You are on page 1of 23

GUA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78
2002-08-28

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. GUA PARA LA PREPARACIN Y PRODUCCIN DE MEDIOS DE CULTIVO. GUA GENERAL PARA EL ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD PARA LA PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN EL LABORATORIO

E:

MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. GUIDELINES OF PREPARATION AND PRODUCTION OF CULTURE MEDIA- PART 1 GENERAL GUIDELINES ON QUALITY ASSURANCE FOR THE PREPARATION OF CULTURE MEDIA IN THE LABORATORY

CORRESPONDENCIA:

esta gua es una adopcin idntica (IDT) por traduccin de la ISO/TS 11133-1:2000 Microbiology of food and animal feeding stuffs-guidelines of preparation and production of culture media. Part 1. General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory. microbiologia de alimentos; anlisis microbiolgico; alimento para animales; alimento.

DESCRIPTORES:

I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. Tel. 6078888 Fax 2221435

Prohibida su reproduccin

Editada 2002-09-16

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. l ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La GTC 78, fue ratificada por el Consejo Directivo el 2002-08-27. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 000031 de Microbiologa.

ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. ALPINA S.A. ASINAL LTDA ASOCIACIN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGA AVESCO BAVARIA S.A. BIOCONTROL BIOQUILAB LTDA CENICAA COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. COOPERATIVA DE GANADEROS DE CARTAGENA LTDA. CREPES & WAFLES FRIGORFICO SUIZO S.A. GASEOSAS COLOMBIANAS S.A. INGENIO PROVIDENCIA S.A.

INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO INSTITUTO NACIONAL DE SALUD IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. LABORATORIO BIOCONTROL LESNIAK E.U LEVAPAN S.A. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. NULAB LTDA. PURIFICACIN Y ANLISIS DE FLUIDOS LTDA. QUIOS LTDA. TRES M. COLOMBIA S.A. UNIVERSIDAD JAVERIANA

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas: ALGARRA S.A. AQUALAB ALGARRA AQUALAB ASESORIAS MICROBIOLGICAS AVESCO CONSULTORA BEATRIZ DEL PILAR MACAS

CARULLA VIVERO S.A. CASA LUKER S.A. CERVECERA LEONA COLOMBINA S.A. COMPAA NACIONAL DE LEVADURAS LEVAPAN CONGELAGRO CONSULTORIAS MICROBIOLGICAS DISA S.A. EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOT FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY FRESENIUS MEDICAL CARE FRIGORIFICOS COLOMBIANOS S.A. FRIGORIFICOS SUIZO S.A. CONSULTOR NARDA PABN CONSULTOR MARIA CLEMENCIA MORA CONSULTOR ANA MARA MORALES INGENIO PICHICHI S.A. INGENIO PROVIDENCIA

INGENIO RIOPAILA INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS INVIMA LABORATORIO PROCALIDAD LABORATORIOS GRAM LLOREDA GRASAS S.A. MINISTERIO DE SALUD NESTLE DE COLOMBIA S.A. PANAMCO COLOMBIA MANANTIAL PASSIFLORA COLOMBIANA S.A. PRODUCTORA DE JUGOS S.A QUALA S.A. QUIOS LTDA. RICA RONDO TECNIMICRO LABORATORIO DE ANLISIS UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD PBLICA UNIVERSIDAD JORGE TADEO LOZANO VIKINGOS S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. GUA PARA LA PREPARACIN Y PRODUCCIN DE MEDIOS DE CULTIVO. GUA GENERAL PARA EL ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN LA PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN EL LABORATORIO

INTRODUCCIN En el laboratorio de microbiologa, muchos ensayos y procedimientos dependen de que los medios de cultivo sean homogneos y produzcan resultados reproducibles. Los medios de cultivo se usan con todas las tcnicas de cultivo tradicionales y tambin en muchas tcnicas alternas. En el comercio se pueden obtener muchas frmulas de medios de cultivo, y en la literatura se describen muchas ms, diseadas para fines de crecimiento especfico. Adems, en los laboratorios donde se hacen exmenes microbiolgicos de alimentos, el objetivo principal es mantener, resucitar, hacer crecer, detectar y/o enumerar una gran variedad de microorganismos. Los requisitos del medio son especficos tanto para la muestra como para los organismos que se detectarn. Los medios de cultivo que cumplan criterios establecidos de desempeo son, por lo tanto, un requisito previo de cualquier trabajo microbiolgico confiable. Es aconsejable hacer suficientes ensayos para demostrar: i) la aceptabilidad de cada lote del medio; y ii) que el medio es adecuado para el fin; y iii) que el medio pueda producir resultados consistentes. Estos tres criterios son parte esencial de los procedimientos de control interno de calidad y, con la documentacin adecuada, permitirn una vigilancia efectiva del medio de cultivo y contribuirn a la produccin de datos tanto precisos. 1. OBJETO

Esta gua proporciona la terminologa general relacionada con el aseguramiento de la calidad en la preparacin de medios de cultivo, y especifica los requisitos mnimos para un anlisis microbiolgico de productos destinados al consumo humano o de alimento para animales. Estos requisitos se aplican a tres categoras de medios de cultivo usados en los laboratorios donde se preparan o se usan medios de cultivo para anlisis microbiolgicos:

medios fabricados comercialmente y listos para usar; medio preparado a partir de frmulas deshidratadas disponibles comercialmente (bien sea un medio completo para recuento en placa como por ejemplo agar Plate Count o un medio basal al cual se le agregan suplementos como por ejemplo agar Baird-Parker); y 1

GUIA TCNICA COLOMBIANA


2.

GTC 78

medio preparado por componentes individuales.

REFERENCIAS NORMATIVAS

Esta gua incorpora, con referencias fechadas o no fechadas, disposiciones provenientes de otras publicaciones. Tales referencias normativas se citan en los lugares adecuados del texto y las publicaciones aparecen a continuacin. En el caso de referencias fechadas, solamente se harn correcciones o revisiones a esta gua cuando se corrijan o revisen dichas referencias. Para referencias no fechadas se aplica la ltima edicin de la publicacin de referencia. EN 1659:1996, In Vitro Diagnostics Sistems. Culture Media for Microbiology. Terms and Definitions. EN 12322:1999, In Vitro Diagnostics Medical Devices. Culture Media for Microbiology. Performance Criteria for Culture Media. ISO 8402:1994, Quality Management and Quality Assurance-Vocabulary 3. 3.1 TERMINOLOGA GENERALIDADES

Esta seccin contiene las definiciones generales relacionadas con aseguramiento de la calidad, as como diferentes grupos de terminologa relacionada con medios de cultivo y cultivos de control (cepas de referencia). Las normas citadas entre parntesis indican que el texto es idntico al citado. 3.2 TERMINOLOGA DE ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

3.2.1 aseguramiento de la calidad todas las actividades, programadas y sistemticas, implementadas como parte del sistema de calidad, las cuales demuestran segn necesidades, la suficiente confianza en que esa entidad cumplir los requisitos de calidad. [ISO 8402] 3.2.1.1 parte de la gestin de la calidad orientada a proporcionar confianza respecto al cumplimiento de los requisitos de la calidad. 3.2.2 control de calidad tcnicas y actividades operativas que se usan para cumplir los requisitos de calidad. [ISO 8402]. 3.2.3 control interno de la calidad programa continuo del control del trabajo del laboratorio, preparado por el mismo y basado en el anlisis y seguimiento del control y, si fuera necesario, acciones correctivas. 2

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78

3.2.4 lote de medio de cultivo unidad de un medio susceptible de investigacin hasta sus orgenes, relacionada con una cantidad definida de producto en bruto, producto terminado o final, la cual tiene una clase y calidad homognea y ha satisfecho los requisitos de produccin (control del proceso) y los ensayos de aseguramiento de la calidad, se ha producido dentro de un perodo de produccin definido y se le ha asignado el mismo nmero. [EN 12322] 3.2.5 desempeo del medio de cultivo la respuesta de un medio de cultivo a los organismos de ensayo, en condiciones definidas. 3.3 TERMINOLOGA DEL MEDIO DE CULTIVO

3.3.1 medio de cultivo frmula de sustancias, en forma lquida, semislida o slida, formada por constituyentes naturales y/o sintticos, diseados para resistir la multiplicacin o preservar la viabilidad de los microorganismos.
NOTA Cuando este trmino se usa en relacin con palabras compuestas, con frecuencia se expresa como medio (por ejemplo, medio enriquecido).

[EN 1659] 3.3.2 medio de cultivo clasificado por composicin 3.3.2.1 medio de cultivo definido qumicamente medio de cultivo formado nicamente por constituyentes definidos qumicamente (por ejemplo, estructura molecular y grado de pureza conocidos). [EN 1659] 3.3.2.2 medio de cultivo qumicamente incompleto medio de cultivo formado total o parcialmente por materiales naturales, procesados, o de otra forma, cuya composicin qumica no est totalmente definida.
NOTA Para los distintos componentes qumicamente indefinidos que se usan en los medios de cultivo, ISO/TC34/SC9 especifica designaciones armnicas Vase el Anexo A.

3.3.3 clasificacin del medio de cultivo segn la consistencia 3.3.3.1 medio de cultivo lquido medio de cultivo formado por una solucin acuosa con uno o varios constituyentes (por ejemplo, agua peptonada, caldo nutritivo).

GUIA TCNICA COLOMBIANA


NOTA 1 NOTA 2

GTC 78

En algunos casos se agregan partculas slidas al medio de cultivo lquido. El medio lquido en tubos, frascos o botellas se conoce, frecuentemente, como caldo.

[EN 1659] 3.3.3.2 medio de cultivo slido y semislido medio de cultivo lquido, el cual contiene materiales solidificantes (por ejemplo, agar-agar, gelatina, etc.) en diferentes concentraciones.
NOTA 1 Debido al uso mundial de medios de cultivo solidificados con agar-agar, con frecuencia se usa el trmino agar como sinnimo de medio de cultivo slido y, por lo tanto, en relacin con adjetivos, por ejemplo: agar para recuento en placa. NOTA 2 Con frecuencia, los medios de cultivo slidos, vertidos en cajas petri, se denominan comnmente placas. Adems, los medios de cultivo slidos, vertidos en tubos que permanecen en posicin inclinada mientras se solidifica el medio, se conocen como inclinados.

[EN 1659] 3.3.4 clasificacin segn su uso 3.3.4.1 medio de transporte medio de cultivo diseado para preservar y mantener la viabilidad de microorganismos durante el perodo entre la toma de la muestra y su procesamiento en el laboratorio. [EN 1659]
NOTA Usualmente, el medio de transporte contiene sustancias que no permiten la multiplicacin de microorganismos pero aseguran su preservacin (por ejemplo, medio de transporte Stuart o Amies).

3.3.4.2 medio de preservacin medio de cultivo desarrollado para la preservacin y el mantenimiento de microorganismos durante largos periodos de tiempo, que permite la recuperacin despus de este perodo (por ejemplo, medio de huevo Dorset). 3.3.4.3 medio de resucitacin medio de cultivo que permite a microorganismos estresados y lesionados repararse y recuperar su capacidad de crecimiento normal sin promover necesariamente su multiplicacin. [EN 1659] 3.3.4.4 medio de enriquecimiento medio de cultivo predominantemente lquido, el cual debido a su composicin, proporciona condiciones particularmente favorables para la multiplicacin de los microorganismos. [EN 1659]

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78

3.3.4.4.1 medio de enriquecimiento selectivo medio que promueve el crecimiento de microorganismos especficos, al tiempo que inhibe, total o parcialmente, el crecimiento de otros microorganismos (por ejemplo, medio RappaportVassiliadis). 3.3.4.4.2 medio de enriquecimiento no selectivo medio enriquecido, el cual promueve el crecimiento de la mayora de los microorganismos (por ejemplo, caldo nutritivo). 3.3.4.5 medio de aislamiento medio de cultivo slido o semislido, el cual promueve el crecimiento de microorganismos. 3.3.4.5.1 medio de aislamiento selectivo medio que promueve el crecimiento de microorganismos especficos, al tiempo que inhibe otros microorganismos (por ejemplo, agar PALCAM, agar MacConkey). [EN 1659] 3.3.4.5.2 medio de aislamiento no selectivo medio que no est diseado para inhibir selectivamente microorganismos (por ejemplo, agar nutritivo). [EN 1659] 3.3.4.6 medio diferencial medio de cultivo que permite el ensayo de una o varias caractersticas fisiolgicas o bioqumicas de los microorganismos para su identificacin (por ejemplo, medio de urea, agar Kligler).
NOTA Los medios diferenciales que se pueden usar como medio de aislamiento, se conocen como medio de aislamiento o diferencial (por ejemplo, agar xilosa-lisisna-desoxicolato XLD).

[EN 1659] 3.3.4.7 medio de identificacin medio de cultivo diseado para producir una reaccin especfica de identificacin, que no requiere ningn ensayo adicional para confirmacin.
NOTA El medio de identificacin que se puede usar como medio de aislamiento se conoce como medio de aislamiento o identificacin.

[EN 1659] 3.3.4.8 medio de mltiples usos medios de cultivo a los cuales se les puede asignar distintas categoras; Ej.: el agar sangre es un medio de resucitacin, de acuerdo con el numeral 3.3.4.3; un medio de aislamiento, de 5

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78

acuerdo con el numeral 3.3.4.5; y un medio diferencial, de acuerdo con el numeral 3.3.4.6, el cual se usa para detectar hemlisis. 3.3.5 clasificacin del medio de cultivo segn el mtodo de preparacin 3.3.5.1 medio listo para usar medio de cultivo suministrado en recipientes listos para usar (por ejemplo, cajas Petri o tubos u otros recipientes):

un medio completo listo para usar; un medio incompleto al cual se agregan componentes hbiles al momento de usarlo.

3.3.5.2 medio de cultivo preparado con frmulas comerciales deshidratadas medio de cultivo seco que no est listo para usar inmediatamente (por ejemplo, en polvo, granulado, productos liofilizados). La rehidratacin dar una de dos clases de medio:

Medio completo listo para usar; Medio incompleto al cual se agregan componentes hbiles al momento de usarlo.

3.3.5.3 medio de cultivo preparado en el laboratorio con componentes individuales 3.4 TERMINOLOGA PARA LOS ORGANISMOS DE ENSAYO

3.4.1 generalidades se trata de microorganismos utilizados, generalmente, para control de calidad y ensayo del comportamiento del medio de cultivo. Se definen de acuerdo con su fuente, as: 3.4.2 cepa de referencia microorganismo definido, por lo menos, en cuanto a gnero y especie, catalogado y descrito de acuerdo con sus caractersticas y, preferiblemente; con la indicacin de su origen. [EN 12322] 3.4.3 cepa madre un conjunto de cultivos separados e idnticos, obtenidos en el laboratorio a partir de un solo subcultivo de la cepa de referencia, bien sea en el laboratorio o de un proveedor. [EN 12322]

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78

3.4.4 cultivo de trabajo un subcultivo primario de un stock de la cepa de referencia (3.4.3) 4. 4.1 PRCTICAS PARA EL CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO DOCUMENTACIN

4.1.1 Documentacin requerida del fabricante Se recomienda que el fabricante suministre los siguientes detalles:

nombre del medio, componentes individuales y cualquier suplemento, as como sus cdigos de producto; cdigos del lote; valor pH del medio antes de usarlo; informacin de almacenamiento y fecha de vencimiento; cualquier ensayo de evaluacin de comportamiento y el organismo de ensayo utilizado; hoja de datos tcnicos; certificado de control de calidad; datos de seguridad y/o riesgos, cuando sea necesario.

4.1.2 Lista de verificacin del laboratorio Verificaciones del laboratorio al recibir el medio:

4.2

nombre del medio y cdigo del lote; fecha de recibo; fecha de vencimiento; condicin e integridad del envase.

ALMACENAMIENTO

4.2.1 Generalidades En todos los casos, se recomienda seguir las instrucciones del fabricante, cuando estn disponibles, relacionadas con las condiciones de almacenamiento, fecha de vencimiento y uso. 7

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78

4.2.2 Gestin y control de calidad de medios deshidratados y suplementos Usualmente, el medio se compra al fabricante. Se entregan en forma de polvo deshidratado o grnulos, en recipientes sellados, los suplementos de las distintas sustancias selectivas o de diagnstico vienen en forma liofilizada o lquida. Sin embargo, es aconsejable programar la compra para que haya una rotacin regular de existencias (por ejemplo, lo primero que entra es lo primero que sale). Para mantener un inventario eficiente, se aconseja que las verificaciones adicionales incluyan:

nueva verificacin del sello; fecha cuando se abri inicialmente; evaluacin visual del contenido de los envases abiertos.

Especialmente, despus de abrir un envase nuevo, la calidad del medio depender del ambiente del almacenamiento. El cambio en el flujo del polvo, la falta de homogeneidad, apelmazamiento, el cambio de color, etc., indican prdida de calidad del medio deshidratado. Es aconsejable desechar cualquier medio deshidratado que haya absorbido humedad o muestre cambios obvios de su apariencia fsica. 4.2.3 Medio suministrado comercialmente y listo para usar Se siguen las instrucciones del fabricante con respecto de las condiciones de almacenamiento, la fecha de vencimiento y el uso. 4.2.4 Medio preparado con frmulas deshidratadas, disponibles comercialmente, y componentes bsicos individuales La vida til de esta clase de medios es variable. Por lo tanto, es difcil indicar los lmites generales de tiempos de almacenamiento de los medios preparados. Las normas internacionales o nacionales especficas pueden estipular las condiciones de la vida til. Se aconseja proteger los medios de cultivo esterilizados, dispensados en cajas, tubos o frascos y los reactivos que no se usen inmediatamente, contra la luz y la desecacin. Es aconsejable mantener en un refrigerador no ms de 3 meses, o a temperatura ambiente no ms de 1 mes, en condiciones que eviten modificaciones en su composicin, los medios estriles, parcialmente completos, como, por ejemplo, los medios a los cuales se agregan los componentes finales inmediatamente antes de usarlos; excepto si se ha establecido una fecha de vencimiento, o si la norma nacional o internacional lo especifica. Sin embargo, se recomienda que los medios a los cuales se han agregado suplementos lbiles selectivos, se usen el mismo da que se preparan. Se recomienda no guardar los medios slidos que contengan reactivos qumicos y/o substancias lbiles, para volverlos a fundir. Es recomendable que no se usen los lotes de medios que presenten caractersticas como cambios de color, signos de evaporacin, deshidratacin, o crecimiento microbiano, Se recomienda que, antes de usar o antes de calentar adicionalmente, se equilibre el medio de cultivo a la temperatura ambiente.

GUIA TCNICA COLOMBIANA


4.3

GTC 78

PREPARACIN DEL MEDIO EN EL LABORATORIO

4.3.1 Generalidades La preparacin exacta del medio de cultivo es uno de los pasos fundamentales del examen microbiolgico con el cual se recomienda especial cuidado. Se respetarn las buenas prcticas de laboratorio y se seguirn las instrucciones del fabricante para el manejo de medios deshidratados y otros componentes, particularmente aquellos que contengan materiales peligrosos como, por ejemplo, sales biliares y otros agentes selectivos. Cuando se prepare el medio con formulaciones comerciales deshidratadas, se recomienda seguir las instrucciones del fabricante en forma precisa. Se recomienda documentar todos los datos relevantescomo, por ejemplo, peso/volumen, pH, fecha de preparacin, condiciones de esterilizacin, operario. Cuando se trate de medios preparados con componentes individuales, se recomienda seguir exactamente la frmula y registrar todos los detalles, como se indica en el numeral 4.2.1, adems de la identificacin completa como, por ejemplo, cdigo y nmero de lote de todos los componentes que se usen. 4.3.2 Agua Se recomienda usar agua destilada o agua de calidad equivalente, es decir, libre de substancias que pudieran inhibir o influenciar el crecimiento de microorganismos en las condiciones del ensayo. Si el agua destilada se prepara con agua clorada, se recomienda neutralizar el cloro antes de destilarla. Se aconseja guardar el agua destilada en recipientes fabricados, preferiblemente, con materiales inertes (vidrio neutro, polietileno, etc.), y del cual se debe demostrar, antes de su uso inicial, que est libre de cualquier sustancia inhibitoria.
NOTA En algunos casos puede ser necesario usar agua recin preparada, libre de dixido de carbono disuelto.

Para considerar que el agua destilada es de buena calidad, es aconsejable que sta tenga una resistividad no inferior a 300 000 cm. PRECAUCIN El agua procesada por intercambio de iones (desionizada) puede tener un alto contenido de microorganismos; por lo tanto, no es aconsejable usar esta agua sin verificar que el contenido de microorganismos en el agua sea bajo. Se recomienda consultar con el fabricante la mejor manera de reducir al mnimo la contaminacin microbiana. El agua desionizada esterilizada por filtrado todava puede contener sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos microorganismos. Ref. ACTM aguas para laboratorio. 4.3.3 Pesaje y rehidratacin Se pesa cuidadosamente la cantidad adecuada de medio deshidratado (teniendo cuidado de no inhalar el polvo, especialmente cuando el medio contiene substancias txicas) y se agrega progresivamente la cantidad necesaria de agua, evitando que se formen grumos.

GUIA TCNICA COLOMBIANA


4.3.4 Disolucin y dispersin

GTC 78

Se aconseja disolver el medio deshidratado rpidamente mezclando instantnea y repetidamente con calentamiento posterior, si fuera necesario. El medio que contiene agar se debe dejar hidratar antes de calentar y luego mezclar para disolverlo. Cuando el medio se prepare con componentes individuales, es aconsejable agregar cada componente por separado y dejar disolver antes de completar el volumen definitivo. 4.3.5 Medida y ajuste del pH Se mide el pH con un medidor de pH y se ajusta, si es necesario: por ejemplo, cuando el medio se prepara en el laboratorio con componentes individuales para que, despus de esterilizar y enfriar a 25 C el medio tenga el pH requerido 0,2 unidades de pH, excepto si se requiere otra cosa. Normalmente, el ajuste se hace con una solucin de aproximadamente 40 g/l (cerca de 1 mol/l) de Hidrxido de sodio (NaOH) o aproximadamente 36,5 g/l (cerca de 1 mol/l) de cido clorhdrico (HCl).
NOTA Los medios fabricados comercialmente pueden presentar cambios significativos de pH, antes y despus de pasarlos por el autoclave. Sin embargo, siempre y cuando se use agua destilada o desionizada, de buena calidad, no deber ser necesario ajustar el pH antes de pasar por el autoclave.

4.3.6 Vertido Se vierte el medio en los recipientes adecuados con un volumen 1, 2 a 3 veces superior al del medio. 4.3.7 Esterilizacin 4.3.7.1 Generalidades Se puede esterilizar el medio de cultivo y los reactivos por calor hmedo (vase el numeral 4.3.7.2), o se puede esterilizar por filtracin (vase el numeral 4.3.7.3 ). Para ciertos medios no es necesario esterilizar en autoclave, sino que se pueden usar despus de hervirlos. Por ejemplo, los medios para Enterobacteriaceae que contienen verde brillante son particularmente sensibles al calor y a la luz, es aconsejable enfriarlos rpidamente despus de hervirlos y protegerlos de la luz fuerte. Adems, algunos reactivos se pueden usar sin esterilizar (vase la respectiva norma nacional, internacional o las instrucciones del fabricante). 4.3.7.2 Esterilizacin por calor hmedo La esterilizacin por calor hmedo se hace en un autoclave o preparador de medio. La operacin en el autoclave demora, generalmente, 15 min a 121 C. Cuando los volmenes son superiores a 1 000 ml, se adapta el ciclo de esterilizacin como sea necesario. En todos los casos se recomienda seguir las instrucciones contenidas en la norma internacional, nacional o las instrucciones del fabricante. Se recomienda monitorear el comportamiento del autoclave para asegurar que se alcanza la temperatura deseada en condiciones tpicas de carga. Se recomienda, para tal fin, el uso de cinta indicadora y termocuplas.
NOTA Se puede presentar exceso de calentamiento cuando se procesan grandes volmenes de medio (>1 000 ml) en un autoclave.

Es esencial controlar la eficacia de la esterilizacin.

10

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78

Despus de calentar, es esencial enfriar el medio de manera que se evite el exceso de ebullicin. Esto es importante con medios sensibles, como, por ejemplo, volmenes medios, grandes y medio para Enterobacteriaceae. 4.3.7.3 Esterilizacin por filtracin Se puede esterilizar por filtracin en condiciones de vaco o a presin. Se usan membranas y los elementos del filtro estriles con un dimetro de poro de 0,22 m. Se siguen las instrucciones del fabricante con respecto al uso de los elementos del filtro o a las membranas compradas ya esterilizadas. Las distintas partes del aparato de filtrado, ensambladas o no, se esterilizan en el autoclave durante 15 min a 121 C. Si es necesario, se pueden ensamblar en forma asptica en una cmara de flujo laminar, despus de esterilizar en el autoclave.
NOTA Algunas membranas de filtro pueden retener protenas (por ejemplo antibiticos). Para obtener la concentracin correcta, se recomienda que el usuario humedezca previamente el filtro.

4.3.7.4 Monitoreo Despus de esterilizar, por autoclave, hirviendo o filtrando, se recomienda monitorear todos los medios, en particular con respecto al pH, el color, la esterilidad y la consistencia. 4.3.8 Preparacin de suplementos Se recomienda manejar con cuidado los suplementos fabricados que contienen agentes txicos, para evitar la dispersin del polvo, el cual puede causar reacciones alrgicas u otra clase de reacciones al personal del laboratorio. Se recomienda tomar las precauciones necesarias y seguir las instrucciones del fabricante. No es aconsejable usarlos cuando haya vencido su vida til, la cual, para antibiticos, generalmente es el mismo da. Las soluciones antibiticas se pueden guardar, en algunas circunstancias, congeladas en alcuotas convenientes pero no se es aconsejable volver a congelar despus de descongelar. Es recomendable que el usuario consulte con el fabricante la posible prdida de actividad por congelamiento o que la pruebe l mismo. 4.4 4.4.1 PREPARACIN PARA USO Fundido del medio de cultivo agar

Se funde el medio de cultivo colocndolo en un bao de agua hirviendo, o con otro proceso cuyos resultados sean idnticos (por ejemplo, flujo de vapor por el autoclave). Se recomienda volver a calentar en el menor tiempo posible los medios que se han pasado previamente por el autoclave, para mantener la calidad del medio. Se aconseja evitar que el medio se caliente demasiado, y retirar cuando se ha fundido. Se enfra el medio fundido hasta 47 C 2 C en un bao de agua controlado con termostato, hasta cuando se use. El tiempo necesario para alcanzar 47 C depende de la clase de medio, el volumen y la cantidad de unidades en el bao de agua. Se aconseja usar el medio fundido tan pronto como sea posible, pero se recomienda que no se guarde ms de 4 horas. Nunca es recomendable usar un medio de cultivo a una temperatura superior a los 50 C. 4.4.2 Desaireacin del medio de cultivo Si es necesario, inmediatamente antes de usar, se calienta el medio de cultivo en agua caliente o bajo flujo de vapor, durante 15 min, con la tapa floja; despus de calentar, se cierra bien la tapa y se enfra el medio rpidamente a la temperatura de operacin.

11

GUIA TCNICA COLOMBIANA


4.4.3 Adicin de suplementos

GTC 78

Los suplementos termolbiles agregan al medio despus de enfriarlo a 47 C 2 C. Los suplementos refrigerados estriles pueden hacer que el agar se gelatinice o forme hojuelas transparentes, por lo tanto se permite que el suplemento estril llegue a la temperatura ambiente antes de agregarlo al medio. Se mezclan bien y suavemente todos los suplementos con el medio, luego se distribuyen en los recipientes tan pronto como sea posible. 4.4.4 Preparacin y almacenamiento de los medios en cajas Petri Se vierte el medio de cultivo en cajas Petri hasta obtener un espesor no inferior a 2 mm (por ejemplo, en cajas de 90 mm se requieren normalmente 15 ml). Se deja enfriar y solidificar el agar colocando las cajas Petri, tapadas, en una superficie horizontal fra.
NOTA Durante la incubacin el medio agar perder humedad. Una prdida de ms de 15 % del contenido de agua puede afectar adversamente el crecimiento de microorganismos, en algunas circunstancias. Los factores que influyen en la prdida de agua son: la composicin del medio, la cantidad de medio en los platos, la clase de incubadora, por ejemplo, con ventilador o de otra clase, la humedad de la atmsfera en la incubadora, la posicin y la cantidad de cajas en la incubadora y la temperatura de la incubadora.

Se usa el medio solidificado inmediatamente, o se guarda en condiciones que eviten modificaciones en su composicin, por ejemplo, en un sitio oscuro y/o en el refrigerador de 4 C a 12 C, en bolsas cerradas, durante una semana como mximo, o como indique el fabricante o la norma especfica. Se rotulan las cajas en la base, con la fecha de preparacin y/o la fecha de vencimiento y la identificacin. Se pueden usar cdigos que cumplan este requisito. La vida til de las cajas llenas, aumentar si se guardan en bolsas plsticas selladas. Para evitar que se presenten condensados, las cajas deben estar fras antes de colocarlas en las bolsas. No es aconsejable secar la superficie de las cajas de agar antes de guardarlas en fro. En general, para inocular un medio de cultivo slido, se secan las cajas, preferiblemente retirando las tapas y con la superficie del agar hacia abajo, en un horno a temperatura entre 25 C y 50 C, o en un gabinete de flujo laminar, hasta que desaparezcan las goticas de la superficie del medio. se aconseja no secar demasiado. Se recomienda guardar y usar las cajas de agar listas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 4.4.5 Incubacin Se recomienda no apilar las cajas en pilas de ms de 6 y dejar espacio para que circule el aire y se equilibre la temperatura de incubacin tan rpido como sea posible. Cuando el medio sea lquido, el tiempo necesario para alcanzar la temperatura de incubacin depende de varios factores, como, por ejemplo, el volumen, la carga, el recipiente, la clase de incubadora. Cuando se usen jarras anaerbicas puede ser necesario apilar ms de 6 cajas. 4.5 ELIMINACIN DEL MEDIO

Se recomienda eliminar tanto los medios contaminados como los que no se hayan utilizado en forma segura, de acuerdo con las regulaciones locales o nacionales. 5. 5.1 CONTROL DE CALIDAD DEL PRODUCTO TERMINADO CONTROL DE CALIDAD FSICO - QUMICO

Es aconsejable que los ensayos de laboratorio incluyan lo siguiente, como mnimo: 12

GUIA TCNICA COLOMBIANA


-

GTC 78

valor pH medido entre 20 C y 25 C;

y mediante observacin:

5.2

cantidad con la que se llen y/o espesor de la capa; color; claridad/presencia de artefactos pticos; estabilidad / consistencia/humedad del gel.

CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLGICO

5.2.1 Esterilidad Es aconsejable que se pruebe la esterilidad de una cantidad adecuada de cada lote. 5.2.2 Organismos de ensayo Se recomienda que el conjunto de organismos de ensayo contenga slo microorganismos de caractersticas estables, representativos de su especie, los cuales son confiables para demostrar el comportamiento ptimo de un medio preparado en un laboratorio en particular. Se recomienda que los organismos de ensayo contengan, primordialmente, cepas disponibles en las colecciones de cepas de control, pero tambin se pueden incluir cepas bien caracterizadas, aisladas por el laboratorio. Es aconsejable que el laboratorio examine y registre las caractersticas relevantes del cultivo en existencia, y se renueve la cepa si se presentaran caractersticas atpicas. Es preferible usar cepas que se han originado en alimentos, aunque no todas las colecciones de cultivos suministran esos datos sobre su origen. Los organismos de ensayo de cada medio pueden incluir: cepas positivas robustas, con caractersticas tpicas;

cepas positivas de crecimiento dbil (por ejemplo, de naturaleza ms sensible); cepas bioqumicas no reactivas, por ejemplo, aquellas con diferente fermentacin o reacciones a la fluorescencia; cepas totalmente inhibidas.

NOTA El Equipo de Trabajo en Medios de Cultivo del Comit Internacional para la Microbiologa de Alimentos (WPCM) prescribi una coleccin vlida de cepas de ensayo para evaluacin de medios (1).

5.2.3 Medios y reactivos listos para usar Los fabricantes de medios disponibles en el comercio y listos para usar, especialmente los aprobados bajo las normas ISO 9001, tendrn un programa de calidad y podrn usar el certificado de calidad para los medios que suministran. En esas condiciones el usuario no tendr que hacer ensayos extensos con tales medios, sino que deber asegurar que se mantienen las condiciones de almacenamiento. 13

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78

5.2.4 Medios preparados con formulaciones deshidratadas disponibles en el comercio Para los fines de esta parte de la gua , los ensayos cualitativos de cada lote son un requisito mnimo pero, si se hacen exmenes cuantitativos de muestras, estos darn mayor seguridad en cuanto a la calidad del medio. Para los medios que tienen indicadores o agentes selectivos, es adecuado usar una sola sepa positiva de ensayo. Con los medios que no contienen indicadores o agentes selectivos, es aconsejable utilizar cepas que demuestran la funcin del o de los indicadores y su selectividad. Con los medios complejos, como, por ejemplo, medios con suplementos agregados, es aconsejable verificar, en cada lote, las cepas con las caractersticas indicadas en el numeral 5.2.2, Cuando se trate de medios listos para usar, a los cuales se han agregado suplementos preparados en el laboratorio, es aconsejable proceder de la misma manera. 5.2.5 Medios preparados con componentes bsicos individuales Se recomienda que adems de los ensayos cualitativos descritos en el numeral 5.2.4 se hagan algunos ensayos cuantitativos, usando tcnicas como la tcnica modificada, Miles & Misra (1), o placa en espiral con el fin de monitorear las tendencias de la calidad de los materiales bsicos, la productividad del medio y los protocolos de produccin del laboratorio.
NOTA Estas son pautas mnimas, en la prctica, los alimentos pueden contener microorganismos estresados. Se recomienda tener en cuenta la idoneidad del medio, con respecto a la recuperacin de clulas estresadas. Para informacin sobre preservacin, tcnicas de mantenimiento y colecciones de cepas de control, ver el Anexo B.

14

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78
ANEXO A (Informativo)

DESIGNACIN DE LOS COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO EN LAS NORMAS SOBRE ANLISIS MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES

A.1

GENERALIDADES

Con el fin de armonizar la descripcin de los distintos componentes de los medios de cultivo de los mtodos microbiolgicos normales, la norma ISO/TC 34/SC 9 Alimentos y productos agrcolas Microbiologa, design las categoras de los componentes relacionados en las secciones A2 hasta A5. A.2 PEPTONAS digestin enzimtica de caseina2); digestin enzimtica de frjol de soya; digestin enzimtica de tejidos animales3) digestin enzimtica de la gelatina; digestin enzimtica de tejidos de plantas y animales:

A.3

EXTRACTOS

A.4 AGAR

extracto de carne; extracto de cerebro-corazn; extracto de levadura; bilis de buey para bacteriologa; sales biliares;

agar bacteriolgico;

2)

Incluye la digestin pptica y trptica de casena. Incluye peptona de carne, digestin peptnica de carne, digestin pancretica de carne

3)

15

GUIA TCNICA COLOMBIANA


A.5 OTROS -

GTC 78

emulsin de yema de huevo; leche en polvo descremada; hidrolizado de casena.

16

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78
ANEXO B (Informativo)

PAUTAS PARA LA PRESERVACIN Y MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS DE CONTROL

B.1

GENERALIDADES

Se dispone de varios mtodos, por ejemplo, liofilizacin, almacenamiento en perlas a -70 C, o el uso de nitrgeno lquido para preservar y mantener con xito todos los microorganismos relevantes para la microbiologa de los alimentos. Es posible que un mtodo no sea adecuado para todas las cepas. Estas pautas se presentan en la figura B.1. B.2 CEPAS DE REFERENCIA DE FUENTES COMERCIALES

Si se compran cepas de referencia de colecciones de referencia o a proveedores aprobados por las normas ISO 9001 y se guardan en sus recipientes originales, se recomienda seguir las instrucciones del fabricante para su cultivo y uso. B.3 CEPA MADRE LABORATORIO EXISTENCIAS DE REFERENCIA PREPARADAS EN EL

Se recomienda mantener y manejar la existencia de cultivos de cepas de referencia (B2) para fines de control de calidad y ensayos de tal manera que se reduzca al mnimo la posibilidad de contaminacin cruzada, mutacin o alteracin de las caractersticas tpicas. Se aconseja guardar la existencia de cepas madre en mltiples alcuotas y ultra congelar (-70 C) o liofilizar. Es aconsejable documentar perfectamente las caractersticas de crecimiento de cada medio en el cual se usarn como organismos de ensayo. B.4 CULTIVOS DE TRABAJO

Los cultivos de trabajo se preparan con cepas madre, ultracongeladas congeladas (B3). Se recomienda manejar las alcuotas de tal manera que se evite la posible contaminacin cruzada de las cepas madre y/o su deterioro. Se recomienda preparar los cultivos de trabajo volviendo a suspender una alcuota de la existencia de referencia en un medio de crecimiento no selectivo e incubndolo para que produzca una fase de cultivo estacionaria. Se recomienda seguir rigurosamente las instrucciones del fabricante cuando se trate de sistemas comerciales para preservacin.
NOTA Se recomienda no hacer sub-cultivos de cultivos de trabajo. Sin embargo, se pueden usar los cultivos de trabajo ms de una vez, siempre y cuando se manejen y se guarden, no ms de una semana, adecuadamente, para evitar, por ejemplo, contaminacin cruzada y/o deterioro..

17

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78

Cepa de referencia

Obtenido a partir de una coleccin de cultivos de referencia liofilizados y a vacio. Microorganismo definido por lo menos a nivel de gnero y especie, catalogado y descrito de acuerdo con sus caractersticas y, preferiblemente; indicando su origen

Cepa madre

Serie de alicuotas de cultivos idnticos obtenidos en el laboratorio a partir de solo subcultivo de la cepa de referencia

Cultivo de trabajo

Un subcultivo primario de un stock de la cepa de referencia

Figura B.1

18

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78
ANEXO C (Informativo)

Aseguramiento de la Calidad de los medios de cultivo solucin de problemas Anormal Agar con defecto de solidificacin Razn posible Sobrecalentamiento del medio durante la preparacin. Bajo pH causado por la hidrlisis cida. Mal pesaje del agar. Agar sin disolver. Deficiente mezclado de ingredientes Sobrecalentamiento del medio durante la preparacin. Calidad del agua deficiente. Contaminacin extraa de qumicos. Medida de pH a una temperatura incorrecta. Mala calibracin del potencimetro. Mala calidad del medio deshidratado. Sobrecalentamiento del medio durante la preparacin. Calidad del agua deficiente. Mala calidad del medio deshidratado. pH incorrecto. Contaminacin extraa. Sobrecalentamiento del medio durante la preparacin. Calidad del agua deficiente. Mala calidad del medio deshidratado. Falta de control de pH Sobrecalentamiento del medio durante la preparacin. Mala calidad del medio deshidratado. Calidad del agua deficiente. Formulacin incorrecta por ejemplo ingredientes mal pesados, error en la concentracin de los suplementos.. Sobrecalentamiento del medio durante la preparacin. Mala calidad del medio deshidratado. Formulacin incorrecta Suplementos aadidos incorrectamente, por ejemplo, cuando el medio est muy caliente o por error en la concentracin.

pH incorrecto

Color anormal

Formacin de precipitados

Inhibicin del medio/ Baja produccin

Pobre selectividad

19

GUIA TCNICA COLOMBIANA

GTC 78
BIBLIOGRAFA

[1] [2]

Culture media for Foood Microbiology. Progress in Industrial Microbiology, Vol.34 (1995). Eds. Corry J.E.L., Curtis, G.D.W and Baird, R.M. Elsevier, Amsterdam. ISO 9001:2000, Quality management systems- Requirements. DOCUMENTO DE REFERENCIA

ISO/ TS11133-1. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Guidelines of preparation and production of culture media- Part 1 general guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory.

20

You might also like