Bioqumica

ENZIMAS

Las caractersticas ms sobresalientes de las enzimas son su poder cataltico y
especificidad. Adems, la actividad de muchas enzimas est regulada.
Casi todas las enzimas conocidas son protenas, sin embargo, existen molculas de
RNA (ribozimas) catalticamente activas, lo que indica que las protenas no tienen un
monopolio absoluto como catalizadores.

Las enzimas tienen un enorme poder cataltico

Aceleran reacciones multiplicando su velocidad por un milln de veces o incluso ms
(10
6
a 10
12
veces)

La mayora de las reacciones en los sistemas biolgicos no tienen lugar a velocidades
perceptibles en ausencia de enzimas.

Ejemplo:

H
2
O + CO
2
HCO
3
-
+ H
+

Anhidrasa
carbnica



Cada molcula de enzima puede hidratar 10
5
molculas de CO
2
en 1 segundo, 10
7
veces
ms rpido que la misma reaccin sin catalizar.

Como todo verdadero catalizador, las enzimas muestran las siguientes propiedades:

1. Estn presentes en pequea cantidad
2. No sufren alteraciones irreversibles en el curso de la reaccin y por tanto, cada
molcula de enzima puede participar en muchas reacciones individuales
3. No tienen efecto sobre la termodinmica de la reaccin

Las actividades catalticas de muchas enzimas estn reguladas

Control a nivel de sustrato. Es una regulacin que se da por interaccin directa
de sustratos y productos de cada reaccin catalizada enzimticamente con la
propia enzima (el producto puede actuar como inhibidor competitivo)
Ej. Glucosa + ATP Glucosa-6-fosfato + ADP
a Hexoquinas

La hexoquinasa se inhibe por glucosa-6-fosfato. Si la gluclisis se bloquea por

cualquier razn, se acumular G-6-P, se inhibe la hexoquinasa y la entrada de
glucosa ser ms lenta.
La enzima que cataliza la primera etapa de una va biosinttica resulta
normalmente inhibida por el producto final (retroinhibicin o feedback)

Z D C B A a


A: materia prima
B, C y D: intermediarios
Z: producto final

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Z podra usarse en otro proceso posterior, si Z deja de utilizarse, se acumulara si
todo lo anterior se mantiene trabajando igual y el consumo de A continuara
ineficientemente. Lo correcto sera que ante la acumulacin de Z se enviara una
seal hacia atrs para que la va actuara con mayor lentitud. La clula puede
controlar la generacin del producto final mediante la activacin o la inhibicin
de un paso de la ruta. Lo ms eficiente sera lentificar el primer paso (AB, as
pues la enzima que cataliza este primer paso debe regularse por la cantidad de Z.
Se impide as la utilizacin no deseada de A y la acumulacin de Z. Adems,
dado que la mayora de los procesos bioqumicos son reversibles en cierto grado,
la generacin de gran cantidad de Z tender a aumentar los intermediarios.
Otras situaciones metablicas requieren patrones ms complicados, en los que la
activacin, al igual que la inhibicin pueden ser tiles.
Veamos el siguiente ejemplo, donde G y N se necesitan en cantidades iguales:

DEFG
ABC
KLMN

Las enzimas vistas hasta el momento no pueden lograr este tipo de regulacin
llamada regulacin alostrica. Puede verse que el compuesto que inhibe o
activa (G o N) no se parece ni al sustrato ni al producto directo de la reaccin
que inhibe (AB) Estas enzimas alostricas son protenas con mltiples
subunidades, con mltiples sitios activos, presentan cooperatividad de unin al
sustrato y regulacin de sus actividad por otras molculas efectoras.
Las enzimas pueden estar controladas por protenas reguladoras que pueden
estimularlas o inhibirlas.
Modificacin covalente. Numerosas enzimas estn controladas por la unin
reversible de grupos fosforilo.

Las enzimas son muy especficas

Las enzimas son altamente especficas. Tanto en la reaccin que catalizan, como en la
seleccin de las sustancias reaccionantes, denominadas sustratos. Una enzima cataliza
una sola reaccin qumica o un grupo de reacciones estrechamente relacionadas. En
contraposicin con las reacciones no catalizadas, en las reacciones catalizadas por
enzimas son raras las reacciones colaterales que conducen a la formacin de productos
secundarios. El grado de especificidad del sustrato es normalmente elevado y a veces
prcticamente absoluto.
C
O
N
H

Enzimas proteolticas catalizan la siguiente reaccin:

Enlace peptdico Componente Componente
N
H
C
H
R
1
C
H
R
2
C
O
+ H
2
O
N
H
C
H
R
1
C
O
O
-
+
+
H
3
N C
H
R
2
C
O

carboxlico amnico


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La mayora de las enzimas proteolticas tambin catalizan una reaccin diferente pero
relacionada, la hidrlisis de un enlace ster:

ster cido Alcohol
as enzimas proteolticas varan marcadamente en su grado de especificidad por el
Subtilisina, procede de algunas bacterias, acta independiente de la naturaleza de las
arboxlico de los
a, cataliza la hidrlisis de los enlaces Arg-Gly slo

a energa libre es la funcin termodinmica ms til en bioqumica
n termodinmica un sistema es la materia de una regin definida. La materia del resto
E = E
B
E
A
= Q W

A
: energa del sistema al principio del proceso
na importante cualidad de esta ecuacin es que el cambio de energa de un sistema
R
1
C
O
O R
2
+
H
2
O
R
1
C
O
O
-
+ HO R
2
+ H
+


L
sustrato, as por ejemplo:

cadenas laterales adyacentes al enlace peptdico que ha de ser roto

Tripsina, es especfica, rompe enlaces peptdicos slo por el lado c
residuos de lisina y de arginina
Trombina, es an ms especfic
en secuencias peptdicas determinadas
L

E
del universo se denomina entorno. La primera ley de la termodinmica establece que la
energa total de un sistema y su entorno es constante, en otras palabras, la energa se
conserva.

E
E
B
: energa del sistema al final del proceso
Q : calor absorbido por el sistema
W : trabajo realizado por el sistema

U
depende slo de los estados inicial y final y no del camino seguido en la transformacin.
Dificultades: algunas reacciones transcurren espontneamente aunque E sea positivo
(la energa del sistema aumenta), con lo cual no se puede usar esta ecuacin para
predecir se la reaccin transcurrir en forma espontnea.

Se define luego la entropa (S) que es una medida del grado de desorden o azar de un
a segunda ley de la termodinmica establece que un proceso tiene lugar
S
Sistema
+ S
Entorno
> 0 Para un proceso espontneo
e debe tener en cuenta que la entropa de un sistema puede disminuir durante un
proceso espontneo, con tal de que la entropa del entorno aumente de tal manera que la
suma sea positiva.
sistema. La entropa de un sistema aumenta (S>0) cuando se desordena.

L
espontneamente si aumenta la suma de las entropas del sistema y de su entorno.

S

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Dificultades: los cambios de entropa de las reacciones qumicas no son fcilmente
medibles. Adems, el criterio de espontaneidad dado en la ecuacin, requiere que se
conozca el cambio de entropa del entorno y el sistema que nos interesa.
G: cambio de energa libre de un sistema que sufre una transformacin a presin y
tantes
H: cambio de entalpa del sistema
vienen en esta ecuacin. El cambio de energa libre
rio valioso para saber si sta puede transcurrir
spontneamente:
en equilibrio y no tiene lugar a un cambio neto si G es cero
itir tal reaccin.
reac
e la transformacin. G para la oxidacin de la glucosa a CO
2
y H
2
O es el mismo para

abo a velocidad apreciable. La velocidad de una reaccin depende de la energa libre

Las dificultades se evitan al utilizar una funcin termodinmicamente distinta
denominada energa libre (G)

G = H - TS

temperatura cons

S: cambio de entropa del sistema

Las propiedades del entorno no inter
(G) de una reaccin es un crite
e
Una reaccin puede transcurrir espontneamente solo si G es negativo (procesos
exergnicos)
Un sistema est
Una reaccin no puede transcurrir espontneamente si G es positivo (procesos
endergnicos) Se requiere aporte de energa libre para perm

G es funcin de estado, con lo cual depende de la energa libre de los productos y los
tivos. El G de una reaccin es independiente del camino (o mecanismo molecular)
d
la reaccin in vitro o para una serie de etapas catalizadas enzimticamente en la clula.

El G no proporciona informacin sobre la velocidad de reaccin. Un G<0 indica que
una reaccin puede transcurrir espontneamente, pero no significa que se pueda llevar a
c
de activacin que no est relacionada con G.

Cambio de energa libre estndar de una reaccin y su relacin con la constante de
equilibrio


A+ B C
+
D
[ ][ ]
[ ][ ] B A
D C
ln RT ' G G + =

G: cambio de energa libre en condiciones estndar
[A], [B], [C] y [D] son las concentraciones molares de los reactantes

G se obtiene cuando cada uno de los reactantes A, B, C y D estn presentes a una
atm) y a T=298K. As que el G
los reactantes. En
ioqumica, estado estndar se define a pH 7 (G)

concentracin 1,0M (para un gas al estado estndar es 1

de una reaccin depende de la naturaleza y concentracin de
b

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En equilibrio G = 0 y por tanto

[ ][ ]
[ ][ ] B A
D C
ln RT ' G = pero
[ ][ ]
[ ][ ] B A
D C
' K
eq
=
eq
30 , 2 ' K =

Entonces

eq
' K log RT 3 ln RT ' G =

ebe quedar claro que el criterio de espontaneidad de una reaccin est dado por G
G. Una reaccin puede tener G positivo pero las concentraciones de
act hacer que G sea negativo, otra forma
ga libre de una reaccin exergnica acoplada,
or e
e una enzima acelera la reaccin en un sentido y otro
recisamente con el mismo factor.
mos que en ausencia de enzima la
onstante de velocidad para la reaccin directa es K
d
= 10
-4
s
-1
y para la reaccin inversa
D
y no por
re ivos y productos dentro de la clula pueden
de lograrlo podra ser por aporte de ener
jemplo la hidrlisis del ATP. p

Las enzimas no alteran los equilibrios de reaccin

Una enzima es un catalizador y, en consecuencia, no puede alterar el equilibrio de una
reaccin qumica. Esto significa qu
p
Consideremos la interconversin de A en B. Suponga
c
es K
i
= 10
-6
s
-1
. La constante de equilibrio viene dada por la relacin de las constantes
de velocidad.

[ ]
[ ]
100
10
10
K
K
A
B
K
6
4
i
d
= = = =

a concentraci
A B
10
-4
s
-1

10
-6
s
-1

L
S
n de equilibrio de B es 100 veces la de A, haya o no enzima presente.
in embargo se tardaran varias horas para conseguir este equilibrio sin enzima. As es
as aceleran la consecucin del equilibrio pero no varan su posicin.
as enzimas aceleran reacciones estabilizando los estados de transicin
va de reaccin cuya energa del
stado de transicin es menor que en la reaccin en ausencia de la enzima (fig.1)
que las enzim

L

Una reaccin qumica que transforma S en P transcurre a travs de un estado de
transicin S* que tiene mayor energa libre que S o P.

La energa libre de activacin de Gibbs (G*) es G* = G
S*
-G
S


Las enzimas aceleran las reacciones disminuyendo G*, la barrera activacin. La
combinacin del sustrato con la enzima crea una nueva
e


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Fig. 1. Disminucin de la energa de activacin de reacciones qumicas por enzimas.

La primera etapa de la catlisis enzimtica es la creacin de un complejo enzima-
sustrato

Los sustratos quedan unidos a
una reaccin especfica de la
enzima denominada centro
activo. La mayora de las
enzimas son muy selectivos en
su unin a los sustratos. La
capacidad cataltica de las
enzimas depende en gran parte
de la especificidad en la unin.

Fig. 2. Mecanismo de accin enzimtica.

La existencia de complejos enzima-sustrato, ES (fig. 2), ha sido demostrada de varias
maneras:

1. A una concentracin constante de enzima, la velocidad de reaccin aumenta con la
concentracin del sustrato hasta que se alcanza la velocidad mxima. Las reacciones
no catalizadas no muestran este efecto de saturacin. En 1913 Leonor Michaelis
interpret la velocidad mxima de una reaccin catalizada por una enzima en
trminos de la formacin de un complejo ES. A concentraciones de sustrato
suficientemente elevadas, los centros catalticos estn ocupados por l y, por lo
tanto, la velocidad de reaccin alcanza un mximo. Esta es la prueba ms antigua y
general de la existencia de los complejos ES.

2. Algunos complejos ES se han visualizado directamente por microscopa electrnica.
La cristalografa de rayos X ha proporcionado imgenes de alta resolucin de
sustratos y anlogos de sustratos unidos a centros activos de muchas enzimas.

3. Las caractersticas espectroscpicas de muchas enzimas y sustratos cambian con la
formacin del complejo ES.


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Los centros activos de las enzimas tienen algunas caractersticas comunes

El centro activo de una enzima es la regin que se une al sustrato y contiene los residuos
que participan en la produccin y ruptura de enlaces. Estos residuos se denominan
grupos catalticos.

Caractersticas comunes de las enzimas respecto a sus centros activos:

a) El centro activo supone una porcin relativamente pequea del volumen total de la
enzima.



Fig. 3. Sitio activo de una enzima luego de su plegado (A) e interaccin con el sustrato AMPc (B)
b) El centro activo es una entidad tridimensional formada por grupos que proceden de
distintas partes de una secuencia lineal de aminocidos. Residuos muy alejados en la
secuencia lineal pueden interactuar ms fuertemente que los residuos adyacentes en
la secuencia de aminocidos (fig. 3)
c) Los sustratos se unen a las enzimas por numerosas fuerzas dbiles (fig. 3). Las
interacciones no covalentes en los complejos ES son mucho ms dbiles que los
enlaces covalentes. Las interacciones reversibles entre biomolculas se realizan por
enlaces electrostticos, puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals e
interacciones hidrofbicas. Las fuerzas de Van der Waals llegan a ser importantes
en la unin slo cuando varios tomos de sustrato se acercan simultneamente a
varios tomos de la enzima. Por consiguiente, la enzima y el sustrato deben tener
formas complementarias.
d) Los centros activos son hoyos o hendiduras (fig. 3). En todas las enzimas de
estructura conocida, las molculas de sustrato quedan ligadas a un hoyo o una
hendidura de la cual el agua ha quedado normalmente excluida. El carcter no polar
de esta hendidura aumenta la afinidad por el sustrato. Adems, el hoyo crea un
microambiente en el cual ciertos residuos polares adquieren propiedades especiales
para su funcin cataltica. Las posiciones internas de estos residuos polares son

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excepciones cruciales desde el punto de vista biolgico a la regla general de que los
residuos polares estn expuestos al agua.
e) La especificidad del enlace depende de la disposicin exactamente definida de los
tomos del centro activo. Un sustrato debe tener una forma adecuada para
introducirse en el centro. El modelo de la llave y la cerradura (Fischer, 1890) es
esencialmente correcto y es una forma fructfera de contemplar la
estereroespecificidad de la catlisis. Sin embargo, est actualmente probado que la
forma de los centros activos de algunas enzimas se modifica sensiblemente al unirse
al sustrato. Los centros activos de estas enzimas tienen formas que son
complementarias a las del sustrato solamente despus de que el sustrato se haya
unido. Este proceso de reconocimiento dinmico se denomina ajuste inducido
(Koshland, 1958)

El modelo de Michaelis-Menten explica las propiedades cinticas de muchas
enzimas

Para muchas enzimas, la
velocidad de catlisis (V)
vara con la concentracin de
sustrato ([S]) (fig. 4) V se
define como el nmero de
moles de producto que se
forma por segundo. Cuando
[S] es pequea V es casi
proporcional a [S], cuando [S]
es elevada V es prcticamente
independiente de [S]. El
modelo sencillo propuesto por
Michaelis-Menten (1913)
explica estas caractersticas
cinticas. El aspecto crtico
del desarrollo es que se
necesita un complejo
especfico ES intermediario en la catlisis:
Fig. 4. Efecto del incremento en la concentracin de sustrato
sobre la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente.
En saturacin (lnea punteada horizontal), el aumento de la
concentracin de sustrato no se refleja en la velocidad de
catlisis.

E+ S ES E + P
k
1
k
3
k
2


Una enzima E se combina con S para formar un complejo ES con una constante de
velocidad k
1
. El complejo ES tiene dos destinos posibles, puede disociarse hasta E y S
con una constante de velocidad k
2
, o puede continuar hasta formar un producto P con
una constante de velocidad k
3
. Se supone que nada del producto revierte al sustrato
inicial, una condicin que se cumple en el estado inicial de la reaccin, antes de que la
concentracin de producto sea apreciable.

Lograremos a partir de este modelo, una expresin que relacione la velocidad de
catlisis con las concentraciones de sustrato y enzima y las velocidades de las etapas
individuales.

Velocidad de catlisis: V (1) [ES k
3
= ]

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Velocidad de formacin de [ ] (2) [ ][S E k ES
1
= ]
]
]
Velocidad de desintegracin de [ ] (3) ( )[ES k k ES
3 2
+ =

Estamos interesados en la velocidad de catlisis bajo condiciones de estado estacionario,
en estas condiciones las concentraciones de los intermediarios permanecen invariables,
mientras que las de los materiales de partida y de los productos van cambiando. Esto
ocurre cuando las velocidades de formacin y desintegracin de ES son iguales:

Igualando (2) y (3) (4) [ ][ ] ( )[ES k k S E k
3 2 1
+ =

Despejando [ ]
[ ][ ]
( )
[ ][ ]
1
3 2
3 2
1
k
k k
S E
k k
k S E
ES
+
=
+
= (5)

Se define entonces K
M
(constante de Michaelis) como:

1
3 2
M
k
k k
K
+
= y sustituyendo en (5) tenemos:

[ ]
[ ][ ]
M
K
S E
ES = (6)

Se entiende por E la concentracin de enzima que no forma parte del complejo ES, por
lo tanto es un valor no conocido y lo debemos expresar en funcin de valores
conocidos:

[ ] [ ] [ ] ES E E
T
= (7)

Siendo E
T
la concentracin de enzima total al inicio de la reaccin, un valor conocido.

Sustituyendo esta ltima en (6)

[ ]
[ ] [ ] ( )[ ] [ ][ ] [ ][ ]
M
T
M
T
K
S ES S E
K
S ES E
ES

=

= y agrupando

[ ] [ ] ( ) [ ][ ] [ ]
[ ][ ]
[ ] S K
S E
ES S E S K ES
M
T
T M
+
= = + sustituyendo en (1)

[ ][
[ ]
]
S K
S E k
V
M
T 3
+
= (8)

Intuitivamente, la velocidad mxima se logra cuando todos los sitios activos estn
ocupados por el sustrato, y eso es posible a [S] muy elevadas ([S]>>K
M
)
En ese caso
[ ]
[ ]
1
S K
S
M

+
(9) [ ]
3 T MAX
k E V =

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Sustituyendo esta ltima expresin en (8) se obtiene la ecuacin de Michaelis-Menten
para una reaccin enzimtica simple en dos pasos:

[ ]
[ ] S K
S
V V
M
MAX
+
=


Puede verse aqu que cuando K
M
= [S]
2
V
V
MAX
=

Entonces K
M
es aquella concentracin de sustrato a la cual la velocidad de reaccin se
hace la mitad de su valor mximo.

k
cat
, el nmero de recambio

Para la reaccin enzimtica simple en dos pasos que dio origen a estos clculos, la
ecuacin (8) es apropiada. Cuando la reaccin es ms compleja, k
3
se sustituye por k
cat
,
un parmetro que incorpora todas las constantes de velocidad de las reacciones entre ES
y E+P. k
cat
es la medida directa de la produccin cataltica de producto en condiciones
ptimas (enzima saturada) Las unidades de k
cat
son s
-1
y su valor representa el nmero
de molculas de sustrato recambiadas por molcula de enzima por segundo. El
recproco de k
cat
puede interpretarse como el tiempo necesario para que una molcula
de enzima recambie una molcula de sustrato.

El criterio k
cat
/K
M


A [S] bajas ([S]<<K
M
) la mayor parte de la enzima se encuentra libre ([E
T
] [E]) y
entonces [ ][ ] S E
K
k
V
M
CAT
con lo que k
cat
/K
M
pasa a ser una constante de velocidad para
la reaccin entre el sustrato y la enzima libre. Esta relacin es importante ya que
proporciona una medida directa de la eficiencia y la especificidad de la enzima. Muestra
lo que una enzima y el sustrato pueden realizar cuando se dispone de lugares
enzimticos abundantes, y permite una comparacin directa de la eficacia de una
enzima respecto a distintos sustratos.
k
cat
/K
M
tiene un valor lmite dado pro la teora de la difusin de 10
8
a 10
9
(mol/L)
-1
s
-1
.
Una enzima con una eficiencia mxima evidenciar esta eficiencia con un valor de
k
cat
/K
M
de este orden. Un ejemplo de esto es la triosa fosfato isomerasa con k
cat
/K
M
=
2,4x10
8
(mol/L)
-1
s
-1
.