ADN

La molcula de ADN (que es la que se va a extraer en este laboratorio) est constituida por dos largas cadenas de nucletidos unidas entre s formando una doble hlice. Las dos cadenas de nucletidos que constituyen una molcula de ADN, se mantienen unidas entre s porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas. La unin de las bases se realiza mediante puentes de hidrgeno, y este apareamiento est condicionado qumicamente de forma que la adenina (A) slo se puede unir con la Timina (T) y la Guanina (G) con la Citosina (C). La estructura de un determinado ADN est definida por la "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de nucletidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la informacin gentica del ADN. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es, por tanto, crtico para la clula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa gentico de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje gentico. La estructura en doble hlice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( A-T; G-C ), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria. REPLICACIN DEL ADN Es la capacidad que tiene el ADN de hacer copias o rplicas de su molcula. Este proceso es fundamental para la transferencia de la informacin gentica de generacin en generacin. Las molculas se replican de un modo semiconservativo. La doble hlice se separa y cada una de las cadenas sirve de molde para la sntesis de una nueva cadena complementaria. El resultado final son dos molculas idnticas a la original. Existen varios mtodos para la purificacin del ADN. Por ejemplo, con la extraccin directamente de 300 ml. de sangre completa se puede utilizar el Kit comercial "Wizard genomic DNA purification kit" que sirve para purificar material gentico de humanos, clulas en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias. Para la realizacin de este y otros mtodos se debe seguir las instrucciones del fabricante, (esta tcnica es la que vamos a utilizar en este laboratorio para purificar DNA, y se describir posteriormente sus pasos para la obtencin de dicho material). Con esta tcnica, podemos utilizar posteriormente los anlisis de DNA tales como amplificacin (PCR), digestin con endonucleasas de restriccin, southern blot o Dot blot. Otros mtodos son: Mtodo comercial InstaGene Matrix: donde tambin se extrae DNA a partir de sangre entera, diseado para aislar DNA que posteriormente ser utilizado en reacciones de PCR. En un tubo Eppendorf se agrega solucin de Lysis Buffer (pH: 7.9) y sangre entera. Luego de varios lavados y centrifugaciones con este buffer, se descarta el sobrenadante y se agrega el InstaGene Matriz al pellet obtenido. Por ltimo, se realizan dos incubaciones, una a 70C y otra a 95C. Las muestras son guardadas a -20C hasta la realizacin de la tcnica de PCR, digestin con endonucleasas de restriccin, southern blot o Dot blot. Mtodo Salting Out: En este mtodo se utiliza un buffer que contiene Proteinasa K ( Tris-HCl, pH 8.3,Tween 20, Nonidet P40, Proteinasa K), la cual destruye las membranas nucleares, liberando a la solucin los cidos nucleicos. El paso siguiente consiste en la precipitacin de

los cidos nucleicos, ya que el DNA presente en soluciones con alta concentracin de sales acetato de sodio (AcONa) puede precipitarse mediante la adicin de alcohol etlico a dichas soluciones. Extraccin de DNA de sangre perifrica con Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB): El fundamento es similar al mtodo anterior, pero en este caso no se utiliza el buffer con Proteinasa K y, la liberacin de los cidos nucleicos se realiza con una solucin de homogeinizacin (CTAB, NaCl, b-mercaptoetanol, EDTA, Tris-HCl pH 7.5). El CTAB es una sal de amonio cuaternario, uno de cuyos grupos alquilo es de gran magnitud molecular, y tiene propiedades detergentes; se conocen con el nombre de jabones invertidos, debido a que su actividad superficial se debe a la presencia de un ion positivo y no a uno negativo, como sucede en los sulfatos de alquilo e hidrgeno, que son los detergentes usuales. Luego se realiz la extraccin de los cidos nucleicos con cloroformo: alcohol isoamlico, y la posterior precipitacin del DNA con etanol absoluto primero, y posteriormente con etanol 70%. Esta es considerada por muchos la una tcnica que rene los requisitos fundamentales para purificacin del DNA, ya que sirve para amplificacin PCR, mostrando una pureza muy alta del material que separa. La purificacin del DNA es importante porque permite: Identificar mutaciones. Ver caractersticas propias de los tipos de DNA (Polimorfismo). Para clonar (Genes especficos, fragmentos de cromosomas o individuos). Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno. Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patognicos. Identificar resistencia microbiana. Evaluar desordenes genticos, neurodegenerativos, neoplsicos, imunolgicos. Medicina forense para la identificacin de personas. Para hacer tests de paternidad.

Hay que tener en cuenta que es muy importante la fuente de clulas de las cuales voy a extraer el DNA , ya que de esto depende la facilidad para la ejecucin del procedimiento, Por ejemplo la extraccin del DNA de las clulas del cabello es difcil de separar su DNA pero es muy fcil conseguir el pelo, o la extraccin de DNA de leucocitos es fcil pero para conseguirlos es ms dificultoso. CONCEPTOS IMPORTANTES Heparina: Heteropolisacrido complejo; posee buena cantidad de grupos sulfato y residuos glucosalina. La heparina inhibe la coagulacin de la sangre por activacin de la antitrombina III. En cantidades pequeas la heparina no tiene un efecto significativo en muchas de las determinaciones de laboratorio y se utiliza generalmente como anticoagulante en las muestras de sangre en los laboratorios clnicos. El citrato, la heparina y el EDTA entre otros, son anticoagulantes que imposibilitan la disponibilidad de iones de calcio, que es imprescindible en la coagulacin, y ya sin el calcio, la muestra de sangre al centrifugarla no se coagular y se podrn separar las molculas sin problema. Isopropanol: (CH3 CHOHCH3). Lquido transparente, voltil e incoloro empleado en el laboratorio qumico para extraer y disolver lpidos y en histologa se usa como solubilizante de los colorantes de grasas y como agente deshidratante. El isopropanol precipita el DNA porque compite con este por el agua, deshidratndolo y llevndolo al fondo del tubo. Etanol: (CH3CH2OH). Lquido voltil, incoloro, miscible con agua, metanol, ter, acetona y cloroformo. Se emplea principalmente como solvente en muchosprocedimientos de laboratorio, como agente deshidratante en histologa como solvente de algunas sustancias 8tinturas) y como desinfectante. Solvatacin: Interaccin estabilizadora de un solvente con un soluto o de un solvente con grupos funcionales en la superficie de un material insoluble.

ANLISIS El proceso efectuado en el laboratorio para la purificacin del DNA a partir de leucocitos humanos, se bas en la aplicacin del mtodo "Wizard Genomic Purification Kit" como ya lo habamos mencionado anteriormente. 1. Partiendo de una muestra de 300 ml de sangre humana (sacada con una micropipeta graduada previamente y limpiada luego con fluhidrxido de sodio para aumentar el ph y destruir la contaminacin biolgica que probablemente adquiri) previamente tratada con heparina que es un anticoagulante, se procedi a mezclar con el tampn de cloruro de magnesio (Cell Lysis Solution y el cual tena una cantidad de 900 ml) que entra en las clulas y genera una desestabilizacin osmtica, haciendo que las clulas se hinchen y se estallen sus membranas celulares. Todo esto se logra en un tiempo de incubacin de 10 minutos a 37c para favorecer la reaccin. Luego procedemos a centrifugar para ayudar con el rompimiento de la membrana y a la vez para sedimentar los ncleos de leucocitos, quedando un sobrenadante compuesto por restos de membrana, organelas celulares, protoplasma y restos de hemoglobina que le da un color rojo con tendencia a oscuro. 2. Se procedi a la extraccin del sobrenadante con la micropipeta varias veces para sacar la mayor cantidad posible, evitando succionar los ncleos de los leucocitos. Esta cantidad de ncleos sedimentados es llevada al vrtex por 15 segundos para resuspenderlos y facilitar el mismo proceso. 3. Se agregaron 300ml de Nuclei Lysis Solution la cual es bsica (NONIDET P4O) que acta selectivamente en la membrana nuclear con el objetivo de romperla y liberar los cidos nucleicos ejerciendo as su funcin detergente. Luego de mezclar la solucin con la pipeta, se empez a observar de consistencia muy viscosa. 4. Adicionamos 1,5 ml de RNase solution y mezclamos invirtiendo el tubo 25 veces para luego proceder a incubar la muestra a 37c y por un tiempo de 15 minutos. Este procedimiento se hace con el fin de desintegrar el RNA, quedando as el DNA y varios tipos de protenas. 5. Pasados los 15 minutos de incubacin agregamos 100ml de Protein precipitation solution (proteinasa K) y colocamos en el vrtex por 20 segundos. La solucin de precipitacin de protena que es bsicamente cloruro de sodio, solvata las protenas e inicia su precipitacin. Centrifugamos por 3 minutos para agilizar este proceso de precipitacin. 6. Terminado el proceso de centrifugacin, se pudo observar una pequea porcin sedimentada de color rojo oscuro que contiene las protenas y con ellas la presencia de hemoglobina con su color rojo caracterstico. El sobrenadante es de color transparente y contiene el DNA, aunque an no visible. 7. Retiramos el sobrenadante y lo mezclamos con 300ml de isopropanol. Luego de haber invertido esta varias veces, buscando la buena interaccin de los componentes, pudimos observar el DNA como unas pequeas fibras de algodn color blanco y esto se logr gracias a que el isopropanol deshidrata el DNA e inicia su sedimentacin. 8. Centrifugamos para sedimentar el DNA y sacar la mayor parte posible de isopropanol y le agregamos al DNA sedimentado 300ml de etanol al 70% para rehidratarlo y luego centrifugar por 1 minuto para sedimentar el DNA ya hidratado. 9. Aspiramos cuidadosamente el etanol con la pipeta, e invirtiendo el tubo sobre una servilleta se puede sacar el exceso de etanol quedando el DNA en el tubo. Teniendo as el DNA se debe posteriormente dejar al aire 15 minutos y para conservarlo se agregan 100ml de DNA Rehydration solution e incubar a 65c/1 hora y luego incubar la solucin a 4c