6 semanas a 6 meses, e em raas como Rottweiler, Doberman Pinscher, Labrador Retriever e American Pit Bull Terrier. Os filhotes tornam-se mais suscetveis infeco na fase em que h um declnio dos anticorpos maternais, ausncia de adequada imunizao e exposio ao agente viral. (GLICKMAN et al, 1985).

21 3.2.1 PATOGNESE E ALTERAES CLNICAS DA PARVOVIROSE

O parvovrus um DNA vrus epiteliotrfico dependente das DNA e RNA polimerases celulares e que devido a estas carncias enzimticas necessita replicar-se somente em clulas de rpida diviso celular. Por este motivo, invade as clulas das criptas epiteliais do intestino, medula ssea e tecidos linfides (STANN et al, 1984). Aps o contagio pela mucosa orofaringeana, o perodo de incubao leva de 5 a 7 dias; a excreo ativa do vrus nas fezes comea no terceiro dia aps exposio oronasal, antes mesmo do aparecimento dos sinais clnicos. O vrus localiza-se e multiplica-se inicialmente na medula ssea e tecidos linfides, em especial timo, bao e linfonodos mesentricos (FRANKLIN et al, 1986). A primeira viremia pode acontecer no primeiro ou segundo dia psincubao, e a infeco intestinal aps o quarto dia (MEUNIER et al, 1985). Nas criptas das vilosidades intestinais do duodeno e jejuno ocorre a replicao viral, e as clulas ao se romperem so substitudas por clulas epiteliais cubides imaturas sem funo absortiva. Ocorre nas vilosidades tambm severo encurtamento e ocasionalmente fuso das vilosidades adjacentes, com atrofia e reduo da superfcie de absoro intestinal. Conseqentemente, h acmulo de fluido no lmen intestinal e manifestao clnica de diarria normalmente hemorrgica (TIMONEY et al, 1992). A doena ocorre de duas formas distintas: miocardial ou gastrointestinal, sendo a primeira mais rara atualmente (LENGHAUS et al, 1982). A insuficincia cardaca pode ocorrer em filhotes infectados no tero ou logo aps

22 ao nascimento. Esses animais so, freqentemente, encontrados mortos ou apresentam sinais de doena cardaca, como: arritmia, dispnia, tosse, edema pulmonar, ascite, gemidos e sncope (CARPENTER et al, 1980). A resposta clnica dos ces infeco intestinal parvovirtica varivel, podendo ser inaparente (subclnica) ou aguda, e at mesmo fatal. Os casos mais graves geralmente so vistos em filhotes com menos de 12 semanas de idade. Nesta fase ocorre a chamada janela imunolgica devido a queda do ttulo dos anticorpos maternais coincidente com o perodo de rpido crescimento e diviso mittica das clulas intestinais do organismo canino (HOSKINS, 1997). No incio da infeco entrica parvoviral, os sinais clnicos so inespecficos e incluem anorexia, prostrao, letargia e febre. Aps 24 a 48 horas, pode progredir para vmito e diarria sanguinolenta de odor ptrido, evoluindo para desidratao, hipoproteinemia, caquexia e perda de peso (MACINTIRE & CARR, 1997). O filhote recuperado da doena clnica est imune reinfeco por pelo menos 20 meses e, possivelmente pelo resto da vida. Verifica-se que mesmo aps reexposio a diversas cepas de parvovrus canino tipo 2, os filhotes protegidos no apresentam ttulo sorolgico elevado, no demonstram sinais evidentes de doena, nem eliminam o vrus nas fezes (TIZARD, 1998). No hemograma do paciente infectado, pode ser constatada: leucopenia, de intensidade proporcional gravidade e ao estgio da doena; linfopenia, em geral aps 4 ou 5 dias de contaminao oral, devido a destruio dos linfcitos (linfocitlise) ocorrida no timo, linfonodos e bao; e neutropenia, observando-se depleo celular de neutrfilos maduros (segmentados), devido maior perda

23 para o lmen intestinal, acompanhada de desvio esquerda e neutrfilos txicos. E assim sendo, a presena concomitante de leucopenia e neutropenia pode ser um indicativo da severidade do comprometimento intestinal, sugerindo mau prognstico (MACARTNEY et al, 1984). Exames bioqumicos e achados radiogrficos so inespecficos. A deteco das partculas virais nas fezes de pacientes suspeitos pode ser realizada por intermdio de Microscopia Eletrnica, Hemoaglutinao fecal, isolamento viral em cultivo celular ou Ensaio Imuno Enzimtico (ELISA). Estes mtodos so os mais sensveis e especficos para o diagnstico, porm dependentes do perodo de eliminao do antgeno fecal, que breve e cclico. Testes sorolgicos indiretos, como Inibio de Hemoaglutinao, Neutralizao Viral e ELISA tambm podem ser utilizados para diagnstico de infeco passada, ou mesmo para o acompanhamento da condio imunolgica do animal aps vacinao. Concentraes sricas elevadas de IgM podem ser observadas ainda na primeira semana de infeco natural ou mesmo aps vacinao recente com vrus atenuado. J na segunda semana, as concentraes sricas de IgG apresentam aumento, sendo a classe de imunoglobulina predominante em ambos os casos (HOSKINS, 2004). As leses histolgicas, em sua grande maioria, so precisas e de importante valor diagnstico. Extensas leses intestinais so comumente encontradas, sendo inicialmente, mais pronunciadas na poro distal do duodeno, e posteriormente mais severas no jejuno (FIGURA 2) (POLLOCK & CARMICHAEL, 1990). Leses segmentais, descolorao, hemorragia e congesto da serosa intestinal so achados macroscpicos na necropsia (FIGURA 3 e 4) (PLETCHER et al, 1979).

24

FIGURA

2:

NECRPSIA

DE

UM E

CO

COM

PARVOVIROSE EM JEJUNO,

APRESENTANDO

HIPEREMIA

CONGESTO

DESCOLORAO E RUGOSIDADE NA SEROSA DO RESTANTE DOS SEGMENTOS INTESTINAIS. FONTE: GISELE SPREA - HOSPITAL VETERINRIO DA UFPR (2003)

FIGURA 3: INTESTINO DELGADO DE UM CO COM PARVOVIROSE APRESENTANDO INTESTINAL. FONTE: GISELE SPREA - HOSPITAL VETERINRIO DA UFPR (2003) REAS DE COLORAO AVERMELHADA MAIS INTENSA SUGESTIVAS DE PRESENA DE HEMORRAGIA NO LMEM

25

FIGURA 4: MUCOSA INTESTINAL DE UM CO COM PARVOVIROSE APRESENTANDO ESTRIAES TRANSVERSAIS E LONGITUDINAIS. FONTE: GISELE SPREA - HOSPITAL VETERINRIO DA UFPR (2003)

Microscopicamente, as leses so mais proeminentes em reas com proliferao celular. Podem ser observados corpos de incluso intranuclear em clulas epiteliais intactas, atrofia das vilosidades, necrose das clulas epiteliais das criptas. Ocorre substituio dessas por clulas imaturas, bem como fuso das vilosidades adjacentes. Os linfonodos mesentricos podem estar aumentados e edematosos com petquias hemorrgicas multifocais na cortical. O timo pode apresentar-se reduzido e sua cortical necrosada (FIGURA 5, 6 e 7) (POLLOCK & CARMICHAEL, 1990).

26

D A B C

FIGURA 5: MICROSCOPIA PTICA DE UM CORTE HISTOLGICO DO DUODENO DE UM CO COM PARVOVIROSE (OBJETIVA DE 5X). (A) MUCOSA, (B) SUBMUCOSA, (C) SEROSA E (D) INFILTRADO INFLAMATRIO MONONUCLEAR. FONTE: GISELE SPREA CENTRO POLITCNICO (2003).

B A

FIGURA 6: MICROSCOPIA PTICA DE UM CORTE HISTOLGICO DO DUODENO DE UM CO COM PARVOVIROSE (OBJETIVA DE 10X). (A) VILOSIDADES INTESTINAIS E (B) INFILTRADO INFLAMATRIO MONONUCLEAR. FONTE: GISELE SPREA CENTRO POLITCNICO (2003).

27

FIGURA 7 CORTE HISTOLGICO DO DUODENO DE UM CO COM PARVOVIROSE (OBJETIVA DE 5X). (A) NECROSE DE CLULAS EPITELIAIS COM ATROFIA E FUSO DAS VILOSIDADES INTESTINAIS. FONTE: GISELE SPREA CENTRO POLITCNICO (2003).

28 3.3 ENDOTOXEMIAS CAUSADAS POR BACTRIAS GRAM-NEGATIVAS

As enterites virais parvovirticas, por intermdio da replicao viral e destruio seletiva de clulas epiteliais, podem promover a formao de lceras gastrointestinais e conseqentemente a perda da barreira de proteo do intestino, possibilitando a translocao bacteriana (LEGEAY, 2001; LANGHEINRICH & NIELSEN, 1971). A invaso da corrente sangnea por bactrias Gram negativas e anaerbicas caracteriza o evento denominado de bacteremia e contribui para a instalao da Sndrome da Resposta Inflamatria Sistmica, sepsis e endotoxemia (CARTER et al, 1995). A Sndrome da Resposta Inflamatria Sistmica (SRIS) considerada uma resposta do hospedeiro a uma srie de injrias, incluindo quelas de origem infecciosa. A leso primria nesses casos consiste na inflamao difusa do endotlio vascular, e secundariamente ocorrem sinais compatveis como febre, taquicardia, taquipnia e neutropenia. Sepsis diagnosticada quando ocorre a Sndrome da Resposta Inflamatria Sistmica em pacientes com doena infecciosa, associada a presena de bactrias e suas toxinas no sangue ou tecidos. A endotoxemia ocorre por conseqente destruio das clulas bacterianas pelo mecanismo de defesa do hospedeiro, ao lisar a membrana externa das bactrias Gram negativas, ocasionando liberao de endotoxinas (KRUTH, 1990). As endotoxinas so lipopolissacardios (LPS) presentes na parede de bactrias Gram negativas, enquanto que as exotoxinas so toxinas liberadas por bactrias Gram positivas ou Gram-negativas (WESSELS et al, 1987). O LPS composto de trs importantes componentes: lipdios, glicose e

29 carbohidratos. O lipdio A o componente da parede que confere a endotoxicidade bacteriana. A glicose concentra-se na poro mais interna e os carbohidratos encontram-se na superfcie e constituem a especificidade antignica de toda a estrutura celular (SEARLE, 1989). As endotoxinas possuem vrias aes nocivas como: ao pirognica, ao neurotxica por intensa estimulao do sistema nervoso simptico, lesar diretamente as membramas celulares, promover agregao plaquetria, leucocitria e de hemceas, bem como provocar nas hemceas alcalose intracelular, alm de aumentar a permeabilidade capilar (WESSELS et al, 1987). As possveis manifestaes clnicas iniciais de todos esses danos so evidenciadas atravs de febre, tremores, fraqueza, vmitos, diarria mucide com sangue, taquipnia e taquicardia. Em seguida verificam-se os sinais de Sndrome da Resposta Inflamatria Sistmica como hipertenso portal, seqestro de sangue para fgado e bao, diminuio da presso venosa central e da resistncia vascular sistmica. O fluxo sangneo para os tecidos apresenta-se reduzido, as extremidades corporais podem ficar frias, as mucosas plidas e o pulso fraco (KRUTH,1990). A resposta a endotoxemia espcie-especfica. Ces desenvolvem hipertenso portal, com congesto gastrointestinal e edema. Gatos

desenvolvem hipertenso pulmonar e bronquioconstrio, resultando em insuficincia respiratria aguda (HARDIE, 1990). Em ambas as espcies, o choque progride comprometendo a integridade vascular, promovendo

insuficincia de miocrdio, hipotenso generalizada, coagulao intravascular disseminada e hipo ou hiperglicemia (JAWETZ et al, 1980).

30 O choque endotxico a resposta extrema do hospedeiro endotoxemia; pode ser definido como uma profunda deficincia de perfuso dos tecidos, inadequada oxigenao compensada provisoriamente atravs da respirao anaerbica, podendo progredir para hipxia e morte (ISOGAI et al, 1989). Aproximadamente 25% dos humanos com bacteremia causada por bactrias Gram negativas desenvolvem choque endotxico, e deste montante 50 a 80% dos mesmos vo bito. No entanto a prevalncia de endotoxemia em pequenos animais ainda no foi bem determinada (KRUTH, 1990). De acordo com DOW et al (1989), em um estudo envolvendo ces doentes e debilitados, 49% desses animais apresentavam doena infecciosa associada bacteremia. As bactrias Gram negativas estavam presentes em 46% dos casos, os cocos Gram positivos em 36% e as bactrias anaerbicas em 31%. Em pequenos animais, as bacteremias por bactrias Gram negativas e a conseqente endotoxemia podem ocorrer tanto em situaes de enterite hemorrgica como as verificadas na parvovirose, bem como em acidentes gastrointestinais em que haja comprometimento da perfuso vascular como as observadas em casos de vlvulo dilatao gstrica e toro gastroesplnica, Tambm ocorre em casos de piometra, peritonite, mastite, insuficincia heptica primria e "shunts" portossistmico (SEARLE, 1989). Em condies normais, o ingresso de endotoxinas na circulao geral dificultado pela mucosa intestinal ntegra, e aquelas bactrias que conseguem penetrar na circulao portal so imediatamente destrudas pelas clulas do sistema retculo-endotelial do fgado e do bao, sem causar dano maior. No choque endotxico as endotoxinas estimulam as terminaes simpticas ps-

31 ganglionares que liberam catecolaminas, promovendo a vasoconstrio. Esta insuficincia funcional vasoconstritiva bloqueia a perfuso sangnea, diminui a oferta circulatria aos tecidos por longo perodo, provocando leses celulares graves por hipxia isqumica e facilitando a absoro de endotoxinas na circulao (BOGOSSIAN, 1991). A endotoxemia interfere no metabolismo geral dos carbohidratos, lipdios e protenas, causando uma srie de efeitos metablicos tais como: inicialmente, rpida hiperglicemia e, mais tarde, hipoglicemia com acentuada diminuio nas reservas de hidrato de carbono, aumento do nvel de cidos graxos circulantes e interferncia na sntese do NAD (nicotinamina

dinucleotdeo) (RAISER, 2002). Distrbios gastroentricos associados a endotoxemia comumente resultam em choque, por ativao generalizada de mediadores inflamatrios, liberados de moncitos e macrfagos, freqentemente localizados no foco de infeco (SHERDING, 1998; HARDIE, 1990). Citocinas e demais produtos de estimulao dos macrfagos, tais como Interleucina 1 (IL-1) e Fator de Necrose Tumoral (TNF) so liberados em resposta as endotoxinas circulantes, atuando como mediadores centrais da resposta do hospedeiro infeco bacteriana e precursores da Sndrome da Resposta Inflamatria Sistmica (MINS et al, 1995). Os nveis basais do TNF comeam a subir aps 15 minutos de exposio aos LPS, alcanando seu pico em 2 horas, e retornando aos nveis normais aps 4 horas. A IL-1 liberada logo em seguida ao TNF. Ambas as citocinas promovem efeitos em cascata como: liberao de citocinas pelos linfcitos T, aumento da produo de anticorpos, ativao de neutrfilos,

32 estimulao hematopoitica, aumento da liberao de prostaglandinas, citocinas e outros mediadores dos macrfagos, aumento da liplise e diminuio da atividade da lipase lipoproteica nos adipcitos, induo de reao de fase aguda nos hepatcitos, alterao na produo de insulina, glucagon, catecolaminas e glicocorticides (PUDIFIN et al, 1985). Outras citocinas como IL-6 na e IL-8 so reconhecidas e como mediadores so

complementares

endotoxemia;

prostaglandinas

leucotrienos

responsveis por uma srie de efeitos vasculares; enquanto que outros mediadores secundrios como, beta-endorfinas, histamina, serotonina,

vasopressina, angiotensina II e catecolaminas amplificam a resposta inicial no choque endotxico (KRUTH, 1990). OTTO et al (1997) e ISOGAI et al (1989) demonstraram que 82% dos ces com parvovirose apresentaram graus variados de endotoxemia, sendo detectado na circulao dos mesmos o Fator de Necrose Tumoral. Tambm sugeriram que a atuao das endotoxinas e da cascata de citocinas liberadas em conjunto apresentaram grande importncia na patofisiologia da enterite parvovirtica, relacionando a ocorrncia de diarria com sangue mais presena desses fatores de que prpria infeco viral. OTTO et al (2001) acreditam que a interrupo do processo inflamatrio por intermdio da neutralizao das endotoxinas pode reduzir a mortalidade e resultar em melhora clnica dos ces com parvovirose. Uma perfeita definio do preponderante papel das endotoxinas das bactrias entricas j foi elucidado em trabalhos cientficos utilizando coelhos com e sem microbiota intestinal normal. Nos coelhos com microbiota normal, ocorreu endotoxemia logo aps diversos traumas entricos e morte em 12

33 horas. Nos coelhos em que as bactrias intestinais tinham sido previamente removidas, no houve endotoxemia. Ao reintroduzirem bactrias Gram negativas junto aos alimentos, a endotoxemia surgiu. Este experimento demonstrou que a microbiota intestinal composta, principalmente, de enterobactrias Gram negativas adiciona elementos de letalidade evoluo dos traumas fsicos em geral (BOGOSSIAN, 1991).

3.4 ENTEROBACTRIAS DA MICROBIOTA ENTRICA NORMAL

As enterobactrias so microrganismos geralmente mveis, aerbicos e anaerbicos facultativos, oxidase negativo (no apresentam a enzima citocromo-oxidase), catalase positivo, fermentadores de glicose e redutores de nitrato nitrito como parte dos processos de gerao de energia (SCANLAN,1991). Esses microrganismos pertencem famlia das

Enterebacteriaceae, que inclui uma srie de gneros como, Escherichia sp., Shigella sp., Salmonella sp., Enterobacter sp., Klebsiella sp., Proteus sp., Morganella sp., Yersinia sp., Citrobacter sp. e Serratia sp. (TRABULSI & TOLEDO, 1998). Alguns desses gneros fazem parte da microbiota normal do trato intestinal tendo um papel benfico na produo de determinadas vitaminas e aminocidos essenciais. Outros so caracterizados pela sua patogenicidade e virulncia ao hospedeiro. No entanto, todos podem provocar endotoxemias, independentemente de apresentarem ou no patogenicidade (BROOKS et al, 1995). Muitas das reaes e caractersticas bioqumicas da famlia das Enterobacteriaceae servem para disting-las de outras famlias de bactrias de

34 igual importncia. Bastonetes Gram negativos No Fermentadores tambm so freqentemente isolados de fezes caninas e apresentam potencial risco de endotoxicidade em casos de complicaes infecciosas que envolvam a integridade da mucosa intestinal (WOOLCOCK, 1985). A Pseudomonas aeruginosa constitui a principal espcie representante dessa famlia e, ao contrrio das Enterebacteriaceae, um organismo aerbico estrito, oxidasepositivo (produz energia por oxidao), no fermentador de glicose e no redutor de nitrato nitrito (LEVINSON & JAWETZ, 1998). Embora seja possvel efetuar uma identificao preliminar dos membros da famlia Enterobacteriaceae com base nas caractersticas coloniais e bioqumicas encontradas em gar TSI, uma identificao mais precisa requer uma srie de testes bioqumicos complementares. Com este fim, so realizadas provas que avaliam as caractersticas metablicas dos membros da famlia Enterobacteriaceae e que compem as clssicas reaes IMViC (I, Indol; M, Vermelho de Metila; V, Voges-Proskauer; C, Citrato), termo utilizado por sanitaristas e epidemiologistas para referir-se s provas necessrias para detectar contaminao fecal de guas e alimentos. Estas provas foram adotadas a princpio, com a finalidade de diferenciar Escherichia coli de Enterobacter aerogenes, sendo esta segunda espcie amplamente distribuda no solo e na matria vegetal, sem no entanto significar necessariamente contaminao fecal (QUINN et al, 1994).

35 TABELA 1 : CARACTERSTICAS-CHAVE PARA IDENTIFICAO DOS MEMBROS DA FAMLIA Enterobacteriaceae TSI E.coli Shigella A/A Alc/A H2S VM + + -/+ + + + + + + -/+ -/+ -/+ + + + + VP + + + +/+ +/_ IND + -/+ + +/-/+ -/+ +/+ + +/CIT + + + + +/+ -/+ + URE MOT +/+ +/-/+ + + +/+/+ + + + + + + + + + +/LIS + + + + +/+ + -

Edwardsiella Alc/A Salmonella Alc/A Alc/A A/A A/A Klebsiella Enterobacter A/A Alc/A Hafnia Citrobacter Pantoea Serratia Proteus Morganella Providencia Yersinia Alc/A A/A Alc/A Alc/A Alc/A Alc/A Alc/A

FONTE: KONEMAN et al, 2001 TSI: Trplice acar com ferro; H2S: Sulfeto de hidrognio; VM: Vermelho de metila; VP: Voges-Proskauer; IND: Indol; CIT: Citrato; URE: Uria; MOT: Motiliddade; LIS: Lisina; A:cido; Alc: Alcalino.

36 3.5 MICROBIOTA INTESTINAL NATIVA X PATOGNICA

A microbiota intestinal nativa vive uma relao de simbiose com o hospedeiro. Por intermdio da colonizao da mucosa, ela ocupa o seu espao no intestino grosso ao liberar produtos metablicos inibitrios ao crescimento de bactrias estranhas, prevenindo que outros microrganismos patognicos colonizem o local. Microrganismos com ao deletria no trato gastrointestinal so classificados de enteropatognicos, dentre estes esto: Escherichia coli (determinadas cepas patognicas), Clostridium perfringens, Salmonella sp., Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus , Vibrio cholerae, Campylobacter sp. e Shigella sp.. Bactrias que causam comprometimento da mucosa e diarria por liberao de enterotoxinas denominam-se Enterotoxignicas e incluem: Escherichia coli (ETEC), Clostridium perfringens, Salmonella sp., Yersinia enterocoltica, Yersinia pseudotuberculosis, Staphylococcus aureus e Vibrio cholerae. Outras bactrias que causam diarria por invaso de mucosa e submucosa so denominadas de Enteroinvasivas e incluem: Escherichia coli (EIEC),

Salmonella typhimurium, Yersinia enterocoltica, Yersinia pseudotuberculosis, Campylobacter sp. e Shigella sp. (FRANKLIN et al, 1986).

37 TABELA 2: MECANISMOS E LOCAIS DE AO DE MICRORGANISMOS ENTEROPATOGNICOS: FONTE: HOSKINS (1999). MECANISMOS E MICROORGANISMOS Produo de Enterotoxinas Vibrio cholerae Staphylococcus Clostridium perfringens Bacillus cereus Vibrio parahaemolyticus Escherichia coli (ETEC) Yersinia enterocoltica Klebsiella pneumoniae Campylobacter jejuni Salmonella typhimurium Entamoeba histolytica Enteroaderentes Enterococci Escherichia coli (EAgg) Girdia Invaso da Mucosa Salmonella (certos sorotipos) Shigella B.cereus V. parahaemolyticus Escherichia coli (EIEC) Campylobacter Helicobacter Coccidia Invaso da Submucosa Salmonella (certos sorotipos) Shigella Escherichia coli (EIEC) Candida Histoplasma Aspergillus Atrofia das Vilosidades Coronavirose Reovirose Rotavirose Degenerao das Criptas Parvovirose Canina Panleucopenia Felina LOCAL Intestino delgado (ID) Estmago e ID ID ID em estgio inicial ID ID ID e clon ID ID ID em estgio inicial

ID e clon ID ID leo em estgios tardios Clon ID em estgios tardios ID em estgios tardios ID ID Estmago, ID, clon ID

ID ID e clon ID Estmago e ID Clon Clon ID ID ID Primeiramente ID Primeiramente ID

38 Alm da participao da microbiota nativa no decorrer do choque endotxico, pode ainda ocorrer o agravamento do quadro clnico caso haja a participao dos microrganismos enteropatognicos e seus mecanismos de virulncia (HOSKINS, 1999). De acordo com CALVERT & GREENE (1984), o isolamento em duas ocasies distintas, de Escherichia coli, Pseudomonas sp., Staphylococcus aureus, Proteus sp. e Klebsiella sp. em hemoculturas de animais

comprometidos confirma a presena de bacteremia, enquanto que a presena de Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium sp. e Bacillus sp. podem ser um achado decorrente da contaminao cutnea no momento da venopuno. Segundo KREEGER et al (1984), bacteremia concomitante

parvovirose foi detectada em sete filhotes, tendo sido isolados do sangue destes animais Klebsiella oxytoca e Enterobacter cloacae, consideradas habitantes normais da microbiota intestinal dos ces. TURK et al (1990), citaram um estudo com 88 ces apresentando infeco grave por parvovrus, dos quais no "post mortem" foi isolado Escherichia coli do pulmo e/ou do fgado em 90% dos animais. Em 69% dos casos, foram visualizadas leses pulmonares semelhantes quelas

encontradas em humanos com Sndrome da Angstia Respiratria, na qual ocorre insuficincia respiratria progressiva e fatal associada a edema pulmonar e alveolite. TURK et al (1992), em outra pesquisa envolvendo ces com parvovirose entrica isolaram Clostridium perfringens do jejuno desses animais, em 69% dos casos. Essa espcie compe parte da microbiota normal da poro distal do intestino delgado e de todo o intestino grosso. A hipermotilidade intestinal

39 associada com diarria, freqentemente, reduz a microbiota bacteriana anaerbica normal e pode predispor ao crescimento bacteriano na poro proximal do intestino delgado. De acordo com BARNES (1986), Clostridium perfringens tambm pode ser isolado na ausncia de outros patgenos entricos, das fezes de ces com diarria. OSWALD et al (1994) relataram ser comum o isolamento de Campylobacter sp. em infeces diarricas nos animais e no homem. Ces podem ser carreadores assintomticos e a infeco, freqentemente, autolimitante em perodo de sete a dez dias. O Campylobacter jejuni raramente responsvel por participao nas bacteremias, apesar disso, tm potencial para sepsis e envolvimento extraintestinal. HAGIWARA et al (1996), em seu trabalho, no isolaram

enteropatgenos como, Salmonella sp. e Escherichia coli enteropatognica, das fezes de ces com severa enterite por parvovrus, citando ser pouco freqente tais infeces intercorrentes na patogenia da parvovirose. Esclareceu que a possibilidade de infeco por bactrias do gnero Campylobacter sp. concomitante parvovirose bem descrita. Entretanto a proporo desses microrganismos isolados das fezes de ces infectados foi muito similar encontrada em ces sadios, no sendo assim considerada como a causa da diarria nesses pacientes. Foi verificada bacteremia por Escherichia coli, Alcaligenes odorans e Pseudomonas sp. atravs de hemocultura realizada em cinco animais com parvovirose, dos quais quatro sofreram evoluo fatal. RZEZUTKA et al (2003) relataram um caso de parvovirose canina fatal, do qual foi isolada Escherichia coli enterotoxignica atravs do exame bacteriolgico das fezes colhidas do lmen intestinal. Segundo os autores o

40 inapropriado uso de antibiticos resultou na seleo de agentes resistentes, sendo, na atualidade, freqente o envolvimento e isolamento de bactrias enterotoxignicas e/ou enteropatognicas nesses casos. Dentre os enteropatgenos mais freqentes isolados de casos de enterites em mamferos, destaca-se das demais espcies a Escherichia coli (BEUTIN, 1999). Atualmente so reconhecidos cinco tipos causadores de infeces entricas no homem e nos animais, com distintos padres clnicos, epidemiolgicos, patognicos e sorotipos (GYLES, 1994): Escherichia coli enteropatognica (EPEC), Escherichia coli enterotoxignica (ETEC),

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC) e Escherichia coli enterohemorrgica (EHEC), sendo somente as duas primeiras classes associadas s gastroenterites caninas (NATARO & KAPER, 1998).

3.6 TRATAMENTO DAS GASTROENTERITES INFECCIOSAS

O tratamento das gastroenterites infecciosas so inespecficos e de suporte. Os principais objetivos teraputicos consistem em restaurar o equilbrio hdrico e eletroltico, poupar o trato gastrointestinal, utilizar agentes antiemticos e antimicrobianos (HOSKINS, 2004). Os agentes antimicrobianos so indicados para prevenir e controlar as septicemias bacterianas (SHERDING, 1998). O uso de antibiticos parenterais em casos de enterites inquestionvel, devido ao intenso comprometimento da mucosa intestinal e conseqente perda da barreira de proteo, no havendo, no entanto protocolo fixo (HOSKINS, 2004). Nestas condies, antibiticos

41 orais no so recomendados, pois podem alterar a microbiota intestinal em favor de patgenos entricos, alm de promover a difuso e a resistncia de microrganismos enteropatognicos como a Salmonella sp. (POLLOCK & CARMICHAEL, 1990). Nos casos mais severos de enterite viral, a associao de um aminoglicosdeo (gentamicina na dose de 2,2 mg/Kg ou amicacina na dose de 10 mg/Kg a cada 8 horas) com um beta-lactmico (ampicilina na dose de 2 mg/Kg ou cefazolina na dose de 22 mg/Kg cada 8 horas) promove boa cobertura contra bactrias Gram negativas e anaerbicas. Por outro lado, aminoglicosdeos podem causar insuficincia renal aguda e devem ser utilizados somente aps rehidratao do paciente. O uso em dias alternados pode minimizar seus efeitos renais e maximizar sua ao antimicrobiana, promovendo picos do antibitico na circulao com baixas concentraes no restante do tempo. Mas, mesmo assim, altas doses no podem ser utilizadas em ces desidratados e urinlise deve ser realizada para monitorao da funo renal. A enrofloxacina (na dose de 5mg/Kg a cada 12 horas), a cefoxitina (na dose de 25 mg/Kg a cada 6 horas) ou ainda o ceftiofur (na dose de 2,2 a 4,4 mg/Kg a cada 12 horas) so alternativas para se evitar o uso dos aminoglicosdios. Em casos mais brandos da infeco, porm pode-se recorrer ao uso isolado da ampicicilina ou cefazolina, ou ainda utilizar sulfa-trimetropim (na dose de 30 mg/Kg cada 12 horas) (MACINTIRE & CARR, 1997).

42 TABELA 3: TERAPIA DE PACIENTES COM ENTERITE VIRAL CANINA MEDICAMENTOS Antiemticos Clorpromazina Metoclopramida Antimicrobianos Ampicilina Cefazolin Ceftiofur Gentamicina Protetores Gstricos Cimetidina Ranitidina FONTE: HOSKINS (1999). 5 - 10 2-4 IM, IV SC, IV 68 68 0,5 1,0 0,05 0,2 - 0,4 1 -2 10-20 22 2,2 - 4,4 2 IM Retal IV SC IV IV, IM, SC IV, IM SC IM, SC 8 8 8 8 24 68 8 12 8 DOSAGEM INTERVALO VIA DE (mg/Kg) ADMINISTRAO (em horas)

Nas primeiras vinte e quatro horas do incio dos sinais clnicos da parvovirose, tambm recomenda-se terapia adjuvante que inclui a transfuso de plasma hiperimune especfico (de 8 a 10 ml/Kg por via intravenosa uma nica vez), a administrao de fator recombinante humano estimulante da colnia de granulcitos (rG-CSF) (5 a 10 g/Kg, por via subcutnea, diariamente at o nmero de neutrfilos exceder 1500/l) ou o fornecimento de soros antiendotoxina (dose de acordo com as normas do fabricante) (WELLS et al, 1987).

43 3.7 ANTIBITICOS E AGENTES ANTIMICROBIANOS SINTTICOS

Classicamente, os agentes antimicrobianos empregados no tratamento de doenas infecciosas so divididos em dois grupos principais: os antibiticos e os agentes quimiossintticos (KETCHUM, 1988). Os antibiticos so definidos como aquelas substncias produzidas naturalmente por um microrganismo, capazes de matar ou inibir o crescimento de outro microrganismo. sintticos Os so agentes todos quimiossintticos aqueles ou agentes orgnicos

antimicrobianos

compostos

quimicamente sintetizados que possuam atividade txica seletiva aos microrganismos (FERREIRA, 1997). Os antibiticos e agentes antimicrobianos sintticos diferem

acentuadamente nas suas propriedades fsicas, qumicas, biolgicas e farmacolgicas, no espectro antibacteriano e nos mecanismos de ao. Do ponto de vista histrico, a classificao mais comum baseia-se no mecanismo de ao proposto da seguinte maneira: (CHAMBERS & SANDE, 1996). Agentes que inibem a sntese da parede celular bacteriana: penicilinas, cefalosporinas, vancomicina e bacitracina. Agentes que interferem na atividade da membrana celular: polimixina, anfotericina B, nistatina, colistina. Agentes que interferem na replicao gentica: aminoglicosdios, cloranfenicol, tetraciclinas, eritromicina e clindamicina. Agentes que interferem no cromossomo: quinolonas, cido nalidxico, cido pipemdico, novobiocina, griseofulvina.

44 Agentes que bloqueiam etapas metablicas especficas: trimetropinas, sulfas, nitrofuranos e amprlio (ANDRADE et al , 2002).

3.8 TESTE DE SENSIBILIDADE IN VITRO

A sensibilidade dos microrganismos ao dos agentes antimicrobianos pode ser testada in vitro por meio de provas de sensibilidade, chamadas de antibiograma. Os dois testes mais comumente utilizados so o teste de difuso em disco (qualitativo) e o teste de diluio em gar ou Caldo (quantitativo), sendo o primeiro o mais utilizado na rotina (TAVARES, 1999). O meio de crescimento utilizado para ambos os testes o MuellerHinton, na forma de gar ou caldo, com eficincia em avaliar isolados bacterianos aerbios e anaerbios facultativos. A formulao desse meio a que mais se aproxima dos critrios de um meio reprodutvel e a maioria dos patgenos cresce de maneira satisfatria. O gar um composto natural, preparado a partir de algas vermelhas, que contm infuso de carne desidratada, digerindo cido de casena e amido de milho (KETCHUM, 1988). O teste de difuso em disco efetuado aplicando-se discos de papel filtro comercialmente disponveis, impregnados com quantidades especficas do frmaco, superfcie de placas de gar, sobre as quais foi espalhada uma cultura pura do microrganismo. Assim que o disco impregnado entra em contato com a superfcie mida do gar, a gua absorvida no papel filtro e o princpio ativo do antibitico se difunde no meio circundante. A velocidade de extrao do antibitico para fora do disco maior do que sua difuso para o centro, de tal forma que a concentrao de antibitico imediatamente adjacente

45 ao disco pode exceder do prprio disco. Entretanto, medida que aumenta a distncia em relao ao disco, ocorre uma reduo logartmica da concentrao do antibitico (KONEMAM et al, 2001). Na placa semeada com a suspenso bacteriana, ocorre

desenvolvimento das clulas bacterianas sobre a superfcie do gar, simultneo difuso do antibitico. Quando alcanada uma massa celular bacteriana crtica, a atividade inibitria ultrapassada e aparece o crescimento bacteriano. O tempo requerido para que seja alcanada a massa celular crtica caracterstico de cada espcie, mas depende da composio do meio e da temperatura de incubao (QUINN et al, 1994). Ao trmino da prova, os pontos nos quais a massa celular crtica foi alcanada aparecem com um crculo (halo) com borda claramente definida de crescimento bacteriano. O dimetro obtido denomina-se de halo de inibio e pode ser mensurado, sendo os resultados interpretados como Sensvel, Intermedirio e Resistente ao antimicrobiano em questo (RUBEL et al, 2002). O NCCLS (National Committee for Clinical Laborarory Standards) reconhece essas trs categorias de sensibililidade a antibiticos para as provas de diluio. Sensvel indica que o microrganismo deve responder s doses habituais do agente antimicrobiano administradas por via adequada, incluindo oral. Intermedirio subentende que o isolamento pode ser inibido por concentraes do antibitico alcanadas quando so administradas doses mximas por via parenteral, sendo possvel sua utilizao teraputica, porm devendo ser consideradas outras opes que possam propiciar um tratamento timo. Resistente indica que a bactria no inibida por concentraes alcanveis do antimicrobiano, e, portanto, este no deve ser eleito para

46 tratamento, exceto no caso de certos lquidos corpreos nos quais podem ser acumuladas altas concentraes do agente (KONEMAM et al, 2001).

47 4 -MATERIAL E MTODOS

4.1 LOCAL DO EXPERIMENTO O experimento foi realizado no Laboratrio de Microbiologia Veterinria da Universidade Federal do Paran, durante os anos de 2003 e 2004, a partir de amostras colhidas de pacientes atendidos no Hospital Veterinrio da prpria Universidade.

4.2 PACIENTES ALVOS DO EXPERIMENTO

Participaram deste experimento 50 ces com idade variando entre 2 a 12 meses apresentando diarria hemorrgica. Os pacientes foram avaliados quanto ao histrico e sinais clnicos evidenciados ao exame fsico, hemograma complementar e acompanhamento hospitalar em tempo necessrio para melhora clnica.

4.3 COLHEITA DAS AMOSTRAS FECAIS

As 50 amostras fecais foram colhidas diretamente da ampola retal com o auxlio de swabs estreis embebidos com material fecal, armazenados e transportados em meio de transporte de Amiens ao Laboratrio de Microbiologia do Departamento de Medicina Veterinria para a realizao das anlises bacteriolgicas.

48 4.4 PLAQUEAMENTO E ISOLAMENTO BACTERIANO

As culturas bacterianas foram realizadas inicialmente com o auxlio do swab contendo a amostra a ser analisada, sendo esta espalhada na superfcie de uma placa de Petri contendo gar MacConkey (ANEXO 1.1.1). A seguir, com o auxlio de uma ala de Nquel-Cromo e um Bico de Bnsen, foram realizadas semeaduras em esgotamento de modo a possibilitar a obteno de colnias bacterianas isoladas e puras. As placas foram incubadas a 37C por 24-48 horas em estufa bacteriolgica comum.

4.5 IDENTIFICAO BIOQUMICA PRELIMINAR As colnias isoladas na superfcie do gar MacConkey foram inicialmente identificadas fenotipicamente quanto a sua capacidade de fermentar a lactose, sendo classificados como Fermentadores ou No Fermentadores da Lactose, segundo FORBES et al (1998). A seguir uma colnia fenotipicamente representativa foi escolhida e semeada em Tubo contendo gar com Trs Aucares e Ferro (TSI), os quais foram incubados a 37C por 24-48 horas (ANEXO 1.1.4). A capacidade de Fermentar ou no a Glicose em anaerobiose, bem como as demais caractersticas bioqumicas presuntivas e preliminares neste meio foram avaliadas e anotadas definindo a escolha de testes para a realizao da identificao definitiva (MOURA et al, 1997).

49 4.6 IDENTIFICAO BIOQUMICA DEFINITIVA

Para as culturas que em gar TSI mostraram capacidade Fermentadora da Glicose em anaerobiose, foram realizadas as seguintes provas bioqumicas complementares preconizadas por EDWARD e EWING (1972): Prova do Indol ; Vermelho de Metila; Voges-Proskauer; Citrato; Uria; Mobilidade e Lisina Descarboxilase (ANEXO 1.1.5 1.1.10 e 2.1.3 2.1.7). As culturas que em gar TSI no mostraram capacidade Fermentadora da Glicose em anaerobiose foram realizadas as seguintes provas bioqumicas complementares preconizadas por KING & WEAVER (KONEMAN et al, 2001): Prova da Oxidao da Glicose em Aerobiose e Prova do Citocromo Oxidase em papel filtro (ANEXO 1.1.11; 2.1.8, 2.1.9). Os meios de cultura utilizados para realizao destas provas foram incubados 48-96 horas a 37C em estufa bacteriolgica comum.

50 FIGURA 8: ESQUEMA ADAPTADO PARA ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE MEMBROS DA FAMLIA Enterobacteriaceae. FONTE: KONEMAN et al, 2001 Amostras fecais Swabs retais

gar MacConkey Incubao aerbica em 37C por 24-48 horas Lactose positiva Colnia Rosa Lactose negativa Colnia Incolor

TSI

No Fermentadoras de Glicose

Fermentadoras de Glicose

TESTES BIOQUMICOS : OXIDAO DA GLICOSE EM MEIO DE HUGH-LEIFSON Indol VM VP Citrato Uria Mobilidade Lisina Prova da Citocromo Oxidase

51 4.7 TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

As culturas bacterianas, uma vez identificadas, foram submetidas aos testes de sensibilidade frente a 20 diferentes antimicrobianos. A tcnica utilizada foi a de Difuso em gar preconizada por BAUER et al (1966). Para tanto, foram utilizados discos contendo o antimicrobiano concentrado da marca NewProv, cujo controle de qualidade foi realizado com a cepa padro de Escherichia coli 25.922, com os seguintes princpios ativos e concentraes: Penicilina (10 UI), Ampicilina (10 cg), Amoxicilina (10 cg), Amoxicilina com cido Clavulnico Potssio (20/10 cg), Cefalexina (30 cg), Cefalotina (30 cg), Ceftriaxona (30 cg), Cefadroxil (30 cg), Imipenm (10 cg), Lincomicina (2 cg), Sulfa com Trimetropina (25 cg), Gentamicina (10 cg), Amicacina (30 cg), Neomicina (30 cg), Eritromicina (15 cg), Tetraciclina (30 cg), Doxiciclina (30 cg), Ciprofloxacina (5 cg), Norfloxacina (10 cg) e Enrofloxacina (10 cg). Cinco colnias puras obtidas em gar MacConkey colhidas em pool com swab estril foram diludas em soluo fisiolgica e homogenizadas at verificar-se uma turbidez correspondente escala 0,5 de McFarland (RUBEL et al, 2002). A inoculao das placas foram realizadas com swabs umedecidos nestas culturas e os discos de antimicrobianos depositados nas placas manualmente com o auxlio de uma pina, em condies de esterilidade em fluxo laminar (ANEXO 1.1.2). Aps 18-24 horas de incubao a 37C foi realizada a leitura com uma rgua transparente e milimetrada para determinar precisamente o dimetro (em mm) do halo de inibio. A interpretao para cada antibitico baseou-se nas especificaes contidas na TABELA 4:

52 TABELA 4: PADRO INTERPRETATIVO DAS ZONAS DE INIBIO (em mm) DE ANTIBIOGRAMA, SEGUNDO A TCNICA DE BAUER (1966). ANTIBITICOS Penicilina Ampicilina Amoxicilina Amoxicilina Clavulanato Cefalexina Cefalotina Ceftriaxona Cefadroxil Imipenm Lincomicina Sulfa Trimetropim Gentamicina Amicacina Neomicina Eritromicina Tetraciclina Doxiciclina Ciprofloxacina Norfloxacina Enrofloxacina CONC. 10UI 10 cg 10 cg 20/10 cg 30 cg 30 cg 30 cg 30 cg 10 cg 2 cg 25 cg 10 cg 30 cg 30 cg 15 cg 30 cg 30 cg 5 cg 10 cg 10 cg SIGLA PEN AMP AMO AMC CFX CFL CRO CEF IPM LIN SUT GEN AMI NEO ERI TET DOX CIP NOR ENO R 14 ou 13 ou 11 ou 13 ou 14 ou 14 ou 13 ou 14 ou 13 ou 14 ou 10 ou 12 ou 14 ou 12 ou 13 ou 14 ou 14 ou 15 ou 12 ou 12 ou I 14 a 16 12 a 13 14 a 17 15 a 17 15 a 17 14 a 20 15 a 17 14 a 15 15 a 20 11 a 15 13 a 14 15 a 16 13 a 14 14 a 22 15 a 18 15 a 18 16 a 20 13 a 16 13 a 16 S 15 ou + 17 ou + 14 ou + 18 ou + 18 ou + 18 ou + 21 ou + 18 ou + 16 ou + 21 ou + 16 ou + 15 ou + 17 ou + 15 ou + 23 ou + 19 ou + 19 ou + 21 ou + 17 ou + 17 ou +

FONTE:LABORCLIN - Produtos para Laboratrios Ltda CONC.: Concentrao; R: Resistente; I: Intermedirio; S: Sensvel.

53 4.8 BACTERIOTECA

As 50 cepas bacterianas representativas isoladas e identificadas foram semeadas em frasco contendo meio de preservao de Lignires com sangue, de modo a obter uma bacterioteca disponvel para a realizao de provas bioqumicas complementares (ANEXO 1.1.3). Estes frascos, contendo as cepas em questo, foram armazenados em temperatura de refrigerao 4C.

4.9 ANLISE ESTATSTICA Na anlise da comparativa da ao antibacteriana entre dois antimicrobianos distintos foi aplicado o Teste do Qui-Quadrado e Exato de Fisher. O objetivo da realizao desses testes foi verificar se, estatisticamente, os resultados obtidos para os antimicrobianos diferem ou no entre si. Porm, devido baixa freqncia observada em algumas situaes, o Teste do QuiQuadrado no aplicvel em todos os casos, sendo utilizado assim o Teste de Fisher. Para efeito de hipteses, testou-se em ambos os testes Ho denominada de hiptese nula e Ha denominada de hiptese alternativa. Adotou-se para isso: Ho: antibitico 1 estatisticamente igual ao antibitico 2 Ha:antibitico 1 difere estatisticamente do antibitico 2 Como foi sempre testada a hiptese Ho, sempre rejeitou-se ou no, somente a mesma. Para a hiptese nula ser rejeitada necessrio obter-se um p-valor baixo, que usualmente assim considerado quando abaixo de 0,05.

54 5 RESULTADOS

5.1 HISTRICO DE VACINAO E HEMOGRAMA COMPLEMENTAR

Na anamnese de todos os animais integrantes do experimento constatou-se ausncia de vacinao prvia ou protocolo vacinal incompleto e/ou inadequado. Ao hemograma, observaram-se leucopenia em 72% dos casos, linfopenia em 78% e neutropenia em 36%. Desvio de neutrfilos esquerda foi bastante freqente, sendo observado em 92% dos pacientes, enquanto que a presena de neutrfilos txicos em graus variveis foi verificada em 58% dos hemogramas complementares realizados.

5.2 ISOLAMENTO E IDENTIFICAO BIOQUMICA PRELIMINAR As cinqenta cepas isoladas em gar MacConkey apresentaram na superfcie do meio de cultura as seguintes caractersticas fenotpicas: 39 cepas Fermentadoras da Lactose (FIGURA 9); 8 cepas No Fermentadoras da Lactose (FIGURA 10) e 3 culturas que apresentaram tanto colnias Fermentadoras quanto colnias No Fermentadoras (GRFICO 1) (ANEXO 2.1.1). Quando submetidas identificao bioqumica no gar TSI, 45 cepas apresentaram caractersticas bioqumicas da Famlia Enterobacteriaceae (Fermentadoras da Glicose em anaerobiose) e 2 cepas apresentaram caractersticas bioqumicas da Famlia Pseudomonadaceae (No

Fermentadoras da Glicose em anaerobiose) (ANEXO 2.1.2).

55

GRFICO 1: PORCENTAGEM DE CEPAS ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA CLASSIFICADAS COMO FERMENTADORAS DE LACTOSE E NO FERMENTADORAS DE LACTOSE

14%

6%

Lactose Positiva (40) Lactose Negativa (07) Mistas (03)

80%

56

FIGURA 9: CARACTERSTICA FENOTPICA DAS COLNIAS BACTERIANAS FERMENTADORAS DE LACTOSE (LACTOSE POSITIVA) FONTE: LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DO DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINRIA DA UFPR (2004)

FIGURA NEGATIVA)

10:

CARACTERSTICA NO

FENOTPICA DE

DAS

COLNIAS (LACTOSE

BACTERIANAS

FERMENTADORAS

LACTOSE

FONTE: LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DO DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINRIA DA UFPR (2004)

57 As 45 cepas classificadas preliminarmente como Fermentadoras de Glicose mostraram-se pertencentes Famlia Enterobacteriaceae quando submetidas identificao bioqumica preconizada por EDWARD e EWING (1974). As duas cepas classificadas preliminarmente como No Fermentadoras da Glicose mostraram-se pertencentes Famlia Pseudomonadaceae quando submetidas identificao bioqumica preconizada por KING & WEAVER (GRFICO 2) (KONEMAN et al, 2001).

GRFICO 2: PORCENTAGEM DE CEPAS ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA CLASSIFICADAS COMO FERMENTADORAS DE GLICOSE (FAMLIA Enterobacteriaceae) E NO FERMENTADORAS DE GLICOSE (FAMILIA Pseudomonadaceae)

4%

96%

Fermentadores (48)

No Fermentadores (02)

58

FIGURA 11: CULTURAS BACTERIANAS EM GAR TSI OBTIDAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA: (A) E (C) BACTRIAS DA FAMLIA Enterobacteriaceae; (B) BACTRIAS DA FAMLIA Pseudomonadaceaea. FONTE: LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DO DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINRIA DA UFPR (2005)

59 5.3 IDENTIFICAO BIOQUMICA DEFINITIVA Considerando-se os exames bacteriolgicos realizados observou-se predominncia da espcie Escherichia coli totalizando 38 cepas, seguida de 7 cepas do gnero Proteus sp., 4 de Enterobacter sp., uma de Klebsiella sp., uma de Morganella sp. e duas cepas pertencentes famlia

Pseudomonadaceae, identificadas como Pseudomonas aeruginosa (ANEXO 2 FIGURA 15 e 16). Neste total esto inseridas as cepas das trs culturas mistas, sendo isolado de uma delas Enterobacter sp. e Proteus sp., e das outras duas Escherichia coli e Proteus sp. (TABELA 1).

TABELA 1: GNEROS E/OU ESPCIES BACTERIANAS PRESENTES EM FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA FAMLIA Famlia Enterobacteriaceae GNERO E/OU ESPCIE Escherichia coli Proteus sp. Enterobacter sp. Klebsiella sp. Morganella morganii Famlia Pseudomonadaceae NMERO DE CEPAS 38 7 4 1 1 %

71,6 13,3 7,5 1,9 1,9

Pseudomonas aruginosa TOTAL

2 53

3,8 100

60 GRFICO 3: OCORRNCIA DE MICRORGANISMOS ISOLADOS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA

72%

8% 6% 4% 4% 2% 2%

Escherichia coli (36) Enterobacter sp.(3) Morganella sp.(1) Escherichia coli + Proteus sp. (2)

Proteus sp.(4) 2% Klebsiella sp. (1) Enterobacter sp.+ Proteus sp. (1) Pseudomonas sp.(2)

61 5.4 TESTE DE SENSIBILIDADE FRENTE A 20 ANTIMICROBIANOS Devido ocorrncia de isolamentos mistos, foram realizados no total 53 antibiogramas. A partir dos dados referentes sensibilidade e resistncia das 53 cepas aos antimicrobianos, obteve-se a sensibilidade especfica s 38 cepas de Escherichia coli, s 7 cepas de Proteus sp., s 4 cepas de Enterobacter sp., a uma cepa de Klebsiella sp. e uma de Morganella sp., e tambm s duas cepas de Pseudomonas sp. 5.4.1 SENSIBILIDADE BACTERIANA ESPECFICA Das 36 cepas de Escherichia coli isoladas, associadas s 2 cepas obtidas das culturas mistas encontraram-se os resultados apresentados na TABELA 6 e nos GRFICOS 4 e 5:

TABELA 6: RESULTADOS, EM VALOR NUMRICO E PORCENTAGEM, DAS 38 CEPAS DE Escherichia coli ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS PEN AMP AMO AMC CFX CFL CRO CEF IMP LIN 0 6 9 31 14 2 32 7 37 0 0 16 24 82 37 5 84 18 97 0 0 7 3 2 7 6 5 8 0 0 0 18 8 5 18 16 13 21 0 0 38 25 26 5 17 30 1 23 1 38 100 66 68 13 45 79 3 61 3 100 SUT GEN AMI NEO ERI TET DOX CIP NOR ENO 16 17 20 10 0 11 8 35 33 31 42 45 53 26 0 29 21 92 87 82 1 7 8 7 0 0 1 3 2 2 3 18 21 18 0 0 3 8 5 5 21 14 10 21 38 27 29 0 3 5 55 37 26 56 100 71 76 0 8 13 S: Sensvel I: Intermedirio R: Resistente

S % I % R % S % I % R %

62

GRFICO 4: RESULTADOS EM PORCENTAGEM DAS 38 CEPAS DE Escherichia coli ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

120%

100%

80%

60%

40% 20%

0%
Sensvel Intermedirio Resistente

PEN AMP AMO AMC CFX CFL CRO CEF IMP 0% 0% 16% 24% 82% 37% 18% 8% 5% 5% 84% 18% 97% 0% 3% 61% 18% 16% 13% 21%

LIN 0% 0%

100% 66% 68% 13% 45% 79%

3% 100%

63

GRFICO 5: RESULTADOS EM PORCENTAGEM DAS 38 CEPAS DE Escherichia coli ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%
Sensvel Intermedirio Resistente

SUT GEN AMI NEO 42% 45% 53% 26% 3% 18% 21% 18%

ERI 0% 0%

TET DOX 0% 3%

CIP 8% 0%

NOR ENO 5% 8% 5% 13%

29% 21% 92% 87% 82%

55% 37% 26% 56% 100% 71% 76%

64 Das 4 cepas de Proteus sp. isoladas, associadas s 3 cepas obtidas das culturas mistas encontraram-se os resultados apresentados na TABELA 7: TABELA 7: RESULTADOS, EM VALOR NUMRICO E PORCENTAGEM, DAS 7 CEPAS DE Proteus sp. ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS PEN AMP AMO AMC CFX CFL CRO CEF IMP LIN S 0 1 1 4 3 1 6 0 6 0 % 0 14 14 57 44 14 86 0 86 0 I 0 0 0 2 2 3 1 1 0 0 % 0 0 0 29 28 43 14 14 0 0 R 7 6 6 1 2 3 0 6 1 7 % 100 86 86 14 28 43 0 86 14 100 SUT GEN AMI NEO ERI TET DOX CIP NOR ENO S 5 1 3 1 0 0 0 7 7 6 % 72 14 43 14 0 0 0 100 100 86 I 1 4 1 1 0 1 1 0 0 1 % 14 57 14 14 0 14 14 0 0 14 R 1 2 3 5 7 6 6 0 0 0 % 14 29 43 72 100 86 86 0 0 0 S: Sensvel I: Intermedirio R: Resistente

65

Das 3 cepas de Enterobacter sp. isoladas, associadas 1 cepa obtida em cultura mista encontraram-se os resultados apresentados na TABELA 8: TABELA 8: RESULTADOS, EM VALOR NUMRICO E PORCENTAGEM, DAS 4 CEPAS DE Enterobacter sp. ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS PEN AMP AMO AMC CFX CFL CRO CEF IMP LIN S 0 0 0 3 0 0 4 0 4 0 % 0 0 0 75 0 0 100 0 100 0 I 0 0 0 1 2 0 0 1 0 0 % 0 0 0 25 50 0 0 25 0 0 R 4 4 4 0 2 4 0 3 0 4 % 100 100 100 0 50 100 0 75 0 100 SUT GEN AMI NEO ERI TET DOX CIP NOR ENO S 1 3 3 2 0 0 0 4 4 4 % 25 75 75 50 0 0 0 100 100 100 I 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 % 0 25 25 25 0 25 25 0 0 0 R 3 0 0 1 4 3 3 0 0 0 % 75 0 0 25 100 75 75 0 0 0 S: Sensvel I: Intermedirio R: Resistente

66

As cepas de Klebsiella sp. e Morganella sp. foram isoladas em somente uma amostra de fezes e apresentaram os resultados descritos na TABELA 9: TABELA 9: PORCENTAGEM DAS CEPAS DE Klebsiella sp. E Morganella sp. ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA FRENTE AOS ANTIMICROBIANOS Klebsiella sp. S PEN AMP AMO AMC CFX CFL CRO CEF IMP LIN SUT GEN AMI NEO ERI TET DOX CIP NOR ENO 0 100% 100% 100% 0 0 100% 0 100% 0 100% 0 0 0 0 0 0 100% 100% 100% I 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100% 100% 100% 0 0 0 0 0 0 R 100% 0 0 0 100% 100% 0 100% 0 100% 0 0 0 0 100% 100% 100% 0 0 0 I: Intermedirio S 0 0 100% 100% 0 0 100% 0 100% 0 100% 0 100% 0 0 0 0 100% 100% 100% Morganella sp. I 0 100% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100% 0 0 0 0 0 0 R 100% 0 0 0 100% 100% 0 100% 0 100% 0 100% 0 0 100% 100% 100% 0 0 0

S: Sensvel

R: Resistente

67

As 2 cepas de Pseudomonas sp. isoladas apresentaram os resultados demonstrados na TABELA 10 e GRFICOS 6 e 7: TABELA 10: RESULTADOS, EM VALOR NUMRICO E PORCENTAGEM, DAS 2 CEPAS DE Pseudomonas sp. ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS PEN AMP AMO 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 100 100 100 SUT GEN AMI 0 1 1 0 50 50 1 0 0 50 0 0 1 1 1 50 50 50 S: Sensvel AMC CFX CFL CRO CEF IMP LIN 1 0 0 1 0 1 0 50 0 0 50 0 50 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 50 0 50 0 1 2 2 0 2 0 2 50 100 100 0 100 0 100 NEO ERI TET DOX CIP NOR ENO 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 50 50 50 1 0 0 0 0 0 0 50 0 0 0 0 0 1 2 2 2 1 1 1 50 100 100 100 50 50 50 I: Intermedirio R: Resistente

S % I % R % S % I % R %

68

GRFICO 6: RESULTADOS EM PORCENTAGEM DAS 2 CEPAS DE Pseudomonas sp. ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%
Sensvel Intermedirio Resistente

PEN AMP AMO AMC CFX CFL CRO CEF 0% 0% 0% 0% 0% 0% 50% 0% 0% 0% 0% 0% 50% 50% 0% 0%

IMP 50% 50%

LIN 0% 0%

100% 100% 100% 50% 100% 100% 0% 100% 0% 100%

69

GRFICO 7: RESULTADOS EM PORCENTAGEM DAS 2 CEPAS DE Pseudomonas sp. ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%
Sensvel

SUT GEN AMI NEO 0% 50% 50% 0%

ERI 0%

TET DOX 0% 0%

CIP NOR ENO 50% 50% 50%

Intermedirio 50% 0% 0% 50% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 50% 50% 50% 50% 100% 100% 100% 50% 50% 50% Resistente

70

5.4.2 SENSIBILIDADE BACTERIANA GERAL A sensibilidade e resistncia s 53 cepas bacterianas isoladas das fezes de ces com diarria hemorrgica constam na TABELA 11 e nos GRFICOS 8 e 9:

TABELA DE

11:

RESULTADOS

OBTIDOS,

EM

VALOR

NUMRICO TESTE

E DE

PORCENTAGEM, DAS 53 CEPAS BACTERIANAS ISOLADAS DAS FEZES CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS PEN AMP AMO 0 8 12 0 15 23 0 8 3 0 15 6 53 37 38 100 70 71 SUT GEN AMI 24 22 28 45 42 53 3 13 11 6 24 21 26 18 14 49 34 26 S: Sensvel AMC CFX CFL CRO CEF IMP LIN 41 17 3 45 7 51 0 77 32 6 85 13 94 0 5 11 9 7 10 1 0 9 20 17 13 19 2 0 7 25 41 1 36 2 53 14 48 77 2 68 4 100 NEO ERI TET DOX CIP NOR ENO 13 0 11 9 49 47 44 25 0 21 17 92 88 83 12 0 2 3 3 2 3 23 0 4 6 6 4 6 28 53 40 41 1 4 6 52 100 75 77 2 8 11 I: Intermedirio R: Resistente

S % I % R % S % I % R %

71

GRFICO 8: RESULTADOS OBTIDOS EM PORCENTAGEM DAS 53 CEPAS BACTERIANAS ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS 120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%
Sensvel Intermedirio Resistente

PEN AMP AMO AMC CFX 0% 0% 15% 23% 77% 32% 15% 6% 9%

CFL CRO CEF 6%

IMP 2%

LIN 0% 0%

85% 13% 94% 2% 68%

20% 17% 13% 19%

100% 70% 71% 14% 48% 77%

4% 100%

72

GRFICO 9: RESULTADOS OBTIDOS EM PORCENTAGEM DAS 53 CEPAS BACTERIANAS ISOLADAS DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA NO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS 120%

100%

80%

60%

40%

20%

0%
Sensvel Intermedirio Resistente

SUT GEN 45% 6% 49% 42% 24% 34%

AMI 53% 21% 26%

NEO 25% 23%

ERI 0% 0%

TET 21% 4%

DOX 17% 6% 77%

CIP 92% 6% 2%

NOR ENO 88% 4% 8% 83% 6% 11%

52% 100% 75%

73 5.5 ANLISE ESTATSTICA COMPARATIVA DE AO ANTIMICROBIANA TABELA 12: RESULTADOS DO TESTE DO QUI-QUADRADO OU DO TESTE EXATO DE FISCHER COMPARANDO A EFICINCIA DOS ANTIMICROBIANOS COMPARAES ENTRE ANTIBITICOS AMP X AMO AMP X AMC AMO X AMC AMC X CRO AMC X IMP AMC X CIP AMC X NOR AMC X ENO CFX X CFL CFX X CEF CFL X CEF AMP X CFL AMO X CFL AMP X SUT AMO X SUT CRO X IMP CRO X AMI CRO X CIP CRO X NOR CRO X ENO IMP X CIP IMP X NOR IMP X ENO GEN X AMI GEN X NEO AMI X NEO TET X DOX CIP X NOR CIP X ENO NOR X ENO P-VALOR DO QUIQUADRADO OU DO TESTE DE FISCHER 0,2136 (q) 2,568 e-09 (q) 1,384e-08 (f) 0,05888 (f) 0,1017(f) 0,07608 (f) 0,4339 (f) 0,872 (f) 0,002459 (q) 0,09643 (q) 0,3131 (q) 0,2705 (q) 0,01936 (q) 0,002208 (q) 0,07571 (f) 0,05945 (f) 0,0008779 (q) 0,527 (f) 0,1248 (f) 0,06813 (f) 0,71 (f) 0,5725 (f) 0,2174 (f) 0,4807 (q) 0,1821 (q) 0,01185 (q) 0,8738 (f) 0,5928 9f) 0,1603 (f) 0,696 (f) CONCLUSO ESTATSTICA no diferem entre si diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si diferem entre si diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si no diferem entre si

(q): Qui-Quadrado; (f): Fischer

74

GRFICO

10:

RELAO

DOS

ANTIMICROBIANOS

COM

MAIOR

EFICINCIA NO TESTE DE SENSIBILIDADE IN VITRO E QUE NO DIFEREM ENTRE SI ESTATISTICAMENTE

Ciprofloxacina Norfloxacina Enrofloxacina Imipenem Ceftriaxona Amoxicilina + c.Clavulnico

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 77% 80% 85%

92%

88%

83%

94%

90% 100%

75

GRFICO

11:

RELAO

DOS

ANTIMICROBIANOS

COM

MAIOR

EFICINCIA NO TESTE DE SENSIBILIDADE IN VITRO ADICIONANDO A CADA UM DELES OS PERCENTUAIS DE CEPAS INTERMEDIRIAS

Ciprofloxacina Norfloxacina Enrofloxacina Imipenem Ceftriaxona Amoxicilina + c.Clavulnico

92% 88% 83% 94% 85% 77% 20% 40% Sensvel 60% 9% 80%

6% 4% 6% 2% 13%

0%

100%

120%

Intermedirio

76 6 DISCUSSO

6.1

GNEROS

OU

ESPCIES

BACTERIANAS

ISOLADAS

NAS

GASTROENTERITES INFECCIOSAS CANINAS

No presente trabalho, a bactria Gram-negativa identificada como Escherichia coli foi a cepa com maior prevalncia, sendo isolada em 71,6% (n=38) das culturas fecais, seguida de Proteus sp. isolada em 13,3% (n=7) dos casos, Enterobacter sp. em 7,5% (n=4), Klebsiella sp. e Morganella sp. em apenas 1,9% (n=1) e Pseudomonas sp. em 3,8% (n=2) (TABELA 5 e GRFICO 3). Segundo DIMMITT (1991), exames bacteriolgicos das fezes de ces com parvovirose identificaram a ocorrncia de Escherichia coli em 61% dos casos, Proteus sp. em 3%, no tendo isolado os gneros Enterobacter sp., Klebsiella sp., Morganella sp. e Pseudomonas sp., como verificado na presente pesquisa. Nesse trabalho foi possvel verificar a constante ocorrncia de microrganismos Gram-negativos em fezes diarricas de ces, especialmente constatar a importncia da microbiota normal intestinal nos distrbios gastroentricos e conseqentemente prever seu grande potencial em promover bacteremia ou mesmo choque endotxico. DOW et al (1989) ao realizarem hemoculturas de ces e gatos doentes e debilitados observaram o fenmeno de bacteremia em 49% dos pacientes, sendo isolado em 46% das amostras caninas e 90% das amostras felinas bactrias Gram-negativas. A espcie Escherichia coli foi a mais prevalente nos ces (20%) e a Salmonella enteritidis nos gatos (28%). Klebsiella pneumoniae e Enterobacter cloacae foram tambm

77 isoladas nestes animais em 10% dos casos. Pseudomonas aeruginosa foi observada somente em culturas caninas em 8% dos casos.

6.2 SENSIBILIDADE E RESISTNCIA AOS ANTIMICROBIANOS

Com relao aos testes de sensibilidade realizados foram testados 20 diferentes antibiticos frente s 53 cepas Gram negativas isoladas, tendo como principal intuito avaliar a eficcia dos mesmos a esses microrganismos e sugerir terapia antibitica nas gastroenterites hemorrgicas. Conforme OTTO et al (1997) ces infectados experimentalmente com parvovrus e sem tratamento, apresentaram mdia de sobrevida em apenas 9,1% dos casos, enquanto que naqueles em que foi institudo terapia de suporte obteve-se 64% de sobrevida. ISOGAI et al (1989) afirmaram que a utilizao indiscriminada de agentes antimicrobianos pode promover prejuzo microflora intestinal e por essas razes, ressaltaram a importncia de adoo de critrios para a utilizao e escolha adequada da terapia antibitica. Tais critrios so descritos por PUYT (2000) como sendo:

microbiolgico, farmacocintico, toxicolgico e econmico. Quanto questo microbiolgica, devem ser avaliados os resultados obtidos no teste de sensibilidade, sua ao biolgica (bactericida ou bacteriosttica) e sua concentrao inibitria mnima (CMI). A farmacocintica envolve a formulao qumica e a capacidade de difuso dos antimicrobianos (lipo/hidrossolveis). A toxicidade da molcula nos tecidos est especialmente associada dose utilizada e durao do tratamento. Enquanto que o aspecto econmico relaciona-se diretamente ao custo do tratamento. Ainda hoje, os custos devem

78 ser colocados como uma questo relevante e muitas vezes limitante do uso do protocolo teraputico apropriado. Ao analisarmos os resultados de sensibilidade obtidos nesse trabalho, foram observados 100% de resistncia trs antimicrobianos: penicilina, lincomicina e eritromicina (TABELA 11 e GRFICOS 8 e 9) . Os resultados obtidos penicilina j eram esperados, porm mesmo assim foi avaliada com o objetivo de compar-la com antibiticos betalactmicos de amplo espectro, como as aminopenicilinas tambm utilizadas nessa pesquisa. Segundo SPINOSA (1999), as penicilinas naturais apresentam curto espectro de ao, atuando principalmente sobre bacilos Gram-positivos. Os Macroldeos (eritromicina) e as Lincosamidas (lincomicinas)

constituem um grupo de antibiticos formado quimicamente por heterosdeos, e com espectro e atividade de ao semelhantes (TAVARES, 1996). De acordo com RANG et al (1997) os bacilos Gram-negativos so naturalmente resistentes eritromicina, confirmando os resultados encontrados nesse trabalho. Segundo FERREIRA (1997) a lincomicina apresenta-se bastante ativa contra bactrias anaerbicas, porm a resistncia natural ou adquirida microrganismos Gram-negativos comum. As resistncias encontradas em 100% dos casos nessa pesquisa reafirmam os dados de literatura segundo sua atividade antibacteriana contra Gram-negativos. Sua utilizao na rotina da clnica de pequenos animais rara e seu espectro de ao frente anaerbicos substitudo freqentemente por outro agente antimicrobiano, denominado metronidazol.

79 No presente trabalho foram avaliados os efeitos bactericidas in vitro de oito antibiticos beta-lactmicos de diferentes geraes. As penicilinas e as cefalosporinas se enquadram nesse grupo de frmacos com presena da estrutura qumica denominada de anel beta-lactmico. Ambos os grupos de antibiticos impedem a sntese da parede celular e, portanto, so classificados como bactericidas (SPINOSA, 1999). Quanto aos resultados obtidos na sensibilidade geral ampicilina e amoxicilina, 70 e 71% de todas as cepas apresentaram resistncia (GRFICO 8). Em relao Escherichia coli, 66 e 68% das cepas respectivamente foram resistentes a esses frmacos (GRFICO 4). SOUZA (2000) trabalhando com cepas enteropatognicas de Escherichia coli isoladas de fezes diarricas sunas observou que somente 25% de cepas dessa espcie bacteriana apresentaram resistncia ampicilina. No presente estudo, 85% das cepas de Proteus sp. e 100% das cepas de Enterobacter sp. e Pseudomonas sp. foram resistentes s aminopenicilinas (TABELAS 7 e 8, GRFICO 6). Por outro lado, a eficcia da ampicilina e amoxicilina frente cepa de Klebsiella sp e Morganella sp. foi de 100% (TABELA 9). Segundo ANDRADE et al (2002), a resistncia ampicilina vem aumentando dramaticamente nos ltimos anos em decorrncia da sua larga utilizao na teraputica veterinria e humana, promovendo resistncia conjunta amoxicilina. Por esse motivo, a ampicilina e seus anlogos tm sido associados inibidores de beta-lactamases bacterianas, entre os quais o cido clavulnico e o sulbactam (PRESCOOT & BAGGOT, 1994). No presente estudo a associao de amoxicilina com cido clavulnico foi eficaz em 77% das cepas,

80 e se adicionado s cepas sensveis quelas classificadas como intermedirias a eficcia passa a ser de 86% (GRFICOS 8, 10 e 11). Em relao sensibilidade especfica, sua eficcia foi maior contra Klebsiella sp. e Morganella sp. (100%), relativamente alta contra Escherichia coli (82%) e Enterobacter sp. (75%) e intermediria frente s cepas de Proteus sp. (57%) e Pseudomonas sp. (50%) (TABELAS 7, 8 e 9, GRFICOS 4 e 6) O cido clavulncio sob a forma de clavulanato de potssio juntamente com a amoxicicilina podem ser administrados por via oral e intravenosa. No entanto, na prtica mdica essa apresentao injetvel, no se encontra facilmente disponvel no comrcio farmacutico local de Curitiba. O nico laboratrio veterinrio com essa apresentao comercial suspendeu a venda desse produto injetvel sem maiores esclarecimentos. Dessa maneira, a utilizao da amoxicilina com cido clavulnico no mbito hospitalar tornou-se limitata, impossibilitando o seu uso em pacientes com vmitos ou em condies de septicemia. Com relao s cefalosporinas de primeira gerao, a cefalotina foi a primeira de uso clnico introduzida comercialmente em 1962 (REESE & BETTS, 1995). Nessa pesquisa observou-se que 77% do total das cepas bacterianas foram resistentes a esse frmaco, sendo que 79% das cepas de Escherichia coli e 100% das cepas dos gneros Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Klebsiella sp e Morganella sp. tambm apresentaram-se resistentes (TABELAS 8 e 9, GRFICOS 4, 6 e 8). Percentuais relativamente menores de cepas resistentes cefalotina foram observados para Proteus sp. (43%) (TABELA 7). Cefalexina e cefadroxil tambm classificados como cefalosporinas de primeira gerao, absorvidas somente por via oral, foram ineficazes em 48 e

81 68% cepas, respectivamente (GRFICO 8); apresentaram percentuais de resistncia semelhantes aos gerais frente s cepas de Escherichia coli e Enterobacter sp, enquanto que 100% das cepas de Klebsiella sp., Morganella sp. e Pseudomonas sp. e somente 28% das cepas Proteus sp. mostraram-se resistentes (TABELAS 7, 8 e 9, GRFICOS 4 e 6). Os resultados obtidos demonstraram o baixo grau de eficcia de todas as cefalosporinas de primeira gerao em condies de gastroenterite infecciosa, no sendo indicado o uso desse grupo de antimicrobianos em pacientes sujeitos a endotoxemia. A ceftriaxona, uma cefalosporina de terceira gerao, foi testada demonstrando eficcia em 85% das 53 cepas e percentuais ainda maiores como de 98% se consideradas as cepas com ao intermediria (GRFICOS 8, 10 e 11). As cepas de Escherichia coli e Proteus sp. apresentaram 84 e 86% de sensibilidade, respectivamente. (TABELA 7 e GRFICOS 4 e 8). Em 100% das cepas de Enterobacter sp., Klebsiella sp.e Morganella sp. observaram-se eficcia (TABELAS 8 e 9). Enquanto que somente 50% das cepas de Pseudomonas sp. apresentaram sensibilidade (GRFICO 6). Segundo TAVARES (1999), a terceira gerao de cefalosporinas inclui antibiticos com marcada atividade contra bacilos Gram-negativos como Escherichia coli, Klebsiella sp., Proteus sp., Salmonella sp., Shigella sp., Enterobacter sp. e Morganella sp., possuindo maior resistncia inativao provocada pelas betalactamases elaboradas por esses microrganismos. Age tambm sobre Grampositivos, sendo pobre sua ao sobre a Pseudomonas aeruginosa. As vias de administrao preconizadas para a ceftriaxona so a intramuscular e a intravenosa, facilitando sua utilizao em pacientes com gastroenterite suscetveis septicemia. Atualmente, o custo do tratamento em

82 pequenos animais relativamente baixo e acessvel. Esses motivos associados a sua baixa toxicidade vm possibilitando sua utilizao com maior freqncia e demonstrando bons resultados na clnica mdica veterinria de pequenos animais. Outro beta-lactmico avaliado nesse estudo foi o imipenm, o qual apresentou a maior eficcia geral entre todos os antimicrobianos testados, correspondendo 94%, ou de 96% se consideradas as cepas intermedirias (GRFICOS 8 e 11). Sua eficcia tambm permaneceu alta quando as cepas foram testadas individualmente, sendo que 97% das Escherichia coli, 85% dos Proteus sp. e 100% das cepas de Enterobacter sp., Klebsiella sp. e Morganella sp. apresentaram sensibilidade frente a esse antimicrobiano (TABELAS 7, 8 e 9, GRFICO 4). A eficcia s foi menor frente s cepas de Pseudomonas sp. (50%) (GRFICO 6). Segundo FONSECA (2000), na atualidade o imipenm considerado o agente com maior espectro de ao na prtica da clnica mdica humana e veterinria, sendo ativo contra microrganismos aerbicos e anaerbicos Gram-positivos e Gram-negativos. Este composto atravessa os envoltrios celulares bacterianos de maneira mais rpida que os outros antibiticos beta-lactmicos, fato observado sobretudo nas bactrias Gramnegativas, graas a sua habilidade de passar pelos seus canais pornicos e sua ao supressora sobre as bactrias mais duradoura, fenmeno esse denominado de efeito ps-antibitico Dentre os efeitos indesejveis do imipenm esto relacionados formao de metablitos resultantes da hidrlise enzimtica do frmaco pela dhidropeptidase renal. Para inibir o metabolismo renal deve ser associado

83 cilastatina, um inibidor competitivo reversvel da d-hidropeptidase. (PRESCOTT & BAGGOT, 1994). O frmaco apresenta vias de administrao intravenosa e intramuscular, porm seu uso induz a produo de beta-lactamases cromossmicas em algumas espcies bacterianas. Desta maneira, as beta-lactamases podem tornar os bacilos Gram-negativos resistentes a outros antibiticos betalactmicos. A repercusso desse fato tornou-se motivo de preocupao de seu uso mais difundido em ambientes hospitalares (TAVARES, 1999). Os aminoglicosdeos testados foram a gentamicina, a amicacina e a neomicina. A amicacina foi a que obteve maior porcentagem de eficcia (53%), seguida pela gentamicina (42%) e pela neomicina (25%) (GRFICO 9). Segundo RANG et al (1997) o espectro de ao da amicacina o mais amplo dentre todos os aminoglicosdeos, possuindo resistncia s enzimas inativantes produzidas por algumas bactrias. Apesar disso, a sensibilidade especfica no presente trabalho demonstrou resultados variveis, sendo de 53% a eficcia frente s cepas de Escherichia coli, 43% para Proteus sp., 75% para Enterobacter sp., 50% para Pseudomonas sp., 100% para Morganella sp. e classificada com ao intermediria frente a Klebsiella sp. (TABELAS 7, 8 e 9, GRFICOS 5 e 7). Para a gentamicina as eficcias especficas apresentadas foram iguais as observadas com a amicacina frente ao Enterobacter sp., Klebsiella sp. e Pseudomonas sp. (TABELAS 8 e 9, GRFICO 7). A Escherichia coli demonstrou 45% das cepas sensveis a esse antimicrobiano e o Proteus sp., somente 14% (GRFICO 5 e TABELA 7). Por outro lado, 100% das cepas de Morganella sp. apresentaram-se resistentes (TABELA 8).

84 J em relao neomicina, altos percentuais de resistncia foram observados, sendo: ineficaz em 56% das cepas de Escherichia coli, 72% dos Proteus sp., 50% das Pseudomonas sp. e 25% dos Enterobacter sp. (TABELAS 7 e 8, GRFICOS 5 e 7). A gentamicina apresentou sensibilidade considerada intermediria frente cepa de Klebsiella sp. e Morganella sp. (TABELA 9). Segundo MACINTIRE & CARR (1997) a associao de

aminoglicosdeos com beta-lactmicos, promove boa cobertura antibitica contra organismos Gram-negativos e anaerbicos. Os aminoglicosdeos so primeiramente bactericidas e sua penetrao na clula bacteriana facilitada pela ao de inibidores da sntese da parede celular (beta-lactmicos), explicando assim o sinergismo entre esses frmacos. Os aminoglicosdeos so ativos principalmente contra bactrias Gram-negativas aerbicas da famlia das enterobactrias, porm muitas cepas isoladas em casos de infeces mistas podem mostrar resistncia (CHAMBERS & SANDE, 1996). De acordo com FERREIRA (1997), embora a utilizao conjunta de aminoglicosdeos com beta-lactmicos produza efeito sinrgico, os

aminoglicosdeos podem ser inativados por muitos antibiticos beta-lactmicos devido a formao de uma ligao covalente entre o grupo carboxila de um anel beta-lactmico cindido e um grupo amina de um aminoglicosdeo. A alta toxicidade dos aminoglicosdeos o principal fator limitante do seu uso. Em humanos as estimativas sugerem que 5 10% ou mais dos pacientes podem desenvolver algum grau de oto, nefro ou neurotoxicidade (REESE & BETTS, 1995). A nefrotoxidade referida a todos os aminoglicosdeos, sendo observada reduo na filtrao glomerular e significante elevao da creatinina

85 srica. Pacientes desidratados, apresentando perdas hidroeletrolticas ou insuficientes renais, so mais predispostos a sofrer a toxicose quando comparados a pacientes saudveis. Seu uso concomitante com outros agentes nefrotxicos, como as cefalosporinas, apesar do sinergismo de ao existente, aumenta ainda mais os riscos de ocorrncia desses efeitos indesejveis (RANG et al, 1997). Segundo MACINTIRE & CARR (1997) a administrao dos

aminoglicosdeos em uma nica dose diria por curto perodo em associao s aminopenicilinas, em pacientes previamente rehidratados e monitorados quanto funo renal, minimiza seus efeitos indesejveis e maximiza sua ao bactericida. O sulfametoxazol associado a trimetropina ao ser testado demonstrou valores percentuais muito prximos de resistncia e sensibilidade, 49 e 45% respectivamente (GRFICO 9). Verificou-se que 75% das cepas de Enterobacter sp. apresentaram resistncia a essa associao, enquanto que 100% das cepas de Klebsiella sp. e Morganella sp., e ainda 71% das cepas de Proteus sp. foram sensveis (TABELAS 7, 8 e 9). J as culturas de Escherichia coli e Pseudomonas sp. demonstraram sensibilidade e resistncia semelhantes aos obtidos no geral (GRFICOS 5 e 7). De acordo com TAVARES (1999), nos ltimos anos tornou-se comum o desenvolvimento de cepas resistentes as sulfonamidas, fazendo surgir a associao do antibibiticos sulfametoxazol e trimetropina. Todavia, em diferentes regies geogrficas, verifica-se uma variao significativa na sensibilidade das enterobactrias a trimetropina, devido propagao da resistncia mediada por plasmdios e transposons. Por estes motivos, a

86 associao sulfametoxazol com trimetropina pode apresentar espectro de ao relativamente incerto contra microrganismos Gram-negativos, comprometendo sua eficincia quando utilizada em pacientes septicmicos. As tetraciclinas so antibiticos produzidos por diversas espcies de Streptomyces, sendo alguns deles obtidos semi-sinteticamente, como exemplo da doxiciclina. A doxiciclina designada como uma tetraciclina de segunda gerao, porm os resultados de sensibilidade geral encontrados nessa pesquisa foram semelhantes para ambas. Foram encontradas 75% das cepas resistentes s tetraciclinas e 77% resistentes s doxiciclinas (GRFICO 9). Os resultados especficos frente Escherichia coli, Proteus sp. e Enterobacter sp. foram similares aos encontrados para a sensibilidade geral (GRFICO 5 e TABELAS 7 e 8). Porm, contra Klebsiella sp., Morganella sp. e Pseudomonas sp. a resistncia a esses frmacos foi de 100% das cepas (TABELA 9 e GRFICO 7). PUYT (2000) relatou em seu trabalho que apesar do amplo espectro de ao demonstrado por esse grupo, no so os antibiticos de primeira escolha, devido a sua ao bacteriosttica ao invs da ao bactericida. As fluorquinolonas constituem atualmente um grupo de antimicrobianos de grande utilidade tanto na Medicina Humana quanto na Medicina Veterinria em conseqncia de seu amplo espectro de ao, atividade bactericida e excelente concentrao no sangue e tecidos (ANDRADE et al, 2002). Nesse estudo foram utilizados ciprofloxacina, norfloxacina e enrofloxacina. Todos apresentaram percentuais altos de eficcia geral em in vitro, destacando-se dentre eles a ciprofloxacina com 92% de cepas sensveis, a norfloxacina, com 88% e por fim, a enrofloxacina, com 83% (GRFICO 9). Ao ser considerada as

87 cepas intermedirias, os percentuais passam a ser de 98%, 92% e 89%, respectivamente (GRFICO 11). A sensibilidade especfica frente a Escherichia coli permaneceu semelhante a da geral (GRFICO 5). A eficcia desses antimicrobianos foi de 100% frente s cepas de Enterobacter sp., Klebsiella sp. e Morganella sp. e de 50% frente s cepas de Pseudomonas sp. (TABELAS 8 e 9, GRFICO 7) Em relao s culturas de Proteus sp. a eficcia foi de 85% para a enrofloxacina e 100% para a ciprofloxacina e norfloxacina (TABELA 7). FONSECA (2000) referiu que a resistncia bacteriana a esses agentes antimicrobianos relativamente rara, porm em regimes teraputicos prolongados com subdoses, o surgimento de bactrias mutantes pode ser favorecido. Segundo JERGENS (1994), os efeitos indesejveis desse grupo o seu principal limitante, podendo ocasionar artropatias decorrentes de alteraes espongiformes na cartilagem articular em ces jovens de crescimento rpido. Por este motivo, devem ser evitados em ces de pequeno a mdio porte nos primeiros 8 meses de vida, e em ces de grande porte nos primeiros 18 meses de vida. A escolha racional e criteriosa do antibitico ou associao destes para iniciar um protocolo teraputico emprico , sem dvida, fundamental para o sucesso do tratamento. Entretanto, a identificao do microrganismo envolvido em cultura pura e a execuo dos testes de sensibilidade in vitro so medidas indispensveis (FERREIRA, 1997). Convm salientar as vantagens da utilizao de associao de antibiticos que apresentam sinergismo de ao, diminuindo as possibilidades do surgimento de cepas resistentes a dois frmacos simultaneamente

88 (PRESCOTT & BAGGOT, 1994). Na presente pesquisa poder-se-ia preconizar os seguintes sinergismos de ao: aminoglicosdeos com amoxicilina ou ampicilina, ou associaes de maior espectro de ao, como aminoglicosdeos com ceftriaxona, ou mesmo ceftriaxona com fluorquinolona, sendo a enrofloxacina o mais utilizado na rotina da clnica mdica veterinria.

89 7 CONCLUSES

Das 50 amostras fecais de ces com parvovirose processadas, foram obtidas 48 (96%) cepas pertencentes Famlia Enterobacteriaceae e 2 (4%) cepas da Famlia Pseudomonadaceae. Cepas de Escherichia coli foram predominantes nas gastroenterites parvovirticas, sendo isoladas em 38 (71,6%) amostras fecais examinadas. Das cepas isoladas, 100% delas foram resistentes Penicilina, Eritromicina e Lincomicina. Entre os 20 antimicrobianos testados, queles que apresentaram maior eficcia frente a todos os microrganismos isolados foram: Imipenm (94% das cepas sensveis), Ciprofloxacina (92%), Norfloxacina (88%), Ceftriaxona (85%), Enrofloxacina (83%) e a associao Amoxicilina com cido Clavulnico (77%). Os antibiticos com maior eficcia, quando administrados em doses mximas por via parenteral, podem apresentar um aumento no percentual de sensibilidade frente s bactrias isoladas. Dentre esses agentes antimicrobianos esto: Imipenm (96% das cepas sensveis), Ciprofloxacina (98%), Norfloxacina (92%), Ceftriaxona (98%),

Enrofloxacina (89%) e a associao Amoxicilina com cido Clavulnico (86%).

90 Com base nos resultados e critrios adotados para a escolha adequada da terapia antibitica nas gastroenterites infecciosas, sugere-se: Em filhotes, o uso de Ceftiaxona por via parenteral nas condies mais graves e de Amoxicilina com cido Clavulnico por via oral em casos mais brandos sem presena de vmitos. Em adultos, o uso de Ceftiaxona e/ou fluorquinolonas por via parenteral nas condies mais graves e de Amoxicilina com cido Clavulnico por via oral em casos mais brandos sem presena de vmitos.

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98 ANEXO 1 - COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA 1.1 MEIOS DE CULTURA, REAGENTES E SOLUES 1.1.1 gar MacConkey Peptona --------------------------------------------------------- 17g Proteose peptona --------------------------------------------- 3 g Lactose ---------------------------------------------------------- 10 g Sais biliares ---------------------------------------------------- 1,5 g Cloreto de sdio ----------------------------------------------- 5 g Vermelho neutro ---------------------------------------------- 0,03 g Cristal violeta --------------------------------------------------- 0,001g Agar -------------------------------------------------------------- 13,5 g PREPARO: Foram dissolvidas 50 gramas do meio "Bacto MacConkey gar" desidratado em 1000 ml de gua destilada. Deixava-se hidratar por 5 a 10 minutos e aquecia-se at o ponto de ebulio, agitando freqentemente at a completa dissoluo. Ajustava-se o pH para 7,1 e esterilizava-se em autoclave a 121C durante 15 minutos. O meio foi resfriado at a temperatura de 45-50C e distribudo volumes de aproximadamente 12 ml em placas de Petri de 15 x 100 mm. Aps o resfriamento, os meios eram mantidos em geladeira a 4C. 1.1.2. gar Mueller-Hinton Infuso de carne ---------------------------------------------- 5 g Casena hidrolizada ------------------------------------------ 17,5 g Amido ------------------------------------------------------------ 1,5 g gar -------------------------------------------------------------- 12,5 g PREPARO: Foram dissolvidas 36,5 gramas do meio "gar Mueller-Hilton" desidratado em 1000 ml de gua destilada. Deixava-se hidratar por 5 a 10 minutos e aquecia-se at o ponto de ebulio agitando freqentemente at a completa dissoluo. Ajustava-se o pH para 7,4 e esterilizava-se em autoclave a 121C durante 15 minutos. Distribuam-se volumes de aproximadamente

99 20ml em placas de Petri de 15 x 150 mm. Os meios eram mantidos a 4C em geladeira. 1.1.3 Meio de Lignires, segundo BIER (1985) Extrato de carne ----------------------------------------------- 5 g Peptona --------------------------------------------------------- 10 g Cloreto de sdio ----------------------------------------------- 5,0 g Gelatina --------------------------------------------------------- 5,0 g gar -------------------------------------------------------------- 8,0 g pH: 7,4 1.1.4 gar com trs acares e ferro Extrato de carne ----------------------------------------------- 3,0 g Extrato de levedura ------------------------------------------- 3,0 g Peptona --------------------------------------------------------- 15,0 g Proteose e peptona ------------------------------------------ 5,0 g Lactose ---------------------------------------------------------- 10,0 g Sacarose -------------------------------------------------------- 10,0 g Dextrose --------------------------------------------------------- 1,0 g Sulfato ferroso ------------------------------------------------- 0,2 g Cloreto de sdio ----------------------------------------------- 5,0 g Tiossulfato de sdio ------------------------------------------ 0,3 g Vermelho de fenol -------------------------------------------- 0,024 g Agar -------------------------------------------------------------- 12,0 g PREPARO: Foram dissolvidas 65 gramas do meio "Bacto Triple Sugar Iron Agar" desidratado em 1000 ml de gua destilada. Deixava-se hidratar por 5 a 10 minutos e aquecia-se at o ponto de ebulio, agitando freqentemente at a completa dissoluo. Ajustava-se o pH para 7,4 e distribua-se a soluo em volumes de 5 ml em tubos de ensaio de 13 x 100 mm. Esterilizava-se em autoclave a 121C durante 15 minutos. Resfriavam-se os tubos em posio

100 inclinada, de modo que o meio no fundo do tubo alcanasse uma profundidade de 1,5 a 2,0 cm e formasse na superfcie uma base inclinada. Aps o resfriamento, os meios eram mantidos em geladeira a 4C. 1.1.5 gua peptonada (caldo triptofano), segundo KONEMAN (2001) Peptona --------------------------------------------------------- 10 g Cloreto de sdio ----------------------------------------------- 5 g gua destilada ------------------------------------------------- 1000 ml PREPARO: Foram dissolvidas 15 gramas do meio gua peptonada desidratado em 1000 ml de gua destilada. Deixava-se hidratar por 5 a 10 minutos e aquecia-se at o ponto de ebulio. Ajustava-se o pH para 8,4 a 8,5 e distribua-se a soluo em volumes de 5 ml em tubos de ensaio de 13 x 100 mm. Autoclavava-se a 121C durante 15 minutos e resfriavam-se os tubos at a temperatura de 45-50C. Aps o resfriamento, os meios eram mantidos em geladeira a 4C. 1.1.6 Caldo VM/VP Polipeptona------------------------------------------------------ 7 g Glicose ----------------------------------------------------------- 5 g Fosfato dipotssio -------------------------------------------- 5 g gua destilada ------------------------------------------------- 1000 ml PREPARO: Foram dissolvidas 17 gramas do meio VM/VP desidratado em 1000 ml de gua destilada. Deixava-se hidratar por 5 a 10 minutos e aquecia-se at o ponto de ebulio, agitando freqentemente at a completa dissoluo. O pH era ajustado para 6,9 e distribua-se a soluo em volumes de 5 ml em tubos de ensaio de 13 x 100 mm. Autoclavava-se a 121C durante 15 minutos e resfriavam-se os tubos at a temperatura de 45C. Aps o resfriamento, os tubos eram mantidos em geladeira a 4C.

101 1.1.7 gar Citrato de Simmons Amnio dehidrogenofosfato -------------------------------- 1,0 g Di-potssio hidrogenonofosfato --------------------------- 1,0 g Cloreto de sdio ----------------------------------------------- 5,0 g Citrato de sdio ------------------------------------------------ 5,0 g Sulfato de magnsio ----------------------------------------- 0,2 g Azul de bromotimol ------------------------------------------- 0,08 g gar -------------------------------------------------------------- 12 g PREPARO: Foram dissolvidas 22 gramas do meio gar Citrato, segundo Simmons (MERCK, 1982) desidratado em 1000 ml de gua destilada. Deixavase hidratar por 5 a 10 minutos e aquecia-se at o ponto de ebulio. Ajustavase o pH para 6,9 e distribua-se a soluo em volumes de 5 ml em tubos de ensaio de 13 x 100 mm. Esterilizava-se em autoclave a 121C durante 15 minutos e resfriavam-se os tubos na posio inclinada at a solidificao do gar. Os meios eram mantidos em geladeira a 4C. 1.1.8 gar uria de Christensen Meio base Peptona de carne --------------------------------------------- 1,0 g D (+) glicose ---------------------------------------------------- 1,0 g Cloreto de sdio ----------------------------------------------- 5,0 g Potssio dihidronofosfato ----------------------------------- 2,0 g Vermelho de fenol -------------------------------------------- 0,012 g gar -------------------------------------------------------------- 12 g Aditivo Uria ------------------------------------------------------------- 20 g PREPARO: Foram dissolvidas 21 gramas do meio "'Agar Uria de Christensen" desidratado em 1000 ml de gua destilada. Deixava-se hidratar por 5 a 10 minutos e aquecia-se at o ponto de ebulio, agitando freqentemente at a

102 completa dissoluo. Ajustava-se o pH para 6,8 e esterilizava-se em autoclave a 121C durante 15 minutos. O meio base era resfriado at 45C e incorporavase no mesmo, 50 ml de soluo (esterilizada por filtrao) de uria a 40%. Distribua-se a soluo em volumes de 5 ml em tubos de ensaio de 13 x 100 mm e resfriava-se os mesmos em posio inclinada. Os meios eram mantidos em geladeira a 4C. 1.1.9 gar SIM Peptona de casena ------------------------------------------ 20 g Peptona de carne --------------------------------------------- 6,1 g Sulfato de ferro e amnio ----------------------------------- 0,2 g Tiossulfato de sdio ------------------------------------------ 0,2 g gar -------------------------------------------------------------- 3,5 g PREPARO: Foram dissolvidas 30 gramas do meio "'Agar SIM" desidratado em 1000 ml de gua destilada. Deixava-se hidratar por 5 a 10 minutos e aqueciase at o ponto de ebulio, agitando freqentemente at a completa dissoluo. Ajustava-se o pH para 7,3, esterilizava-se em autoclave a 121C durante 15 minutos e distribua-se a soluo em volumes de 5 ml em tubos de ensaio de 13 x 100 mm. Aps resfriados, os meios eram mantidos em geladeira a 4C. 1.1.10 Caldo base descarboxilase de Moeller Peptona --------------------------------------------------------- 5,0 g Extrato de carne ----------------------------------------------- 5,0 g Ppura de bromocresol ------------------------------------- 0,01 g Vermelho de cresol ------------------------------------------- 0,005 g Glicose ----------------------------------------------------------- 0,5 g Piridoxal --------------------------------------------------------- 0,005 g gua destilada ------------------------------------------------- 1000 ml

103 PREPARO: Foram dissolvidas 10 gramas do meio base "Caldo Base Descarboxilase de Moeller", desidratado em 1000 ml de gua destilada. Deixava-se hidratar por 5 a 10 minutos e ajustava-se o pH em 6,0. Aquecia-se at o ponto de ebulio, agitando freqentemente at completa dissoluo. A base era ento dividida em duas pores iguais: em uma adicionava-se lisina a 1%, enquanto a outra poro era utilizada como controle. O meio era distribudo em tubos de ensaio de 13 x 100 mm em volumes de 5 ml. Adicionava-se vaselina estril e autoclavava-se a 121C por 10 minutos. Os meios eram mantidos em geladeira a 4C. 1.1.11 Meio de Hugh e Leifson Peptona 2g Cloreto de sdio 5g D-Glicose 10g Azul de bromotimol 0,03g Agar 3g Fosfato dipotssico 0,30g gua destilada 11 1.1.12 (2001) p-dimetilaminobenzaldedo --------------------------------- 2,0 g cido clordrico concentrado ------------------------------- 40, 0 ml lcool etlico absoluto ---------------------------------------- 190,0 ml 1.1.13 Indicador de pH Vermelho de Metila Vermelho de metila ------------------------------------------- 0,1 g lcool etlico a 95% ------------------------------------------ 300 ml gua destilada ------------------------------------------------- 200ml 1.1.14 Reativo de Alfa-Naftol Reativo de Ehrlich para Prova do Indol, segundo KONEMAN et al

104

Alfa-naftol (5%) ------------------------------------------------ 5,0 g lcool etlico absoluto ---------------------------------------- 100 ml 1.1.15 Hidrxido de Potssio (KOH) Hidrxido de potssio (40%) ------------------------------- 40 g gua destilada ------------------------------------------------- 100 ml

105 ANEXO 2 - INTERPRETAO DAS PROVAS BIOQUMICAS

2. 1.1 FERMENTAO DA LACTOSE A partir de amostras de fezes e/ou contedo intestinal, os meios mais comumente empregados na rotina diagnstica de isolamento so o gar MacConkey e o gar sangue de carneiro. A capacidade diferencial do gar MacConkey se baseia na fermentao de lactose, que o critrio metablico mais importante utilizado para a identificao destes organismos. Este meio contm vermelho-neutro como indicador de pH e, como resultado as colnias que no fermentam lactose, formam colnias incolores, enquanto quelas fermentadoras de lactose formam colnias coradas devido a acidificao do meio. As bactrias produtoras de cidos fortes, como Escherichia coli, formam colnias vermelho escuro e as produtoras de cidos fracos formam colnias rosa-plido ou que so claras na periferia e rosadas no centro. O efeito seletivo deste meio na supresso do crescimento dos microorganismos Gram positivos indesejveis exercido pelos sais biliares ou por corantes bacteriostticos presentes no gar (QUINN et al, 1994).

2.1.2 FERMENTAO DA GLICOSE EM GAR TSI A inoculao em meio de gar de trplice acar com ferro (TSI) ou gar ferro de Kligler (KIA) detectam os microorganismos capazes de fermentar a glicose. Os princpios nos quais as reaes so observadas est relacionado configurao de duas cmaras de reao dentro do mesmo tubo. A poro inclinada ou pico, exposta em toda a sua superfcie ao oxignio atmosfrico, aerbia. A poro inferior, denominada profundidade ou fundo, est protegida do ar e relativamente anaerbia. Os meios TSI ou KIA so inoculados com um filamento reto e longo, e as reaes encontradas podem ser: (KONEMAN et al, 2001)

106

A BACTRIAS DA FAMLIA Enterobacteriaceae

FIGURA 12: (A)MEIO DE GAR TSI ESTRIL E (B) CULTIVO DE FONTE: LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DO DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINRIA DA UFPR (2005) Pico Alcalino/ Fundo Alcalino: indica ausncia de fermentao de carboidratos; caracterstica de bctrias No Fermentadoras, como Pseudomonas aeruginosa ou demais pertencentes da Famlia Pseudomonadaceae. Pico Alcalino/ Fundo cido: indica fermentao de glicose e ausncia de fermentao da sacarose; caracterstica de bactrias No Fermentadoras de sacarose, como espcies de Shigella. Pico Alcalino/ Fundo cido (Preto): indica fermentao de glicose, ausncia de fermentao da sacarose e produo de sulfeto de hidrognio; caracterstica de bactrias no fermantadoras de sacarose, produtoras de sulfeto de hidrognio, como espcies de Salmonella, Citrobacter e Proteus. Pico cido/ Fundo cido: indica fermentao de glicose e sacarose; caracterstica 2001). de coliformes fermentadores de sacarose, como Escherichia coli e espcies de Klebsiella- Enterobacter (KONEMAN et al,

107 2.1.3 PROVA DA UREASE Na inoculao em gar uria, os microorganismos que possuem a enzima urease hidrolisam a uria e liberam amnia, tornando o meio alcalino e produzindo uma colorao vermelho-rosada, devido a presena do indicador de pH vermelho de fenol. Estes organismos produzem reaes positivas em 1 a 2 horas, enquanto que as espcies menos ativas podem requerer trs ou mais dias. Nos casos em que no h reao o meio permanece amarelo (LEVINSON & JAWETZ, 1998). 2.1.4 PRODUO DE INDOL O indol um dos produtos de degradao do metabolismo do aminocido triptofano. As bactrias que possuem a enzima triptofanase podem clivar o triptofano e, desse modo, produzir indol, cido pirvico e amnia. O indol pode ser detectado em um meio de prova com triptofano, observando-se o aparecimento de cor vermelha aps adio de uma soluo pdimetilaminobenzaldedo (reativo de Ehrlich ou de Kovac) (KONEMAN et al, 2001).

A NEGATIVA. FONTE: LABORATRIO DE

B MICROBIOLOGIA DO

FIGURA 13: (A) PROVA DE INDOL POSITIVA E (B) PROVA DO INDOL DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINRIA DA UFPR (2005)

108 2.1.5 PROVA DO VERMELHO DE METILA O metabolismo do piruvato formado a partir da fermentao da glicose contm apenas duas vias metablicas alternativas: cidos mistos e butileno glicol. As bactrias que primariamente seguem a via de fermentao de cidos mistos, com freqncia, produzem cido suficiente para manter o pH abaixo de 4,4 (o ponto cido limite do indicador de vermelho-de-metila). Por este motivo, a prova de vermelho-de-metila proporciona uma caracterstica valiosa para a identificao de espcies bacterianas que produzem cidos fortes a partir da glicose. O aparecimento de cor vermelha no tubo, reflete um decrscimo de pH a 4,4 ou menos, indicativo da presena de fortes fermentadores, produtores de cidos mistos (KONEMAN et al, 2001). 2.1.6 PROVA DE VOGES-PROSKAUER Voges-Proskauer um epnimo duplo, em homenagem a dois microbiologistas que desenvolveram trabalhos no nicio do sculo XX. Neste teste, em presena de oxignio atmosfrico e hidrxido de potssio 40%, a acetona convertida diacetila e o -naftol atua como catalisador para produzir um complexo de cor vermelha. A acetona um subproduto inativo proveniente de uma das vias de degradao fermentativa da glicose e produzidos por alguns grupos bacterianos como Klebsiella-EnterobacterHafnia-Serratia (KONEMAN et al, 2001). 2.1.7 UTILIZAO DE CITRATO O princpio da prova de utilizao de citrato determinar a capacidade de um microorganismo usar citrato de sdio como nica fonte de carbono para metabolismo e crescimento. Algumas bactrias podem obter energia de outras fontes que no a fermentao de carboidratos, e estas assim como utilizam o citrato tambm assimilam nitrognio a partir do sal de amnia, produzindo amonaco (NH3) e causando a alcalinizao do meio por formao de hidrxido de amnia (KONEMAN et al, 2001).

109 O meio de citrato utilizado com maior freqncia o desenvolvido por Simmons, sendo distribudo em tubos e solidificado inclinado. A prova positiva quando h desenvolvimento de cor azul-escura dentro de 24 a 48 horas, nos casos em que ocorre formao de produtos alcalinos e pH acima de 7,6. Caso contrrio, em pH abaixo de 6,0, o indicador, azul-bromotimol amarelo (KONEMAN et al, 2001).

FIGURA 14: (A) REAO DO CITRATO POSITIVA E (B) REAO DO CITRATO NEGATIVA. FONTE: LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DO DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINRIA DA UFPR (2005)

110

FIGURA 15: REAES BIOQUMICAS IDENTIFICANDO UMA CEPA DE Escherichia coli ISOLADA DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA FONTE: LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DO DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINRIA DA UFPR (2005)

FIGURA 16: REAES BIOQUMICAS IDENTIFICANDO UMA CEPA DE Proteus sp. SOLADA DAS FEZES DE CES COM GASTROENTERITE INFECCIOSA FONTE: LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DO DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINRIA DA UFPR (2005)

111 2.1.8 PROVA DE OXIDAO-FERMENTAO (HUGH E LEIFSON) Para a prova, so necessrios dois tubos de Hugh e Leifson, semeando em ambos o microorganismo em estudo com um filamento em agulha. Inocular em profundidade trs a quatro vezes at a metade da distncia do fundo do tubo. Cobrir um dos meios do par de tubos com uma camada de 1 cm de leo mineral esterilizado e o outro fica exposto ao ar. Incubar os tubos a 35C A produo de cido no meio detectada pelo aparecimento de uma cor amarela. No caso de microorganismos oxidativos, a produo de cor pode ser notada primeiro, prxima superfcie do meio. Os padres de reao so os expostos na TABELA 13: (KONEMAN et al, 2001). TABELA 13: INTERPRETAAO DA PROVA DE OXIDAO-FERMENTAO MEIO ABERTO cida (amarelo) cida (amarelo) Alcalina (verde) MEIO FECHADO Alcalina (verde) cida (amarelo) Alcalina (verde) METABOLISMO Oxidativo Fermentativo No-Sacaroltico

FONTE: KONEMAN et al (2001)

FIGURA

17:

TUBOS

DE

HUGH

LEIFSON

IDENTIFICANDO

MICROORGANISMO COM METABOLISMO OXIDATIVO . (A) MEIO ABERTO COM REAO CIDA (AMARELA) E (B) MEIO FECHADO COM REAAO ALCALINA (VERDE). FONTE: LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DO MARCOS ENRIETTI (2005)

112

2.1.9 CITOCROMO OXIDASE A prova usualmente realizada pelo mtodo indireto utilizando tiras de papel filtro, no qual algumas gotas de reagente so colocadas na tira, e posteriormente estendida a colnia suspeita sobre a rea do papel. As colnias de bactrias que possuem atividade de citocromo oxidase desenvolvem cor azul-escura no stio de inoculao dentro de 20 segundos. O sistema citocromo encontrado em microorganismos aerbicos e anaerbios facultativos. Assim, a prova de oxidase importante na identificao de bactrias como Pseudomonas sp., Neisseria sp., Campylobacter sp., Pasteurella sp. e Aeromonas sp. que apresentam reao positiva e tambm s enterobactrias, as quais demonstram reao negativa. (KONEMAN et al, 2001).

FIGURA 18: COLNIA DE Pseudomonas sp. ISOLADA DE FEZES CANINAS APRESENTANDO REAO DE CITOCROMO OXIDASE POSITIVA. FONTE: LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA DO MARCOS ENRIETTI (2005)