Processos Endocticos e Exocticos nas Sinapses

Faria, Joaquim; Loureiro, Mnica; Menezes, Ana; Santos, Cristiana Departamento de Qumica e Bioqumica, Faculdade de Cincias da Universidade de Lisboa, PORTUGAL

Resumo:
A libertao de neurotransmissores e a transmisso de informao por sinapse qumica requer todo um conjunto de endocitoses e exocitoses coordenadas. Quando um potencial de aco chega a uma terminao nervosa, o Ca2+ flui para dentro desta atravs de canais de clcio dependentes de voltagem, dando origem libertao de neurotransmissores por exocitose das vesculas sinpticas. Paralelamente, ocorre uma renovao do nmero de vesculas sinpticas existentes no terminal nervoso por endocitose. Este processo permite criar um pool de vesculas para que, aquando da chegada de um novo potencial de aco, possa ocorrer nova libertao de neurotransmissores. A maquinaria celular envolvida desempenha um papel crucial no funcionamento deste processo. A calmodulina e a sinaptotagmina so ambas sensores de clcio, sendo que a primeira actua nos processos endocticos e a segunda nos exocticos. O complexo de protenas SNARE funciona como mediador da exocitose sinptica, ao passo que a sinaptofisina necessria para que a endocitose ocorra de modo eficiente. Outras protenas, como as Rab e o complexo exocisto, tambm exercem funes importantes no decorrer da estimulao neuronal. Todo este ciclo desencadeado pelo clcio: por um lado, este exerce um efeito regulador de retroaco negativa dos processos endocticos; por outro, este que d origem fuso das vesculas sinpticas por activao da sinaptotagmina.

Introduo:
A transmisso por sinapse qumica representa a principal forma de comunicao neuronal entre clulas e est na base de todas as funes do sistema nervoso, desde a percepo sensorial memria. O processo inicia-se com a libertao de uma substncia transmissora do neurnio pr-sinptico, como consequncia de um potencial de aco. Seguese a difuso desta substncia ao longo da fenda sinptica extracelular que, posteriormente, se vai ligar a receptores localizados na membrana da clula ps-sinptica e induzir, assim, alteraes nas propriedades elctricas da mesma. Uma sinapse qumica de vertebrados particularmente bem estudada a juno neuromuscular. So os processos endocticos nos terminais nervosos que possibilitam a existncia de um pool de vesculas para a libertao de neurotransmissores a partir de um terminal prsinptico. Aps ocorrer a libertao de neurotransmissores, necessrio que o nmero de vesculas no terminal nervoso seja renovado, para que novas vesculas estejam disponveis em -1-

quantidade suficiente na ocorrncia de um novo potencial de aco. Deste modo, garantida uma libertao eficiente do neurotransmissor. A percepo da possvel existncia de dois tipos de endocitose remonta aos anos 70, altura em que se iniciaram os estudos sobre a renovao das vesculas nos terminais nervosos. Desde a tem-se vindo a tentar perceber as diferenas entre os dois modelos endocticos: a endocitose mediada por clatrina e a endocitose do tipo kiss and run. As diferenas entre ambos esto relacionadas no s com o mecanismo envolvido, como tambm com o local de aco locais activos ou nas proximidades , e ainda com o tipo de protenas envolvidas em cada um dos processos, requerendo a endocitose mediada por clatrina uma maior maquinaria proteica do que a de tipo kiss and run (Morgan J. R. et al., 2002). Um outro processo fundamental para a transmisso sinptica a exocitose, que define a fuso de vesculas com a membrana plasmtica da clula com consequente libertao dos seus contedos. Este mecanismo constitui o passo final da via de secreo que se inicia, geralmente, no retculo endoplasmtico, passa pelo complexo de Golgi e termina no exterior da clula. Tem como funes a adio de membrana extra e dos seus constituintes membrana plasmtica, a partir das membranas das vesculas e, ainda, a libertao dos contedos das mesmas no espao extracelular (Lin & Scheller, 2000). A exocitose diferencia-se em duas vias: exocitose constitutiva, que visa a manuteno dos constituintes da membrana plasmtica e do ambiente extracelular, ocorrendo na ausncia de sinais externos; e exocitose regulada que, ao contrrio da anterior, no s limitada a clulas que desempenham funes mais especficas, como tambm se d em resposta a certos estmulos, tal como o aumento da concentrao de clcio (Lin & Scheller, 2000). a partir deste tipo de exocitose que se d a libertao dos neurotransmissores nas sinapses. A fuso exoctica de vesculas envolve a formao de um poro de fuso, canal este que atravessa ambas as membranas plasmtica e vesicular, e possibilita a libertao do contedo para o exterior da clula. Todo este processo, desde a formao e transporte das vesculas sinpticas sua fuso, pode ser dividido em cinco passos: trafficking; tethering; docking; priming e fusion. A maquinaria molecular interveniente , de igual modo, de extrema importncia, e inclui pequenas GTPases das subfamlias Ral, Rab e Rho, que regulam os processos da formao, trfego e fuso de vesculas; o complexo exocisto, que participa no encaminhar das vesculas para as zonas especficas de fuso na membrana plasmtica; e as protenas SNARE, fundamentais na fuso vesicular. a interaco entre estes dois ltimos intervenientes, SNAREs e exocisto, que permite a fuso das membranas nos domnios alvo da membrana plasmtica da clula, durante o processo de exocitose. Neste artigo fazemos uma abordagem geral acerca dos processos endocticos e exocticos fundamentais nas sinapses, descrevendo as variedades de mecanismos existentes ao explorarem-se as diferenas fisiolgicas que levam ocorrncia de cada. A importncia e modo de regulao da maquinaria molecular outro tpico essencial, destacando-se as protenas sinaptofisina e calmodulina no caso da endocitose, e as SNAREs e sinaptotagmina na exocitose. O papel fundamental do clcio na regulao destes mesmos processos e, ainda, os vrios passos em que se desenrolam so igualmente desenvolvidos. Em suma, tentmos que o

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nosso trabalho fosse o mais til possvel para a compreenso do tema como um todo e que abordasse uma grande variedade de assuntos dentro da Bioqumica.

Introduo histrica:
As primeiras demonstraes de endocitose em terminais sinpticos foram realizadas no incio dos anos 70 por Heuser e Reese e pelo grupo de Ceccarelli. Nestes estudos, os terminais sinpticos eram estimulados vigorosamente, de modo a conseguir causar o maior nmero possvel de fuso das vesculas com o terminal pr-sinptico. O que se observou foi que, apesar de o nmero de eventos exocticos ter sido muito elevado, apenas se deu uma eliminao parcial do nmero de vesculas. Esta observao levou a concluir que o nmero de vesculas no pool deve ter sido renovado de modo a responder actividade exoctica. Porm, apesar de ambos os grupos usarem mtodos idnticos e o mesmo tipo de sinapses, foram obtidas diferenas nos resultados referentes aos tempos, local e identidades moleculares. Enquanto o grupo de Heuser e Reese defendia que a endocitose ocorria a partir de vesculas revestidas, de modo relativamente lento e com ocorrncia distante dos locais activos das sinapses, o grupo de Ceccarelli defendia que no era necessria a formao de vesculas revestidas, sendo o processo relativamente rpido e ocorrendo nas zonas activas. No final dos anos 70 e 80, a investigao por parte de ambos os grupos incidiu nos tempos envolvidos no processo, tendo sido tambm realizada em paralelo alguma investigao sobre o local de aco no neurnio. Nos anos 80, outros grupos comearam tambm a desenvolver estudos nesta rea, tendo sido nos anos 90 que houve uma maior incidncia em estudos sobre a importncia relativa de cada tipo de endocitose e as condies que os favorecem, os mediadores proteicos requeridos para cada um dos modelos e os passos do processo endoctico em que esto envolvidos. (Morgan J. R. et al., 2002). Quanto ao processo de exocitose, os primeiros estudos comearam a ser desenvolvidos na dcada de 50, maioritariamente ao nvel neuronal, com a transmisso de sinapses qumicas. Por essa altura surgiu a ideia de se explicar a libertao de acetilcolina, observada na juno neuromuscular, com a existncia de vesculas sinpticas (Fatt & Katz, 1952). Contudo, os avanos iniciais nesta rea, com recurso a tcnicas como a electrofisiologia e microscopia electrnica, foram sucedidos por um perodo de estagnao, tendo as mesmas atingido todo o seu potencial. Com o avanar dos anos, sobretudo por volta da dcada de 90, foram surgindo novas tcnicas para a medio e controlo da concentrao pr-sinptica de clcio com o uso de corantes fluorescentes e compostos fotossensveis que se ligam ao Ca2+, bem como o aparecimento de mtodos para simular a difuso do mesmo no neurnio pr-sinptico. Foram tambm desenvolvidas novas tcnicas para monitorar a secreo, tais como medies da rea da membrana pr-sinptica atravs da sua capacitncia e, ainda, da absoro e libertao com corantes fluorescentes em vesculas endocitadas (Zucker R, 1996), bem como a aplicao da engenharia gentica e biologia de membranas a protenas que participam no s na fuso de vesculas sinpticas, como tambm em outros passos do trfego das mesmas (targeting, -3-

docking e priming). Modificaes a cada um destes passos podem alterar a fora das conexes sinpticas e participar assim na plasticidade sinptica (Lin & Scheller, 2000). A tcnica de patch clamp permitiu, entretanto, a anlise electrofisiolgica de tecidos outrora inacessveis. Desta forma, o processo de exocitose foi sendo sucessivamente elucidado ao longo dos anos, estabelecendo-se agora como uma nova fronteira na investigao biolgica (Zucker R, 1996).

Processos Endocticos:
1- Comparao entre endocitose rpida (Kiss and run) e endocitose lenta (mediada por clatrina): - Diferenas de mecanismo de aco, mediadores proteicos, local de aco no neurnio, rapidez de aco: Existem dois tipos de processos endocticos com caractersticas distintas nas sinapses, a endocitose mediada por clatrina e a endocitose rpida denominada por kiss and run. Pelo tipo de endocitose kiss and run as vesculas apenas se fundem de modo transiente e incompleto com a membrana plasmtica, por meio de formao de um poro de pequenas dimenses (Granseth B. et al., 2007), sendo posteriormente recuperadas quase instantaneamente como estruturas intactas a partir da zona activa (Jung N. & Haucke V., 2007). Por outro lado, a endocitose mediada por clatrina, ocorre aps fuso completa da vescula com a membrana, sendo um mecanismo bastante mais lento e que necessita da presena de vrias protenas acessrias que se ligam membrana antes de ocorrer a endocitose (Zhu Y. et al., 2009). Ainda em contraste com a endocitose do tipo kiss and run, a endocitose mediada por clatrina vai ocorrer no nas zonas activas, mas sim nas suas proximidades (Brodin L. et al., 2000) (Morgan J. R et al., 2002). Verificou-se que os dois processos de endocitose ocorrem em locais diferentes nos terminais sinpticos. Enquanto que a endocitose rpida observada nas zonas activas, a endocitose mediada por clatrina ocorre em regies usualmente conhecidas por zonas periactivas que rodeiam as zonas activas e estendem-se cerca de um micrometro para alm do limite destas (Brodin L. et al., 2000). Nestas zonas activas onde vesculas esto prontas para ser libertadas durante a exocitose, tambm observada a endocitose kiss and run, que acontece imediatamente aps a abertura do poro de fuso durante a exocitose, sendo recuperada a membrana da vescula sem a necessidade de recorrer a uma maquinaria mais complexa. Sendo ento nas zonas periactivas onde se concentra toda a maquinaria necessria para a endocitose mediada por clatrina (Jarousse N. et al., 2001). Na endocitose mediada por clatrina, a formao de uma vescula revestida um processo altamente cooperativo e sob forte controlo regulatrio, podendo dividir-se em 4 -4-

fases: recrutamento do revestimento de clatrina, maturao, fisso da vescula e libertao do revestimento.

Fig. 1 - Representao esquemtica das vrias fases da endocitose mediada por clatrina e respectivas imagens por microscopia electrnica. (Slepnev & Camilli, 2000).

Os componentes do revestimento das vesculas servem principalmente para formar uma membrana curva. So estes a clatrina, que reveste toda a vescula, a AP-2, (AP adaptor protein) que associa a clatrina membrana lipdica, e a AP-180, que dever estar envolvida na regulao do tamanho das vesculas e tambm possui domnios de reconhecimento de outras protenas. Protenas acessrias como a epsina, a sinaptotagmina e a endofilina vo sendo recrutadas medida que a invaginao aumenta de tamanho e de curvatura ajudando assim sua maturao. Antes da fisso a invaginao adopta uma conformao caracterstica em que existe um estrangulamento da membrana por aco da dinamina, julga-se que vai constringindo ou esticando esta regio da membrana at que finalmente se rompa e d origem a uma vescula revestida de clatrina. Poucas so as vesculas com o revestimento de clatrina que so detectadas em terminais sinpticos o que leva a presumir que estas so rapidamente destitudas da sua camada exterior. Pensa-se que a auxilina e a sinaptojanina tenham uma grande importncia neste processo afectando a estabilidade das ligaes entre clatrina e AP-2 facilitando a remoo destes (Takei K. & Haucke V., 2001). Os mecanismos inerentes endocitose rpida kiss and run, ainda no so totalmente compreendidos e foram menos estudados do que o outro tipo de endocitose. Estudos recentes indicam que os dois tipos de endocitoses so regulados pela mesma cascata de sinalizao clcio/calmodulina/calcineurina e apontam para uma necessidade da dinamina para que qualquer endocitose possa ser realizada. Estas observaes revelam que so partilhados mecanismos semelhantes nas fases de iniciao e de fisso evidenciando tambm que a endocitose rpida no necessita de uma maquinaria proteica to complexa pois as vesculas j no precisam de se libertar de um revestimento intrincado como as provenientes de uma endocitose lenta (Sun T. et al., 2010). -5-

Em diversos estudos, em que se utilizaram mtodos de capacitncia (Morgan J. R. et al., 2002), sondas fluorescentes (Ryan T. A. et al., 1995) e tcnicas de imagem ptica (Granseth B. et al., 2007), foram obtidas escalas de tempos distintas para os processos endocticos, existindo resultados numa escala de tempo entre 1 e 5 segundos, enquanto noutros casos era observada uma escala de tempo entre 30 a 60 segundos (Ryan T. A. et al., 1995). As diferenas entre os valores obtidos foram interpretadas como pertencentes a dois mecanismos endocticos com cinticas diferentes (Granseth B. et al., 2007). Com o intuito de perceber qual a importncia relativa de cada um dos mecanismos durante o processo endoctico, foram realizados estudos utilizando sondas fluorescentes como a FM 1-43, de modo a conseguir acompanhar a renovao de vesculas sinpticas, em neurnios do hipocampo de ratinhos (Ryan T. A. et al., 1995). Chegou-se concluso de que quando usado 5% do pool de vesculas no processo exoctico, as vesculas so recuperadas por um mecanismo lento de endocitose, com um tempo mdio de 40 segundos. Aumentando o nmero de vesiculas exocitadas para cerca de 25%, a recuperao deu-se pelo mesmo mecanismo, apesar de, nos primeiros 5 segundos, se ter observado uma pequena acelerao. Outros autores (Wu W. et al., 2005) observaram ainda que, mesmo em casos de elevada estimulao, quando a concentrao de clcio comea a diminuir, observada uma maior prevalncia do processo endoctico lento face ao modelo kiss and run. Posteriormente foram feitos estudos em que, contrariamente ao referido anteriormente, se induziram despolarizaes de membrana intensas e repetidas, tentando simular situaes de actividade neuronal intensa (Wu W. et al., 2005). Constatou-se que, sob estas condies, o tipo de endocitose rpida kiss and run apresenta um papel dominante face endocitose mediada por clatrina. O facto da endocitose kiss and run ser activada durante elevada estimulao de grande importncia fisiolgica, uma vez que, nestas condies, ocorre a fuso de um elevado nmero de vesculas, o que pode levar alterao da estrutura dos terminais nervosos. Deste modo, sugerido por alguns autores (Wu XS. & Wu LG., 2009) que a endocitose do tipo kiss and run, activada durante uma estimulao rpida, importante para manter a estrutura normal dos terminais nervosos por recuperao das vesculas que se fundiram com a membrana.

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Fig. 2 - Viso geral dos passos envolvidos na endocitose mediada pela protena clatrina com respectivas protenas intervenientes em cada passo. Os passos esto numerados segundo a ordem sequencial em que ocorrem na mediao. Interaces protena-protena e protena-lpido desempenham um papel fundamental na nucleao do revestimento. (PIP2, Fosfatidilinasitol 4,5-bifosfato.) (Takei & Haucke, 2001)

2- Exemplos de reguladores proteicos: -Sinaptofisina

A sinaptofisina a protena maioritria das vesculas endocticas sinpticas, constituindo cerca de 10% de todo o seu material proteico. Em estudos em ratinhos com knockout da sinaptofisina (Know E. & Chapman R., 2011), observou-se que esta no necessria para que a endocitose ocorra, continuando a dar-se libertao sinptica mesmo na sua ausncia e no se observando alteraes morfolgicas nas vesculas. Porm, verificou-se que a sua presena necessria para que a endocitose ocorra de modo eficiente, tanto durante como aps a estimulao neuronal contnua. Uma vez que os processos endocticos durante e aps estimulao so diferentes, foram realizados estudos (Know E. & Chapman R., 2011) com o intuito de perceber se a sinaptofisina regula ambos os processos do mesmo modo. Para isso, os autores focaram-se na poro C-terminal, da sinaptofisina, que faz ligao dinamina I (protena que se pensa ser responsvel por mediar a fisso de vesculas durante a endocitose). Chegou-se concluso de que esta regio C-terminal importante para a endocitose que ocorre durante mas no aps a transmisso sinptica. O que est de acordo com o facto de a sinaptofisina apenas recrutar a dinamina I para a formao de vesculas na presena de concentraes de Ca2+ intracelular relativamente elevadas (Daly C. et al., 2000). Estas observaes indicam que diferentes domnios da sinaptofisina esto envolvidos no controlo da endocitose, dependendo se esta ocorre durante ou aps estimulao.

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Foram realizados estudos com o intuito de perceber a funo do complexo sinaptofisina/dinamina I na regulao dos processos endocticos (Daly C. et al., 2000). Para perceber a importncia do complexo, os autores bloquearam a interaco das duas protenas. Aps um minuto de estimulao contnua, observou-se uma forte diminuio da libertao de sinal durante a ocorrncia de potenciais de aco. Os autores concluram que o impedimento da interaco da sinaptofisina com a dinamina I resulta numa diminuio da disponibilidade de vesculas para se dar a exocitose, durante perodos de elevada frequncia de estimulao, o que est de acordo com resultados de artigos posteriores (Know E. & Chapman R., 2011). Porm, foi observado que bloqueando o complexo apenas a endocitose rpida, kiss and run, diminua. O que est de acordo, mais uma vez, com o facto de a sinaptofisina apenas se ligar dinamina I na presena de concentraes de clcio relativamente elevadas. Para alm de se ligar com a dinamina I a sinaptofisina forma ainda um complexo com a sinaptobrevina nos terminais nervosos. A interaco entre as duas protenas ocorre na regio transmembranar da sinaptofisina, tendo sido observado que esta interaco ocorre nos terminais nervosos em repouso e diminui com o aumento de clcio intracelular, ao contrrio do que ocorre com a interaco com a dinamina I, sendo que a poro citoslica C-terminal no necessria para esta interaco. ento possvel concluir que a presena da protena sinaptofisina necessria para que o processo endoctico ocorra de modo eficaz nos terminais nervosos, tanto no caso da endocitose mediada por clatrina como na endocitose do tipo kiss and run. ainda possvel verificar que cada tipo de endocitose apresenta interaces com protenas diferentes, utilizando para isso domnios distintos. A sinaptofisina possivelmente controlada pelos nveis intracelulares de clcio, uma vez que para valores elevados se observa uma interaco da sinaptofisina com a dinamina I e uma tendncia para diminuir a ligao com a sinaptobrevina, contrariamente ao que se observa para baixas concentraes de clcio intracelulares.

- Calmodulina
No processo de endocitose, tanto a forma rpida como a lenta, dependente da concentrao de ies Ca2+ e dependente do sensor calmodulina sendo este sensor muito importante para o estmulo endoctico. A calmodulina (CALcium MODULated proteIN) uma protena que sensvel aos nveis de clcio. composta por 2 domnios globulares ligados por uma hlice muito flexvel, cada um dos domnios das extremidades capaz de estabelecer ligaes com 2 ies de clcio, tendo a capacidade de se ligar a 4 ies de Ca2+ no total. Usando medies de capacitncia possvel concluir que o bloqueio do complexo Ca /calmodulina inibe a taxa de endocitose, na sequncia de um impulso de despolarizao associado a um grande fluxo de ies Ca2+, no entanto, no existe efeito em resposta a estmulos mais fracos (Yao L. & Sakaba T., 2012).
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Em modelos que se assemelham capacidade de uma sinapse no perturbada, a calmodulina essencial para o recrutamento rpido de vesculas aps um impulso, sem influenciar a taxa de endocitose (Yao L. & Sakaba T., 2012). Alguns autores (Wu XS. et al., 2009) sugerem que a calmodulina o principal sensor de Ca na endocitose, sendo os resultados de L. Yao e T. Sakaba consistentes com esta hiptese. Os resultados sugerem ainda que a presena de calmodulina aumenta a taxa de endocitose, numa relao de dependncia com a actividade, mas sem no entanto ser necessria a sua presena para a ocorrncia de endocitose. Dado que a endocitose no completamente bloqueada pela ausncia de calmodulina tm de existir outros sensores, ainda por identificar, que tambm estimulem este processo. Estes resultados coincidem tambm com a ideia de que o complexo clcio/calmodulina modela a capacidade endoctica, semelhana do papel de Ca2+ em culturas de neurnios do hipocampo (Balaji J. et al., 2008).
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Aps a exocitose, o desimpedimento da zona activa uma aco de ps-fuso, que pode afectar a cadeia de aces a montante. A inibio de calmodulina bloqueia o recrutamento de vesculas sinpticas para o pool de libertao rpida e tambm a remoo de membrana (Wu XS. et al., 2009). No entanto a relao entre os dois processos permanece indeterminada. Foram sugeridas duas possibilidades para o papel da calmodulina no recrutamento de vesculas sinpticas. Por um lado, a calmodulina pode actuar um passo antes da exocitose, aumentando a taxa de activao (priming) de vesculas sinpticas, tendo como consequncia o aumento do recrutamento de vesculas sinpticas para o pool de libertao rpida. A outra possibilidade sugere a aco da calmodulina entre a fase de exocitose e endocitose, antes da fisso de vesculas, passos intermdios como a remoo de materiais das zonas activas, o seu transporte e tambm a formao de depresses revestidas de clatrina, mas a possvel interaco da calmodulina com tais processos no pode ser detectada por estudos de capacitncia pois s conseguem detectar a fisso de membrana ficando-se por enquanto sem saber todas as possibilidades da implicao real por parte da calmodulina (Yao L. & Sakaba T., 2012).

Processos Exocticos: 1 A exocitose e os seus diferentes tipos e mecanismos:

Podemos definir o processo de exocitose como a fuso de uma vescula secretora intracelular com a membrana plasmtica da clula. Todas as clulas eucariticas dependem deste processo para o seu crescimento e diferenciao, uma vez que o nico mecanismo pelo qual uma clula consegue adicionar membrana extra sua membrana plasmtica. A exocitose considerada como um dos principais meios de comunicao qumica entre neurnios. possvel distinguir-se dois tipos de exocitose, a chamada constitutiva e a regulada que, ao contrrio da outra, accionada por Ca2+. A exocitose constitutiva diz respeito a todas as fuses nas quais vesculas so formadas, transportadas e exocitadas de forma contnua, sem -9-

sofrerem regulao a curto prazo. Um exemplo importante o transporte de protenas, tais como receptores, que desempenham a sua funo na membrana plasmtica. Por outro lado, a exocitose regulada geralmente requer o armazenamento de membranas percursoras em pools intracelulares especializados, a partir dos quais so mobilizadas com a activao de cascatas de sinalizao. A composio destas membranas geralmente diferente da relativa membrana plasmtica. Este tipo de exocitose permite, ainda, uma entrega controlada de produtos de secreo como protenas ou neurotransmissores, ou ento a incorporao regulada de constituintes especializados da membrana plasmtica, como transportadores e canais. A exocitose regulada , na maioria dos casos, accionada por segundos mensageiros em resposta activao dos receptores ou despolarizao da membrana, sendo o clcio o mais comum (Jahn R, 2004). As sinapses so um bom exemplo deste tipo de exocitose, com a secreo de neurotransmissores aquando da fuso de vesculas secretoras com a membrana plasmtica, dependente de Ca2+. Para alm da classificao referida, pode-se ainda definir dois mecanismos diferentes quanto fuso de vesculas exocticas na membrana plasmtica. Desta forma, atravs do dito mecanismo clssico apresenta-se a fuso completa ou de tudo ou nada onde, ao nvel de sinapses, uma vescula funde-se com a membrana pr-sinptica e liberta o seu contedo para a fenda. A membrana da vescula depois reciclada. Alternativamente, uma vescula sinptica pode formar um poro de fuso transiente na membrana pr-sinptica e libertar apenas parte do seu contedo. Neste mecanismo de exocitose, designado por kiss and run, a vescula depois reutilizada. Clulas com vesculas de maiores dimenses utilizam primariamente a exocitose por fuso completa, e apenas ocasionalmente por kiss and run. Dentro deste ltimo processo h ainda que diferenciar modos de libertao do contedo das vesculas, tais como eventos simples, onde uma pequena vescula sinptica forma um poro de fuso na membrana pr-sinptica e liberta o seu contedo na fenda, afastando-se de seguida da membrana, e eventos mais complexos, que ocorrem quando o poro de fuso se intercala rapidamente entre uma forma aberta e uma fechada, permitindo repeties da libertao parcial do contedo da vescula (Wightman & Haynes, 2004).

Fig. 3 - Representao dos dois mecanismos de fuso exoctica na membrana plasmtica da clula: (a) fuso completa, na qual a membrana da vescula sinptica reciclada aps a libertao dos neurotransmissores, e kiss and run, com secreo atravs de um poro de fuso transiente, dividindo-se este ltimo em eventos simples (b) e complexos (c). (Wightman, R.M. & Haynes, C.L., 2004).

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A partir de estudos realizados por Bruns e Jahn (1995) observou-se que pequenas respostas, presumivelmente originadas pela fuso de vesculas pequenas, se deveram libertao de cerca de 5 000 molculas em 100 s, o que sugere uma abertura rpida de um poro de fuso. Quanto a respostas maiores, originadas estas possivelmente pela fuso de vesculas grandes e densas, levaram libertao de cerca de 80 000 molculas por um poro que, inicialmente, se abriu da mesma forma como o do caso anterior, mas agora com uma dilatao progressiva. No ainda muito claro se, na maioria das situaes, este poro volta a fechar ou se se dilata de todo, resultando numa fuso completa (Zucker R, 1996). A vantagem da exocitose por kiss and run assenta no facto de, e sabendo que o processo de reciclagem de vesculas pelo compartimento endossomal relativamente lento, esta levar a uma maior longevidade de uma vescula sinptica. No caso de neurnios do mesencfalo, o uso eficiente de vesculas necessrio devido a um nmero relativamente pequeno de vesculas sinpticas ai presentes. Especificamente falando do processo de kiss and run complexo, este pode apresentar-se como uma forma mais econmica de exocitose, sendo assim vantajoso no caso da existncia de poucas vesculas carregadas (Wightman & Haynes, 2004). Em relao s vesculas secretoras, estas apresentam um aspecto varivel consoante o seu contedo. Assim, as vesculas que contm acetilcolina, glicina, GABA ou glutamato so pequenas e claras, enquanto que as que contm catecolaminas so pequenas e densas, e ainda as que contm neuropptidos apresentam-se como grandes e densas. Atendendo a esta classificao, as vesculas participam em funes neuronais distintas e a sua exocitose desencadeada por diferentes padres de estimulao.

2 A via exoctica:
A libertao regulada de neurotransmissores controla a comunicao neuronal e est na base de todas as funes do sistema nervoso. Para que tal acontea, as vesculas vo sendo transportadas por compartimentos at atingirem a membrana plasmtica, atravs de um processo composto por vrios passos. Cada um destes envolve a ciso da vescula do compartimento dador, sendo posteriormente levada para um compartimento aceitador. Neste d-se o docking e fuso da vescula e o seu contedo ou libertado ou transformado. Estes vrios passos vo-se repetindo at que o contedo atinja a membrana plasmtica. A via exoctica envolve o movimento das vesculas para a regio subplasmalemal da clula, onde so situadas e ancoradas em locais de libertao na membrana plasmtica. Nesse momento h a converso para um estado no qual o contedo se encontra pronto para ser libertado, passando por processos de priming dependentes de ATP e d-se, por fim, a fuso de membranas com a consequente libertao do contedo das vesculas (Burgoyne & Morgan, 2003). Podemos assim separar o processo da exocitose em cinco passos fundamentais: trafficking; tethering; docking; priming e fusion. O primeiro, relativo ao trfego vesicular, envolve a migrao das vesculas at membrana plasmtica. O citoesqueleto e vrias - 11 -

protenas motoras facilitam este processo. Assim que as vesculas chegam s zonas activas estabelecem a primeira interaco com a membrana plasmtica qual se iro fundir, para que assim sejam dirigidas para essas zonas. Este definido como o passo seguinte, no qual se formam ligaes com uma certa distncia entre a vescula e a superfcie da membrana, tal como se de pesca se tratasse. Estas interaces esto envolvidas na concentrao de vesculas sinpticas numa sinapse. O docking ocorre quando as vesculas, aps a primeira interaco com a membrana, so ancoradas a esta atravs de uma protena ou complexo proteico. Os processos de tethering e docking antecedem a formao do complexo SNARE, que se encontrar descrito na seco 4. De seguida, a exocitose de vesculas sinpticas d-se num processo constitudo por dois passos, um primeiro de priming que inclui todos os rearranjos moleculares e modificaes dependentes de ATP de protenas e lpidos, seguido pela rpida fuso de membranas desencadeada pelo influxo Ca2+ e libertao, quase instantaneamente, dos neurotransmissores. importante referir que, o processo de priming s ocorre na exocitose regulada.

Fig. 4 - Vias de transporte nos terminais nervosos. As vesculas sinpticas preenchidas com neurotransmissores ficam armazenadas no citoplasma at serem translocados para as zonas activas, onde atracam (docking). O priming envolve todos os passos necessrios para que o complexo exoctico fique pronto para libertar os neurotransmissores. Aps exocitose, as protenas das vesculas encontram-se em clusters, sendo recuperadas por endocitose. Apesar de algumas controvrsias, pensa-se que esta recuperao ocorre, geralmente, por endocitose mediada por clatrina. Aps o desencapsulamento da clatrina, as vesculas sinpticas so regeneradas dentro do terminal nervoso, passando provavelmente por um intermedirio endossomal. (Jahn et al., 2012)

3 Maquinaria molecular e estruturas envolvidas:

O processo de exocitose de vesculas sinpticas controlado por toda uma maquinaria celular proteica, sendo esta conservada de organismo para organismo. As protenas SNARE (soluble NSF-attachment receptor) so componentes essenciais desta maquinaria, juntamente com o ATPase NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor), a sinaptotagmina, a classe de protenas Rab (protenas G e seus efectores), o complexo exocisto e as SM (Sec1/Munc18-like) ou nSec1 (homlogo neuronal da protena Sec1 de levedura, tambm designada como Munc18). Muitos - 12 -

outros factores que interagem com as protenas SNARE tm sido estudados, como as complexinas, VAP33 e as sinaptofisinas.

3.1 Protenas SNARE

As protenas SNARE foram as primeiras molculas a ser identificadas como mediadores do processo sinptico. Originalmente descobertas como as protenas sinpticas sinaptobrevina (ou VAMP, vesicle-associated membrane protein), sintaxina e SNAP-25, verificou-se mais tarde que tambm actuam como receptores para protenas solveis envolvidas no trfego do complexo de Golgi. Estudos realizados com protenas tipo-SNARE requeridas para a secreo em leveduras indicaram que estas desempenham uma funo comum a todos os trfegos de membrana (Sudhof & Rizo, 2011). Apesar de, geralmente, se encontrarem localizadas num mesmo compartimento de membrana, as protenas SNARE encontram-se subdivididas em dois grupos: as associadas especificamente a vesculas (v-SNARE), s quais corresponde a sinaptobrevina, e as localizadas na membrana alvo (t-SNARE), que incluem a SNAP-25 e a sintaxina.

Fig. 5 - Estrutura do ncleo do complexo sinptico SNARE. O complexo formado por quatro hlices paralelas: domnio H3 da sintaxina, domnio coiled-coil da VAMP, hlice aminoterminal da SNAP-25 e hlice carboxiterminal da SNAP-25. (Lin et al., 2000)

A sequncia de aminocidos destas protenas sugere que estas exercem um papel na ancoragem e fuso de vesculas. As SNAREs esto associadas membrana atravs de um domnio transmembranar nico e todas possuem uma ou mais hlices capazes de formar coiled-coils (ou motivos SNARE) (Jahn & Fasshauer, 2012). As SNAREs passam por um ciclo regulado de assemblagem/desassemblagem, catalisado pelo ATPase NSF. Quando entram em contacto, estas protenas (v- e t-SNARE) associam-se em hlice no chamado complexo trans-SNARE, que leva aproximao das duas - 13 -

membranas envolventes. Esta assemblagem acompanhada por uma grande libertao de energia, que utilizada para dar incio fuso das membranas. Aps fuso, o complexo ternrio SNARE assume a sua configurao de energia mais baixa e dissociado pelo NSF, juntamente com o seu cofactor SNAP. A sinaptobrevina depois endocitada e reciclada, de modo a que possa ser utilizada noutro ciclo exoctico.

3.2 Protenas SM (Sec1/Munc18):

Outro componente obrigatrio da maquinaria envolvida na exocitose das vesculas sinpticas a famlia de protenas SM (ou Munc18/nSec1). So protenas citoslicas com cerca de 600 resduos de aminocidos que actuam lado a lado com as SNAREs (Sudhof & Rizo, 2011). Sec1/Munc18 liga-se sintaxina, dando origem ao complexo sintaxina/Munc-18, o qual se pensa que preceda e/ou regule o priming vesicular, um processo mediado pelas diferentes protenas SNARE. Munc18-1, um membro da famlia de protenas SM, promove directamente a estabilidade da sintaxina na exocitose sinptica. Estudos mostraram que a ausncia desta protena nas vesculas sinpticas causa perda total da actividade exoctica (Jahn & Fasshauer, 2012). Enquanto que estas protenas so claramente indispensveis na exocitose das vesculas sinpticas, a sua funo no processo de fuso ainda no est completamente claro. A eliminao de Munc18 em clulas de rato elimina por complexo a libertao de neurotransmissores, mas no surte qualquer efeito no docking das vesculas. Tal facto sugere, ento, que esta protena actua apenas aps docking (Li & Chin, 2003). Em mamferos, estudos revelaram que a Munc18 interage selectivamente com a sintaxina-1 na sua conformao fechada, uma conformao que previne a interaco desta SNARE com as restantes. Mais recentemente, foi proposto que a Munc18 pode ter um comportamento semelhante a um chaperone, na maneira em que regula a transio da sintaxina-1 entre a sua conformao fechada e aberta, tornando assim possvel a formao do complexo SNARE, em conjunto com outras protenas, como o caso das GTPases Rab3, descritas mais adiante (Li & Chin, 2003).

3.3 Sinaptotagminas
As sinaptotagminas so protenas intrnsecas da membrana constitudas por mltiplos domnios, responsveis por inmeras interaces moleculares, dos quais se destacam dois domnios citoplasmticos C2. A sinaptotagmina-1 (syt1) est localizada nas v. Dentro deste ltimo processo h ainda que diferenciar modos de libertao do contedo das vesculas, tais como eventos simples, onde uma pequena vescula sinptica forma um poro de fuso na membrana pr-sinptica e liberta o seu contedo na fenda, afastando-se de seguida da membrana, e eventos mais complexos, que ocorrem quando o poro de fuso se intercala rapidamente entre uma forma aberta e uma fechada, permitindo repeties da libertao parcial do contedo da vescula e quem a desencadeia a exocitose induzida por clcio. Os seus dois domnios C2, C2A e C2B, inserem-se na membrana aps ligao ao clcio, iniciandose assim o processo de fuso (Sascha Martens et. al, 2007). - 14 -

Fig. 6 - Estrutura cristalina dos domnios C2A e C2B da syt1 humana [nmero de acesso no Protein Data Bank: 2R83].

Na presena de clcio, a syt1 liga-se aos fosfolpidos membranares a partir de ambos os domnios C2. O domnio C2A da sinaptotagmina liga trs ies Ca2+, ao passo que o C2B liga apenas dois. Para alm disso, a ligao desta protena ao clcio parece originar a rpida penetrao dos seus domnios nas membranas lipdicas em processos de exocitose rpida. Estas propriedades levam a crer que a sinaptotagmina funciona como uma mquina sensvel a clcio que se liga a fosfolpidos, de modo a promover a fuso de vesculas sinpticas, atravs da aproximao das duas membranas intervenientes (Li & Chin, 2003). Para alm dos fosfolpidos, a sinaptotagmina-1 pode ainda interagir com outras molculas de uma forma dependente de Ca2+, incluindo outras sinaptotagminas, sintaxina-1, SNAP-25, complexo SNARE e canais de clcio. As sinaptotagminas pertencem a uma famlia de protenas de ligao ao clcio especficas de eucariotas complexos, expressas principalmente nos neurnios. A no existncia destas protenas em leveduras sugere que no fazem parte da maquinaria celular bsica conservada de trfego de membrana. Tal como referido anteriormente, a sinaptotagmina-1 representa um derradeiro sensor de Ca2+ em mecanismos de exocitose sinptica desencadeada por clcio (Li & Chin, 2003). A ausncia deste grupo de protenas leva perda de exocitose rpida; por outro lado, o facto do processo sinptico continuar a ocorrer por exocitose lenta, sugere que existem outras protenas de ligao ao clcio envolvidas, como diferentes isoformas de sinaptotagminas ou protenas relacionadas (por exemplo, Doc2) (Jahn & Fasshauer, 2012).

3.4 Protenas Rab:

As protenas Rab pertencem a uma famlia de pequenas GTPases monomricas que participam no transporte de vesculas. Estas protenas foram inicialmente descobertas em levedura, onde foram identificadas como reguladoras de eventos de trfego intracelular. Em humanos, existem cerca de 60 protenas Rab diferentes, das quais a Rab3 a que se encontra - 15 -

directamente envolvida na exocitose regulada de neurotransmissores e hormonas (Li & Chin, 2003). Estas protenas tm um papel importante na especificidade do transporte vesicular. Tal como as SNAREs, cada uma possui uma distribuio caracterstica nas membranas celulares e esto presentes na superfcie citoslica de todos os organelos. A sua principal funo na exocitose sinptica passa pela regulao de vrios nveis do trfego vesicular, incluindo a mobilidade, o docking e a fuso das vesculas (Li & Chin, 2003). Muitas vesculas transportadoras s se formam se um tipo especfico de protena Rab e SNARE estiverem acopladas sua membrana, permitindo assim que a vescula se funda correctamente. O ciclo de hidrlise e ligao do GTP est directamente relacionado ao ancoramento vesicular. Como todas as outras GTPases, as protenas Rabs deslocam-se entre a membrana celular e o citosol. Mais especificamente, um enzima chamada GDI catalisa a troca de GDP, ligado ao Rab citoslico, por GTP, o que leva a alteraes conformacionais na Rab que permitem que ela se ligue a uma protena membranar da vescula de transporte. Aps fuso, o GTP ligado Rab , ento, hidrolisado, sofrendo novamente mudanas na sua conformao, sendo posteriormente libertado no citosol para que o ciclo se repita novamente. As diversas aces das Rab so mediadas pelos seus efectores, que normalmente interagem com a conformao activa destas protenas (ligadas ao GTP) A Rab3 tm, pelo menos, cinco potenciais efectores, dos quais os mais importantes so a rabfilina e a RIM (Li & Chin, 2003). A rabfilina uma protena associada s vesculas sinpticas, que participa nos processos exo-endocticos nas sinapses. No caso da RIM, esta protena est localizada nas zonas activas e liga-se especificamente Rab na sua forma activa, de modo a prevenir a hidrlise precoce. Esta multiplicidade nos efectores pode reflectir diferentes aces das Rabs em compartimentos de membrana distintos, bem como apoia a, j referida, coordenao de inmeras etapas do trfego vesicular por parte destas protenas. Alguns estudos sugerem ainda que as protenas Rab so necessrias para a assemblagem das v-SNARES e das t-SNARES e, consequente, formao do complexo SNARE (Morten Sogaard et al,1994).

3.5 O complexo exocisto:

Um dos componentes participantes da maquinaria geral de fuso o exocisto, um complexo necessrio para os passos finais da exocitose, quer constitutiva, quer regulada. A sua funo dirigir a vescula para domnios especficos da membrana plasmtica no passo inicial do docking, tambm designado por tethering, e localiza-se especificamente em zonas de fuso vesicular, sugerindo assim a sua importncia na definio das mesmas. O exocisto composto por oito protenas: Sec3p, Sec5p, Sec6p, Sec8p, Sec10p, Sec15p, Exo70p e Exo84p. Foi, ainda, primeiramente identificado em levedura e, a partir de estudos nesse mesmo organismo, sugeriu-se que o exocisto actua antes da formao do complexo SNARE e depois do Sec4p, um GTPase Rab que se encontra associado a vesculas secretoras e necessrio para a exocitose (Li & Chin, 2003).

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O complexo exocisto, no caso da levedura, apresenta o componente Sec15p a interagir directamente com a forma do Sec4p ligada a GTP, interaco esta que, juntamente com as interaces protena-protena no complexo, controla o docking inicial das vesculas secretoras s zonas de fuso (Li & Chin, 2003). Outros membros da famlia Rho de pequenos GTPases, como o Rho1, Rho3 e Cdc42 interagem tambm com os componentes Sec3p e Exo70p do exocisto, encontrando-se o primeiro associado membrana plasmtica. No mamfero, o exocisto interage com a sintaxina 1 neuronal pertencente s QSNAREs, o que sugere um possvel envolvimento do complexo na exocitose de vesculas sinpticas. atravs do componente Sec5p que se d a interaco com a forma da Ral ligada a GTP, um pequeno GTPase ausente na levedura. Esta protena apresenta duas isoformas, RalA e RalB, nas quais a primeira se encontra enriquecida no crebro e associada a vesculas sinpticas (Li & Chin, 2003). A interaco entre o exocisto e a Ral pode, tal como no caso da levedura, regular o recrutamento de vesculas sinpticas s zonas de fuso exocticas. O componente Exo70 aparenta, nos mamferos, ser o nico associado membrana plasmtica. Uma vez que no h um complexo semelhante ao exocisto que seja necessrio para outros passos do trfego membranar na via secretora, possvel concluir que o exocisto no um elemento fundamental da maquinaria bsica de fuso membranar, participando antes nos passos especializados que levam exocitose (Yun Kee et al, 1997). As protenas SNARE interagem com o complexo exocisto para facilitarem a fuso entre as membranas plasmtica e das vesculas.

Importncia do Ca2+ na regulao dos processos exo-endocticos:

Tem-se verificado a existncia de uma correlao entre os processos endocticos nas sinapses e as concentraes de clcio intracelular. No entanto, diferentes estudos tm revelado resultados distintos; ao passo que alguns autores apoiam o facto de o clcio no exercer um efeito directo nos processos endocticos (Ryan T. A. et al., 1996), existem evidncias que suportam o facto de o clcio ser essencial para iniciar a endocitose (Wu XS. & Wu LG., 2009), havendo ainda quem defenda a existncia de um efeito de retroaco negativa (Leitz J. & Kavalali T., 2011). O facto de terem sido feitos estudos em processos de endocitose em massa em vez de em processos endocticos individuais pode ser a causa da existncia de resultados to distintos. Com o intuito de perceber de que modo o clcio regula estes processos, foram realizados estudos utilizando uma sonda marcada com a molcula fluorescente, a pHluorina, sensvel a alteraes de pH, de modo a ser possvel monitorizar a recuperao de vesculas individuais ao longo do tempo (Leitz J. & Kavalali T., 2011), permitindo estudar a probabilidade de recuperao de vesiculas individuais em funo da concentrao de clcio. Os autores chegaram concluso de que o aumento das concentraes de clcio extracelular leva a uma diminuio da recuperao das vesculas, contribuindo para a permanncia das mesmas na superfcie da membrana sinptica. Este comportamento aponta para um efeito de retroaco negativa por parte do clcio, o que est de acordo com resultados obtidos por outros autores, - 17 -

que observaram uma diminuio da constante de tempo aps elevada estimulao (Wu W. et al., 2005). O efeito da concentrao de clcio foi estudado, tanto para baixos nveis de actividade sinptica, como para actividade elevada, tendo-se observado que, durante baixa actividade, o efeito regulatrio do clcio funciona de um modo negativo, diminuindo a taxa de recuperao das vesculas. O mesmo foi observado para elevada actividade, havendo uma diminuio gradual dos nveis de endocitose conforme a concentrao de clcio intracelular aumenta no terminal. Os autores questionaram-se ainda se esta diminuio de endocitose observada com o aumento das concentraes de clcio intracelular era significativa para as concentraes de clcio presentes em situaes fisiolgicas, em casos de maior intensidade de estimulao. Para isso, registaram as ondas obtidas por fluorescncia a partir de estimulaes sucessivas a frequncias de 1 Hz. Foi estimado que seria de esperar uma diminuio da endocitose em cerca de 15-40%. De facto para uma concentrao de clcio de 4 mM, valor inferior ao fisiolgico, foi observada uma diminuio da endocitose em cerca de 13-33%, sendo que a 8 mM de clcio extracelular foi observada uma diminuio do nvel de endocitose em cerca de 0,5%- 9% em relao ao anterior. Deste modo foi possvel concluir que ocorre realmente uma diminuio significativa da taxa de endocitose para concentraes de clcio fisiolgicas elevadas. Porm, a percentagem foi inferior esperada teoricamente, tendo-se observado ainda que a diminuio progressiva da taxa de endocitose com o aumento da concentrao de clcio tende para um valor inferior limite, o que leva a concluir que existe um valor limite mnimo para a taxa de recuperao das vesculas nas sinapses. A nvel exoctico e, sabendo que, em sinapses rpidas este processo requer elevada concentrao pr-sinptica de clcio, foram feitas diversas experincias, nomeadamente em neurnios bipolares da retina de peixe-dourado por Heidelberger et al., apercebendo-se estes que essa concentrao necessria teria que ultrapassar os 50 M para que as velocidades de secreo se igualassem s atingidas por despolarizao (Heidelberger et al., 1994). Ao mesmo tempo, na juno neuromuscular de lagostim, um aumento transiente na concentrao prsinptica de clcio at cerca de 75 M desencadeou uma neurosecreo de magnitude e cinticas semelhantes libertao faseada que acompanha um potencial de aco (Land & Zucker, 1994). A partir destas experincias foi demonstrada uma dependncia no linear da velocidade de secreo no nvel da concentrao pr-sinptica de clcio. Estes estudos sugerem ainda que, pelo menos, quatro ies Ca2+ se devem ligar com cooperatividade e afinidades positivas de 10-150 M a um complexo alvo para desencadear uma secreo rpida (Zucker R., 1996). Para alm do modelo anterior, existem ainda outras possibilidades, como a de Vogel et al. (1996), na qual a secreo acelerada pela activao dependente de Ca2+ de complexos de fuso vesicular, contidos nas vesculas. Em sinapses entre clulas nervosas observa-se um aumento na concentrao prsinptica de clcio durante os potenciais de aco, aumento este que se d nas chamadas zonas activas, onde ocorre o docking de vesculas na vizinhana de clusters de canais de Ca2+. A existncia destes microdomnios sugerida a partir de trs tipos de experincias, uma primeira atravs de simulaes da difuso de Ca2+ a partir dos referidos clusters na presena - 18 -

de um tampo lentamente difusvel, sendo atingidas concentraes de cerca de 150 M em zonas situadas entre conjuntos de canais de Ca2+, locais onde so ancoradas vesculas. Estas mesmas concluses foram igualmente obtidas por experincias em clulas ciladas do sculo de r, por medies da actividade dos canais de potssio activados por Ca2+ que se encontram simultaneamente localizados com os canais pr-sinpticos de Ca2+ (Roberts, 1994). Um outro tipo de experincia realizada foi a observao de domnios de Ca2+ em clulas ciladas da cclea de tartaruga (Tucker e Fettiplace, 1995) e nas sinapses gigantes da lula (Llins et al., 1995). Por ltimo, estudou-se tambm a secreo desencadeada pela entrada de Ca2+ por misturas de canais activados por alta voltagem de tipo N e P/Q, com a aco de bloqueadores especficos. Esta experincia levou concluso de que, a dependncia no linear da secreo induzida de clcio no nmero de canais abertos pode ser desencadeada por microdomnios de Ca2+ compostos por mltiplos canais em cluster. Uma questo interessante , ainda, a de como estes canais de Ca2+ se encontram organizados em relao s vesculas. De acordo com o modelo proposto por Meinrenken et al. (2002), as vesculas encontram-se possivelmente distribudas de forma aleatria nas zonas activas, enquanto que os canais de Ca2+ permanecem em cluster. Adicionalmente, a distncia de uma vescula ao cluster varia entre 30 a 300 nm (mdia ~ 100 nm), e vesculas com diferentes localizaes sero, no s expostas a diferentes transientes de Ca2+, como tambm apresentam diferentes probabilidades de libertao (de <0.01 a 1). Este modelo prev ainda que o nico passo na cascata de sinalizao cuja velocidade depende da concentrao de Ca2+, a ligao deste ao seu sensor, o que explica a razo para o facto do atraso sinptico, definido pelo tempo que decorre entre o potencial de aco e a libertao dos neurotransmissores, ser relativamente independente da concentrao de Ca2+, situao esta contrria dependncia apresentada pela magnitude da libertao. A velocidade com que o clcio desencadeia a libertao dos contedos das vesculas, inferior a 400 s, sugere que a ligao de Ca2+ ao respectivo sensor apenas induz a abertura do poro de fuso, no dando incio a uma cascata complexa de reaces. A probabilidade de abertura do poro de fuso depende da tenso e composio das membranas envolvidas, e portanto, qualquer alterao destes factores na membrana plasmtica ir afectar a libertao dos neurotransmissores (Sdhof T, 2004). Quando um potencial de aco invade um nervo terminal, o influxo de clcio induz a libertao de neurotransmissores com uma especificidade temporal excepcional. O principal problema entender o forte acoplamento entre o aumento do Ca2+ intracelular atravs da abertura dos canais de clcio pr-sinpticos aps a chegada de um potencial de aco, e a activao da maquinaria de fuso das vesculas sinpticas exocticas. A probabilidade de fuso aumenta drasticamente nos 200 secs que se seguem ao influxo de Ca2+, voltando a valores mais baixos no espao de 1 msec (George J. Augustine, 2001). De modo a assegurar a fidelidade temporal da transmisso sinptica, a libertao de neurotransmissores regulada por clcio extremamente rpida e precisa, o que a distingue de outros processos de trfego de membrana. Apesar de j terem sido descobertas algumas protenas envolvidas na exocitose (j descritas anteriormente neste artigo), muitos aspectos deste mecanismo e da sua regulao - 19 -

por parte do Ca2+ permanecem desconhecidos. As protenas pr-sinpticas SNARE, compostas pela sinaptobrevina, pela sintaxina e pela SNAP-25, so essenciais na transmisso sinptica. Estas formam um complexo cujo ncleo formado por quatro hlices , complexo este que interage com os sensores de clcio para promover a exocitose sinptica (Jahn et al., 2003). Desta forma, a identificao dos sensores de clcio crucial para o desvendar dos mecanismos que regulam a transmisso sinptica. A sinaptotagmina-1 , actualmente, uma das protenas melhor caracterizadas que actua como principal sensor de Ca2+ (Martens et. al, 2007). Mas afinal qual o papel exacto do clcio nas sinapses? Quando um potencial de aco chega a um terminal pr-sinptico, despolariza a membrana o suficiente para que ocorra a abertura dos canais de clcio dependentes de voltagem. O gradiente de clcio atravs da membrana tal que, quando os canais abrem, produzida uma corrente de clcio em direco ao interior da membrana, levando entrada deste io na clula. O clcio rapidamente ligado pela sinaptotagmina pr-sinptica (George J. Augustine, 2001). A activao desta protena d, ento, origem fuso das vesculas com a membrana pr-sinptica (Martens et. al, 2007) e consequente libertao de neurotransmissores. Esta libertao desencadeada pelo influxo de Ca2+ feita por canais de tipo P/Q ou N, enquanto que canais de Ca2+ de tipo R ou L raramente se envolvem. Uma vez que o clcio provoca a converso de um sinal elctrico (o potencial de aco) num qumico (a libertao de neurotransmissores), este pode ser considerado como o gatilho para a transduo electroqumica (o termo significa, literalmente, a converso de energia elctrica em informao qumica).

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Concluses:
Cada tipo de endocitose apresenta interaces entre protenas diferentes, capazes de se associar a domnios distintos dependendo da via endoctica. Para que a endocitose rpida e a lenta ocorram de maneira correcta necessria pelo menos a existncia de sinaptofisina e de calmodulina que ajudam a recrutar as protenas necessrias para estes processos e modular de modo eficaz os mesmos. A exocitose controlada e regulada por toda uma maquinaria celular proteica, sendo os seus componentes fundamentais as protenas SNARE, o ATPase NSF, a sinaptotagmina, as protenas Rab, o complexo exocisto entre muitos outros factores, como complexinas, VAP33 e as sinaptofisinas. O processo de kiss and run, que se trata numa primeira fase de uma exocitose at ao instante da fuso da vescula (kiss) e que rapidamente se torna numa endocitose no momento da fisso (run), processo activado durante uma estimulao rpida e/ou no caso da existncia de poucas vesculas carregadas, importante para manter a estrutura funcional dos terminais sinpticos recuperando vesculas que no se fundiram totalmente com a membrana. Altamente regulado, apresenta-se como uma forma eficaz e mais econmica de exocitose e endocitose havendo vantagens como poupana de recursos tanto de maquinaria proteica como de componentes vesiculares e tambm uma maior taxa de retorno de vesculas. Foi possvel concluir a existncia de um papel regulador por parte do clcio sobre os processos endocticos tendo-se verificado um efeito de retroaco negativa por parte do mesmo uma vez que observada uma diminuio da taxa de recuperao de vesculas com o aumento dos nveis de clcio intracelular. Nos processos exocticos observa-se uma dependncia no linear entre estes e as concentraes de clcio. Observou-se ainda a existncia de microdomnios onde se verifica um aumento da concentrao pr-sinptica de clcio. Relativamente probabilidade de fuso das vesculas, aps influxo de Ca2+ ocorre um aumento abrupto nos 200 s voltando a valores mais baixos passado 1 ms. A libertao de neurotransmissores, regulada por clcio, extremamente rpida e precisa, ao contrrio de muitos outros processos de trfego de membrana. Esta baixo tempo de resposta permite assegurar a fidelidade temporal da transmisso sinptica.

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