BIOP Desarrollo Inoculo y Cultivo Por Lote

DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES
PROFESOR: AUGUSTO CASTILLO CALDERN
INTEGRANTES Burgos Ramirez Jamir Chumpitaz Ayala Lizardo Gamarra Corman Jairo Guillen Vega Maximo Polo Laguna Jason VIII CICLO
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES

OBJETIVOS:
1.1. Objetivos Generales:
Disear y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en matraces empleando una cepa de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126, evalundose el efecto de la razn de S0/X0 en la cintica de crecimiento microbiano.
1.2.
Objetivos Especficos:
Disear y preparar el medio de cultivo. Activacin celular y desarrollo del inculo Determinar la cintica de crecimiento de la biomasa. Determinar de la cintica de consumo de la fuente de carbono. Determinar la cintica de produccin de Etanol. Determinacin del M y los rendimientos del nutriente limitante en clulas y en etanol adems de las respectivas productividades en clulas y en etanol.
Captulo:DESARROLLO DEL INOCULO Y C.L.
METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Antes de comenzar a trabajar el desarrollo experimental del cultivo del microorganismo, es importante siempre recalcar, cul ser la metodologa experimental a utilizar, a fin de evitar problemas y/o errores experimentales, los mismos que podran darse en: las tcnicas aspticas, en la obtencin de cultivos puros, en la preparacin de los medios de cultivo, en las tomas de muestra, en el crecimiento del microorganismos y entre otros factores.
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LABORATORIO DE BIOPROCESOS
Es necesario recordar que, cualquier medio de cultivo de levaduras debe proporcionar los requerimientos nutritivos bsicos, que incluyen los siguientes: una fuente de carbono, agua, una fuente de nitrgeno, una fuente de fsforo, una fuente de azufre, y varios minerales, como el hierro y el magnesio. A este tipo de medio de cultivo se llama definido o sinttico, porque se conoce exactamente su composicin qumica. Sin embargo en el trabajo laboratorial rutinario, a menudo se emplean tambin medios complejos. Por ejemplo, el extracto de levaduras y las peptonas (protenas hidrolizadas). Estos
materiales proporcionan una gran variedad de fuentes de carbono; nitrgeno, fosforo y azufre en forma de pptidos y aminocidos; y una mezcla de cofactores, como por ejemplo las vitaminas. Un caldo de cultivo es un medio lquido en el que los componentes se disuelven simplemente en agua destilada. La adicin de agar (un carbohidrato complejo extrado de algas marinas da lugar a un medio slido. El agar es un agente solidificante ideal para los medios microbiolgicos por sus propiedades reolgicas y porque no posee ningn valor nutritivo para la inmensa mayora de bacterias y hongos. El agar solido funde a 90 100C, y se solidifica a unos 42C.
DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO

A la hora de disear un medio de cultivo no slo hay que tener en cuenta los nutrientes sino tambin las condiciones fsicas que permitan el crecimiento de los microorganismos, asimismo nos interesa cuanto de biomasa se desea producir. Estado: Medio lquido Volumen del medio: 10 30 % del volumen del matraz Temperatura: 35C pH: 4.2 (ajustar pH con tampn citrato) Velocidad de agitacin: 150rpm en el agitador orbital (shaker)
Se utilizar como fuente de carbono y energa: Sacarosa
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http://es.scribd.com/doc/20375393/30/Requerimientosnutricionales http://html.rincondelvago.com/fermentacion.html
COMPOSICIN DE MEDIOS DE MANTENCIN, ACTIVACIN Y CULTIVO PARA SaccharomycescerevisiaeATCC 4126PARA LA PRODUCCIN DE ETANOL
Medio Slido de Mantencin (YM slido): Se calcularon compuestos para el medio Al 20% de 250 ml
los
Tabla 01: Concentracin de Nutrientes para el medio de mantencin (50 mL)
NUTRIENTE
CONCENTRACIN (G/L)
PESO (G) PARA 50 ML

Extracto de Levadura Peptona Extracto de Malta Agar Glucosa
3 5 3 20 10
0.15 0.25 0.15 1.00 0.5
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Medio de Activacin: Al 20% de 150 ml
Tabla 02: Concentracin de Nutrientes para un medio de activacin (30mL)
NUTRIENTE
CONCENTRACIN (g/L) 10.0 3.00 5.0 0.65
PESO (gr.) Para 30 ml* 0.3 0.09 0.15 0.0195
Sacarosa Extracto de levadura Peptona MgSO4. 7H2O
Se debe tener un Toptima= 35C y 150rpm
Medio Fermentacin:
Tabla 03: Concentracin de Nutrientes para un medio de fermentacin (Para un volumen de medio = 20% del volumen del matraz de 500ml) (Para una concentracin final = 5 g/l) Tomamos los mayores valores obtenidos para cada nutriente:
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Nutriente C12H22O11
Fuente C
Concentracin (g/l) 10.72 1.8
Peso (g) Para 100 ml 1.072 0.18
Extracto de Levadura (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O KH2PO4 Soluciones de Sales Concentradas
N Mg P -
0.255 0.24 0.53 10 ml/L
0.0255 0.024 0.053 1ml/L
Se debe tener un pHoptimo=4.2 (sino se debe ajustar con Tampn citrato) Tabla N 04: Solucin de sales
Nutriente CaCl2.2H2O ZnSO4.7H2O FeSO4.7H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O MoO3 MnCl26H2O NaCl
Concentracin (g/l) 1.12

0.11 0.06 0.05 0.01 0.0005 0.027 0.28
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CONDICIONES DE CULTIVO Temperatura: 35C Velocidad de Agitacin: 150 rpm en shaker. pH: 4.2 (ajustar pH con Tampn Citrato)
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Preparacin de los materiales para el medio de cultivo
1. Lavar y secar todos los materiales de vidrio a utilizar. 2. Luego colocarlos en la estufa en posicin vertical los vasos precipitados, matraces y tubos de ensayo. 3. Las pipetas a utilizar deber ser puestas en la estufa previamente recubierta de papel aluminio. 4. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. 5. Pesar la sacarosa requerida y los dems fuentes de nutrientes. 6. En un matraz de 125ml diluir las sales con 5 ml de agua destilada. 7. En un matraz de 125 ml diluir la galactosa con 5 ml de agua destilada.
8. En un matraz de 125 ml diluir el extracto de levadura con 5 ml de agua destilada. 9. Colocar los matraces previamente recubierto con papel aluminio en la estufa. 10. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. 11. En un matraz de 1 L agregar las 3 disoluciones antes hechas. 12. Elaborar la curva de calibracin para la determinacin de azucares reductores por el mtodo del DNS.
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Condiciones de Asepsia
Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la tcnica asptica se utiliza para prevenir la introduccin de organismos adicionales al cultivo. 1. Rotular el matraz con el nombre de la cepa, la fecha y el nombre del alumno o grupo. 2. Encender el mechero Bunsen. 3. Sostener los matraces. Si los matraces tienen un tapn de algodn, scalo un poco de manera que no est muy apretado. 4. Flamear en el mechero Bunsen, el cual da un rea de desinfeccin de 30 cm a la redonda. 5. Retirar una tapa con el meique, mientras sostienes los matraces. Nunca poner las tapas sobre la mesa. 6. Flamear la boca de ambos matraces para matar cualquier microorganismo presente en el aire y que pueda contaminar la parte superior durante las manipulaciones. 7. Los matraces abiertos deben mantenerse en posicin inclinada
para que el riesgo de contaminacin sea mnimo. 8. Sembrar en el matraz estril el inoculo. 9. De nuevo flamea las bocas de los matraces y tpalos de nuevo. Asegrate de mezclar muy bien el inoculo en los matraces que contienen el caldo sembrado. 10. Flamea los tapones antes de que los coloques en los matraces.
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CONFECCIN DE LOS CAPACHOS
Se corta el papel aluminio en forma cuadrada, de tal manera que pueda ser suficientemente grande como para cubrir el molde el cual se desea confeccionar.
Luego el papel aluminio que se ha cortado se coloca encima del molde y se empieza a dar forma de ste. Luego de haberse realizado el moldeado se procede a sacar del molde. Posteriormente de haber realizado el procedimiento anterior, ya no se puede manipular directamente, sino que debe hacerse por medio de pinzas.
CONFECCIN DEL TAPN PARA MATRACES
Para confeccionar este tapn se cortar un pedazo de gasa, el cual debe de ser doble para obtener una buena consistencia del tapn.
Luego este pedazo de seda es colocado perpendicularmente en la boca del matraz. Despus se hundir con algodn hasta que cubra todo el cuello del matraz, pero este llenado deber ser a presin para que no deje entrar mucho aire, slo el necesario para el microorganismo
Luego de haber culminado se realizarn los nudos respectivos para sujetar el algodn y as impedir su cada, pero tambin servir para poder manipular los matraces a travs de estos nudos.
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ESTERILIZACIN DE PIPETAS
Se lavan las pipetas con cuidado y se dejan secar por un lapso de tiempo. Despus se colocar algodn la boquilla de la pipeta, cuidando de no presionarse mucho ya que cumplir la funcin de un filtro. Luego de haber realizado este procedimiento se agrupan las pipetas y al mismo tiempo envolverlas con papel aluminio, tratando de cubrir todas las pipetas y marcando la seccin en donde est colocado el filtro de la pipeta para que as al manipularlas no se contaminen.
Se introducirn las pipetas a la estufa a 120 C por 2 horas. Pasado este tiempo se sacarn de la estufa, pero cuidando de no desenvolver las pipetas, para evitar su contaminacin.
Preparacin del medio de mantencin, segn la tabla N1 para el cultivo de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126, para la produccin de etanol. Se inicia teniendo en cuenta la referencia de composicin de medios de cultivo de mantencin para ATCC 4126 Luego de acuerdo a la tabla N 1 anterior se pesan las cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado, con la ayuda de la balanza analtica. Medir en un vaso de precipitados cierta cantidad de agua destilada para diluir todos los compuestos pesados anteriormente. Continuar agregando agua destilada hasta llegar a los 50 ml que se requiere. Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de vidrio, hasta la aparicin de la primera burbuja, a partir de lo cual se controla de 1 a 2 minutos.
Saccharomycescerevisiae
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Preparar 6 tubos de ensayo con tapa, y en caliente adicionar 7ml de la mezcla a cada tubo con la ayuda de una pipeta de 10 ml, e inmediatamente taparlos.
Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a la olla a presin, previamente aflojar las tapas, para evitar el rompimiento de tubos.
Calentar hasta que la temperatura alcance los 121C (hasta la primera burbuja) y a partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la esterilizacin.
Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de la olla, luego colocarlos en posicin inclinada y dejarlos a temperatura ambiente.
Preparacin del medio de activacin, segn los la tabla N2 para el cultivo de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126, para la produccin de etanol. Pesar los componentes descritos en la tabla N2 Se esterilizan por separado el extracto de levadura y extracto de malta en un tubo de ensayo (hasta 5 ml con agua destilada),la
glucosa en un matraz de 125 ml (con 15ml de agua destilada); esto para evitar la reaccin entre estos dos componentes; y por ltimo las sales (tabla 04) en otro tubo de ensayo (hasta 5 ml). Se completa en total un volumen de 25ml. Esterilizar a 121C por 15 minutos Previamente a la esterilizacin utilizar ajustar el pH a 4.2 de la solucin de que contiene glucosa. Mezclar todo en un matraz el mismo matraz de 125ml, en un ambiente asptico (segn los pasos indicados).
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Preparacin del medio de fermentacin, segn la tabla N3 para el cultivo de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126, para la produccin de etanol.

Pesar los componentes descritos en la tabla N 3 Disolver completamente cada compuesto con agua destilada Regular el pH de la solucin de sacarosa 4.2 Esterilizar las diluciones por separado. Terminada la esterilizacin dejar enfriar y guardar en refrigeracin hasta su posterior uso.
Regulacin de pH en Sustrato En los medios de cultivo es deseable mantener un pH relativamente constante durante el crecimiento microbiano, y esto se consigue mejor con el uso de sustancias reguladoras (sustancias tampn). Estas son sales de cidos o bases dbiles que toman o liberan iones hidrogeno a medida que cambia la concentracin de hidrogeniones del medio, y de este modo mantienen constante la concentracin de hidrogeniones. Existen cientos de sustancias tampn en potencia, pero siempre es esencial tener la seguridad de que esta sustancia no tiene un efecto directo sobre el organismo.
Aunque los microorganismos se encuentran en hbitats de un amplio margen de pH, el del interior de sus clulas est probablemente cerca de la neutralidad. En un ambiente cido, el organismo puede un pH prximo al neutral o bien no permitiendo la entrada de iones H + o bien expulsndolos de modo activo tan rpidamente como entran. Probablemente la pared celular desempea tambin algn papel para mantener fuera los hidrogeniones. Cada organismo tiene un margen de pH dentro del cual es posible su crecimiento, y generalmente tiene tambin un pH ptimo bien definido. Los mismos organismos, a travs de sus actividades, alteran el valor del pH de sus ambientes.
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CULTIVO DEL MICROORGANISMO

Inoculacin de m.o. Su crecimiento del m.o es: Es el incremento ordenado de todos los componentes de la clula viva, arribando a la duplicacin de todas las estructuras, orgnulos y componentes celulares, as como la biognesis de mitocondrias y cromoplastos cuando ciertos
microorganismos se ven sbitamente expuestos a las condiciones en que dichos orgnulos son esenciales. En la mayora de los organismos unicelulares, la reproduccin es consecuencia del crecimiento y lleva al incremento en el nmero de individuos de la poblacin, mientras que en los pluricelulares el crecimiento conduce al aumento del tamao del organismo. La figura muestra una curva general del crecimiento de un microorganismo unicelular.
Despus de la inoculacin de una porcin de medio con unas pocas clulas, transcurre un perodo de tiempo (fase de latencia) antes de que se establezca una velocidad constante de crecimiento, debido a que el microorganismo tiene una intensa actividad metablica para adaptarse al nuevo medio de cultivo antes de poder duplicarse. Cuando el cultivo alcanz una velocidad constante de crecimiento se dice que est en la fase exponencial debido a que el nmero de clulas se puede expresar como funcin de 2n, donde n es el nmero de ciclos de duplicacin experimentado por la poblacin.
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En condiciones ideales el tiempo de generacin de las bacterias puede ser de 20 minutos, de esta forma una nica clula producir 2.097.152 bacterias al cabo de 7 horas. Finalmente el cultivo entra en la fase estacionaria del crecimiento, en la que permanece constante el nmero de clulas. Esta fase puede durar mucho tiempo, por ejemplo dcadas en el caso de las bacterias endosporuladas, pero siempre ser seguida, ms temprano o ms tarde, por la fase de muerte.
RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SLIDO )
Para la resiembra se siguen las tcnicas de asepsia y colocando bajo mechero con lo que se mantendr un ambiente estril. El asa bacteriolgica se somete al fuego del mechero hasta alcanzar el rojo vivo. Se debe dejar enfriar por unos segundos, del tubo de ensayo que contiene las clulas desarrolladas en medio slido, se extrae una azada, se flamea el tubo para cerrarlo.
El procedimiento de resiembra se hace en los tubos de ensayos preparados con medio slido (con agar). La azada se realiza en el tubo desde adentro hacia fuera. Se llevan a la incubadora a 35 C durante 48 horas. Luego se refrigera para parar el crecimiento.
ACTIVACIN CELULAR Y DESARROLLO DEL INCULO Se tuvo el lugar bien desinfectado, se colocaron los mecheros se prosigue de la siguiente manera: Para la inoculacin partimos con la cepa incubada en medio slido Saccharomycescerevisiae ATCC 4126
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Se toma una azada y se inocula en el matraz con los 25 ml del medio de activacin
Tapamos el tubo con un tapn de gasa y algodn. Llevamos al Shaker a 200 rpm, T = 30 C y un t = 10 hasta alcanzar un desarrollo celular suficiente, evidenciado por el incremento en la turbidez del medio.
El procedimiento de inoculacin se har por duplicado es decir 2 azadas.
INOCULACIN AL MEDIO DE FERMENTACION Inocular los 25 ml de caldo (medio rico de activacin + biomasa) a un matraz de 500ml conteniendo el medio definido para fermentacion. A partir de este paso se determinar la cintica de crecimiento de la biomasa. Inmediatamente despus, se extrae una muestra de 5 ml del caldo y medir X0 y S0 con D.O. Se toman las medidas de asepsia en la zona de trabajo y el encendido del mechero. La toma de muestras se inicia desde la dilucin del medio de activacin en el medio de fermentacin.
Estas se realizaran cada hora y media para la primera muestra y posteriormente cada hora de la siguiente manera: Se extrae 5 mL del medio de cultivo, 3 mL se le agrega al tubo del espectrofotmetro y el resto se le agrego al tubo de centrifugado. Se mide su absorbancia a una determinada log. de onda (640nm)y pH; luego se devuelve al tubo de centrifugado para completar los 5 ml y se centrifuga a la mxima velocidad por 20 minutos; el sobrenadante se vierte a los viales y se guarda en el refrigerador con el fin de despus determinar el consumo de sustrato.
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CRECIMIENTO CELULAR: CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES Plan de Muestreos y Registro de Datos Grupo: __________________________________ Da: ___ /___ / ___ Microorganismo: ___________________________ Fuente Carbono: ____________________________
Nombre N HORA TIEMPO Abs.(640 nm) del alumno Observaciones
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DETERMINACIN
DE
LOS
RENDIMIENTOS
DEL
NUTRIENTE
LIMITANTE EN CLULAS. Fuente de carbono y energa: SACAROSA (C12 H22 O11), M= 342 g YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la clula % de C en el nutriente = 12(12) x 100 / 342 = 42.11 % % de C en la clula = 45 % YX/S = (42.11/45) x 0.5 (este factor por ser aireado) YX/S = 0.95 x 0.5 = 0.47 g/g
DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES: MTODO DEL DNS (CIDO DINITROSALICLICO) La preparacin del reactivo DNS se requiere de lo siguiente: 10 g/l de cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS) 200 ml/l de NaOH 2N 300 g/l de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
Para la preparacin de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 o 600 ml de agua, paralelamente se disuelve el cido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolucin de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro. Se precisa realizar los siguientes pasos para el anlisis de la muestra: 1. Se aade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a analizar. 2. Se mantiene la mezcla en un bao de agua a ebullicin durante 5 minutos para luego dejar enfriar.
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3. Se aaden 10 volmenes de agua destilada. 4. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco. 5. La concentracin se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. 6. La curva de calibrado para el azcar se obtiene a partir de muestras de concentracin conocida y analizadas segn este procedimiento.
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN CELULAR POR D.O
El mtodo se basa en el aumento de la turbidez del medio, al incrementarse la concentracin de microorganismos, esto puede ser detectado fcilmente por espectrofotometra a 640 nm. Para sta determinacin es necesario que previamente se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de
microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento: 1. Se toman 4 muestras de volumen conocido, y se centrifuga a
1200 rpm. Durante 15 - 20 minutos. 2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con tampn citrato (aprox. 3ml) 3. Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la
determinacin. 4. Se aade un poco de agua destilada (agua que se evapora posteriormente) para redisolver todo el precipitado y se seca en la estufa a 80 C hasta peso constante. (24horas)
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DETERMINACIN DE ETANOL POR CROMATOGRAFA DE GASES. A. REACTIVOS Y SOLUCIONES Etanol Propanol
B. PROCEDIMIENTO Preparacin de 50 ml de solucin patrn de Etanol a 6 g/L. Concentracin de solucin patron etanol = 6 g/l Volumen solucin patrn etanol a 6 g/L = 50 ml Volumen solucin etanol 99.7 % = 0.3809 ml Preparacin de 50 ml de solucin patrn de Propanol a 4 g/L Concentracin de solucin patrn propanol = 4 g/l Volumen solucin patrn etanol a 4 g/L = 50 ml Volumen solucin etanol 99.5 % = 0.2487 ml Estndar interno Anlisis Cromatogrfico 1. Instalar una columna capilar RTX-20 utilizando frulas de grafito para asegurar conexiones hermticas. 2. Encender el cromatgrafo de gases, abrir la vlvula a media luna del gas portador (helio, aire e hidrgeno) y regular cuidadosamente su flujo. 3. Ajustar las condiciones cromatogrficas.
4. Abrir las vlvulas de los otros gases, primero el aire y luego el hidrgeno. 5. Con una solucin de jabn o detergente, verificar fugas de gases en todas las conexiones. 6. Encender el detector y obtener una lnea de base estable.
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T inicial del horno T final del horno Tiempo inicial Tiempo final
55C. 120C. 3min. 2min
Velocidad de calentamiento 10 C/min.(RATE =rampa) T inyector Volumen de inyeccion Modo de inyeccin Radio Split Velocidad lineal 200C 1l. Split 300 32.9 cm/seg
Luego de establecidas las condiciones cromatogrficas, se procede a la determinacin de los parmetros en estudio.
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Condiciones Cromatografcas
MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS

Material Biolgico: Cepa de Saccharomycescerevisiae ATCC 4126 PREPARACIN DE SLIDO DE MANTENCIN: Materiales y Equipos:
Balanza analtica Matraz Erlenmeyer de 250 ml. Mechero Bunsen Gradilla 6 Tubos de ensayo con tapas. Centrifuga.
Pipeta de 10 ml. Vaso de precipitado. Cocina a gas Olla a presin. Varilla de vidrio Guantes. Esptula
Reactivos y nutrientes:
Agua destilada. Extracto de levadura. Peptona. Extracto de malta
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Agar.
PREPARACIN DE MEDIO DE ACTIVACIN: Materiales y Equipos:
Balanza analtica 2 Matraz de 125 ml. Una probeta de 100ml Micropipeta Estufa Algodn Gasa Varilla de vidrio Esptula
Reactivos y nutrientes:
Glucosa Extracto de levadura Solucin de sales Agua destilada Alcohol

PREPARACIN DE MEDIO DE FERMENTACIN: Materiales y Equipos: Matraz de 1 L 2 Matraces de 125 ml. Varilla de vidrio
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Balanza analtica Gasa y algodn Olla a presin
Reactivos y nutrientes: Glucosa (NH4)2SO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O Extracto de Levadura Agua destilada Alcohol
INOCULACIN AL MEDIO DE ACTIVACIN: Materiales y equipos
Algodn Gasa Agua destilada Aza bacteriolgica Shaker Mechero Bunsen, trpode y rejilla
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Matraz de 125 ml.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES DE Saccharomycescerevisiae ATCC 4126 DA 30/09/13 03/10/13 10/10/13 ACTIVIDAD Presentacin del pre-informe. Esterilizacin de material de vidrio Preparacin de medio de mantencin, agar nutriente, esterilizar y refrigerar. Preparacin Tampn pH 4.2 Resembrado de clulas en el medio de mantencin agar slido Preparacin de reactivos DNS. Obtencin de las curvas de calibrado de azcares reductores DNS (Glucosa y Sacarosa).Obtencin de la curva de calibrado Etanol, cromatgrafo de gases. 16/10/13 17/10/13 23/10/13 24/10/13 Preparar capachos (6unid.) Secarlos. Obtencin de la curva de calibrado de Biomasa. Preparacin y esterilizacin del medio rico lquido para inoculo y fermentacin. Preparar material de vidrio estril. Inoculacin de medios y seguimiento de la cintica de crecimiento microbiano. Anlisis DNS y alcohol.
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30/10/13
Presentacin del informe final y sustentacin.
PROGRAMACION DE CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES DIA mircoles 10/10/13 ACTIVIDAD HORARIO INICIO Preparacin de materiales para la inoculacin en medio de activacin y el medio rico para la cintica de fermentacin. Inoculacin con aza bacteriolgica desde la cepa en agar a medio rico de activacin. Tiempo de referencia para la activacin del inculo en el medio de activacin. Inoculacin de medios para cintica (fermentacin) Seguimiento de la cintica por cada hora ( programacin y registro de datos)
TERMINO
7:30 a.m.
8:00 a.m.
8:00 a.m.
8:20 a.m.
8:20 a.m.
11:20 a.m.
11:20 a.m.
11:40 a.m.
11:40 a.m.
7:40 p.m.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=q uimicos QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniera
Bioqumica.http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5 CKits-C.pdf. http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml THOMAS D. BROCK, Biologa de los Microorganismos
25
http://es.scribd.com/doc/14173118/4-Esterilizacion-y-Preparacion-deMedios-de-Cultivo http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/fi le/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%201%20T%C3%A9c nica%20as%C3%A9ptica.pdf
ANEXOS
DISEO DEL MEDIO DE ACTIVACIN Y DE FERMENTACIN Rendimiento: Fermentacin aerbica
X %Elem ento en nutriente f ... (1) S %Elem ento en biom asa
Y XS
Para fuente de carbono, fermentacin aerbica: f =0.5 Para otra fuente, f =1 Donde:
Y XS %Elem ento en nutriente f (2) %Elem ento en biom asa
Y XS
X (3) S
De (3):
Y XS X (4) S f S i
| De (4):
Si Sf 0 . Entonces; S i g L
X n (5) YX
S
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Para fuente de carbono, n =1.5 Para otra fuente, n =1
Nota: El nutriente limitante en esta investigacin se considerar a la fuente de carbono que en este caso es la Sacarosa.
FUENTE SACAROSA MgSO4.7H2O MgSO4.7H2O (NH4)2SO4 lim. KH2PO4 KH2PO4
ELEMENTO C S Mg N K P
% CELULA 45 0.25 0.4 9 0.5 2
% NUTRIENTE 42 13.01 9.87 21.21 28.73 22.79
Yx/s 0.56 52 24.7 2.4 57.5 11.4
S (G/L) 10.72 0.12 0.24 0.255 0.10 0.53
S (G/L) 16.080 0.173 0.365 2.547 0.157 0.790
PARA LA SACAROSA: %C nutriente = 42.11%; %C. en biomasa= 45%

Y XC
X %C.ennutriente 0.5 S %C.enbiomasa
Y XC
42.11% 0.6 0.56 g g 45%
PARA KH2PO4:
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Y X P
X % P.ennutriente S % P.enbiomasa
% P.ennutriente
31 100 22.79% 136
YXP
22.794% 1 11.395 g g 2%
% K .ennutriente 39 100 28.73% 136
Y XK
28.676% 1 57.5 g g 0.5%
PARA (NH4)2SO4:
YXN
% N .ennutriente % N .enbiomasa
% N .ennutriente 14 2 100 21.21% 132
YXN
21.21% 1 2.4 g g 9%
PARA MgSO4.7H2O:
% Mg .ennutriente % Mg .enbiomasa
Y XS
%Mg.ennutriente
24 100 9.87% 246
Y X Mg
9.7561% 1 24.7 g g 0.4%
28
%S .ennutriente
32 100 13.01% 246 Y XS 13.0081% 1 52 g g 0.25%
REFERENCIAS DE COMPOSICION DE MEDIOS DE MANTENCION, ACTIVACION Y CULTIVO DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE MEDIO NUTRIENTE Extracto de levadura Solidos de mantencin (YM solido) Peptona Extracto de malta Agar Glucosa Glucosa Extracto de levadura Extracto de malta Activacin Solucin de sales 5 5 ml/L T 35C, 200 rpm Sacarosa Extracto de levadura Fermentacin (NH4)2SO4 kH2PO4 1.8 10 3
CONCENTRACION (g/L) 3 5 3 20 10
29
MgSO4.7H2O Solucin de sales 10 ml/L
Tampn Citrato pH 4.2 %
100 ml/L
30

BIOP Desarrollo Inoculo y Cultivo Por Lote

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DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

PROFESOR: AUGUSTO CASTILLO CALDERN

DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR LOTES

DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

DISEO DE MEDIOS DE CULTIVO

Se utilizar como fuente de carbono y energa: Sacarosa

Captulo:DESARROLLO DEL INOCULO Y C.L.

DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

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Tabla 01: Concentracin de Nutrientes para el medio de mantencin (50 mL)

PESO (G) PARA 50 ML

Extracto de Levadura Peptona Extracto de Malta Agar Glucosa

0.15 0.25 0.15 1.00 0.5

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Medio de Activacin: Al 20% de 150 ml

Tabla 02: Concentracin de Nutrientes para un medio de activacin (30mL)

CONCENTRACIN (g/L) 10.0 3.00 5.0 0.65

PESO (gr.) Para 30 ml* 0.3 0.09 0.15 0.0195

Sacarosa Extracto de levadura Peptona MgSO4. 7H2O

Se debe tener un Toptima= 35C y 150rpm

Captulo:DESARROLLO DEL INOCULO Y C.L.

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Concentracin (g/l) 10.72 1.8

Peso (g) Para 100 ml 1.072 0.18

Extracto de Levadura (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O KH2PO4 Soluciones de Sales Concentradas

0.255 0.24 0.53 10 ml/L

0.0255 0.024 0.053 1ml/L

Nutriente CaCl2.2H2O ZnSO4.7H2O FeSO4.7H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O MoO3 MnCl26H2O NaCl

Concentracin (g/l) 1.12

0.11 0.06 0.05 0.01 0.0005 0.027 0.28

DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

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DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA E.A.P. INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

CONFECCIN DE LOS CAPACHOS

CONFECCIN DEL TAPN PARA MATRACES

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DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

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DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

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DESARROLLO DEL INCULO Y CULTIVO POR LOTES

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CULTIVO DEL MICROORGANISMO

Captulo:DESARROLLO DEL INOCULO Y C.L.

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RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SLIDO )

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El procedimiento de inoculacin se har por duplicado es decir 2 azadas.

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Nombre N HORA TIEMPO Abs.(640 nm) del alumno Observaciones