Introduccin Como complemento prctico de la asignatura Ingeniera de Fermentaciones, cursada el semestre pasado, se realizarn una serie de experiencias a travs

de los meses siguientes, comenzando por un laboratorio en el cual se trabajar con la levadura Kluyveromyces marxianus en un ambiente aerobio, realizando diferentes modificaciones (tanto fsicas como qumicas) en el medio de crecimiento, todo esto para posteriormente registrar el aumento de la biomasa a travs del tiempo. Kluyveromyces marxianus, levadura perteneciente a la familia de las Saccharomycetaceae y cuya forma asexual es llamada Candida kefyr, posee estudios amplios de sus principales caractersticas de crecimiento. Entre ellos encontramos: Tabla N1: Caractersticas principales de crecimiento de Kluyveromyces marxianus Caracterstica pH Temperatura (C) Nutrientes bsicos (W. C. Frazier, D. C. Westhoff. 1978) La importancia de este microorganismo radica en la capacidad de producir diferentes metabolitos, tanto aerobia como anaerobiamente. Entre dichos metabolitos el de ms renombre y sobre el cual existen muchos estudios es sobre la produccin de -galactosidasa y de etanol a partir de lactosa. Mediante esta experiencia se espera lograr un correcto manejo del biorreactor, as como tambin un aprendizaje basado en el comportamiento de nuestro microorganismo frente a los distintos estmulos que se le aplicarn en cada uno de los proyectos que se llevarn a cabo. Rango 1,5 8,5 5 - 46 Ideal 4,2 36,5 (mesfilo) Glu, Gal, Fru, Suc, Malt, Lac, Rib, vitaminas

1. Descripcin general del proyecto En la primera experiencia de la asignatura a realizar estableceremos el comportamiento de la cintica de crecimiento de Kluyveromyces marxianus, analizando dicho factor mediante varios cambios en los parmetros fsicos que afectan directamente en el desarrollo de la ya mencionada levadura. Especficamente, se realizar un anlisis de la cintica utilizando una bebida gaseosa comercial (7up) como fuente de carbono, sta previamente desgasificada. Cabe destacar que dicha bebida posee una concentracin de azcar de 114,4 gr/L, y un pH se 3,19 cuando se encuentra gasificada y 2,47 cuando se ha desgasificado [1]. El proceso se realizar en el fermentador Biostat A plus de 1 litro de volumen utilizable. En dicho equipo se ajustarn los parmetros de control, como lo son: pH: 4,2 Temperatura: 40C Agitacin: 200 rpm

Se estima una duracin del proceso aerobio de 7 horas, con un tiempo de muestreo de una hora, partiendo de tiempo cero hasta tiempo 7. En cada muestreo se tomarn seis muestras en total, de las cuales tres son para anlisis de azcares reductores y las otras tres sern para el recuento de biomasa. Los procedimientos para realizar cada anlisis sern mencionados ms adelante. 1.1 Objetivo general:

Establecer los parmetros cinticos del crecimiento de Kluyveromyces marxianus utilizando la bebida gaseosa 7up como fuente de carbono.

1.2 Objetivos especficos: Disear el medio de cultivo utilizando como base 7 up Obtener crecimiento del microorganismo en un biorreactor controlando los parmetros cinticos establecidos Registrar y analizar los resultados obtenidos

2. Diseo experimental Como ya se mencion anteriormente, la toma de muestras est programada para ser realizada con una diferencia de hora entre una y otra. En cada muestreo se extraern distintos volmenes del caldo, los cuales sern:

Tabla N2: Volmenes estimados del medio que sern destinados para anlisis cuantitativos de azcar y biomasa presentes. Anlisis Cuantificacin de azcares reductores Cuantificacin aumento de biomasa Volumen por muestra 3 mL 2 mL Cantidad de muestras extradas en cada muestreo 3 3 Volumen total 72 mL 48 mL

Segn lo seala la Tabla N2, en cada muestreo se extraer un triplicado para cada anlisis, por lo cual los datos obtenidos sern analizados utilizando el programa informtico Statgraphics Centurion IV, donde se observar de mejor manera la variacin de los valores que se buscan cuantificar a travs del tiempo, con sus respectivos intervalos de confianza. Adicionalmente, los datos tambin sern procesados en Excel, para obtener grficas de mejor entendimiento general. 3. Mtodos: 3.1 Metodologa experimental: Con el fin de realizar correctamente esta experiencia, se seguirn distintos protocolos, los que sern mencionados a continuacin 3.1.1 Preparacin del medio de cultivo - Desgasificar 1,5 L de bebida gaseosa 7 up - Calcular masas de nutrientes para 1 L y para 500 mL - Masar los nutrientes que sern agregados al medio en una balanza analtica de alta precisin. - Diluir los nutrientes en 500 mL de bebida desgasificada, todo esto en un vaso precipitado de 1 L. Para el volumen menor, diluir los nutrientes en 250 mL de bebida desgasificada, todo esto en un vaso precipitado de 500 mL - Trasladar el medio preparado a un matraz aforado de 1000 mL y 500 mL, respectivamente, por medio de un embudo - Enrasar a 1000 mL con bebida 7 up desgasificada. Repetir operacin con 500 mL - Agitar el medio de cultivo - Trasvasar dicho contenido a un frasco Schott de 1 L y 500 mL - Levar a autoclave y esterilizar a 121C por 15 minutos a 1 atm - Dejar enfriar y almacenar hasta su uso

*Nota: Los 500 mL restantes sern

2.1.1 Formulacin del medio de cultivo:

Masar los diferentes componentes del medio segn la tabla con sus componentes. Trasladar los nutrientes cuantitativamente a un matraz Erlenmeyer y adicionar agua destilada y aforar hasta 1000mL. Esterilizar matraz y pipetas a travs de autoclave (121C a 1atm por 15minutos). Inocular con 10ml del cultivo de Kluyveromyces marxianus utilizando las pipetas graduadas de 10ml previamente esterilizadas.

Tabla Error! No text of specified style in document..1.1 Diseo de medio de cultivo Medio definido Elemento Fuente PM % Celular C N Mg P K S Ca Na Fe Cu Mn Zn Mo C6H1206 (NH4)2SO4 MgSO4*7H2O K2HPO4 K2HPO4 MgSO4*7H2O CaCl2 NaCl Fe SO4*7H2O Cu SO4*5H2O Mn Cl2*4H2O Zn Cl2 MoO3 180 132 246,3 174,1 174,1 246,3 110,9 58,5 277,8 249,5 197,9 136,4 144 48 7,5 0,3 0,16 2,5 0,13 0,9 0,44 0,3 0,006 0,004 0,012 0,00015 % Elemento 40 21,2 9,8 0,18 0,4 13 36,16 39,32 20,09 25,45 27,74 47,95 66,67 Yx/s So So* 1,5

0,5 2,8 32,6 1,12 0,18 100 40,2 89,4 66,9 4241,6 6935,8 3995,8 444466,6

3,98 0,71 0,061 1,78 11,11 0,02 0,049 0,022 0,029 0,00047 0,00028 0,0005 0,000004

3,98 1,1 0,09 2,67 16,6 0,03 0,074 0,044 0,033 0,00071 0,00042 0,00075 0,000006

2.1.3 Preparacin solucin tampn

Preparacin cido ctrico 0,1 M Agregar 21.01g de cido ctrico en 1000ml de agua destilada

Preparacin Citrato sdico 0,1 M (base) Agregar 29.41g de citrato de sodio en 1000mL de agua destilada

Preparacin Buffer a pH 4,2 (pH ptimo K. marxianus)

X ml A+ X ml B Diluido en 100mL de agua destilada 31,5 ml A + 18,5ml B

2.1.4 Preparacin del reactivo DNS:

Disolver 8g de NaOH en 500mL de agua destilada en un vaso precipitado Agregar 150g de Tartrato de sodio y potasio Cubrir el vaso precipitato con papel aluminio y agregar lentamente 5g de cido 3,5 dinitrosaliclico agitando bajo calor Aforar hasta alcanzar un volumen de 1000mL con agua destilada Conservar en un shott ambar

2.1.5 Obtencin de la curva de calibracin de DNS

Preparar una solucin patrn de glucosa en concentraciones conocidas, en las cuales se utilizara 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1. Se desarrollara la reaccin con el reactivo DNS agregando en un tubo de ensayo 1mL de la muestra patrn y 3mL de reactivo DNS, llevar a bao maria por 20 minutos, dejar enfriar y aadir 6 mL de agua destilada, llevar a espectrofotmetro y medir a 540nm. Anotar resultados y graficar.

2.1.6 Obtencin de la curva de calibracin de biomasa

FALTAAA L O HABIA EXO MAL XD PERDOON

2.2 Diagrama de flujo de la metodologa experimental:

Esterilizacin 121 x 15 min

Preparacin del Medio de cultivo

Preparacin Reactivo DNS

Esterilizacin 121 x 15 min

Preparacin Reactor

Curva de calibracio de DNS

Inoculacin K. marxianus

Curva de calibracin de Biomasa

Muestra

12mL de muestra

Determinacin Biomasa

Determinacin Sustrato

Peso seco

Turbidimetra

DNS

Concentracin de celulas

Concentracin de sustrato

Anlisis de Datos

2.3 Metodologa analtica:

2.3.1 Determinacin de la concentracin celular:

Peso seco: La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en trminos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como slidos en suspensin totales (SST) o slidos en suspensin voltiles (SSV). Las clulas se separan del lquido por centrifugacin o por filtracin. La principal desventaja de esta tcnica es que su determinacin incluye no slo microorganismos activos, sino tambin microorganismos muertos, material inerte, polmeros extracelulares y materia orgnica adsorbida. Para el practico, se tomara una muestra de 10ml de caldo de cultivo, el cual debe estar vigorosamente agitado, posteriormente se realizara una centrifugacin a 6000rpm durante 10minutos. A esta muestra se le retirara el sobrenadante y se resuspender el pellet con agua destilada, para volver a repetir el paso durante 2 ocasiones. El pellet obtenido se volver a resuspender con una cantidad minima de agua destilada y se llevara a un capacho de aluminio de peso conocido, este se introducir a una estufa a 110C para su secado. Hasta obtener un peso constante en el conjunto capacho-biomasa. La diferencia de peso entre el capacho sin muestra y aquel que si posee muestra se obtendr el peso o la masa seca de clulas presente en el caldo de cultivo, dividiendo la masa por el volumen de muestra utilizado se obtendr la concentracin celular.

Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a las partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que las soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es proporcional al peso seco, independiente del tamao celular del microorganismo. Para realizar la turbidimetra se realizaran diluciones (4/5, 3/5, 2/5, 1/10, 1/30, 1/50, 1/100) hasta obtener una muestra de dilucin 1/100. Con todas estas diluciones y la muestra original se colocaran una por una en las celdas para leer la absorbancia en el espectrofotmetro. Se utilizara una celda con agua como blanco.

2.3.2 Determinacin de la concentracin de sustrato:

Mtodo DNS: la determinacin del consumo de sustrato en el tiempo puede realizarse mediante este mtodo. EL mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5 cido dinitrosalislico para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra, seguido de determinacin espectrofotomtrica a 540 nm de los azucares reductores. Esta tcnica sirve para cuantificar azcares reductores producidos durante una fermentacin o para cuantificar los productos de una reaccin enzimtica. La concentracin se obtiene a partir de la recta obtenida al realizar la curva de calibracin, que correlaciona la Absorbancia medida a 540 nm con la concentracin de Glucosa.

Para realizar la medicin, se prepararan diluciones, tomando 1 mL de muestra del medio de cultivo, centrifugando y llevando las muestras a matraces. Se realizaran duplicados para cada muestra. Se tomara 1 mL de cada muestra diluida, poner en tubos de ensayo, agregar 3 mL de reactivo DNS, llevar a bao maria por 20 minutos, dejar enfriar y aadir 6 mL de agua destilada. Llevar a espectrofotmetro para medir a 540 nm.

2.4 Diagrama de flujo analtico

Determinacin de Biomasa

Determinacin de Sustrato

Turbidimetria

Peso seco

Mtodo DNS

Curva de Crecimiento Celular

Curva de Consumo de Sustrato

3 Materiales

Para mtodo DNS

Reactivo

Unidad de

Cantidad

Anlisis

Objetivo asociado

medida Acido 3,5 dinitrosalicilico Hidrxido de sodio Tartrato de sodio y potasio gramos gramos gramos 5 gramos 8 gramos 150 gramos

asociado DNS DNS DNS Determinacin de azucares reductores Determinacin de azucares reductores Determinacin de azucares reductores

Materiales

Unidad de medida

Cantidad

Anlisis asociado

Objetivo asociado

Esptula Vaso precipitado Matraz aforado Embudo de vidrio Papel aluminio Agua destilada Piseta mL mL

1 1

DNS DNS DNS

Determinacin de azucares reductores Determinacin de azucares reductores Determinacin de azucares reductores Determinacin de azucares reductores Determinacin de azucares reductores Determinacin de azucares reductores Determinacin de azucares reductores

DNS DNS

1000 mL 1

DNS DNS

Equipo Balanza analitica

Descripcin Instrumento para medir la masa . da datos exactos y especficos

Anlisis asociado

Objeivo asociado

Para medio de cultivo

Reactivo

Unidad de medida g/L g/L g/L

Cantidad

Anlisis asociado

Objetivo asociado

glucosa Sulfato de amonio Sulfato de magnesio heptahidratado Diofosfato de potasio Cloruro de calcio Cloruro de sodio Sulfato ferroso heptahidratado Sulfato cprico pentahidratado Cloruro de manganeso tetrahidratado Cloruro de zinc Trixido de molibdeno

3,98 g 1,1 g 0,09 g

g/L g/L g/L g/L g/L g/L

16,6 g 0.074 g 0,044 g 0,033 g 0,00071 g 0,00042 g

g/L g/L

0,00075 g 0,0000068 g

materiales

Unidad de medida

Cantidad

Anlisis asociado

Objetivo asociado

Vidrio reloj Esptula Matraz aforado Vaso precipitado

1 1 1 1

piseta

Equipo Balanza analtica

Descripcin Instrumento para medir la masa, datos exactos y especficos Recipiente metlico, trabaja a presin sirve para esterilizar con vapor de agua.

Anlisis asociado

Objeivo asociado

Autoclave

Reactor

Para peso seco

materiales

Unidad de medida

Cantidad

Anlisis asociado

Objetivo asociado

4 Carta Gantt

Bibliografa [1] Jos ngel Beleo Alczar. Determinacin de la acidez en una gaseosa convencional (7up) a travs de titulacin potenciomtrica. Ingeniera Qumica, Universidad de Colombia. Abril 2011. Erika Madeira Reeves. Kinetic analysis of Kluyveromyces marxianus yeast strain. Department of biological and Agricultural Engineering, Louisiana State University. Mayo 2004.