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CAPTULO 2
Mtodos y procedimientos de investigacin
Psicologa Fisiolgica
Grado de Psicologa
ABLACIN EXPERIMENTAL
ablacin experimental o evaluacin de la conducta de un animal despus de destruir una parte del encfalo. no suele extraerse el tejido, se deja en su sitio lesionado.
investigador = comprender las funciones cerebrales que originan una conducta o dificultad: todas las regiones del encfalo estn conectadas entre s.
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error en lesin cerebral o se produce cuando la alteracin comportamental es debida a afecciones por encima de la zona daada como consecuencia del rasgado de la cnula o el electrodo. lesin falsa o se realiza para averiguar el posible error en una lesin cerebral. o se realiza una incisin con la cnula o el electrodo pero sin activar (RF) ni aminocido o animales = grupo de referencia. lesin cerebral reversible o lesin cerebral temporal o inyeccin del anestsico muscimol bloquea potenciales de accin de los axones estimula los receptores del GABA
Ciruga estereotxica
ciruga cerebral que sita un electrodo o cnula en una posicin especfica dentro del encfalo.
en el crneo existen varios huesos formando suturas(puntos de unin) o los nios recin nacidos tienen un punto blando o fontanela en la unin de las suturas sagital y coronal. bregma o unin de las suturas sagital y coronal (fontanela cerrada despus de fase postnatal) o punto de referencia en ciruga estereotxica. en ratas, es un punto bastante constante en el espacio. VER FIGURA 2.3 PGINA 36
Atlas estereotxico es una recopilacin de esquemas de secciones del encfalo del animal. representaciones de secciones frontales, tomadas a distancias rostrales y caudales al bregma del animal. son las coordenadas para realizar la ciruga posterior. ej. frnix de la rata o VER FIG.2.4 PGINA 36 o la cuadrcula de cada pgina del atlas indica las coordenadas de las estructuras cerebrales en el plano ventral a la parte superior del crneo y lateral a la lnea media. o ejecucin: taladrar la parte superior hasta el frnix y bajar el electrodo por el orificio hasta que su punta llegue al frnix. atlas proporciona una localizacin aproximada. o debido a variaciones en la cepa y la edad de los animales. o hay que probar con una nueva serie de coordenadas, corregir los valores y realizar varios intentos.
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Grado de Psicologa
Mtodos histolgicos
despus de la lesin se observa la conducta del animal una vez que el animal ha fallecido hay que seccionar y teir el tejido cerebral para inspeccionar con el microscopio el lugar de la lesin. o pasos: 1) fijar 2) seccionar 3) teir 4) examinar o a veces el aparato falla y hay que ver el lugar del dao cerebral.
FIJACIN Y OBTENCIN DE CORTES HISTOLGICOS 1) para estudiar el tejido tal y como era en el momento de la muerte hay que realizar los siguientes pasos: o perfusin reemplazamiento de la sangre por un fijador (lquido). o destruccin de las enzimas autolticas sino estas convertirn el tejido en una masa deforme. o conservarlo en formol(u otro fijador parecido) detiene la autolisis (autodisolucin) endurece el tejido elimina microorganismos que pudieran destruirlo 2) se realiza la seccin del encfalo en lminas o a travs de un micrtomo instrumento que corta lminas muy finas (10-80m) compuesto de una plataforma, una cuchilla y un mecanismo que hace avanzar a las piezas para cortarlas.
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TINCIN se realiza para ver los elementos enceflicos a estudiar con mayor detalle. ej. tincin de somas neuronales o se utiliza un tinte llamado azul de metileno (lo descubri Franz Nissl) este tinte es captado por la sustancia de Nissl (formada por ADN,ARN y protenas del ncleo y del citoplasma). o tambin se utilizan otros tintes: el ms importante es el criscilo VER FIG. 2.8 PGINA 39 seccin frontal del encfalo de un gato. los fascculos no quedan teidos ya que no absorben el tinte. no tie selectivamente los somas, sino a todas las clulas por igual. o es el investigador quien debe averiguar cul es cual por su forma, tamao y localizacin.
MICROSCOPIA ELECTRNICA microscopio ptico(normal) :poca utilidad para ver estructuras tan pequeas del encfalo. microscopia electrnica o microscopio electrnico de transmisin haz de electrones que van de un lado a otro de una fina lmina del tejido a examinar. se proyecta una imagen del tejido en una pantalla fluorescente que se fotografa o escanea. o microfotografas electrnicas podemos ver detalles del orden de nanmetros. o microscopio electrnico de barrido muestra imgenes en 3D pero tiene menor amplificacin que el anterior. el haz de electrones se desplaza, un detector recibe la informacin y un ordenador produce las imgenes en 3D. VER FIG. 2.10 PGINA 40
MICROSCOPIO CONFOCAL CON LSER permite ver detalles en el interior de secciones gruesas o incluso en el cerebro vivo. o los microscopios anteriores requieren que el tejido se seccione en finas lminas. VER FIG. 2.9 PGINA 39 requiere que se tian de fluorescente las partes a estudiar. o inmunocitoqumica el microscopio lanza un rayo de luz reflejado en un espejo dicroico a una profundidad del tejido reflejndose en las partes fluorescentes.
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empleo de sustancias captadas por las dendritas o somas y transportadas a lo largo del axn hasta los botones terminales. ej. HVM o 1) inyectamos PHA-L(protena de las judas) para descubrir el destino de sus axones eferentes. a travs del instrumento estereotxico. o 2) las dendritas absorben las molculas de PHA-L y las transportan hasta el axn. desde donde viajan por transporte axoplsmico rpido hasta los botones. o 3)en pocos das, las neuronas estn repletas de PHA-L o 4) se sacrifica al animal y se le secciona el encfalo. o 5) se aplica un mtodo inmunocitoqumico. VER FIG. 2.15 PGINA 43
empleo de sustancias captadas por los botones terminales y transportadas hacia los somas. ej. HVM o 1) inyectamos oro fluorado que es absorbido por los botones despus ser conducido a lo largo de los axones hasta el soma. o 2) se sacrifica al animal y se secciona el encfalo. o 3) se examina mediante una luz que hace fluorescente al oro fluorado. o ej. aferencia de la amgdala medial VER FIG. 2.16 PGINA 44
mtodo antergrado o retrgrado = neuronas cuyos axones entran o salen de una regin determinada mtodo de marcado transneuronal = identifica 2,3 o ms neuronas formando sinapsis. mtodo transneuronal retrgrado o emplea virus de la seudorrabia mtodo transneuronal antergrado o emplea virus del herpes simple
permiten obtener un diagrama de cableado neural VER PGINA FIG. 2.17 PG. 45
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RM (resonancia magntica) interaccin entre ondas de radio y un intenso campo magntico. proporciona imagen de los planos horizontal, sagital y frontal o a diferencia del TAC(slo horizontal) ej. regiones de sustancia blanca y sustancia gris. o VER FIG. 2.20 PGINA 47
ITD (imgenes tensoriales de difusin) emplea una RM modificada para ver los haces de axones mielnicos en el cerebro in vivo. ej. axones desde el tlamo a la corteza o VER FIG. 2.21 PGINA 47
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MICROELECTRODOS electrodo muy fino utilizado generalmente para registrar la actividad en neuronas individuales. o registro de unidades individuales ej. los agentes qumicos que afectan a las neuronas serotoninrgicas y noradrenrgicas tambin afectan al sueo REM. podemos ver la actividad de estas neuronas durante el sueo mediante microelectrodos. o la actividad de estas neuronas decae casi hasta cero durante el sueo REM. suelen utilizarse varios electrodos de gran duracin aislados entre s. o las actividades que se registran son registros crnicos. tambin se utilizan amplificadores para aumentar la seal y tornillos para desplazar por varios puntos los electrodos. procedimiento: o 1)se implantan en el encfalo mediante ciruga estereotxica. o 2)se conectan unos zcalos de conexin elctrica en miniatura. se fijan al crneo con una pasta dental. o 3) cuando el animal se recupera de la ciruga, se le conecta al registro. VER FIG. 2.22 PGINA 50 o los animales no suelen prestarles atencin y se comportan con normalidad.
MACROELECTRODOS electrodo utilizado para registrar la actividad elctrica de una gran cantidad de neuronas de una regin especfica del encfalo. o no detectan la actividad de neuronas individuales. suelen colocarse sobre el cuero cabelludo. o rara vez en el interior del encfalo. polgrafo o mecanismo que hace avanzar una larga tira de papel sobre la que escriben unas plumillas. o muestra la actividad elctrica registrada con electrodos que se observa en un EEG(electroencefalograma). o VER FIG. 2.23 PGINA 51
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MAGNETOENCEFALOGRAFA procedimiento que detecta grupos de neuronas activadas sincrnicamente gracias al campo magntico inducido por su actividad elctrica. utiliza un conjunto de elementos superconductores de interferencia cuntica o SQUID. o capaces de detectar campos magnticos 1millonsima menor que la Tierra. neuromagnetmetro o VER FI. 2.24 PGINA 52 o contiene varios SQUID o utilizacin: localizacin del foco de crisis epilpticas. cuantificar la actividad cerebral etc.
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Estimulacin elctrica y qumica estimulacin elctrica o paso de una corriente elctrica a travs de un cable insertado en el encfalo. o activa los somas y axones de todas las neuronas de la zona. estimulacin qumica o inyeccin de una cantidad de aminocido excitador. puede hacerse tambin mediante un dispositivo permanente unido al crneo. o inconveniente presenta mayor complejidad que la estimulacin elctrica(ms materiales y procesos) o ventaja activa los somas neuronales pero no los axones de otras neuronas. o excitadores glutamatrgicos: cido glumtico principal neurotransmisor excitador que se encuentra en el encfalo.
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Fotoestimulacin existen protenas fotosensibles: o Rodopsina-canal-2 (ChR2) se encuentra en las algas verdes controla un canal inico que cuando se abre permite el flujo de iones de sodio, potasio y calcio. cuando una luz incide en un canal inico de Chr2, este se abre y la corriente de iones de sodio y calcio cargados positivamente despolariza la membrana. o Natronomonas pharaonis halorhodopsin (NpHR) se encuentra en una bacteria controla un transportador que ingresa cluoruro dentro de la clula cuando es activada por una luz azul. esta entrada de iones cargados negativamente hiperpolariza la membrana. o la accin de estas protenas fotosensibles comienza y termina muy rpido cuando se enciende y apaga una luz de longitud de onda apropiada. VER FIG.2.30 PGINA 57 o se puede introducir estas protenas en neuronas incorporando los genes que las codifican al genoma de virus inocuos. despus se inyecta el virus en el cerebro. los investigadores pueden observar los efectos de activar o desactivar tipos especficos de neuronas en una regin concreta del encfalo. o los investigadores necesitan hacer penetrar luz en el cerebro. si las neuronas que expresan las protenas fotosensibles se encuentran en la corteza se puede taladras un orificio en el crneo y adherir diodos emisores de luz. si las neuronas estn situadas en la profundidad del encfalo se pueden implantar fibras pticas mediante ciruga como si fueran electrodos o cnulas. o usos clnicos: posible tratamiento de la ceguera mediante la utilizacin de estas protenas. Bi y col. utilizacin de ChR2 en las clulas ganglionares de la retina en ratones ciegos que carecan de fotorreceptores.
Estimulacin Magntica transcraneal VER FIG.2.31 PGINA57 estimulacin de la corteza cerebral mediante campos magnticos que se producen aplicando pulsos elctricos mediante una bobina electromagntica situada cerca del crneo. interfiere en la funcin de la regin cerebral que se estimula. los efectos de la EMT son muy parecidos a los de la estimulacin directa del encfalo al descubierto. ej. la estimulacin de una regin especfica de la corteza visual de asociacin altera la capacidad de una persona para detectar movimientos de estmulos visuales. la EMT se ha utilizado para tratar sntomas de trastornos como la depresin.
MTODOS NEUROQUMICOS
en ocasiones nos interesa la localizacin de neuronas que tengan un tipo especfico de receptor o que produzcan un tipo especfico de neurotransmisores o neuromoduladores.
Psicologa Fisiolgica
Grado de Psicologa
se emplea para explorar regiones del cerebro inyectando un marcador radioactivo. la TEP nos indicar la localizacin exacta del marcador radioactivo que se habr unido a un receptor determinado. VER FIG. 2.38 PGINA 63
MTODOS GENTICOS
Estudios con gemelos
mtodo muy eficaz para evaluar la influencia de la herencia en un rasgo concreto comparando el ndice de concordancia en gemelos monocigticos y dicigticos. o concordantes: si a ambos gemelos se les diagnostica un mismo trastorno o discordantes: si slo uno de ellos ha recibido un diagnstico dado. gemelos monocigticos (univitelinos) o tienen un genotipo idntico o porcentaje de gemelos concordantes es superior a los dicigticos. gemelos dicigticos (bivitelinos) o semejanza gentica del 50% uso clnico y cientfico o se han encontrado que factores genticos influyen en muchas caractersticas individuales: rasgos de la personalidad, obesidad, alcoholismo, etc.
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Mutaciones dirigidas
alteracin de un gen knockout que se produce en el laboratorio y se inserta en los cromosomas de un ratn. o este gen no puede producir una protena funcional. casos y objetivos de la mutacin: o en muchos casos el objetivo de la mutacin es una enzima que controla una reaccin qumica especfica. ej.falta de una enzima determinada puede interferir en el aprendiazaje. o en otros casos el objetivo es una protena que desempea una til funcin a la clula. ej. un tipo concreto de receptor para los opioides interviene en los efectos reforzantes y analgsicos de estos. o se pueden producir knockouts condicionales que provocan que los genes del animal dejen de expresar un determinado gen cuando se le suministra una droga. o tambin se pueden insertar genes que den lugar al aumento de la produccin de protenas que se encuentran en la especie <husped> o producir protenas nuevas.
Oligonucletidos <antisentido>
cadena modificada de ADN o ARN que se une con una molcula especfica de ARN mensajero e impide que se produzca su protena. una vez que las molculas de ARNm estn bloqueadas de este modo, son destruidas por enzimas de la clula. parecido a la hibridacin in situ.
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