REAO DE CADEIA DE POLIMERASE (PCR)

O advento da biologia molecular foi certamente um dos maiores passos das cincias biolgicas durante o Sculo XX. A descoberta da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) trouxe enormes benefcios e desenvolvimentos cientficos como o sequenciamento de genomas, a expresso de genes em sistemas recombinantes, o estudo de gentica molecular, a determinao rpida da paternidade e o diagnstico rpido de doenas infecciosas. A Reao em Cadeia de Polimerase (PCR, do ingls Polymerase Chain Reaction), uma metodologia que pode ser executada inteiramente in vitro sem o uso de clulas. A tcnica da PCR foi desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis, que recebeu, em 1994, o prmio Nobel. A PCR possibilita a sntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA-polimerase, a mesma que participa da replicao do material gentico nas clulas. Esta enzima sintetiza uma sequncia complementar de DNA, desde que um pequeno fragmento (o iniciador, ou primer, em ingls) j esteja ligado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o incio da sntese. Os iniciadores definem a sequncia a ser replicada e o resultado obtido a amplificao de uma determinada sequncia DNA com bilhes de cpias.

UTILIZAO DA TCNICA
O desenvolvimento da tcnica de amplificao de segmentos de DNA utilizando a PCR abriu enormes perspectivas para a anlise de genes, diagnstico de doenas genticas e deteco de agentes infecciosos como citomegalovrus, vrus da hepatite B e C, herpes vrus simples, vrus da rubola, vrus da imunodeficincia humana (HIV), Chlamydia trachomatis, Helicobater pylori, Mycobacterium tuberculosis e Pneumocistis carinii. O avano da cincia sobre a compreenso dos genes trouxe para a rotina do laboratrio de gentica, ferramentas que permitem o diagnstico em nvel molecular. Na linha das doenas genticas, o permanente desenvolvimento de novos protocolos tem permitido a pesquisa de pequenas alteraes na sequncia de DNA, como, por exemplo, na fibrose cstica. Outras aplicaes especialmente teis para a PCR a clonagem de um determinado fragmento de DNA, que pode ser um gene e o conhecimento do DNA codificante (cDNA) obtido a partir da molcula de RNA, o que permite o estudo da expresso de genes. Finalmente, a PCR tem um grande potencial na medicina forense. Sua sensibilidade torna possvel utilizar uma amostra bastante pequena (traos mnimos de sangue e tecidos que poderiam conter os restos de somente uma nica clula) e ainda se obter uma impresso digital de DNA da pessoa da qual a amostra foi coletada, podendo

assim fazer comparaes com aqueles obtidos de vtimas e/ou suspeitos de casos de infrao penal. O genoma de cada ser humano (exceto dos gmeos idnticos) diferente nas regies polimrficas, sendo possvel amplificar essas regies. Assim, a pesquisa de STRs (Small Tandem Repeats) atravs da PCR, utilizando um conjunto de iniciadores que cobrem estas partes altamente variveis do genoma humano, pode gerar uma impresso digital caracterstica de DNA para cada indivduo.

DESNATURAO A temperatura elevada ( geralmente >90C ) separa a cadeia dupla de DNA. As duas fitas de DNA so mantidas unidas por pontes de hidrognio (relativamente fracas), que se rompem em altas temperaturas. As ligaes entre as molculas de fosfato e desoxirribose (ligaes covalentes e mais fortes) permanecem intactas. HIBRIDIZAO OU ANNEALING Temperatura de annealing ou hibridizao: normalmente encontra-se entre 40C e 65C, dependendo do comprimento dos primers e da sua sequncia. Os iniciadores (os primers) marcam as extremidades da sequncia alvo: estes iniciadores so curtas sequncias sintticas de nucleotdeos, entre 20 e 30 bases. Numa reao de PCR so includos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturao. EXTENSO Aps a ligao dos primers ou iniciadores s sequncias complementares de DNA, a temperatura eleva-se a aproximadamente 72C e a enzima taq polimerase replica a cadeia de DNA. O processo de sntese iniciado onde esto ligados os primers, incorporando os nucleotdeos complementares sequncia alvo atravs dos dNTPs em soluo. A extenso inicia-se sempre no extremo 3 do primer. A taq polimerase sintetiza exclusivamente na direo 5 para 3. REVELAO Finalizada a PCR, o prximo passo detectar a presena de produtos amplificados. Em geral, isso realizado pela eletroforese em gel de agarose (corado com brometo de etdeo) ou poliacrilamida (corado pelo nitrato de prata).