EDUCACIN Y PRCTICA DE LA MEDICINA Citogentica enLA la medicina actual E DUCACIN Y PRCTICA DE MEDICINA

Utilidad de la citogentica en la medicina actual

Visin histrica y aplicacin

The utility of cytogenetics in modern medicine.

Historical view and application CLAUDIA TAMAR SILVA, NORA CONSTANZA CONTRERAS, DORA JANETH FONSECA BOGOT, D.C.
Resumen

La citogentica es el estudio de los cromosomas tanto en nmero como en estructura, los primeros pasos en la citogentica humana se dieron a nales del siglo XIX con la publicacin de Flemming en 1882 de las primeras ilustraciones del cromosoma humano a partir de observaciones al microscopio, y concluy con Tjio y Levan en 1953 cuando se determina el nmero real de cromosomas humanos por clula diploide. La citogentica convencional es una herramienta de gran importancia que permite realizar el diagnstico cromosmico de pacientes con indicacin clnica de cromosomopata, lo cual les va a permitir asesorar a las familias respecto de dicha enfermedad, su pronstico y riesgo de recurrencia. El propsito de esta revisin es documentar a los mdicos, pediatras, gineclogos y en general al personal de la salud, de la importancia de los estudios citogenticos en aquellos casos en que se enfrenten a un paciente con una cromosomopata o sndrome dismrco. (Acta Med Colomb 2008; 33: 309-316). Palabras claves: cariotipo, citogentica, cromosomopata, sndrome dismrco, diagnstico.

Abstract

Cytogenetics is the study of chromosomes and their numerical and structural abnormalities. In the late 1800s Flemming published his rst illustrations of human chromosomes based on his observations on a microscope. In 1953 Tijo and Levan determined the number of chromosomes in a human somatic cell. From then on, conventional cytogenetics became an important tool for physicians in the diagnosis of patients with chromosomal anomalies through the use of the karyotype. The karyotype thus becomes a means to diagnose patients and provide them genetic counseling. The purpose of this review is to enlighten family doctors, pediatricians and gynecologists and other health practitioners of the importance of cytogenetics when challenged with patients with an abnormal karyotype or dysmorphic syndrome. (Acta Med Colomb 2008; 33: 309-316). Key words: karyotype, cytogenetics, chromosomal anomaly, dysmorphic syndrome, diagnosis.

Dras.: Claudia Tamar Silva Aldana. Biol. MSc. Profesora Principal; Nora Constanza Contreras Bravo, Biol.MSc. Profesora Asistente; Dora Janeth Fonseca Mendoza, Biol. MSc. Profesora Principal. Universidad del Rosario. Facultad de Medicina. Instituto de Ciencias Bsicas. Unidad de Gentica. Correspodencia: Claudia Tamar Silva. Cra 24 N 63C-69. 3101275. Bogot E-mail: ctsilva@urosario.edu.co Recibido: 15/VII/08 Aceptado: 27/VIII/08

Con el advenimiento de la biologa molecular y de la citogentica molecular, la citogentica convencional es una herramienta que muchos mdicos han dejado de lado o por el contrario, el cariotipo se ha constituido en un examen que se ordena para reforzar diagnsticos de enfermedades que no estn relacionadas con alteraciones cromosmicas. El uso actual de la citogentica convencional sigue siendo amplio y constituye una herramienta importante en varios campos de la medicina como pediatra, endocrinologa o
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Introduccin

ginecoobstetricia; por ello, esta revisin pretende resaltar la utilidad del anlisis cromosmico e informar a los profesionales de la salud los aportes que puede ofrecer a un diagnstico clnico. La citogentica es el estudio de los cromosomas tanto en nmero como en estructura. Los primeros pasos en la citogentica humana se dieron a nales del siglo XIX con la publicacin de Flemming en 1882 de las primeras ilustra309

Hechos histricos

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ciones del cromosoma humano a partir de observaciones al microscopio (1); algunos aos ms tarde, Waldeyer introdujo el trmino cromosoma, que signica cuerpo coloreado (2). Estas primeras descripciones llevaron a la generacin de algunas preguntas como cul era el nmero total de cromosomas del cariotipo humano, y si existan variantes en dicho nmero dependiendo de la raza y el sexo, entre otros factores, ya que algunos investigadores haban sugerido tales diferencias entre descendientes africanos y caucsicos y entre hombres y mujeres (3). En 1921 Painter demostr la presencia del cromosoma Y en preparaciones obtenidas a partir de testculo, e indic que el nmero total de cromosomas era 48; a raz de estos hallazgos, surge un nuevo interrogante: si el sexo en los humanos era determinado mediante X0 o XY (4). Pero el gran desarrollo de la citogentica se dio con la determinacin del nmero de cromosomas en el cariotipo humano por Tjio y Levan en 1956 y conrmada en el mismo ao por Ford y Hamerton (5, 6). El nmero cromosmico humano 2n=46, fue conrmado en por lo menos 74 individuos hacia 1958. Los cromosomas mitticos mostraron caractersticas morfolgicas claras, tales como longitud de los brazos, lo cual permiti a los investigadores situarlos dentro de siete grupos: 1-3, 4-5, 6-12 + X, 13-15, 16-18, 19-20 y 21-22 + Y. Una nomenclatura estndar para

el cariotipo, fue propuesta en Denver por los siete grupos que haban publicado artculos sobre el cariotipo normal a principios de 1960; estos siete grupos fueron denominados con letras de la A a la G como fue propuesto por Patau en 1960 (7, 8). Esta nomenclatura fue universalmente aceptada y usada con mnimas modicaciones por cerca de 10 aos. Los citogenetistas organizaron a los cromosomas en 23 pares, criterio que fue aceptado en la conferencia de Londres y en la reunin de Chicago (7, 8). El gran interrogante que surge en ese momento, es el papel de la citogentica en la medicina comenzando por la relacin entre algunas enfermedades genticas y el nmero cromosmico. Por esta poca Jerme Lejeune, un mdico de la clnica des Maladies Infantiles del Hpital Necker-Enfants Malades de Pars, atrado por la homogeneidad en los rasgos fenotpicos en nios con sndrome de Down descrito previamente por Seguin y posteriormente por Langdon-Down estableci el origen cromosmico del sndrome de Down, con base en la hiptesis de Waardenburg de que el sndrome estaba determinado probablemente por una aberracin cromosmica, estableciendo as por primera vez el origen cromosmico de una enfermedad humana (9-11) (Figura 1). La presencia de mltiples malformaciones que involucraban varios rganos

Figura 1. Los padres de la citogentica. Theophilus Painter y su cariotipo donde demuestra la presencia del cromosoma Y, en cariotipos hechos a partir de clulas del testculo. Tjio y Levan, quienes determinaron el nmero de cromosomas en el cariotipo humano y Jerme Lejeune, quien demostr la relacin entre el sndrome de Down y una alteracin en el nmero de los cromosomas.

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y sistemas en los individuos trismicos para el cromosoma 21, llevaron a la idea que la trisoma para otros cromosomas podran causar sndromes de malformacin, tal como ocurra en el sndrome de Down. Dentro de otras anormalidades cromosmicas numricas descritas en la poca, estuvieron aquellas relacionadas con desrdenes de la diferenciacin sexual. Se determin que la ausencia de un cromosoma X, era el responsable del fenotipo en las pacientes con sndrome Turner (45,X); mientras que un cromosoma X adicional, se correlacionaba con las alteraciones fenotpicas en los pacientes con sndrome Klinefelter (47,XXY) (12,13). El descubrimiento de individuos con complementos sexuales inusuales, dieron la clave del entendimiento de la diferenciacin sexual en mamferos, ya que al ser los individuos 45,X femeninos y los 47,XXY masculinos, se indicaba que el cromosoma Y era el determinante masculino. An ms, la presencia de 3 o 4 cromosomas X en el complemento humano indic no tener ningn efecto sobre una nica copia de cromosoma Y en la determinacin sexual. El desarrollo intersexual fue por primera vez observado cuando un porcentaje de clulas contenan cromosoma Y, como el caso de un mosaico 45,X/46,XY o una quimera 46,XX/46,XY (14, 15). En 1960, Klaus Patau, determin que los recin nacidos con un cromosoma 13 adicional, tenan mltiples anomalas congnitas y nalmente se determinaron los hallazgos de la ltima de las alteraciones numricas que se pueden hallar en nacidos vivos, la trisoma del cromosoma 18 o sndrome Edwards (16, 17). Los hallazgos del momento indicaban que los fenmenos de generacin de trisomas y monosomas que se reconoci como no disyuncin, ocurra en un grupo de cromosomas en particular, y dado que no exista una explicacin a que el fenmeno ocurriera en pocos de los cromosomas autosmicos, se indic por primera vez, que muchos de esos desbalances eran tan severos que tenan efectos letales en el desarrollo embrionario o fetal. As, David Carr en el ao 1963 realiza un extenso estudio de embriones y fetos abortados y encuentra que el 40% de ellos fueron cromosmicamente anormales. Debido a que 15% de los embarazos son espontneamente abortados, se podra indicar que cerca de 3% de las gestaciones corresponden a embriones trismicos, 1% triploides y 1% monosmicos, casi todos letales, descubrindose as las graves consecuencias generadas por errores en los procesos meiticos (18, 19). En la dcada de los cincuenta Sajiro Makino, Albert Levan y George Klein demostraron que algunas lneas celulares cancergenas tendan a ser mitticamente inestables y mostraban nmeros cromosmicos altamente variables. La primera evidencia denitiva de una asociacin entre un cambio cromosmico especco y un tipo de cncer particular, que a la postre corresponde a la primera alteracin cromosmica estructural descrita, fue la observacin de un cromosoma parcialmente delecionado, ms tarde descrito como translocacin (9:22) en la leucemia mieloide crnica. Novell y Hungerford interpretaron este dao cromosmico
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como una delecin del cromosoma Y ya que los pacientes que haban analizado eran masculinos; sin embargo, ms tarde observaron este mismo cromosoma, hoy llamado Filadela, en mujeres con el mismo tipo de leucemia (20). El incremento de rearreglos y rupturas cromosmicas, fueron observados en 1964, en dos enfermedades autosmicas recesivas asociadas con un riesgo incrementado a cncer: la anemia de Fanconi, descrita por Tarute Schroeder y el sndrome de Bloom por James German (21, 22). Muchos descubrimientos posteriores de rearreglos relativamente complejos, se vieron limitados por la imposibilidad de la identicacin de los cromosomas individuales, por lo que fueron propuestas mejoras en la tcnica original permitiendo un gran avance en el desarrollo de la citogentica: la solucin hipotnica por Tao-Chiuh Hsu por ejemplo, para obtener una mejor diseminacin de los cromosomas y as hacer un mejor anlisis, Peter Novell quien descubri que la tohemaglutinina estimulaba la divisin de los glbulos blancos; el efecto de la colchicina por Levan como un agente capaz de inducir el arresto de las clulas en divisin. Sin embargo, lo ms importante fue la introduccin de las tcnicas de bandeamiento por Caspersson y colaboradores, lo cual permiti una adecuada identicacin de cromosomas normales y de rearreglos cromosmicos de variada naturaleza. Los descubrimientos originales de Caspersson fueron hechos en plantas y permitan distinguir solamente eucromatina y heterocromatina; sin embargo, la aplicacin de una tcnica de bandeamiento con mostaza de quinacrina a cromosomas humanos, revel el gran poder que tena esta metodologa para identicar un nivel de organizacin del cromosoma hasta ahora desconocido: las bandas cromosmicas. Cada banda contiene de 1 a 50 o ms megabases de pares de ADN, y contienen 100 o ms genes (23-26). John Evans, Marina Seabright y Jerme Lejeune descubrieron mtodos para producir un patrn de bandeamiento similar (bandas G) o de patrn reverso (bandas R). Fue tambin muy sorprendente e importante el descubrimiento de Sam Latt y Bernard Dutrilaux de un mtodo no radiactivo para analizar caractersticas de replicacin; ste produca un patrn de bandeamiento G o R, dependiendo si la bromodeoxiuridina (BrdU) es incorporada temprana o tardamente en la fase S, lo que permiti demostrar que las bandas G son de zonas de replicacin tarda y las R de replicacin temprana (19). De esta manera, la introduccin del bandeamiento cromosmico condujo a un rpido crecimiento en el conocimiento, logrndose la identicacin de cromosomas involucrados en trisomas, translocaciones, deleciones e inversiones, lo cual constituy el segundo renacimiento de la citogentica de mamferos y humanos. Las tcnicas de bandeamiento permiten hacer un adecuado anlisis de cada uno de los cromosomas, individualizndolos y permitiendo su anlisis e identicacin adecuados. Hasta el momento se han descrito las bandas G, las bandas
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Tcnicas de bandeamiento

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R, las bandas C, las bandas T y las bandas Nor; dentro de ellas las bandas G y las bandas R son las ms utilizadas por sus caractersticas. Las bandas pueden dividirse en morfolgicas (Figura 2) si corresponden a la heterogeneidad de la cromatina, dentro de stas tenemos: las bandas G, las bandas R, bandas Q, bandas C y bandas T y bandeamiento dinmico si depende de los patrones de replicacin de los cromosomas (27). Bandas G, denominadas bandas GTG, se producen como consecuencia de someter las lminas a la accin de una enzima proteoltica denominada tripsina. Tien oscuro regiones ricas en A-T, zonas que son transcripcionalmente inactivas, pobres en genes y en secuencias Alu, pero ricas en secuencias Line, de replicacin tarda (Figura 3).

Bandas R, llamadas as porque con ellas se obtiene un patrn inverso al de las bandas G; son ricas en GC, en genes, en secuencias Alu, pobres en secuencias Line, son zonas de replicacin temprana y se producen al someter las preparaciones en solucin salina a altas temperaturas y coloreadas con giemsa (28). Bandas Q fue la primera tcnica de bandeamiento descrita en un momento en el cual la individualizacin de cromosomas era imposible. Caspersson se bas en el conocimiento de Khler de teir los componentes nucleares mediante mtodos uorescentes descrito 100 aos atrs, uniendo dichos uorocromos con un agente alquilante, ya que el solo uorocromo generaba una tincin homognea sobre los cromosomas (23, 29). Caspersson hipotetiz que el uso de

Figura 2. Cromosomas 7, 21 y 22 en bandas R, bandas Q y bandas G, se comparan con un idiograma en bandas G. Se puede ver la diferencia entre el patrn de bandeamiento entre las bandas G y las bandas R, y el mismo patrn entre las bandas G y las bandas Q.

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un agente alquilante podra permitir la diferenciacin de los segmentos cromosmicos ricos en GC (Guanina-Citocina) de aquellos ricos en AT (Adenina-Timina) (11). La hiptesis de Caspersson a pesar de algunos errores, permiti la visualizacin de los cromosomas con bandas brillantes (uorescentes) correspondientes a los segmentos ricos en AT y opacas correspondientes a los segmentos ricos en GC; las bandas eran constantes y esto permiti el reconocimiento de cada uno de los cromosomas. Bandas C. Se trata de la deteccin de regiones heterocromticas, utilizando hidrxido de sodio e incubando los cromosomas en una solucin salina para hacer la tincin posterior con giemsa. Debido a que los centrmeros con

ricos en heterocromatina, esta tincin tie principalmente las regiones centromricas, pericentromricas y gran parte del cromosoma Y. Esta tcnica fue introducida por la doctora Arrigi y mejorada por Craig-Holmes y colaboradores (30-32). Bandas T. Es la tincin diferencial de la porcin distal de los cromosomas, es una variante de las bandas R ya que las preparaciones son incubadas en el mismo buffer, pero por periodos de tiempo ms largos (27, 11). El cariotipo es la organizacin de los cromosomas de acuerdo con el tamao y la posicin del centrmero. El n-

El cariotipo

Figura 3. Fotografa de una metafase en bandas G.

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mero asignado a cada cromosoma est basado en el patrn de bandas Q como fue propuesto por Caspersson y col. en 1971 (33). El anlisis cromosmico requiere de clulas en metafase, para una mejor clasicacin y evaluacin de los cromosomas; la obtencin de clulas en esta fase requiere de un tejido con gran nmero de clulas en divisin: los linfocitos de sangre perifrica, los broblastos, las clulas del lquido amnitico y clulas de algunos tumores, las cuales deben ser cultivadas bajo ciertas condiciones in vitro para obtener un nmero suciente de clulas en divisin. Las clulas empleadas para cultivo cromosmico deben ser capaces de crecer y dividirse rpidamente en el cultivo, siendo las ms accesibles los leucocitos, los cuales en cultivo requieren de estimulantes mitticos como la tohemaglutinina, cuyo efecto transforma los linfocitos perifricos en clulas parecidas a blastos capaces de reentrar en el ciclo mittico, ya que ellos normalmente slo se dividen una vez (27).

Una vez se obtienen clulas en proliferacin activa, es posible detener clulas en metafase al inhibir la formacin del huso acromtico mediante el uso de la colchicina (34). Adems, esta sustancia ayuda a la contraccin de los cromosomas, hecho que permite una mejor delineacin, un extendido ms eciente y un mejor anlisis. Luego, las clulas son expuestas a solucin salina hipotnica con el n de asegurar la dispersin adecuada y la observacin de los cromosomas dentro de la membrana celular, mediante la extensin en un portaobjetos para posteriormente ser coloreados y analizados al microscopio (Figura 4). Las enfermedades genticas son de cuatro tipos: enfermedades de herencia mendeliana o monognica, enfermedades multifactoriales, enfermedades mitocondriales y enfermedades cromosmicas. La citogentica es la rama de la gentica

Aplicaciones

ETAPAS DEL CARIOTIPO

Figura 4. Etapas del cultivo de linfocitos a partir de sangre perifrica.

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que estudia las enfermedades de herencia cromosmica. Se ha determinado que aproximadamente uno de cada 160 nacidos vivos tienen una alteracin cromosmica y que al menos 50% de los abortos espontneos se deben a anomalas cromosmicas (35, 36); dadas estas cifras, la determinacin del tipo de alteracin cromosmica, es una herramienta diagnstica que permite la conrmacin del diagnstico de dichas enfermedades y adems el correcto asesoramiento gentico del paciente y sus familias. Dentro de las enfermedades cromosmicas numricas se tienen las aneuploidas y las poliploidas (Figura 5). Dentro de las aneuploidas, tenemos las trisomas y las monosomas, en nacidos vivos, podemos encontrar la trisoma 21 o sndrome de Down, la trisoma 18 o sndrome Edwards, la trisoma 13 o sndrome Patau y alteraciones de cromosomas sexuales como sndrome Klinefelter, entre otros. En cuanto a trisomas en productos de aborto se ha descrito que la trisoma ms comn es la del cromosoma 16, pero tambin se han reportado para otros cromosomas. Dentro de las monosomas, la nica que llega a la vida son las nias con sndrome Turner cuyo cariotipo es 45,X. Dentro de las alteraciones estructurales, se tienen las deleciones, inserciones, inversiones, translocaciones, duplicaciones y anillos; hay un gran nmero de alteraciones descritas, dentro de las ms comunes estn el sndrome Cri-du-chat (5p-), sndrome

Wolf-Hirschorn (4p-), Sndrome Velocardiofacial (Sndrome CATCH22/DiGeorge) (del22q11.2), entre otros. En otras palabras, la citogentica nos permite hacer el diagnstico de un gran porcentaje de pacientes con sndromes dismrcos, aunque en algunos casos en los cuales la alteracin estructural es menor de tres megabases de pares de bases, debemos recurrir a la citogentica molecular. A continuacin las indicaciones para tomar un cariotipo en sangre perifrica y en lquido amnitico. Indicaciones para hacer un cariotipo en sangre perifrica 1. Conrmacin diagnstica de enfermedades de herencia cromosmica numricas o estructurales. 2. Retardo mental de origen desconocido. 3. Talla baja en estudio. 4. Ambigedad genital. 5. Padres de nios con alteraciones cromosmicas estructurales. 6. Sospecha de sndrome de genes contiguos. 7. Mujeres con enfermedades recesivas ligadas al X, para descartar sndrome Turner o cualquier alteracin estructural. 8. Infertilidad y/o aborto recurrente. 9. Diagnstico preconcepcional.

Alteraciones numricas

Aneuploidas (2n+1) (2n1)

Poliploidas

Trisoma 2n+1

Monosomas 2n1

Triploidas 3n = 69 Tetraploidas 4n = 92

Figura 5. Clasicacin de las alteraciones cromosmicas numricas.

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Indicaciones para hacer un cariotipo en lquido amnitico y/o vellosidades coriales 1. Determinaciones de enfermedades de herencia cromosmica in tero. 2. Hijos previos con una enfermedad de herencia cromosmica. 3. Determinacin del sexo en enfermedades genticas ligadas al sexo. 4. Ansiedad materna. 5. Marcadores sricos sugestivos de aneuploida (-feto protena, gonadotrona corinica y PAPA). 6. Sonoluscencia nucal aumentada. 7. Padres portadores de alguna alteracin estructural. Cundo no es til un cariotipo 1. En pacientes con enfermedades genticas de un nico gen (mendelianas), mitocondriales y/o multifactoriales. 2. Padres de nios con enfermedades cromosmicas numricas. Hemos pretendido con esta revisin presentar un enfoque actualizado de lo que es la citogentica, sus aplicaciones y su utilidad como herramienta diagnstica. Ante los avances modernos, la citogentica sigue siendo una herramienta poderosa para los mdicos en su ardua tarea de denir el diagnstico de un paciente ante cromosomopatas, sndromes dismrcos, o entidades donde se sospecha de un componente cromosmico ya sea numrico o estructural. Adems, ante la posibilidad del diagnstico prenatal, mostrar cules son las razones para recurrir a este examen.
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