Avaliação de Alterações Da Matriz Extracelular em Cultura de Células Após Laserterapia

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DE SO PAULO
MARIA CAROLINA LEAL ALMEIDA
AVALIAO DE ALTERAES DA MATRIZ EXTRACELULAR EM CULTURA DE CLULAS APS LASERTERAPIA
SO PAULO 2013
MARIA CAROLINA LEAL ALMEIDA
AVALIAO DE ALTERAES DA MATRIZ EXTRACELULAR EM CULTURA DE CLULAS APS LASERTERAPIA
Dissertao apresentada ao Departamento de Bioqumica, Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de So Paulo, para obteno do ttulo de Mestre em Cincias. Orientador: Profa. Dra. Maria Aparecida da Silva Pinhal
SO PAULO 2013
Almeida, Maria Carolina Leal
Avaliao de alteraes da matriz extracelular em cultura de clulas aps Laserterapia / Maria Carolina Leal Almeida - So Paulo, 2013. 68 f. Dissertao de Mestrado Universidade Federal de So Paulo. Campus So Paulo. Programa de Ps graduao em Cincias Biolgicas (Biologia Molecular). Orientador: Maria Aparecida da Silva Pinhal
1. Laserterapia 2. Matriz extracelular 3. Glicosaminoglicanos
Aos meus pais, Vitor e Telma por sempre apoiarem e respeitarem as minhas escolhas, mesmo diante das dificuldades, sempre servindo de exemplo e inspirao para que eu pudesse me tornar algum melhor e que lutasse pelos meus sonhos. Amo vocs!!!
A toda minha famlia, em especial a minha madrinha Maria, minha av Hilda, minha irm Ana, minha sobrinha Isadora e meu primo Vinicius, pelos momentos de alegria, descontrao, carinho, amizade, preocupao e pacincia. Amo vocs!!!
E por fim e no menos importante dedico este trabalho a Professora Cida, pelo exemplo de paixo e dedicao pesquisa, pela honestidade, tica e sinceridade. Obrigada pelo voto de confiana, amizade, conselhos, puxes de orelha e por toda a ateno dispensada para que este projeto fosse realizado. Muito obrigada!!!!
AGRADECIMENTOS
Vamos l no decorrer desses quatro anos de faculdade conheci muita gente boa, pessoas que indiretamente ou diretamente fizerem parte dessa histria: Ao nosso grupo de trabalho orientado pela professora Cida, Teka, Juan, Dr. Leandro, Dr. Luciano, Cintia, Eloah, Carina e Bethania, no tenho palavras para descrever o quanto sou grata por ter conhecido vocs e pelo convvio dirio no laboratrio, regado de muitas risadas e conversas, possibilitando uma experincia nica, Obrigada!!!
As amigas Eliete, Risa, Thama, Teka, Carina, Bethania, Tati, Eloah, e a Maria Alice por sempre estarem comigo nos momentos bons, mas principalmente nos momentos difceis, quando minha vontade era desistir. Aos professores do departamento, profa. Giselle Zenker Justo por me ceder s clulas HaCaT, prof. Hugo Pequeno Monteiro por ceder s clulas A431, prof. Joo Roberto Martins por ceder as enzimas condroitinases AC e ABC, prof. Ivarne Tersariol, profa. Yara Michellaci e profa. Leny Toma.
Aos meus colegas da bio mol do Laboratrio da Faculdade de Medicina do ABC e da Unifesp galera do quinto andar em especial Tatiana (Tati), sempre com seus conselhos sbios, aos tcnicos do laboratrio pela ajuda prestada, a todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste trabalho e pela convivncia diria, pelas pipocas, lanchinhos da tarde, festas de aniversrios e risadas e lgrimas!
Aos meus colegas de planto que eu adotei como parte da minha famlia Sandra, Beth, Maria Alice (mais uma vez), ao pessoal da enfermagem. Muito obrigada por fazerem parte de mais 2 anos da minha vida!!!
A Lilian pela amizade, pela pacincia e por toda a ajuda que voc me deu, me ensinando a cultivar clulas e por fazer praticamente todos os experimentos deste projeto comigo! Muito obrigada!
Aos meus amigos da Gakkai pelo apoio, pelas palavras de incentivo e por entenderem a minha dificuldade de participar das atividades. Profa. Dra. Helena Nader pela oportunidade de fazer parte da equipe de biologia molecular.
Universidade Federal de So Paulo e Faculdade de Medicina do ABC.
Agradeo o apoio das agncias de fomento que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho, CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico, CAPES Coordenao de aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior, pela bolsa de mestrado, FAPESP Fundao de Amparo Pesquisa de Estado de So Paulo, pelo apoio financeiro concedido ao laboratrio na forma de Auxlios Pesquisa.
Muitssimo obrigada a todos,
Carol
A causa da derrota no se encontra no obstculo ou no rigor das circunstncias; est no retrocesso na determinao e na desistncia da prpria pessoa. Se falasse em dificuldades, tudo realmente era difcil. Se falasse em impossibilidades, tudo realmente era impossvel. Quando o ser humano regride em sua deciso os problemas que se erguem em sua frente acabam parecendo maiores e confundemno como uma realidade imutvel. A derrota encontra-se exatamente nisso... Somente o conhecimento no suficiente. Somente quando o conhecimento alia-se a sabedoria que uma pessoa pode atingir a vitria na vida.
Daisaku Ikeda
Resumo
A pele corresponde ao rgo de maior exposio a radiao por diferentes tipos de luz. Alguns estudos demonstram o efeito de terapias de luz laser de baixa intensidade em determinadas afeces da pele como manchas, processos inflamatrios e em diferentes tipos de tumores. O laser de baixa potncia tem sido utilizado na prtica clnica h
aproximadamente 20 anos. A laserterapia quando utilizada em tecidos e clulas provoca efeitos fotoqumicos, fotofsicos e/ou fotobiolgicos, sem a produo de calor, estimulando a proliferao celular, ativao de linfcitos e mastcitos, promove aumento na gerao ATP entre outros efeitos. Poucos artigos relacionam a laserterapia com as alteraes de componentes da matriz extracelular em cultura celulares. Portanto, o presente estudo tem por objetivo investigar as possveis alteraes de componentes da matriz extracelular em clulas HaCaT (queratincitos humanos) e A431 (carcinoma epidermide humano), que representam dois tipos distintos de linhagens celulares da pele. Dentre os componentes da matriz extracelular foram analisados glicosaminoglicanos sulfatados (GAG), cido hialurnico, enzimas que participam da degradao de heparam sulfato (heparanase) e enzimas envolvidas na degradao e biossntese de cido hialurnico (hialuronidases e cido hialurnico sintases), respectivamente. As alteraes dos componentes da matriz extracelular foram avaliados comparando-se clulas submetidas ao tratamento com laserterapia de baixa potncia e clulas no tratadas (controle). A viabilidade celular de clulas HaCaT e A431 tambm foi avaliada. Os GAG sulfatados foram analisados por marcao metablica utilizando sulfato radioativo, degradao enzimtica e eletroforese. O cido hialurnico foi quantificado por mtodo de ELISA indireto. Ensaios de PCR em tempo real foram realizados para anlise da expresso das enzimas HAS (cido hialurnico sintases) HYAL (Hialuronidases) e HPSE-1 (Heparanase). Os resultados obtidos no demonstraram diminuio significativa na viabilidade celular em ambas as linhagens (HaCaT e A431), aps laserterapia. Houve alterao no perfil de GAG aps tratamento com luz no comprimento de onda associado (470 e 660 nm), sendo que as clulas HaCaT apresentaram aumento significativo de heparam sulfato e condroitim sulfato. O cido hialurnico aumentou na frao celular, aps laserterapia em clulas HaCaT, enquanto, no foi observado alterao nas clulas A431. A analise por qPCR demonstrou diminuio da expresso em clulas HaCaT e das clulas A431. Os resultados obtidos em nosso estudo demonstraram que o tratamento com laserterapia de baixa intensidade altera componentes da matriz extracelular e tais alteraes diferem com relao ao tipo celular (clulas no neoplsicas ou clulas de carcinoma epidermide humano), e o comprimento de onda utilizado.
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS A431 Linhagem estabelecida de carcinoma epidermide humano AH cido hialurnico ATP Adenosina Trifosfato AU - cido Urnico BSA Albumina srica bovina C - Carbono CBC Carcinoma basocelular CEC Carcinoma espinocelular CO2 - Gs Carbnico CS Condroitim sulfato Da Dalton DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco DMSO - dimetilsulfxido DS - Dermatam sulfato EBSS Soluo salina balanceada de Earl sem clcio e sem magnsio EGF Fator de crescimento epidrmico F-12 Meio de cultura contendo mistura de nutrientes com L-glutamina e sem bicarbonato de sdio FGF Fator de crescimento de fibroblastos FGF-2 - Fator de crescimento bsico de fibroblastos FGF-7 - Fator de crescimento de queratincitos GAG Glicosaminoglicano Gal Galactose GlcNac:N-acetilglucosamina GlcUA: cido glucurnico GPI - glicosilfosfatidilinositol GTP - guanosina trifosfato HaCaT Linhagem estabelecida de queratincitos humano HAS - cido Hialurnico Sintase HCl cido Clordrico HEP Heparina HPSE - Heparanase
HS Heparam sulfato Hx Hexosamina HYAL - Hialuronidase J - Joule KDa Kilodalton KS Queratam sulfato LASER Amplificao da luz por emisso estimulada de radiao MEC - Matriz Extracelular MTT - 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazlio NaCl Cloreto de sdio nm Nanmetro PBS Tampo Fosfato-Salino PCR - polymerase chain reaction PDA 1,3-Diaminopropano-acetato PDT Terapia Fotodinmica PG - Proteoglicanos PGHS Proteoglicanos de heparam sulfato PGKS Proteoglicanos de queratam sulfato RNA cido ribonuclico ROS Espcies reativas de oxignio RT-PCR - reverse transcriptase polymerase chain reaction SFB Soro Fetal Bovino TGF- - Fator de Crescimento Transformante Beta
NDICE
1.
INTRODUO ...................................................................................................................................... 1 1.1. 1.1.1. 1.2. 1.3. 1.3.1. 1.4. 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3. LASERTERAPIA OU TERAPIA COM LUZ LASER DE BAIXA INTENSIDADE .............................................. 1 Efeitos da laserterapia nos tecidos biolgicos ....................................................................... 2 PELE .................................................................................................................................................. 4 MATRIZ EXTRACELULAR .................................................................................................................... 8 Proteoglicanos ............................................................................................................................ 8 GLICOSAMINOGLICANOS.................................................................................................................... 9 cido Hialurnico ...................................................................................................................... 10 Condroitim Sulfato, Dermatam Sulfato e Queratam Sulfato .............................................. 13 Heparam Sulfato ....................................................................................................................... 14
2. 3.
OBJETIVOS .........................................................................................................................................17 MATERIAIS ..........................................................................................................................................18 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. LINHAGEM CELULAR ........................................................................................................................ 18 CULTURA DE CLULAS ..................................................................................................................... 18 ENZIMAS .......................................................................................................................................... 18 LQUIDO DE CINTILAO .................................................................................................................. 19 RADIOISTOPO ................................................................................................................................ 19 REAGENTES GERAIS E OUTROS MATERIAIS .................................................................................... 19 EQUIPAMENTOS ............................................................................................................................... 20
4.
MTODOS ............................................................................................................................................22 4.1. 4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.1.4. 4.2. 4.3. 4.3.1. 4.3.2. 4.3.3. 4.3.4. 4.3.5. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7. 4.7.1. 4.7.2. 4.8. 4.9. CULTURA DE CLULAS ..................................................................................................................... 22 Descongelamento de clulas .................................................................................................. 22 Manuteno das clulas .......................................................................................................... 22 Subcultivo das clulas ............................................................................................................. 22 Contagem das clulas em Cmara de Neubauer ............................................................... 23 TRATAMENTO DA CULTURA DE CLULA COM RADIAO A LASER ................................................... 23 QUANTIFICAO DE GLICOSAMINOGLICANOS SULFATADOS SINTETIZADOS POR CLULAS. ........... 25 Marcao metablica ............................................................................................................... 25 Extrao de GAG marcados metabolicamente .................................................................... 25 Eletroforese em gel de agarose com tampo PDA ............................................................. 26 Anlise e quantificao dos GAG marcados metabolicamente ........................................ 26 Dosagem de protenas por mtodo de Coomassie Blue .................................................... 27 DEGRADAO ENZIMTICA .............................................................................................................. 27 ENSAIO DE VIABILIDADE CELULAR ................................................................................................... 28 DOSAGEM DE CIDO HIALURNICO ................................................................................................. 28 EXTRAO DE RNA TOTAL ............................................................................................................. 30 QUANTIFICAO DO RNA TOTAL .................................................................................................... 31 OBTENO CDNA A PARTIR DO RNA TOTAL ................................................................................. 31 ANLISE DA EXPRESSO POR PCR EM TEMPO REAL (QPCR) ....................................................... 31 ANLISE ESTATSTICA ..................................................................................................................... 32
5.
RESULTADOS E DISCUSSO ..........................................................................................................33 5.1. VIABILIDADE CELULAR EM CLULAS HACAT E A431 ............................................................................... 33 5.4. DOSAGEM DE CIDO HIALURNICO ................................................................................................ 42 5.5. EXPRESSO GNICA POR PCR EM TEMPO REAL DAS ENZIMAS DE BIOSSNTESE E DEGRADAO DO CIDO HIALURNICO ............................................................................................................................... 44
NDICE
6. 7.
CONCLUSES ....................................................................................................................................47 REFERNCIA BIBLIOGRFICA .......................................................................................................48
NDICE
NDICE DE FIGURAS
Figura 1: Esquema que ilustra o poder de penetrao dos diferentes tipos de luz em funo do comprimento de onda ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 3 Figura 2: Espectro de absoro dos cromforos da pele. ----------------------------------------------------------- 4 Figura 3. Representao esquemtica das camadas estruturais da pele ----------------------------------- 5 Figura 4: Processo de diferenciao de queratincitos -------------------------------------------------------------- 6 Figura 5. Sitio de clivagem da heparanase e mecanismos de ao dos oligossacardeos gerados na MEC ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------15 Figura 6. Representao esquemtica do ensaio fluorimtrico para quantificao de cido hialurnico --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------30 Figura 8. Perfil de GAG sulfados sintetizados por HaCaT e A431 ----------------------------------------------36 Figura 11. Expresso relativa de Heparanse-1 (HPSE-1). -----------------------------------------------------------41 Figura 12. Quantificao de cido Hialurnico --------------------------------------------------------------------------43 Figura 13. Expresso relativa de cido Hialurnico Sintases (HAS1-3) e Hialuronidases (HYAL1-2) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------45
NDICE
NDICE DE TABELAS
Tabela 1. Proteoglicanos presentes no tecido epitelial. ......................................................................10 Tabela 2. Caractersticas estruturais dos glicosaminoglicanos ........................................................11 Tabela 3. Parmetros de Irradiao .........................................................................................................24 Tabela 4. Sequncias de Oligonucleotdeos iniciadores ....................................................................32
INTRODUO
1. INTRODUO
1.1.
Laserterapia ou Terapia com luz laser de baixa intensidade
A laserterapia de baixa potncia investigada e utilizada na prtica clnica h aproximadamente 20 anos, Theodore H. Maiman construiu o primeiro emissor de laser de rubi em 1960 e, em 1965, Sinclair e Knoll adaptaram esta radiao prtica teraputica. Um dos pioneiros na aplicao do laser de baixa intensidade nas reas biomdicas foi Endre Mester no incio da dcada de 70, na Europa (FUKUDA T Y, 2008; LIN et al., 2010; MESTER; TOTA, 1967). A palavra laser advm da abreviao de seu prprio significado (Light Amplification by Stimulated Emisson of Radiation), ou seja, amplificao da luz por emisso estimulada de radiao. Assim definimos laser como onda eletromagntica no ionizante com caractersticas especiais (KARU, 1987; LIN et al., 2010; TANZI; LUPTON; ALSTER, 2003). As caractersticas especiais do laser diferenciam totalmente da luz natural e definida como luz coerente, monocromtica e paralela (TANZI; LUPTON; ALSTER, 2003). Os lasers so classificados em duas famlias, conforme sua potncia e capacidade de interao com os tecidos. O tratamento com laser de baixa intensidade de energia (LILT ou Low Intensity Level Treatment) causa efeitos como bioestimulao, analgesia, apresentam ao anti-inflamatria e podem diminuir o edema. Por outro lado, o tratamento com laser de alta intensidade de energia (HILT, Hight Intensity Laser Treatment) pode causar desnaturao de protenas, so utilizados para acelerar processos de coagulao sangunea e causam vaporizao devido produo de calor. Portanto, a literatura sugere que lasers de baixa intensidade de energia so estimulatrios, enquanto os de alta intensidade de energia possuem efeito inibitrio e grande parte de sua utilizao so para fins teraputicos (HARRIS, 1988; LIN et al., 2010). Outro fator importante diz respeito aos conceitos fsicos de irradincia, fluncia e energia depositada, pois como pode ser verificadas em diversos estudos as doses utilizadas no tratamento deve levar em considerao estas propriedades fsicas a fim de padronizar e obter resultados satisfatrios do tratamento, visto que, a irradincia influncia no efeito biolgico. Defini-se Irradincia como sinnimo de densidade de
INTRODUO
potncia (DP) e esta define a potncia ptica til do laser e expressa em watts (W), dividida pela rea irradiada, expressa em centmetros quadrado (cm2). Ento temos: Irradincia = potncia ptica laser (W) / rea irradiada (cm2). Enquanto a fluncia define a taxa de energia aplicada no tecido biolgico, expressa por: Irradincia (W / cm2) x tempo de exposio = densidade de energia (fluncia) ou dose de energia (DE) expressa em joule (J / cm2). Estes dados refletem de forma direta o efeito da irradiao em tecidos biolgicos, pois a irradincia vai determinar se h dano trmico ou no. (LOPES, [S.d.]).
1.1.1. Efeitos da laserterapia nos tecidos biolgicos
H um crescente interesse tem sido demonstrado na utilizao do laser. Entretanto, ainda existe muita divergncia com relao aos resultados obtidos de diferentes estudos que descrevem os efeitos da utilizao do laser. Os dispositivos da bioestimulao esto sendo usados sem o conhecimento suficiente dos mecanismos de ao do tipo de luz em cada tecido. Ainda, existe tambm deficincia nos mtodos de padronizao para utilizao da laserterapia, como por exemplo intensidade da luz, tempo de aplicao e distncia. Existem inmeros relatos sobre a eficcia da laserterapia no efeito analgsico, antiinflamatrio e de regenerao tecidual (HARRIS, 1988; LIN et al., 2010; TANZI; LUPTON; ALSTER, 2003), porm, muitos dos relatos so controversos por diferenas significativas na metodologia aplicada. Na rea dermatolgica os lasers mais utilizados vo de 308 (UV-B) at 10,600 (infravermelho) (CARROLL; HUMPHREYS, 2006), o protocolo de tratamento de pele tpico envolve a irradiao do local afetado com a luz laser de baixa intensidade e o efeito da luz aparentemente cumulativo repetido em intervalos de dias, podendo ser absorvida, refletida, transmitida ou espalhada (HARRIS, 1988; TANZI; LUPTON; ALSTER, 2003). A Figura 1 ilustra o poder de penetrao das diferentes camadas que compem a pele, utilizando diferentes tipos de luz de acordo com o seu comprimento de onda. Quando a luz interage com as clulas e tecidos, necessrio observar que lasers no espectro visvel possuem pouca penetrao nos tecidos, sendo de grande importncia a utilizao de uma dose adequada, onde certas funes celulares
INTRODUO
podem ser estimuladas, tais como ativao de linfcitos, ativao de mastcitos, aumento na produo de ATP mitocondrial, proliferao celular e apoptose. Tambm foi observado efeito da luz sobre componentes da matriz extracelular como estimulo da proliferao de fibroblastos, estmulo da sntese de fibras elsticas e colgenas, aumento da migrao celular de queratincitos, estmulo da liberao do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) e estmulo no processo de cicatrizao de feridas (BASSO et al., 2012; GAO; XING, 2009; HOPKINS et al., 2004; LIN et al., 2010; LOPES, [S.d.]; TANZI; LUPTON; ALSTER, 2003).
Figura 1: Esquema que ilustra o poder de penetrao da radiao em funo do comprimento de onda. (LOPES, [S.d.])
A utilizao de lasers no comprimento de onda de 470 nm (luz azul), apresenta ao importante no processo bactericida e antifngico. A utilizao da luz azul pode ser realizada em associao com fotossensibilizadores, causando fotoexcitao de porfirinas endgenas de bactrias fotossensveis e posterior produo de espcies reativas de oxignio (LUCCA; WILLIAMS; BHATNAGAR, 2012) A laserterapia promove estresse nos tecidos por promover a formao de espcies reativas de oxignio e tambm induz diversas respostas como proliferao celular e processos de cicatrizao (GROSSMAN et al., 1998).
INTRODUO
A formao de espcies reativas de oxignio (ROS) causado pela laserterapia induz proliferao, produo de molculas inflamatrias e aumento na produo de ATP (CHEN; HUNG; HSU, 2008; FUJIMOTO et al., 2012; GAO; XING, 2009). Lasers de baixa potncia so frequentemente empregados no tratamento de patologias, sendo associados a diferentes tcnicas, como por exemplo, Terapia Fotodinmica (PDT), onde se utiliza fotossensibilizador capaz de absorver a luz em comprimento de onda especfico (CASTRO et al., 2007; WAGNER et al., 2012), sendo assim a laserterapia difere da PDT por utilizar cromforos endgenos. Na a pele, os principais cromforos endgenos so a riboflavina, bilirrubina, melanina, protoporfirina e hemoglobina, como demonstrado na Figura 2 (MAHMOUD et al., 2008).
Figura 2: Espectro de absoro dos cromforos da pele. Adaptado de (MAHMOUD et al., 2008)
1.2.
Pele
A pele o maior rgo do corpo humano e representa 16% do peso corpreo,
est dividida em camadas denominadas epiderme, derme e hipoderme, como

representado na Figura 3.
INTRODUO
Figura 3. Representao esquemtica das camadas estruturais da pele. Adaptado de (Cancer Information, [S.d.]).
A epiderme representa a camada mais superficial da pele e composta de camadas estratificadas denominadas estrato basal, estrato espinhoso, estrato granuloso e estrato crneo (Figura 4). A estrutura e funo da pele dependem de um equilbrio entre a proliferao e diferenciao de queratincitos, que sofrem alteraes morfolgicas e boqumicas importantes, conferindo rigidez e fora ao tecido epitelial, bem como proteo contra a invaso de patgenos, agresses fsicas e qumcas. A integridade e resistncia da pele se deve presena de uma extensa camada de filamentos de actina no citoesqueleto dos queratincitos e interaes clula-clula (desmossomos) e clulamatriz (hemidesmossomos) (SIMPSON; PATEL; GREEN, 2012).
INTRODUO
Figura 4: Processo de diferenciao de queratincitos. Adaptado de PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008.
Os queratincitos representam cerca de 90% da epiderme e so as clulas responsveis pela produo da queratina, num processo denominado queratinizao (KANITAKIS, 2002). O estrato basal representa a poro mais interna da epiderme em contato com a membrana basal. Neste estrato esto presentes queratincitos com aspecto cubide, melancitos responsveis pela sntese de melanina e clulas de Merkel, responsveis pela sensao do tato. A camada basal germinativa garante a renovao dos queratincitos e renovao da pele, que ocorre em at 21 dias. As camadas suprabasais da epiderme subdividem-se em estrato crneo, que compreende a camada mais externa, constituda por clulas anucleadas, achatadas e queratina, responsvel por formar uma barreira de proteo que surge a partir da
INTRODUO
diferenciao especfica dos queratincitos da camada espinhosa e granulosa. No estrato granuloso, alm de queratincitos com formato mais achatado encontram-se clulas de Langerhans, que participam das reaes imunolgicas da epiderme. Em diferentes situaes patolgicas, como leso da epiderme, queratose actnica, hiperpigmentao e sarda (lentigo), inicia-se um programa complexo de reestruturao que promove reepitelizao, migrao e proliferao intensa de queratincitos. Tais processos so coordenados pela interao de fatores de crescimento, como fator de crescimento epidrmico (EGF), fatores de crescimento de fibroblastos (FGF) e fator de crescimento transformante (TGF-) (IRIYAMA et al., 2011; NASHAN; MEISS; MLLER, 2013; SADOWSKI et al., 2003; SEPPNENPASONEN et al., 2003). A pele est sujeita a diferentes tipos de estresse, como, por exemplo, a frequente exposio luz UV, e sua alterao pode facilmente progredir ao aparecimento de tumores classificados como melanomas malignos e tumores nomelanomas, este ltimo inclui o carcinoma espinocelular (CEC) e carcinoma basocelular (CBC), que representam respectivamente 25% e 70% dos casos de cncer de pele no-melanoma (INCA, [S.d.]; LUKIC D et al., 2012; PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008; WU et al., 2012). O carcinoma espinocelular (CEC) uma leso das clulas epiteliais originada a partir da transformao de queratincitos, e o segundo cncer no-melanoma mais frequente na populao branca. Sua principal origem a presena de queratose actnica causada pela exposio solar, sendo classificado de acordo com grau o diferenciao dos queratincitos e a invaso epidrmica (KIM; ARMSTRONG, 2012). O crescimento do tumor controlado pela interao das clulas tumorais com o microambiente, envolvendo ativao de fibroblastos, clulas endoteliais e
inflamatrias e interaes com diversos componentes da matriz extracelular, promovendo proliferao celular, angiognese, inibio de apoptose e invaso tumoral (RODUST; FECKER; STOCKFLETH, 2012; WILLHAUCK et al., 2007). O estudo com clulas HaCaT demonstra um grande potencial na investigao da fisiologia e patologias da pele, visto que as clulas HaCaT possuem a capacidade de se diferenciar in vitro, reproduzindo todas as camadas constituintes da epiderme. Cumpre ser observado que trabalhos recentes demonstram claramente que o meio de cultura importante para o processo de diferenciao das diversas camadas da epiderme. Dentre as diferentes variveis do meio de cultura
INTRODUO
celular, a concentrao ideal de clcio e tempo de cultura permitem a presena de todas as camadas epidrmicas em cultura de clulas HaCaT, em mdia 13 dias para chegar ao estgio final de diferenciao (BORANIC et al., 1999; DEYRIEUX; WILSON, 2007). A linhagem no neoplsica de queratincitos humanos imortalizada (HaCaT), bem como clulas de carcinoma epidermide humano (A431), so frequentemente utilizadas como modelo in vitro de estudos (DEYRIEUX; WILSON, 2007; HSIEH; YU; LYU, 2010).
1.3.
Matriz Extracelular
1.3.1. Proteoglicanos
A matriz extracelular (MEC) constituda por uma rede complexa de macromolculas composta por colgenos, glicoprotenas, fibras elsticas,
proteoglicanos (PG) e cido hialurnico (AH) (KRESSE; SCHNHERR, 2001; SCHONHERR; HAUSSER, 2000). A MEC desempenha diversas funes como participao em mecanismos de sinalizao celular, reservatrio para fatores de crescimento, citocinas e modulao de processos como proliferao, adeso e migrao celular (BAUER; JACKSON; JIANG, 2009; KRESSE; SCHNHERR,
2001; SCHONHERR; HAUSSER, 2000). Os proteoglicanos so macromolculas constitudas por um esqueleto protico ligado a cadeias de glicosaminoglicanos e encontram-se presentes na superfcie celular, em grnulos intracelulares e na MEC. Os proteoglicanos modulam a ao de citocinas, fatores angiognicos e fatores de crescimento. Os efeitos dos proteoglicanos em vrios mecanismos celulares em geral so modulados por interaes com as cadeias de glicosaminoglicanos (GAG) ou por interaes entre o esqueleto protico dos proteoglicanos. Os proteoglicanos tambm possuem importante papel na organizao de fibras de colgeno e participam de fenmenos biolgicos como diferenciao, manuteno e organizao da MEC (SCHONHERR; HAUSSER, 2000). No tecido epitelial so frequentemente encontrados proteoglicanos de superfcie celular, como PG da famlia dos sindecans, glipicans, famlia do CD44 e proteoglicanos de MEC (versicam) e lmina basal (perlecam). Os PG de baixo peso molecular, ricos em resduos de leucina como decorim, biglicam e fibromodulina
INTRODUO
tambm so caractersticos da MEC da pele. A Tabela 1 evidencia os diferentes tipos de PG encontrados na pele.
1.4.
Glicosaminoglicanos
Os glicosaminoglicanos (GAG) so heteropolissacardeos lineares, formados por unidades dissacardicas repetitivas, constitudos por um resduo de hexosamina (glucosamina ou galactosamina), ligada a um resduo de acar no aminado, que pode ser cido urnico (D-cido glucurnico ou L-cido idurnico) ou D-galactose. A massa molecular dos glicosaminoglicanos pode variar entre 10-100 kDa. Com exceo do cido hialurnico, todos os GAG encontram-se ligados a um esqueleto protico formando os proteoglicanos, j mencionados (GANDHI; MANCERA, 2008; RADEMACHER; PAREKH; DWEK, 1988). Os GAG podem interagir com protenas distintas, incluindo quimiocinas, citocinas, fatores de crescimento, enzimas e molculas de adeso, promovendo a regulao de diversas funes biolgicas (GALLO, 2000; GANDHI; MANCERA, 2008) Os GAG participam de mecanismos de sinalizao em vrios processos fisiolgicos e patolgicos como angiognese, crescimento axonal, progresso de tumores, metstases tumorais e mecanismos de coagulao. Os GAG sulfatados incluem o condroitim sulfato (CS), dermatam sulfato (DS), queratam sulfato (KS), heparina (HEP) e o heparam sulfato (HS). Enquanto o cido hialurnico (AH) representa a classe de GAG no sulfatado, a Tabela 1 representa a nomenclatura proposta por Jeanloz e unidades dissacardicas constituintes (JEANLOZ, 1960). A pele apresenta grande quantidade de cido hialurnico, dermatam sulfato, heparam sulfato e queratam sulfato, que modulam processos de adeso, migrao e proliferao celular (GALLO, 2000; MALMSTRM et al., 2012; ZHAO et al., 2013).
INTRODUO 10
Tabela 1. Proteoglicanos presentes no tecido epitelial*.

Proteoglicano Sindecam GAG CS HS HS Protena (KDa) 31 82-88 62 Tecido Epitlio e fibroblasto Epitlio e fibroblasto Atividade Morfognese, adeso celular Endocitose
Glipicam
Perlecam
CS/HS
400 Membrana basal
Estrutural
Versicam
CS
265
Fibroblasto
Suporte mecnico, migrao celular Adeso celular, fibrilognese
Decorim
CS/DS
36
Conjuntivo Membrana basal, epitlio Conjuntivo
Colgeno XVIII
HS
150
Adeso celular Adeso celular, fibrilognese
Fibromodulina
KS CS facultativo
42
CD44
32-38
Epitlio e linfcitos
Interao clula-clula
* Adaptada de (ESKO, 1991; SARRAZIN; LAMANNA; ESKO, 2011)
1.4.1. cido Hialurnico
O cido hialurnico (AH) um GAG no sulfatado, formado por unidades repetidas de -D-1,3-N-acetilglicosamina e -1,4-cido D-glucurnico, com peso molecular que varia entre 105 a 107 Da (BRIMACOMBRE; WEBER, 1964; MEYER, 1958). Na MEC o cido hialurnico encontra-se associado proteoglicanos como o agrecam e versicam, formando agregados unidos por domnios de ligao, conhecidos como protena de ligao ou link protein, proporcionando estabilidade molcula e dificultando a degradao do AH (RODRIGUEZ; ROUGHLEY, 2006; SEYFRIED et al., 2005).
INTRODUO 11
O AH encontra-se altamente expresso em clulas epiteliais, desempenha importante papel no remodelamento, reparo e regenerao do tecido, participando tambm em processos patolgicos como inflamao e desenvolvimento tumoral (FRENKEL, 2012; KASTNER; THOMAS; JENKINS, 2007; NEUMAN et al., 2011; PAIVA et al., 2005).
Tabela 2. Caractersticas estruturais dos glicosaminoglicanos

GAG cido Hialurnico Condroitim sulfato Dermatam sulfato Queratam sulfato Heparam sulfato Acar no nitrogenado cido -DGlucurnico cido -DGlucurnico -L-idurnico cido -D-Glucurnico -DGalactose cido -DGlucurnico Ligao glicosdica (1-3) Hexosamina (Hx) -D-NAcetilglucosamina -D-NAcetilgalactosamina -D-NAcetilgalactosamina -D-NAcetilglucosamina -D-NAcetilglucosamina -D-Glucosamina N-Sulfato -D-Glucosamina N-Sulfato Ligao glicosdica (1-4) *Sulfato (s)
(1-3)
(1-4)
C4 ou C6 (Hx) C4 (Hx) C6 (Hx) C6 (Gal) C6 (Hx)
(1-3) (1-3) (1-4)
(1-4)
(1-3)
(1-4)
(1-4)
Heparina
-Lidurnico
(1-4)
(1-4)
C6 (Hx) C2 (AU)
*Posies de sulfatao: GAG, glicosaminoglicanos; Hx, Hexosamina; AU, cido urnico; N, grupamento amino; C, carbono; Gal, galactose.
O AH apresenta-se distribudo no estrato basal e espinhoso da epiderme, enquanto, os estratos granular, crneo, bem como a membrana basal so negativos para a marcao do AH (TAMMI et al., 1988). A associao do AH com diferentes tipos de receptores, como por exemplo na superfcie de clulas tronco e em clulas neoplsicas apresenta correlao com a progresso de tumores. Dentre os receptores de AH encontramos CD44, RHAMM e ICAM (BOURGUIGNON et al., 2012). Trs isoformas de enzimas participam da biossntese do AH, denominadas cido hialurnico sintases (HAS-1, HAS-2 e HAS-3). As cido hialurnico sintases encontram-se ancoradas na membrana plasmtica, onde o AH sintetizado e liberado para o espao extracelular, em geral so pouco expressas, mas produzem
INTRODUO 12
uma grande quantidade de AH (KOSUNEN et al., 2004). As HAS-1 e HAS-2 produzem AH de alto peso molecular, entre 2-4 x106 Da, enquanto, a HAS-3 produz fragmentos de AH de baixo peso molecular, entre 0,4-2,5 x 105 Da (AVERBECK; GEBHARDT; VOIGT, 2006). Os genes que codificam as diferentes cido hialurnico sintases humanas esto presentes em diferentes cromossomos, porm, possuem homologia entre si. O gene da enzima HAS-1 est localizado no cromossomo 19q13.3-q13.4. O gene da HAS-2 encontra-se no cromossomo 8 e o gene da HAS-3 encontra-se no cromossomo 16q22.1 (NOBLE; LIANG; JIANG, 2011; NYKOPP et al., 2009). Estudos mostram que a inibio de HAS-2 na fase embrionria causa letalidade e/ou anormalidades no desenvolvimento embrionrio (CAMENISCH et al., 2000). J as enzimas HAS-2 e HAS-3 so importantes no processo de diferenciao e proliferao da epiderme (SEPPNEN-PASONEN et al., 2003). As enzimas que participam da degradao do AH so denominadas hialuronidases (HYAL). Existem seis isoformas conhecidas, HYAL1-4, PH 20/SPAM1 e HYALPI, sendo que as isoformas HYAL1 e HYAL2 so mais expressas em clulas somticas. A HYAL1 apresenta atividade em pH cido e pode degradar AH de alto ou baixo peso molecular, gerando tetra- e hexassacardeos. A HYAL2 cliva molculas de AH de alto peso molecular, sendo encontrada em baixas concentraes (CSOKA; FROST; STERN, 2001; GEORGE; STERN, 2004). A
HAYL3 apresenta-se expressa na medula ssea e testculo, enquanto a HAYL4 encontrada no msculo esqueltico e placenta (CSOKA, ANTONEI BENJAMIN SCHERER STEPHEN; STERN, 1999). A enzima PH 20/SPAM1 localiza-se no cromossomo 7q31 e encontra-se expressa nos testculos (JONES et al., 1995; PRIMAKOFF; HYATT; MYLES, 1985). A presena e ao das HAYL apresenta um importante papel tanto na fisiologia quanto em processos patolgicos e conforme descrito na literatura sua presena tecido-dependente. O AH tambm pode ser degradado de forma no enzimtica por mecanismo que envolve radicais livres, em presena de agentes redutores, como cido ascrbico, tiis e ons cobre (STERN; MAIBACH, 2008).
INTRODUO 13
1.4.2. Condroitim Sulfato, Dermatam Sulfato e Queratam Sulfato
O condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS) pertencem classe de galactosaminoglicanos, pois a hexosamina constituinte a galactosamina. O CS composto por unidades dissacardicas repetitivas de cido D-glucurnico e Nacetilgalactosamina unidas por ligaes 1-4 e 1-3. O CS pode ser sulfatado na posio C6 ou C4 dos resduos de N-acetilgalactosamina. O DS difere do CS por apresentar resduos de cido L-idurnico, alm de cido D-glucurnico
(BRIMACOMBRE; WEBER, 1964; MALMSTRM et al., 2012). O padro de sulfatao, desacetilao e epimerizao cria uma diversidade de famlias de CS com funes especficas de acordo com sua estrutura. Em mamferos, a unidade mais frequente de galactosamina a forma monosulfatada, na posio C4, tambm denominada CS-A ou CS-C quando apresenta sulfatao em C6. Outras formas de CS tm sido descritos, tais como CS-D e CS-E, ambos dessulfatados (MALMSTRM et al., 2012). O condroitim ocorre em processos de crescimento, ossificao e manuteno da cartilagem normal (MICHELACCI et al., 1979; MOURO et al., 1976). Estudos em diversos tecidos neoplsicos mostram um aumento de CS na matriz extracelular, principalmente do condroitim-6-sulfato (DIETRICH et al., 1980). O DS o GAG mais abundante na pele e talvez seja o principal GAG associado ao colgeno, estando inclusive envolvido com a organizao e fibrilognese. O DS tambm participa de processos de cicatrizao, atravs da interao com o cofator II da heparina e ativao de fatores de crescimento, como FGF-2 e fator de crescimento de queratincitos (FGF-7) (TAYLOR; RUDISILL; GALLO, 2005; TOLLEFSEN, 1994). O queratam sulfato (KS) composto por D-galactose, ligada a Nacetilglucosamina por ligao do tipo 1-4 e 1-3 (BRIMACOMBRE; WEBER, 1964). O KS um componente importante de vrios tecidos ricos em colgeno e representa um dos principais GAG presentes na crnea (HAYASHIDA et al., 2006). Os proteoglicanos de queratam sulfato (PGKS), como lumicam, keratocam e osteoglicina, apresentam um papel regulador na manuteno da estrutura crnea em um grande nmero de espcies. Acredita-se que os PGKS formam a arquitetura da crnea atravs de interaes com as fibras colgenas (BLOCHBERGER et al., 1992; CORPUZ et al., 1996; FUNDERBURGH et al., 1997).
INTRODUO 14
Na pele, o lumicam desempenha um papel central no colgeno da pele fibrilognese e cicatrizao de feridas (YEH et al., 2010), e sua presena foi detectada em clulas de melanoma humano, mas no em clulas de melancitos normais. (BRZILLON et al., 2007; SIFAKI et al., 2006).
1.4.3. Heparam Sulfato
O heparam sulfato (HS) foi descoberto h 50 anos por Jorpes e Gardell, no entanto, suas funes biolgicas at hoje so alvo de extensiva investigao. O HS amplamente distribudo no reino animal, possuindo as mais variadas funes e interaes na MEC (DIETRICH et al., 1998). O HS faz parte dos GAG sulfatados e ocorre geralmente associado a um esqueleto protico formando proteoglicanos (PGHS). Os PGHS ligam-se
especificamente a uma variedade de protenas (IOZZO, 2001). A estrutura do HS composta por resduos de cido L-idurnico e cido Dglucurnico ligados a N-acetilglicosamina (ligao 1-4) (NADER et al., 1987, 1989). O padro de sulfatao do HS influencia a interao e consequente modulao e ativao de diferentes protenas. Algumas funes biolgicas do HS envolvem o reconhecimento clula-clula, interao com componentes da MEC, tais como laminina, fibronectina e colgeno, adeso e migrao celular, alm da ativao de enzimas (IRIE et al., 2008; PARISH, 2006; PORCIONATTO; NADER; DIETRICH, 1999). O HS participa do processo de diviso celular de duas maneiras diferentes: como modulador positivo ou negativo, ou como responsvel por estmulos mitognicos. Sua ao como modulador positivo da proliferao celular deve-se capacidade de ligar-se e agir como um co-receptor para fatores de crescimento (PORCIONATTO; NADER; DIETRICH, 1999). As clulas no podem responder ao fator de crescimento bsico de fibroblastos (FGF-2) na ausncia de HS. Somente a presena de um receptor de fator de crescimento de fibroblasto (FGF) funcional na clula no basta, o complexo s se torna ativo quando o HS est presente (ORNITZ; WILEY, 2000). Observou-se que a epiderme e membrana basal apresentam respectivamente sindecam-1, sindecam-4 e perlecam (BEHRENS et al., 2012; JUNG et al., 2012). O
INTRODUO 15
HS parece ser essencial na constituio do complexo de ancoragem entre derme e epiderme (IRIYAMA et al., 2011). O heparam sulfato degradado endogenamente pela enzima heparanase (HPSE-1), uma endo-beta-glucuronidase que cliva cadeias intrassacardicas do heparam sulfato, propiciando a formao de oligossacardeos que apresentam alta afinidade por fatores de crescimento, citocinas e fatores angiognicos. Os oligossacardeos gerados por ao da heparanase participam, portanto, de processos biolgicos como proliferao celular, inflamao, vascularizao, angiognese e invaso tumoral, como mostra o esquema da Figura 5 (VLODAVSKY et al., 1999; ZCHARIA et al., 2005).
Figura 5. Sitio de clivagem da heparanase e mecanismos de ao dos oligossacardeos gerados na MEC. Adaptado de (VLODAVSKY; FRIEDMANN, 2001).
Estudos recentes evidenciam o importante papel da heparanase na fisiologia da pele e demonstra que a ativao desta enzima induz hiperplasia da epiderme, angiognese e rugas (IRIYAMA; MATSUNAGA; AMANO, 2010). A hiperpigmentao da pele em humanos causada por exposio solar induzida por heparanase, sendo tal fato decorrncia da perda de heparam sulfato essencial para a juno dermeepiderme (IRIYAMA et al., 2011). Foi evidenciado que a exposio luz UV promove aumento na expresso e atividade da enzima heparanase (KURDYKOWSKI et al., 2012). Pacientes com
INTRODUO 16
melanoma, bem como cultura de clulas de melanoma, demonstraram aumento na expresso da heparanase (CHEN et al., 2012; WAGNER et al., 2012). evidente o papel dos glicosaminoglicanos e da enzima heparanase (HSPE1) para a integridade e manuteno das funes da pele. Sabemos que a laserterapia ou aplicao do laser de baixa frequncia bastante utilizada em tratamentos de pele com a finalidade de remover manchas em geral e acne. Diante do exposto resolvemos investigar possveis alteraes do perfil de
glicosaminoglicanos e da expresso da heparanase causadas pela irradiao com laser de baixa freqncia (laserterapia) em modelo experimental in vitro. Em tais estudos decidimos utilizar a linhagem celular caracterstica de queratincitos humanos (HaCaT) e comparar os possveis efeitos da laserterapia com clulas neoplsicas de carcinoma epidermide humano (A431). Este estudo poder
elucidar o efeito da laserterapia em clulas no neoplsicas e clulas tumorais da pele, auxiliando o entendimento dos efeitos e alteraes moleculares
proporcionados por este tipo de terapia.
OBJETIVOS 17
2.
OBJETIVOS
Avaliar o efeito da irradiao de baixa frequncia (laserterapia) na viabilidade celular em clulas no neoplsicas (HaCaT),
comparativamente com linhagem tumoral (A431). Analisar possveis alteraes do perfil de GAG em queratincitos humanos (HaCaT) e em clulas de carcinoma epidermide humano (A431) aps irradiao de baixa frequncia (laserterapia). Investigar possveis alteraes da expresso gnica da heparanase, cido hialurnico sintases e hialuronidases em clulas HaCaT e A431 aps a utilizao de irradiao de baixa frequncia (laserterapia).
MATERIAL E MTODOS 18
3.
MATERIAIS
3.1.
Linhagem celular
Para a realizao deste trabalho foram utilizadas linhagens de clulas estabelecidas de queratincitos humanos (HaCaT), gentilmente cedida pela Profa. Dra. Giselle Zenker Justo e de Carcinoma epidermide humano (A431), gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Hugo Pequeno Monteiro.
3.2.
Cultura de clulas
Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) baixa glicose da Nutricell,
Campinas SP, Brasil; Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) alta glicose da Nutricell,
Campinas SP, Brasil; PBS (tampo fosfato salino) 0,1M, contendo NaCl 137 mM, Na2HPO4 4,3 mM, KH2PO4 1,8 mM e KCL 2,7 mM em gua destilada e filtrada em sistema Milli-QTM (Millipore, Billerica, MA, EUA); Placas para cultura de poliestireno P35 (35x10 mm) e P60 (60x10 mm)
falcon (Lincon Park, New Jersey, EUA); Soluo EBSS (soluo salina balanceada de Earl sem clcio e sem
magnsio), NaCl 116 mM; KCl 5 mM; Na2HPO4 8 mM; KH2PO4 1,46 mM; NaH2HPO4. 1H2O 1 mM; NaHCO3 8 mM (Merck, Darmstadt, Alemanha); D-glucose 1% e vermelho de fenol 0,01% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) em um litro de gua destilada e deionizada em sistema Milli-QTM (Millipore, Billerica, MA, EUA); Soro fetal bovino (SFB) da Cultilab (Campinas, SP, Brasil); Tampo para protelise, Tris-HCl 50 mM, contendo 3,5 M uria, pH 7,4; Antibiticos: Estreptomicina e Penicilina.
3.3.
Enzimas
Maxatase (protease alcalina P126) foi adquirida da Biocon do Brasil Indstria
Ltda. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil); Tripsina 2,5% da Cultilab (Campinas, SP, Brasil);
Condroitinase AC e ABC da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA); Transcriptase Reverse - kit ImProm-IITM Reverse Transcription System Oligo (dT)12-18 da Invitrogen (Life Technologies Corporation). Lquido de cintilao Ultima Gold (PerkinElmer Life And Analytical Sciences, Inc.; Wellesley,
(Promega, Madison, Wisconsin); -
3.4.
MA, USA).
3.5.
Radioistopo Sulfato de sdio (Na2[35S]O4) do Instituto de Pesquisas Energticas e
Nucleares (IPEN, So Paulo, SP, Brasil);
3.6.
Reagentes gerais e outros materiais
Todos os reagentes foram utilizados de acordo com as normas tcnicas: Agarose da Bio Laboratories (Richmond, CA, EUA); Albumina srica bovina (BSA) da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA); Azul de toluidina da Fisher Scientific Co. (Fair Lawn, NY, EUA); Soluo de Coomassie Brilliant Blue G, contendo corante Coomassie Brilliant
Blue G 117M (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA), etanol 4,8% e cido fosfrico 8,5% (Merck, Darmstadt, Alemanha). EUA); Garrafas de cultura, 75, 100 ou 150cm 2 da Corning Laboratory Sciences Co. Placas multiwell para cultura com 96 poos da Falcon (Lincon Park, New Cetavlon (brometo de cetiltrimetilamnia da Merck, Darmstadt, Alemanha); Cloreto de Sdio (Merck, Darmstadt, Alemanha); DMSO (dimetilsulfxido) da Aldrich Chemical Company, Inc. (Millwaukee, WI,
(Corning, NY, EUA); -
Jersey); Tris da Gibco (Grand Island, NY, USA); Uria ultra pura da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA);
New Jersey, EUA); TRIzol da Invitrogen (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA); Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (2x) (Fermentas, Life Sciences)
3.7.
Equipamentos
EUA); -
Agitador Vortex-Genie 2 modelo G250, Scientific Industries (Bohemia, NY, Autoclave vertical e horizontal da FABBE (So Paulo, SP, Brasil); Banhos de temperatura constante FANEM Ltda. (So Paulo, SP, Brasil); Cmaras para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por
Jaques e col. (1968), manufaturado pela Tcnica Permatron Ltda. (So Paulo, SP, Brasil) EUA); Cyclone Sistema de estoque de fsforo, da Packard Instrument Company (Meriden, CT, EUA), com software OptiQuant, para anlise de imagem; Espectrofotmetro modelo Spectronic 2000, da Bauch&Lomb (Rochester, Contador de cintilao Micro Beta Jet da Perkin Elmer, Inc. (Fremont, CA,
NY, EUA); Filmes radiossensveis Multipurpose (12,5 x 19,2; 12,5 x 25,2 e 12,5 x 43,0)
da Packard Instruments Co. (Meriden, CT, EUA); Fluxo Laminar vertical da Vecco (Campinas, SP, Brasil); Incubadora de CO2, modelo 315, acoplada a torpedos de CO2 pelo Gs Guard Leitor de Elisa modelo ELX 800 (Universal microplate reader) da Bio-tek
modelo 3030 da Forma Scientific (Marietta, OH, EUA); -
instruments Inc. (Highland Park, WI, EUA); Microcentrifuga 14.000 rpm modelo 5415, Eppendorf (Hamburg, Alemanha); Microscpio invertido de campo claro e contraste de fase, modelo TE-100,
com cmera fotogrfica digital acoplada, modelo Coolpix 990, ambos da Nikon, Nippon Kogakuk (Tquio, Japo); Microplacas de 96 poos MaxiSorp/FluoroNunc. NanoDrop 1000 Spectrophotometer da Thermo Fischer Scientific INC pHmetro modelo 420 da Orion Research Incorporated (Boston, MA, EUA);
Purificador de gua Milli-Q ZD2- 115 84 da Millipore Corporation (Bedford,
MA, EUA); Termociclador ABI Prism 7500 da Applied Biosystems (Life Technologies
Corporation, Carlsbad, CA)
4. MTODOS
4.1.
Cultura de clulas
4.1.1. Descongelamento de clulas
Para o descongelamento das clulas, o fluxo laminar vertical foi previamente limpo com lcool 70% e tratado com luz ultravioleta por 20 minutos seguido por equilbrio da ventilao por 10 minutos. As clulas, armazenadas em nitrognio lquido, foram descongeladas em banho-maria a 37C, ressuspensas em 5 mL de meio de cultura estril e centrifugadas para eliminao dos eventuais resduos dos reagentes de congelamento. O sobrenadante desta centrifugao foi descartado e as clulas foram ressuspensas em 1mL de meio DMEM baixa glicose com 10% de SFB para a linhagem estabelecida HaCaT e DMEM alta glicose com 10% de SFB para a linhagem estabelecida A431 e plaqueadas em garrafas plsticas especficas para cultura.
4.1.2. Manuteno das clulas
A linhagem estabelecida de queratincito (HaCaT) e Carcinoma epidermide (A431) foram cultivadas em garrafas/placas de cultura, contendo meio de cultura estril DMEM. Este meio foi preparado acrescentando-se 10% de SFB e antibiticos (100 g/mL de estreptomicina e 100 Ul/mL de penicilina). A cada dois dias o meio de cultura foi trocado, por aspirao com o auxilio de uma pipeta Pasteur acoplada bomba de vcuo. O meio de cultura contm o indicador de pH vermelho de fenol que apresenta colorao vermelha em pH neutro e amarela em pH cido. Devido ao metabolismo celular o pH tende a acidificar, tornando o meio de cultura amarelo, indicando, portanto, a necessidade de trocar o meio. O pH ideal para o cultivo das clulas neutro, prximo a 7,4.
4.1.3. Subcultivo das clulas
Quando as clulas apresentaram semi-confluncia, o meio de cultura foi aspirado e a placa foi lavada com tampo EBSS para remover qualquer resduo de SFB, para
que este no inative a enzima proteoltica utilizada na remoo das clulas na placa. Para a remoo das clulas utilizou-se da enzima tripsina. A tripsina diluda 1:10 foi adicionada a cada placa, mantendo-se a placa na estufa a 37C, por aproximadamente 10 minutos, para que as clulas aderidas se soltassem da garrafa/placa de cultura. Aps essa etapa as clulas foram removidas da placa e colocadas em tubo de plstico de 15mL contendo 3 mL de meio DMEM com 10% SFB. O SFB apresenta inibidores de proteases e foi usado para inativar a tripsina, e assim, evitar lise celular. Este tubo foi centrifugado a uma velocidade de 2.500 rpm por 5 minutos e o sobrenadante descartado. As clulas foram ressuspensas em 5 mL de meio de cultura para serem plaqueadas novamente.
4.1.4. Contagem das clulas em Cmara de Neubauer
A contagem foi realizada para determinar a quantidade de clulas a ser distribuda em cada placa (2,0x105 clulas/placa). A contagem foi feita em cmara de Neubauer, a partir das clulas ressuspensas e homogeneizadas em 5 mL de DMEM com 10% de SFB, colocou-se 10 l do volume total de clulas na cmara. A cmara de Neubauer composta de quatro quadrantes laterais maiores, que so subdivididos em dezesseis quadrantes cada. A contagem foi feita com o auxlio do microscpio ptico invertido. Foram contados os quatro quadrantes e foi calculada a mdia de clulas por quadrante. Este resultado foi multiplicado por 1,0x10 4 e o resultado final correspondeu ao nmero de clulas por mililitro de suspenso de clulas. As clulas foram incubadas a 37C, contendo 5% de CO2 at tornarem-se 70% confluentes.
4.2.
Tratamento da cultura de clula com radiao a laser
O equipamento utilizado para a irradiao foi o Quasar Esthtique (DMC equipamentos Ltda., Brasil), utilizado comumente no tratamento de acne, manchas na pele, olheiras e marcas de expresso. Este equipamento utilizado para irradiar nas diferentes clulas em cultura apresenta as seguintes especificaes: Tenso de Operao 90V ~ 240V; Emissor Visvel comprimento de Onda 460 480 nm; Diodo Laser Vermelho 660 685 nm; Potncia til 70 mW.
O equipamento possui um feixe de LED no comprimento de onda de 470 nm, com 180 mW de potncia, rea do feixe de 78,5 cm 2, sendo a aplicao da luz de 470 nm em cultura de clulas, foi realizada a 10 cm de distncia da cultura celular, por 3 minutos, numa densidade de energia de 0,417 J/cm2. O feixe de diodo no comprimento de onda de 660 nm, foi aplicado nas culturas celulares com 112 mW de potncia, rea do feixe de 78,5 cm 2, aplicao a 10 cm de distncia da cultura celular, por 1 minuto numa densidade de energia de 0,0856 J/cm2. Para o tratamento associado, utilizando ambos os comprimentos de onda (470 nm por 3 minutos e 660 nm por 1 minuto), os parmetros utilizados foram os mesmos descritos anteriormente, numa densidade de energia de 0,4983 J/cm 2 . As clulas foram submetidas a 2 aplicaes dirias, seguindo as condies de irradiao para cada comprimento de onda descritas na Tabela 3, considerando um intervalo de 5 horas entre cada aplicao, totalizando 6 aplicaes no perodo de 3 dias. Aps a irradiao as clulas foram submetidas aos testes e incubadas por 18 horas a 37C, em estufa umidificada contendo 5% de CO2. A Tabela 3 esquematiza os parmetros de irradiao utilizados para o tratamento das diferentes linhagens celulares (HaCaT e A431) em cultura. Doses de 0,05-10 J/cm2 ocasionam estmulo, no entanto densidades acima 10 J/cm2 disto exercem efeito oposto, e a potncia abaixo de 400 W/cm 2. (HARRIS, 1988), ajudam a identificar os efeitos no-trmico da laserterapia.
Tabela 3. Parmetros de Irradiao

PARMETROS DE IRRADIAO
Comprimento de onda Potncia Densidade de energia total rea do feixe Distncia da cultura Tempo Total
470 nm 180 mW 2,4762 J/cm 78,5 cm 10 cm 18 minutos

2 2
660 nm 112 mW 0,5136 J/cm 78,5 cm 10 cm 6 minutos

2 2
470 + 660 nm 180 + 112 mW 2.9898 J/cm 78,5 cm 10 cm 18 min + 6 min

2 2
4.3.
Quantificao de glicosaminoglicanos sulfatados sintetizados por clulas.
4.3.1. Marcao metablica
As culturas de clulas de queratincitos (HaCaT) e Carcinoma epidermide (A431) foram submetidas ao crescimento at atingirem aproximadamente 70% de confluncia e foram subcultivadas em placa de 6 poos (35 mm), em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino. As clulas foram incubadas por 18 horas a 37C em estufa umidificada contendo 5% CO2. As clulas foram submetidas irradiao com laser a 470 nm, 660 nm e 470 nm + 660 nm, conforme descrito na metodologia (item 4.2). Aps o terceiro dia de tratamento das culturas celulares nas diferentes condies, foram adicionados 200 Ci/mL de [35S]-sulfato ao meio de cultura em meio F12 na ausncia de soro fetal bovino (SFB). Este ensaio permitiu a marcao das molculas de GAG sintetizadas e secretadas pelas clulas. A incubao foi realizada durante 18 horas, 37C, em estufa sob atmosfera de 5% de CO2. 4.3.2. Extrao de GAG marcados metabolicamente
Aps o perodo de incubao das clulas irradiadas, contendo sulfato radioativo, o meio de cultura foi removido e uma alquota de 500 l foi submetida protelise e outra alquota de 500 l foi armazenada para posterior anlise de cido hialurnico. s clulas aderidas foram adicionados 500 l do tampo Tris HCl 25 mM, contendo uria 7 M, pH 7,5, e com auxlio de um scrapper, esfrego u-se o fundo da placa para remoo das clulas e matriz extracelular. A frao celular (clulas + matriz extracelular), foi homogeneizada e dividida em dois tubos contendo 250 l cada. A protelise da frao celular e meio de cultura foi realizada com adio de 125 l de Maxatase (1 mg/mL) em presena de Tris-HCl 0,05 M e NaCl 0,15 M pH 8,0 (alquota do meio de cultura e frao celular) e incubando-se o material a 60C por 24 horas em banho-maria, seguindo eletroforese em gel de agarose em tampo PDA.
4.3.3. Eletroforese em gel de agarose com tampo PDA
Finalizada a protelise, uma alquota de 5 L do meio de cultura e da frao celular, foi submetida eletroforese em gel de agarose 0,55% em tampo 1,3diaminopropano acetato (PDA) 0,05 M, pH 9,0. Em seguida, o gel foi submetido eletroforese (100 V), durante 1 hora em cmara refrigerada a 4C. Aps a corrida eletrofortica, os GAG foram precipitados por imerso do gel em soluo de cetiltrimetilamnio (Cetavlon) 0,1% por 2 horas. Em seguida, o gel foi totalmente desidratado sob calor e ventilao. Aps a secagem, o gel foi corado com azul de toluidina 0,1% em cido actico 1% e etanol 50%, por 15 minutos. O excesso de corante foi removido com uma soluo descorante contendo cido actico 1% e etanol 50%.
4.3.4. Anlise e quantificao dos GAG marcados metabolicamente
A lmina de eletroforese marcada radioativamente foi posicionada para impresso em filme radiossensvel (Multipurpose, Packard Instruments Co). A revelao do filme radiosensvel foi realizada em cmara escura, no equipamento Cyclone (Storage Phosphor System, Packard Instr.). As bandas correspondentes migrao dos GAG tiveram como referncia a migrao de GAG padro. Os dados foram analisados utilizando-se o software OptiQuanti. As bandas referentes aos GAG foram recortadas do gel desidratado, com o auxlio de uma pina e quantificadas em 5 mL de soluo de lquido de cintilao, Ultima Gold. Esta soluo intensifica a radiao emitida pelo sulfato radioativo e permite a quantificao dos GAG expressa em cpm (contagem por minuto). A quantificao de cada GAG foi corrigida por protena total, dosada em cada experimento antes da protelise pelo mtodo convencional de Coomassie Blue. Assim, foi obtido a quantificao dos GAG sintetizados pelas linhagens estabelecida de queratincitos e de carcinoma epidermide mantidas em cultura, em valores expressos em cpm/g de protenas totais.
4.3.5. Dosagem de protenas por mtodo de Coomassie Blue
Este mtodo utiliza um reagente que apresenta afinidade por protena e possui diferente intensidade de colorao dependendo da quantidade de protenas presentes. O reagente contm 117 M de Coomassie Blue G250, 4,8% de etanol e 8,5% de cido fosfrico preparado em nosso laboratrio. A dosagem foi realizada diluindo-se 5 e 10 l de cada amostra da frao celular sem protelise das clulas irradiadas, em 100 l do tampo Tris-HCl 25 mM com uria 3,5M, pH 7,5 e adicionou-se 2,9 mL do reagente Coomassie Blue. Cada mistura foi homogeneizada e a leitura foi efetuada em espectrofotmetro com comprimento de onda ajustado a 595 nm. A leitura da absorbncia proporcional a quantidade de protenas presente na frao celular. A quantificao relativa leitura das amostras foi determinada por equao da reta de uma curva padro de albumina. A dosagem de protenas da frao celular de cada placa foi realizada com o intuito de corrigir a quantidade de protenas produzidas pela clula, assim o resultado apresentado demonstra apenas a influncia da irradiao na sntese e secreo dos GAG.
4.4.
Degradao enzimtica
O ensaio de degradao enzimtica foi realizado para certificar-se que as bandas marcadas no pulso de sulfato correspondiam aos GAG condroitim sulfato e dermatam sulfato. A condroitinase AC uma enzima que atua degradando condroitim 4,6sulfatado, produzindo dissacardeos insaturados 4- e 6- sulfatados (U-GalNAc,4S e U-GalNAc,6S) e dissacardeo insaturado no sulfatado (Di-0S), uma vez que esta enzima quebra, especificamente, ligaes glicosdicas do tipo (1 -4), entre resduos de N-acetil-hexosamina que podem ou no apresentar sulfatao em C-4 ou C-6 e resduos de cido glucurnico (GlcUA). A condroitinase B uma enzima que degrada ligaes glicosdicas do tipo (1-4), envolvendo N-acetil-hexosamina e cido-L-idurnico degradando dermatam sulfato, gerando dissacardeos insaturados 4- e 6- sulfatados (U-GalNAc,4S e U-GalNAc,6S) (MICHELACCI; HORTON e POBLACIN, 1987). A condroitinase ABC uma liase que atua por meio de uma
reao de -eliminao, sobre sulfato de condroitim-4-sulfato (C4S), condroitim-6sulfato (C6S) e dermatam sulfato (DS) (ROBAT et al., 2012). O teste foi realizado com as amostras de protelise do pulso de sulfato. Em diferentes tubos colocou-se 20 l da enzima condroitinase AC e condroitinase ABC e acrescentou-se 5 l de cada amostra. Incubou-se as amostras em banho Maria a 37C por 24 horas. Aps esse perodo foi feita eletroforese em gel de agarose e impresso do gel em filme conforme j descrito.
4.5.
Ensaio de viabilidade celular
O ensaio de viabilidade celular foi realizado utilizando-se o kit Vybrant MTT Cell Proliferation Assay, de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O ensaio de reduo do MTT (brometo de 3-(4,5)-dimetiltialzolil-2,5-difeniltetrazlio) um ensaio colorimtrico para medir a atividade da redutase mitocondrial em clulas vivas. Esta metodologia baseia-se na reduo do sal de tetrazlio em cristais de formazan por clulas metabolicamente ativas. As clulas foram subcultivadas em uma microplaca de 96 poos, sendo que cada amostra foi semeada em nove poos e incubada por 24 horas, a 37C, em estufa umidificada contendo 5% de CO2. Aps a incubao as clulas foram submetidas ao tratamento com irradiao a laser com luz de 470 nm, 660 nm ou a associao (470 + 660 nm), sendo utilizado como controle do ensaio clulas no tratadas com laserterapia. O sobrenadante foi removido e adicionado 100 L de MTT. A microplaca foi protegida por papel alumnio e incubada por 3 horas, em estufa a 37C, e 5% de CO2. Em seguida, a soluo foi removida e foram adicionado 50 L de DMSO em cada poo. Aps incubao de 10 minutos, a leitura foi realizada em espectrofotmetro no comprimento de onda de 540 nm. O ensaio de viabilidade celular foi determinado pela mdia da absorbncia, seguida de desvio padro.
4.6.
Dosagem de cido hialurnico
Utilizamos um mtodo fluorimtrico para a determinao do AH, que se utiliza de sondas de ligao do AH. A sonda corresponde protena de ligao, isolada de cartilagem nasal bovina. A protena de ligao compreende poro globular da protena que promove a ligao do agrecam (proteoglicano de queratam sulfato e
condroitim sulfato) ao AH. A protena de ligao imobilizada em microplacas de 96 poos MaxiSorp/FluoroNunc. Em cada poo da placa contendo a sonda adsorvida foram adicionados 100 l de soluo de diferentes concentraes de AH padro (0 a 500 g/L), diludas no tampo de ensaio Tris-HCl 0,05 M, pH 7,75 e BSA 1% (albumina bovina srica), ou alquotas de meio de cultura celular e frao celular, diludas 1:100 no mesmo tampo. Cada ensaio foi realizado em triplicata. A incubao foi realizada a 4C, por 12 horas, seguindo trs lavagem consecutivas com tampo Tris-HCl 0,05 M, pH 7,75. Em seguida, cada poo foram adicionados 100 l da protena de ligao (1mg/ml) conjugada com biotina. Aps a adio da protena de ligao conjugada com biotina foi realizada agitao por 2 horas, seguindo lavagens exaustivas com tampo de lavagem. Aps lavagem, foram adicionados 100 l de estreptavidina marcada com eurpio (diluio 1:10000) em tampo de ensaio durante 30 minutos. Como a estreptavidina tem afinidade pela biotina conjugada protena de ligao forma-se um complexo (sanduche). Aps vrias lavagens foi adicionado uma soluo de enhancement (280 l em cada poo) e, aps agitao por cinco minutos, o eurpio foi deslocado do complexo com estreptoavidina. A fluorescncia emitida pelo eurpio livre foi quantificada em um fluormetro. A Figura 6 representa o esquema das etapas descritas. A quantificao de cido hialurnico de cada
amostra foi determinada em valores expressos por ng de AH / ug de protena total.
Figura 6. Representao esquemtica do ensaio fluorimtrico para quantificao de cido hialurnico. A - Placas 96 poos MaxiSorp/FluoroNunc foram revestidas com a protena de ligao (protena ligante de proteoglicanos ao cido hialurnico); B - As amostras da frao celular e meio de cultura de clulas HaCaT e A431 ligada a protena de ligao; C Adio de biotina conjugada com a protena de ligao; D Revelao com estreptavidina marcada com eurpio E - Aps a liberao do eurpio com soluo "enhancement" a fluorescncia final foi quantificada em fluormetro. Este mtodo foi padronizado por Martins e colaboradores (MARTINS et al., 2003).
4.7.
Extrao de RNA total
As clulas foram cultivadas e plaqueadas em placas de 60 mm e tratadas conforme metodologia j descrita. Aps incubao de 18 horas, as clulas foram removidas com tripsina. O sobrenadante foi aspirado utilizando a bomba a vcuo e ao precipitado foi adicionado 1 mL de TRIZOL e homogeneizado por 5 minutos em temperatura ambiente. A amostra foi transferida para um eppendorf de 1,5 mL e foi adicionado 0,2 mL de clorofrmio, misturando gentilmente por 3 minutos em temperatura ambiente. O clorofrmio promove a extrao do RNA na fase aquosa. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 10.000 x g, 4C, durante 15 minutos. A soluo contendo RNA foi transferida para outro tubo e acrescentou-se 0,5 mL de isopropanol para a precipitao do RNA. As amostras foram incubadas por mais 10
minutos, temperatura ambiente e, em seguida, centrifugadas a 4C, a 10.000 x g, por 10 minutos. O precipitado obtido foi lavado com 1 mL de etanol 75%, homogeneizado e centrifugado a 7.500 x g, 4C, por 5 minutos. O etanol foi desprezado e as amostras submetidas a banho seco (55C por 3 minutos). As amostras de RNA foram solubilizadas em 25 L de gua milliQ tratada com DPEC (livre de RNAse). Finalmente, o RNA total foi quantificado por espectrofotometria.
4.7.1. Quantificao do RNA Total
A dosagem foi realizada por espectrofotometria, em aparelho NanoDrop, previamente calibrado. Os valores obtidos foram expressos em ng / l.
4.7.2. Obteno cDNA a partir do RNA Total A obteno do cDNA foi realizada utilizando-se o kit de RT Improm II. Na primeira etapa da reao foi adicionado de 1 g de RNA total e 10 M de Oligo dT ou oligonucleotdeo iniciador (incubao 70C, por 5 minutos e 4C por 5 minutos). Em seguida, foi adicionado ao tubo 10 M de dNTPs (desoxirribonucleotdeos trifosfatados), 2,4 l de MgCl2 (25 mM), 4 l do tampo de reao 5X e 1 l da enzima transcriptase reversa. A reao de transcrio reversa ocorreu a 42C, por 60 minutos. As reaes foram armazenadas -20C para posterior amplificao do cDNA com oligonucleotdeos iniciadores especficos.
4.8.
Anlise da expresso por PCR em tempo real (qPCR)
A expresso do RNAm da heparanase (HPSE), cido hialurnico sintases (HAS1, HAS2 e HAS3) e hialuronidases (HYAL1 e HYAL2) foram realizadas em amostras coletadas das culturas de clulas HaCaT e A431, aps o tratamento com irradiao a laser, comparando-se com o controle (clulas no submetidas ao tratamento). A partir do cDNA obtido pela reao de transcrio reversa, anteriormente descrito, aproximadamente 1g/L das amostras de cDNA foram incubadas com oligonucleotdeos iniciadores sense e antisense (1,5 M), 6 l da enzima DNA polimerase SYBR Green e 0,025 l de Rox (normalizador de fluorescncia para reao de qRT-PCR). As amostras foram homogeneizados em tubos cnicos de 0,2
mL especficos para qPCR. As amostras foram submetidas reao de qPCR numa ciclagem de 95C por 10 minutos iniciais e 40 ciclos (95C, 15 minutos; 60C, 60 segundos). Todos os oligonucleotdeos iniciadores utilizados apresentavam temperatura de desnaturao (Tm), entre 60C a 95C. Os genes endgenos utilizados como controle foram da enzima gliceraldedo-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) e da subunidade 60S da protena ribossomal L13A (RPL13A). Os oligonucleotdeos iniciadores utilizados no presente estudo esto mostrados na Tabela 4. Os resultados obtidos da reao de qRT-PCR representam valores relativos obtidos por mdia geomtrica considerando a expresso de ambos os genes endgenos constitutivos, GAPDH e RPL13A, (-Ct). Os valores foram expressos em 2-Ct.
Tabela 4. Sequncias de Oligonucleotdeos iniciadores

mRNA HPSE1 HAS1 HAS2 HAS3 HAYL1 HAYL2 RPL13a GAPDH Foward 5' TGG CAA GAA GGT CTG GTT AGG AGA 3' 5' CAA GGC GCT CGG AGA TTC 3 5 CAG ACA GGC TGA GGA GGA CTT TAT 3 5 GGC GAT TCG GTG GAC TAC AT 3 5 TAA CCC TGC CAG TTT CTC CAT CCA 3 5 AGG ACA AAG ATG TGT ATC GCC GGT 3 5 TTG AGG ACC TCT GTG TAT TTG TCA A 3 5 TCG ACA GTC AGC CGC ATC TTC TTT 3 Reverse 5' GCA AAG GTG TCG GAT AGC AAG GG 3' 5 CCA ACC TTG TGT CCG AGT CA 3 5 GGA TAC ATA GAA ACC TCT CAC AAT GC 3 5 CGA TGG TGC AGG CTG GAR 3 5 ACA GCC ATC TGT GCC TGA TCT TCA 3 5 GAA CTG CTG TGC TGC GAA CTC AAA 3 5 CCT GGA GGA GAA GAG GAA AGA GA 3 5 GCC CAA TAC GAC CAA ATC CGT TGA 3
4.9.
Anlise Estatstica
A analise estatstica foi realizada utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0 (La Jolla, CA, USA). Para verificar a ocorrncia de diferenas significativas entre os grupos estudados foi utilizado o teste no paramtrico Kruskal-Wallis. Em todas as foram considerados valores estastiticamente significantes p < 0,05).
RESULTADOS E DISCUSSO 33
5. RESULTADOS E DISCUSSO
5.1. Viabilidade Celular em clulas HaCaT e A431
O uso da laserterapia est frequentemente associado ao aumento da proliferao celular e resposta inflamatria (GAO; XING, 2009). No presente estudo decidimos investigar o efeito da irradiao em diferentes comprimentos de onda sobre a proliferao de clulas epiteliais normais (HaCaT) e clulas tumorais (A431). A escolha da dose e quantidade de aplicaes foi determinada conforme o protocolo utilizado em ambulatrio mdico. Observamos na Figura 7 diminuio da viabilidade celular, aps laserterapia utilizando os comprimentos de onda 470 nm, 660 nm, bem como a associao de ambos os tipos de luz. Em clulas HaCaT e A431 foi observado diminuio da viabilidade celular de aproximadamente 32, 67 e 55 % (clulas HaCaT) e 35, 47 e 28 % (Clulas A431), respectivamente, apresentando relevncia estatstica nos dois tipos celulares (* < 0,05). A viabilidade celular foi analisada utilizando o teste MTT descrito na metodologia. O resultado encontra-se expresso em porcentagem de clulas viveis. Resultados semelhantes ao encontrado em nosso estudo, demonstraram diminuio da viabilidade de clulas HaCaT e A431, quando utilizada a luz UVB 280315 nm (JUAN et al., 2012). O tratamento das clulas HaCaT e A431 com luz UVB evidenciou alterao do ciclo celular, aumentando o nmero de clulas em G1-S e diminuio da viabilidade celular dose dependente (JUAN et al., 2012). Ainda, tais efeitos sobre o ciclo celular e viabilidade celular parecem ser mediados pelo fator de transcrio nuclear kappa-B (NF-B), quinase dependente de ciclina 6 (CDK6) e protenas da famlia BCL-2 (JUAN et al., 2012). A utilizao de luz UVC (200-290nm), em clulas A431, tambm demonstrou inibio da proliferao celular (TAI et al., 2012). Outros estudos utilizando cultura primria de clulas epiteliais humanas, demonstraram aumento da proliferao celular, aps irradao com laser de 660 nm e 780 nm (EDUARDO et al., 2007). Este dado contrrio ao obtido no presente estudo pode ser explicado pelo fato de que a densidade de energia utilizada em tais estudos foi menor quela utilizada em nossos experimentos (3 e 5 J/cm2).
Viabilidade Celular
120
% de clulas viveis
100 80
* * * * *
60 40 20 0
nm
nm
nm
nm
66 0
nm
47 0
66 0
47 0
47 0+
HaCaT
A431
Figura 7. Viabilidade Celular aps laserterapia. As clulas HaCaT e A431 foram submetidas a seis irradiaes com diferentes comprimentos de onda, como indicado em mtodos. Os valores obtidos expressam a mdia e desvio padro de ensaios realizados em quintuplicata para clulas HaCaT e nonoplicatas para clulas A431. * representa p < 0,05 utilizando-se o teste no paramtrico KruskalWallis.
Estudos realizados com outros tipos celulares como clulas endoteliais HUVEC (CHEN; HUNG; HSU, 2008), cultura primria de fibroblastos humano (ESMAEELINEJAD; BAYAT, 2013; SEKHEJANE; HOURELD; ABRAHAMSE, 2011) e pr-osteoblastos (PAGIN et al., 2012), evidenciaram grande diversidade nos protocolos experimentais que utilizam laserterapia, variando a intensidade de energia, frequncia de aplicaes, distncia, rea, potncia e tempo, gerando diferentes efeitos biolgicos, que dificilmente podem ser comparados. Vale salientar que a utilizao do laser de 400-500 nm apresenta atividade bactericida, evidenciando diminuio da viabilidade em bactrias E. coli. Efeito oposto pde ser observado em estudos com laser de 400-500 nm em bactrias S. aureus (LIPOVSKY et al., 2010), mostrando tambm aumento na gerao de espcies reativas de oxignio (ROS), que explica o efeito bactericida. Entretanto, em estudos com S. aureus e utilizao de laser de 500-800 nm foi observado menor
47 0+
66 0
66 0
nm
TR
TR
produo de ROS, sugerindo que o efeito bactericida mais eficiente em comprimentos de onda menor (LIPOVSKY et al., 2010).
5.2. Efeito da laserterapia na sntese de glicosaminoglicanos sulfatados em clulas HaCaT e A431
Os glicosaminoglicanos sulfatados exercem um importante papel na sinalizao celular e no remodelamento de matriz extracelular. De acordo com o tipo celular existe grande variabilidade estrutural dos glicosaminoglicanos sulfatados. Tal diversidade estrutural das cadeias de glicosaminoglicanos est diretamente relacionada com a funo que desempenham (DIETRICH et al., 1998;
PORCIONATTO; NADER; DIETRICH, 1999). Alteraes dos glicosaminoglicanos sulfatados esto relacionadas com o desenvolvimento de vrias doenas como cncer, doenas inflamatrias, doenas degenerativas e em processos de cicatrizao (KOZLOWSKI; PAVO; BORSIG, 2011; PECCHI et al., 2012; TAYLOR; RUDISILL; GALLO, 2005; TEIXEIRA et al., 2012). Ainda, o estudo de componentes da matriz extracelular, como proteoglicanos, protenas fibrosas, glicoprotenas, metaloproteases e glicosidases, podem elucidar alteraes moleculares diretamente relacionadas com o desenvolvimento de tais doenas (MOSCATELLO et al., 1998; PECCHI et al., 2012; THEODORO et al., 2007). Atualmente, so conhecidos os benefcios da laserterapia no tratamento de processos inflamatrios e cicatrizao de feridas, porm, pouco se conhece sobre os efeitos da utilizao da terapia de laser de baixa potncia na matriz extracelular. Diante de tais observaes interessante investigar se existe alterao do perfil de glicosaminoglicanos em cultura celular, aps o tratamento laserterapia. Observamos que as clulas HaCaT e A431, apresentaram CS/DS e HS por anlise eletrofortica (Figura 8). A confirmao dos galactosaminoglicanos sulfatados (CS e DS), foi determinada aps degradao enzimtica com condroitinase AC e condroitinase ABC (Figura 9). A anlise desses resultados demonstrou a presena de DS sintetizado e secretado para o meio de cultura de ambas linhagens celulares, HaCaT e A431 (Figura 9).
HaCaT A B
A431 C D
Figura 8. Perfil de GAG sulfados sintetizados por HaCaT e A431. Este emsaio representa a radioautografia da eletroforese realizada para identificao e quantificao dos GAG sulfatados. As 35 clulas HaCaT e A431 foram marcadas com [ S]-sulfato e analisadas aps 6 aplicaes de laserterapia, exceto o grupo controle (como indicado em mtodos). Painel A e B anlise da linhagem HaCaT; Painel C e D anlise da linhagem A431; os nmeros 1 e 2, representam amostras no sem tratamento (controles); os nmeros 3 e 4, indicam amostras submetidas ao tratamento 470 nm; os nmeros 5 e 6, indicam amostras submetidas ao tratamento 660 nm; os nmeros 7 e 8, representam amostras submetidas ao tratamento 470+660 nm.
importante ser observado que at o presente, no existem trabalhos na literatura que caracterizem os glicosaminoglicanos sulfatados de clulas HaCaT e A431. Portanto, os resultados aqui apresentados so importantes para o melhor entendimento das alteraes de tais componentes aps laserterapia. Aps a eletroforese em gel de agarose, os glicosaminoglicanos sulfatados foram quantificados e os valores obtidos esto representados na Figura 10. importante observar que a irradiao induz alteraes cutneas, como fibrose, que envolvem o acmulo de componentes da MEC, como proteoglicanos de heparam sulfato, que sabidamente so requeridos para os mecanismos de reparo
tecidual, visto que tais compostos interagem e modulam a funo de uma variedade de outras molculas como exemplo fatores de crescimento.
HaCaT A B
A431 C D
Figura 9. Radioautografia da eletroforese aps degradao enzimtica dos GAG sulfados 35 sintetizados por HaCaT e A431. As clulas HaCaT e A431 foram marcadas com [ S]-sulfato e submetidas a seis aplicaes de laserterapia, como descrito em mtodos. O extrato obtido da frao celular e meio condicionado foram submetidos degradao com condroitinases AC e ABC, como descrito detalhadamente em mtodos. Painel A e B, Clulas; Painel C e D, Culas A431; os nmeros 1,4,7 e 10, indicam amostras queno foram submetidas degradao enzimtica (controle); os nmeros 2, 5, 8 e 11 representam as amostras digeridas com condroitinase AC e os nmeros 3,6,9 e 12 representam as amostras digeridas com condroitinase ABC.
A avaliao do perfil de glicosaminoglicanos sulfatados em clulas HaCaT aps o tratamento com a associao de 470 nm e 660 nm, sugere um aumento do heparam sulfato de aproximadamente trs vezes, como mostra a Figura 10. Entretanto, anlises estatsticas no confirmam que tal diferena seja significativa. Nas clulas tumorais A431, no foi observado alterao expressiva do heparam sulfato aps aplicao com os diferentes comprimentos de onda (Figura 10). Considerando a linhagem tumoral A431, observamos claramente que houve diminuio significativa do HS na frao celular em relao ao controle e o DS no apresentou alteraes. No meio de cultura no houve alteraes significativas na secreo de HS e DS aps o tratamento (Figura 10).
Considerando a quantificao do DS na linhagem HaCaT, aps aplicao dos diferentes comprimentos de onda, observamos que a associao (470 nm e 660 nm), desencadeou um aumento de aproximadamente duas e trs vezes, repectivamente para a frao celualr e meio de cultura. Novamente, anlises estatsticas no comprovam significncia para este aumento (Figura 10).
HaCaT
HS Frao Celular
100000 80000
cpm/ g protena
cpm/ g protena
HaCaT
HS Meio
25000 20000 15000 10000 5000 2500 2000 1500 1000 500 0
DS Frao Celular
DS Meio
60000 40000 20000 8000 6000 4000 2000 0
C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm
C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm
C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm
A431
HS Frao Celular
200000
cpm/ g protena
A431
HS Meio
40000
cpm/ g protena
DS Frao Celular
150000 100000 50000 0

C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm
30000 20000 10000 0
Figura 10. Quantificao dos glicosaminoglicanos sintetizados por clulas HaCaT e A431. HS, heparam sulfato; DS, Dermatam sulfato; Frao celular, quantificao de glicosaminoglicanos sintetizados por clulas e matriz extracelular. Meio, glicosaminoglicanos secretados para o meio de cultura; CTR, controle (clulas sem tratamento com laser); 470 nm, aps seis aplicaes do laser com 470 nm; 660 nm, aps seis aplicaes com laser de 660 nm; 470 + 660 nm, aps seis aplicaes com associao do laser de 470 + 660 nm. Os ensaios foram realizados em triplicatas e os valores expressam a mdia e desvio pado.
A avaliao da biossntese do heparam sulfato em clulas HaCaT foi investigada em estudos de transfeco que promovem a superexpreso de enzimas
C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm
C T 47 R 0 n 6 m 47 60 0+ nm 66 0 nm
C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm
DS Meio
anti-oxidantes. Em tais estudos, foi observado que houve um aumento significativo no nvel de expresso de cinco enzimas envolvidas na biossntese do heparam sulfato, xilosiltransferase II, glicosiltransferase-2 (EXTL2), D-glucuronosil-C5-
epimerase, iduronosil-2-O-sulfotransferase e 6-O-sulfo transferase (NAKAYAMA et al., 2008). Deve ser lembrado que heparina e heparam sulfato compartilham a mesma via de biossntese e tambm apresentam semelhana estrutural. Portanto, a diminuio do heparam sulfato presente na frao celular em clulas A431, aps o tratamento com laserterapia, pode explicar a diminuio acentuada na viabilidade de clulas A431 (Figura 7). Um dado que corrobora com esta hiptese foi descrito na literatura demonstrando um efeito anti-proliferativo em clulas A431 mediado por heparina (VANNUCCHI et al., 1991). O perlecam um proteoglicano de HS de membrana basal conhecido por impedir a difuso descontrolada de diversos fatores da epiderme para a derme e sua degradao pode afetar a juno dermo-epidrmica, promovendo o aumento da ligao de fatores de crescimento, como fator de crescimento de hepatcitos (HGF), fator de crescimento de queratincitos (KGF) e fator de crescimento de fibroblastos (FGF-2), transferindo e estimulando a melanognese (processo bioqumico de formao do pigmento de melanina) (IRIYAMA et al., 2011). Foi observado em estudo de bipsias de pele humana que ocorrem alteraes na sntese de HS e perlecam at 72 horas aps a exposio com luz UV, evidenciando diminuio da expresso de perlecam (JUNG et al., 2012). A anlise de carcinoma espinocelular oral bem diferenciado, demonstrou baixa intensidade de marcao de heparam sulfato (MORI et al., 1998). importante observar que alm das alteraes na quantidade de heparam sulfato, alteraes da estrutura de tal composto tambm pode estar relacionada com o desenvolvimento de tumores. Foi demonstrado em carcinoma epidermide de pulmo que as cadeias de heparam sulfato apresentam diferenas estruturais no padro de dissacardeos, comparativamente com tecido no tumoral (NACKAERTS et al., 1997). Mais uma vez fica evidente a importncia do heparam sulfato na organizao da estrutura da pele e no potencial metasttico aps sua clivagem. O presente estudo claramente mostra aumento do HS com o tratamento de laserterapia, quando se associa comprimentos de onda (470 e 660 nm). O aumento da sntese de heparam sulfato, aps laserterapia pode favorecer a adeso estrutural
dermo-epidrmica e ainda, podemos sugerir que o aumento do heparam sulfato, aps laserterapia poderia estar relacionado com menor probabilidade de desenvolvimento de carcinoma epitelial. Estudos sobre a importncia do DS associado ao FGF-10 (Fator de crescimento fibroblstico-10), demonstram que a presena de 10 ou 20 dissacardeos, contendo cido idurnico, estimulam o receptor de FGF-10, promovendo aumento da migrao e proliferao de queratincitos e aceleram o processo de reparo de feridas (RADEK; TAYLOR; GALLO, 2009). No entanto, outros estudos demonstraram em carcinoma de clulas escamosas de esfago que a alta expresso de CS/DS e das enzimas epimerase-1 (DS-epi1), 6-O- e 4-O-sulfotransferases estavam significativamente aumentadas nestes tumores. Com a finalidade de investigar melhor o papel do cido idurnico em clulas tumorais, este grupo estudou clulas deficientes em dissacardeos de DS que continham cido idurnico em sua estrutura, e foi observado que houve uma diminuio da capacidade de migrao e invaso tumoral in vitro, associada reduo da ligao com fatores de crescimento de hepatcitos (HGF) (THELIN et al., 2012). Os dados obtidos em nosso estudo demonstram estmulo da sntese de DS em queratincitos normais (HaCaT), somente aps o tratamento associado (470 nm + 660 nm), o que pode sugerir que a laserterapia pode efetivamente desempenhar um papel importante na diferenciao de tais clulas, devido ao estmulo da quantidade de dermatam sulfato.
5.3.
Expresso gnica por PCR em Tempo Real da HPSE-1
Aps o tratamento laser, foi observado diminuio significativa da expresso de HPSE-1 em clulas HaCaT, comparativamente com o controle de clulas HaCaT no tratadas. Porm, tal diminuio no foi estatisticamente significante quando foi avaliada a expresso de HPSE-1 em clulas tumorais A431, comparativamente com o controle de clulas A431 no tratadas (Figura 11). Podemos observar na que a expresso relativa de HPSE-1 maior nas clulas A431, comparativamente s clulas HaCaT, visto que os ensaios foram realizados nas mesmas condies (mesma quantidade de RNA total e cDNA nas reaes de amplificao, como descrito em mtodos). Estes resultados corroboram
com dados da literatura, que evidenciam aumento da HPSE-1 em clulas tumorais, comparativamente com clulas no neoplsicas (BRUN et al., 2009; VLODAVSKY et al., 2012).
qPCR - HaCaT e A431

1.2
Expresso Relativa
HaCaT A431
1.0 0.8 0.3 0.2 0.1 0.0
* * *
TR
nm
nm
47 0
66 0
HPSE-1
Figura 91. Expresso relativa de Heparanase-1 (HPSE-1). CTR, Controle, clulas HaCaT e A431 sem tratamento; Barras brancas indicam a expresso do RNA mensageiro da HPSE-1 em clulas HaCaT e Barras pretas indicam a expresso de RNA mensageiro em clulas A431, tratadas com seis aplicaes do laser de baixa potncia como descrito em mtodos. Os valores expressos so referentes a mdia e desvio padro, obtidos em ensaios realizados em triplicatas. * p < 0,05.
evidente a menor quantidade de heparam sulfato, da frao celular em clulas A431, comparativamente com clulas HaCaT (Figuras 8 e 9).
Consequentemente, este dado poderia ser explicado por maior expresso de HPSE-1 na linhagem tumoral A431 (Figura 10), aps laserterapia. Sabe-se que a HPSE-1 est frequentemente aumentada em tumores, e confere um carter invasivo e metasttico a essas clulas. Sabendo-se que a irradiao com luz UVB prejudicial pele e sua ao pode desencadear o aparecimento de cncer de pele, demonstrou-se aumento da expresso e atividade da HPSE-1 em cultura de queratincitos (KURDYKOWSKI et al., 2012). Outro estudo que utilizou aplicao tpica de heparanase recombinante, demonstrou que a HPSE-1 acelerou significativamente a cicatrizao de feridas, devido epitelizao e maturao dos vasos sanguneos, aumentando a angiognese da ferida,
47 0+ 66 0
nm
possivelmente por gerar oligossacardeos de heparam sulfato que apresentam alta afinidade por fatores angiognicos e intensificam sua ao. Consequentemente, a maior intensidade de angiognese no processo de reparao do tecido sugere um efeito direto mediado por ao da HPSE-1 (ZCHARIA et al., 2005). Ainda, a ativao da HPSE-1 na pele induz hiperplasia da epiderme, aumento dos vasos linfticos e formao de rugas, sendo que tais mecanismos so mediados pela degradao das cadeias de heparam sulfato presentes na pele (IRIYAMA; MATSUNAGA; AMANO, 2010).
5.4.
Dosagem de cido Hialurnico
A anlise da dosagem de cido hialurnico (AH) em clulas HaCaT demonstrou aumento na frao celular e na secreo deste composto, aps os diferentes tratamentos com laserterapia (Figura 12A). importante ser observado que a administrao concomitante dos comprimentos de onda 470 e 660 nm promoveu um aumento de aproximadamente 3 vezes na secreo de cido hialurnico em clulas HaCaT, comparativamente ao controle (sem tratamento). As clulas A431 no apresentaram alteraes na concentrao de AH presente na frao celular e secretado para o meio de cultura, independente do comprimento de onda utilizado (Figura 12B). Um resultado bastante interessante de ser observado foi o fato de que clulas no neoplsicas (HaCaT), sintetizam e secretam quantidades maiores de AH, comparativamente com clulas tumorais A431 (Figura 12). Foi descrito na literatura que a reduo do AH em amostras de bipsias de pacientes com carcinoma oral espinocelular est diretamente relacionada a um prognstico desfavorvel. A diminuio da imunomarcao de AH mostrou uma correlao direta com menor sobrevida dos pacientes (KOSUNEN et al., 2004). Portanto, a diminuio da quantidade de AH em clulas A431,
comparativamente com clulas no neoplsicas HaCaT, corrobora com a hiptese de que clulas menos diferenciadas apresentam menor quantidade de AH.
Dosagem de cido Hialurnico em clulas HaCaT Frao Celular Meio de Cultura A B

AH ng/ug protena total
AH ng/ g protena total
Dosagem de cido Hialurnico em clulas A431 Frao Celular Meio de Cultura

400 350 300 250 200 100 80 60 40 20 0
C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0
C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm
Figura 10. Quantificao de cido Hialurnico. A, clulas HaCaT; B, clulas A431. O cido hialurnico foi quantificado na Frao celular (clulas e matriz extarcelular), bem como no meio de cultura. A dosagem de cido hialurnico est expressa em ng/g de protena total. Os valores representam a mdia e desvio padro de ensaios realizado triplicata para clulas HaCaT e nonoplicata para clulas A431.
O aumento na quantidade de AH, aps laserterapia, observado somente nas clulas no neoplsicas (HaCaT), pode sugerir que o tratamento favorea mecanismos de diferenciao celular e manuteno da homeostase celular, associado ao aumento do cido hialurnico nas clulas HaCaT, porm, tais mecanismos celulares no so afetados em clulas tumorais. A concentrao de AH foi avaliada em ratos, aps sofrerem injria no fmur. Os resultados mostraram que aps laserterapia, utilizando laser diodo de 660 nm (100 mW, 240 J/cm-2), ocorre aumento de AH no tecido sseo (DE SOUZA MERLI et al., 2012). Estes resultados corroboram com a anlise do nosso experimento em clulas HaCaT, reforando a teoria de que laserterapia poderia contribuir com mecanismos de reparo e cicatrizao da pele mediada pelo aumento de AH. O cido hialurnico o componente mais abundante da pele e possui um turnover de 1-2 dias no contedo epidermal (AVERBECK; GEBHARDT; VOIGT, 2006). A constante sntese e degradao do AH mediada por ao de cido hialurnico sintases e hialuronidases.
C T 47 R 0 nm 47 66 0 0 n + 66 m 0 nm
Diante dos resultados obtidos at o momento decidimos investigar a expresso das cido hialurnico sintases e hialuronodases em clulas HaCaT e A431.
5.5.
Expresso gnica por PCR em Tempo Real das enzimas de biossntese e degradao do cido hialurnico
A anlise por PCR em tempo real demonstrou diferenas na expresso de cido hialurnico sintases e hialuronidases entre as clulas HaCaT e A431, aps laserterapia. No entanto estatisticamente s pode ser observado significncia nas clulas HaCaT na expresso do gene HAS2 durante o tratamento de 660 nm e no gene HAS3, nos tratamentos de 470 nm e associado. Nas clulas HaCaT, foi observado diminuio da expresso de RNAm de cido hialurnico sintases e hialuronidases, independente do tipo de tratamento com laserterapia (Figura 13A). O fato da quantidade de cido hialurnico ter aumentado em clulas HaCaT, aps laserterapia, mesmo com diminuio da taxa de transcrio das enzimas envolvidas com a sntese e degradao do AH, reflete que possivelmente, em clulas no neoplsicas (HaCaT), a atividade das sintases encontra-se significativamente aumentada. Esta hiptese pode justificar a
necessidade de altos nveis de cido hialurnico em queratincitos no neoplsicos para manuteno da viscosidade, resilincia e permeabilidade, funes essenciais na manuteno do epitlio. Curiosamente o tratamento com laser promoveu aumento da expresso das cido hialurnico sintases em clulas A431, como mostra a Figura 13B. Com relao s hialuronidases (HYAL), verificamos que a expresso da HYAL-2 aumentou aps os tratamentos com 470 nm e 660 nm, enquanto houve diminuio da expresso da HYAL-1.
A
1.5 1.0
Expresso Relativa
HaCaT
470 nm 660 nm 470+660 nm
0.5 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00

2 3 1 TR 1 A S A S L A S C YA H H H YA H L 2
* * *
B A431
6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
2 TR 3 1 1 AS AS L AS C YA H H
470 nm 660 nm 470+660 nm
Expresso Relativa
Figura 113. Expresso relativa de cido Hialurnico Sintases (HAS1-3) e Hialuronidases (HYAL1-2). Controle (CTR), sem tratamento; A. Clulas HaCaT tratada com seis aplicaes do laser de baixa potncia. B. Clulas A431, tratada com seis aplicaes do laser de baixa potncia, como descrito em mtodos. Os valores expressos so referentes a mdia e desvio padro, obtidos em triplicata. * p < 0,05.
Sabendo que a HYAL-2 degrada especialmente o AH de alto peso molecular (NOBLE; LIANG; JIANG, 2011), poderamos sugerir que em clulas A431 preferencialmente existe tal composto. Ainda, descrito na literatura que a HYAL-2 pode ser regulada por citocinas inflamatrias, enquanto a HYAL-1 no sofre tal regulao (FLANNERY et al., 1998). A diminuio da expresso das cido hialurnico sintases e hialuronidases foi observada em clulas HaCaT tratadas com radiao UVB (280 nm) (HAOV et al., 2011).
YA
O estudo evidenciou alteraes no perfil e expresso de molculas da matriz extracelular, sendo de grande relevncia para o estudo dos efeitos do laser de baixa freqncia em tratamentos dermatolgicos, principalmente se ao utilizarmos a laserterapia com doses inadequadas, pode-se causar alteraes irreversveis as clulas epiteliais e facilitar uma progresso tumoral, entanto vale observar, que os testes in vitro no representam em sua totalidade o tecido epitelial devido a ausncia de interao com outros molculas, como por exemplo a melanina, e hemoglobina, respectivamente constituintes de melancitos e hemcias circulantes no tecido epitelial, visto que a luz tambm exerce efeito sobre tais molculas, e poderiam modificar a resposta ao tratamento.
CONCLUSO 47
6. CONCLUSES A utilizao do laser de baixa frequncia diminuiu a viabilidade celular de ambas as linhagens celulares no neoplsicas (HaCaT) e tumoral (A431). A utilizao do laser de baixa frequncia alterou o perfil de
glicosaminoglicanos sulfatados das clulas HaCaT e A431. Nas clulas HaCaT observamos aumento do HS, quando utilizado o tratamento de associao entre os comprimentos de onda 470 nm e 660 nm. Porm, na linhagem tumoral A431, houve diminuio do HS na frao celular em todos os tratamentos, aps laserterapia. Foram verificadas diferentes respostas com relao quantidade de cido hialurnico nas diferentes linhagens estudadas. Aps irradiao com laser de baixa potncia ocorreu aumento da quantidade de cido hialurnico na linhagem HaCaT, no ocorrendo nenhuma alterao para a linhagem tumoral A431. Foi observado diminuio da expresso do RNA mensageiro da enzima HPSE-1, aps laserterapia em ambas as linhagens celulares estudadas. Porm, uma diminuio mais acentuada da expresso do RNA mensageiro da HPSE-1 foi observada na linhagem HaCaT. Tal resultado possivelmente corrobora com o aumento do HS observado para a linhagem HaCaT. Na linhagem HaCaT foi demonstrado diminuio da expresso das cido hialurnico sintases e hialuronidases. Entretanto, a linhagem A431 o efeito foi oposto, sendo observado aumento na expresso das cido hialurnico sintases e hialuronidase 2, mas no na expresso de hialuronidase 1.
REFERNCIA BIBLIOGRFICA 48
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Avaliação de Alterações Da Matriz Extracelular em Cultura de Células Após Laserterapia

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Avaliação de Alterações Da Matriz Extracelular em Cultura de Células Após Laserterapia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DE SO PAULO

MARIA CAROLINA LEAL ALMEIDA

AVALIAO DE ALTERAES DA MATRIZ EXTRACELULAR EM CULTURA DE CLULAS APS LASERTERAPIA

MARIA CAROLINA LEAL ALMEIDA

AVALIAO DE ALTERAES DA MATRIZ EXTRACELULAR EM CULTURA DE CLULAS APS LASERTERAPIA

Almeida, Maria Carolina Leal

1. Laserterapia 2. Matriz extracelular 3. Glicosaminoglicanos

Universidade Federal de So Paulo e Faculdade de Medicina do ABC.

Muitssimo obrigada a todos,

CONCLUSES ....................................................................................................................................47 REFERNCIA BIBLIOGRFICA .......................................................................................................48

Laserterapia ou Terapia com luz laser de baixa intensidade

1.1.1. Efeitos da laserterapia nos tecidos biolgicos

A pele o maior rgo do corpo humano e representa 16% do peso corpreo,

est dividida em camadas denominadas epiderme, derme e hipoderme, como

Figura 4: Processo de diferenciao de queratincitos. Adaptado de PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008.

Tabela 1. Proteoglicanos presentes no tecido epitelial*.

400 Membrana basal

Suporte mecnico, migrao celular Adeso celular, fibrilognese

Conjuntivo Membrana basal, epitlio Conjuntivo

Adeso celular Adeso celular, fibrilognese

* Adaptada de (ESKO, 1991; SARRAZIN; LAMANNA; ESKO, 2011)

1.4.1. cido Hialurnico

Tabela 2. Caractersticas estruturais dos glicosaminoglicanos

C4 ou C6 (Hx) C4 (Hx) C6 (Hx) C6 (Gal) C6 (Hx)

(1-3) (1-3) (1-4)

1.4.2. Condroitim Sulfato, Dermatam Sulfato e Queratam Sulfato

1.4.3. Heparam Sulfato

proporcionados por este tipo de terapia.

Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) baixa glicose da Nutricell,

Maxatase (protease alcalina P126) foi adquirida da Biocon do Brasil Indstria

(Promega, Madison, Wisconsin); -

Radioistopo Sulfato de sdio (Na2[35S]O4) do Instituto de Pesquisas Energticas e

Nucleares (IPEN, So Paulo, SP, Brasil);

Reagentes gerais e outros materiais

(Corning, NY, EUA); -

modelo 3030 da Forma Scientific (Marietta, OH, EUA); -

Purificador de gua Milli-Q ZD2- 115 84 da Millipore Corporation (Bedford,

Corporation, Carlsbad, CA)

4.1.1. Descongelamento de clulas

4.1.2. Manuteno das clulas

4.1.3. Subcultivo das clulas

4.1.4. Contagem das clulas em Cmara de Neubauer

Tratamento da cultura de clula com radiao a laser

Tabela 3. Parmetros de Irradiao

470 nm 180 mW 2,4762 J/cm 78,5 cm 10 cm 18 minutos

660 nm 112 mW 0,5136 J/cm 78,5 cm 10 cm 6 minutos

470 + 660 nm 180 + 112 mW 2.9898 J/cm 78,5 cm 10 cm 18 min + 6 min

Quantificao de glicosaminoglicanos sulfatados sintetizados por clulas.

4.3.1. Marcao metablica

4.3.3. Eletroforese em gel de agarose com tampo PDA

4.3.4. Anlise e quantificao dos GAG marcados metabolicamente

4.3.5. Dosagem de protenas por mtodo de Coomassie Blue

Ensaio de viabilidade celular

Dosagem de cido hialurnico

amostra foi determinada em valores expressos por ng de AH / ug de protena total.

Extrao de RNA total

4.7.1. Quantificao do RNA Total

Anlise da expresso por PCR em tempo real (qPCR)

Tabela 4. Sequncias de Oligonucleotdeos iniciadores

5.1. Viabilidade Celular em clulas HaCaT e A431

5.2. Efeito da laserterapia na sntese de glicosaminoglicanos sulfatados em clulas HaCaT e A431

60000 40000 20000 8000 6000 4000 2000 0

150000 100000 50000 0