Medidas de combinaciones termodinmicas en el descubrimiento de drogas o medicamentos La Termodinmica gobierna el proceso de reconocimiento biomolecular.

Los pasos de caracterizacin, la comprensin y la explotacin de la termodinmica de unin tienen el potencial de contribuir a un proceso de diseo racional de frmacos mejorado que es ms robusto y fiable. Es solo recientemente que la instrumentacin capaz de direccionar y caracterizar termodinmicamente ha sido mejorada, dando impulso a la aplicacin de medidas termodinmicas en el descubrimiento de frmacos. Esta revisin destaca los instrumentos y mtodos que se pueden emplear para medir las combinaciones o uniones termodinmicas y sus usos en estudios de reconocimiento biomolecular y el descubrimiento de frmacos actuales. Las mediciones de las combinaciones termodinmicas pueden extenderse desde la determinacin de la afinidad y la estequiometra a travs de la estimacin de los cambios en la energa libre, entalpa, entropa o capacidad calorfica. Esta revisin explica estos parmetros, la forma en que se miden y su explotacin en el descubrimiento de frmacos. Se centra en la deconvolucin de la energa de enlace en contribuciones entlpicas y entrpicas (influenciadas por los cambios en la unin y el "desorden", respectivamente), y sobre el uso de efectos en la estabilidad de protenas para estimar mediciones de afinidad de otro modo inaccesibles. Los datos termodinmicos pueden ser explotados para la evaluacin de preparaciones de protenas , la evaluacin de los ensayos , la caracterizacin de las construcciones de protena y el estudio de protenas carrier (transportadoras). Los cambios en las interacciones de unin no se detectan a menudo como cambios en la afinidad a causa de la compensacin entalpa-entropa, donde la entalpa liberada de unin mejorada se ve compensada por una sancin entrpica. Las mediciones de la entalpa de unin a menudo revelan esos cambios. Conceptos bsicos de las combinaciones termodinmicas Si consideramos un evento simple reversible bimolecular de combinacin, en un sistema termodinmico cerrado, como representante de la interaccin de una macromolcula transportadora en sus conformaciones nativas (N) con un ligando de prueba (L), entonces esto puede ser representado como: (i) El cambio en la energa libre de Gibbs (G), en condiciones arbitrarias, para la formacin de N L est relacionado con el cambio de Gibbs estndar de energa libre (G ), en condiciones definidas (por ejemplo, 1 MN y 1 ml a pH 7 y 25 C), por la ecuacin:

(ii) En el equilibrio, bajo condiciones estndar, en donde G = 0, esto se convierte en: (iii)

donde R es la constante del gas, T es la temperatura absoluta, Ka es la constante de equilibrio de asociacin y Kd es la constante de equilibrio de disociacin. Esta relacin demuestra que el valor de Kd es dependiente de la energa libre de unin, G . Figura 1 Medicin de las TIC. (a) Representacin esquemtica de un calormetro de compensacin de potencia isotrmica de titulacin. Una potencia constante se aplica a la celda de referencia, la activacin de un circuito de realimentacin, que se aplica una potencia variable para la celda de muestra. Esto mantiene una diferencia muy pequea y controlada de temperatura entre las celda. La fuente de informacin es la lnea de base en el experimento ITC. Las reacciones exotrmicas generan calor, provocando as una disminucin en el poder de regeneracin, mientras que las reacciones endotrmicas aumentan el poder de regeneracin. (B) Los datos de un experimento CCI, donde 2'-CMP se titul en RNasa A. El panel superior muestra la potencia aplicada por los el instrumento a la celda de muestra para reducir al mnimo la diferencia de temperatura entre las clulas (celdas). El panel inferior muestra las integrales de los picos del panel superior, junto con una lnea de mejor ajuste, que se utiliza para estimar? H, Kd y estequiometra. El valor de Kd se puede medir usando una variedad de tcnicas experimentales, por lo general basado en la determinacin de la concentracin de L libre cuando *N+ = *N L+. Una caracterizacin termodinmica completa requiere el cambio de entalpa, que refleja el calor liberado o adoptado durante el evento de la asociacin tambin medido. Hay dos caracterizaciones, estas requiere que el cambio de entalpa, que refleja el calor liberado o tomado durante el evento de la asociacin, tambin sea medido. Hay dos formas comunes de la determinacin de las magnitudes de estos parmetros termodinmicos: calorimetra de titulacin isotrmica (ITC) y el anlisis de van't Hoff. ITC es el mtodo directo y generalmente preferido. Los Instrumentos ITC son sensibles y han estado disponibles slo en la ltima dcada y han dado lugar a una explosin de estudios termodinmicos. ITC permite que los valores de la variacin de entalpa (H), Kd y estequiometra (n) a medir se den en un solo experimento. Despus de la correccin de dH para detectar la presencia de cualquier equilibrio vinculado para obtener delta H , se obtienen las magnitudes de dS y G utilizando la relacin: (iv) d= delta (no pude hacer el triangulito)

Donde dS es el cambio de entropa en condiciones estndar. Una alternativa indirecta a ITC implica el uso de una forma integrada de la relacin de van't Hoff, de los cuales la ecuacin (iv) es un ejemplo. Sin embargo, la aplicacin de esta relacin particular, cuando sigue una dependencia de la temperatura de Kd y por lo general es problemtica. Las dificultades surgen a partir de la suposicin de que dH no cambia con la temperatura, que a menudo no es el caso. A menudo es necesario el uso de una ecuacin que permite la dependencia de la temperatura de dH , que se caracteriza por un trmino diferente de cero temperatura e independiente Cp, para describir el cambio en la capacidad calorfica (ver ms abajo):

(v) Otros problemas se encuentran a causa del ruido experimental enmascarando la curvatura de las van't Hoff de ln Kd contra 1 / T, y tambin debido a los valores estimados de dH y Cp dependiendo el uno del otro. Esto ha dado lugar a discrepancias notificadas entre calorimtrico y van't Hoff entalpas [2-9] (que parecen reflejar una falta de precisin en el mtodo de van't Hoff) y pone de relieve la ventaja de utilizar ITC para determinar los cambios de entalpa. Mediciones termodinmicas utilizando ITC ITC es la nica tcnica que mide directamente la variacin de entalpa tras la unin. La mayora de los instrumentos ITC operan un sistema de retroalimentacin diferencial de clulas (Figura 1a), en donde la celda de referencia se llena con tampn y la celda de muestra por lo general contiene la macromolcula, en la que se valora el ligando. El instrumento aumenta lentamente la temperatura de ambas clulas durante cada titulacin (menos de 0,1 C por hora) en una forma que se aproxima a las condiciones isotrmicas. La inyeccin del ligando produce los efectos del calor que se derivan de cuatro fuentes: la interaccin de unin, la dilucin de ligando, la dilucin de la macromolcula y un efecto de calor debido a la mezcla. Los cambios de calor que surgen en la celda de muestra causan una diferencia de temperatura (dT) entre las dos clulas, que es detectada por el calormetro y desencadena un cambio en el poder de retroalimentacin aplicado a la celda de muestra. Las reacciones exotrmicas producen una disminucin de la potencia aplicada, mientras que las reacciones endotrmicas producen mayor retroalimentacin. Se mide el cambio en el tiempo en el poder de retroalimentacin aplicado a la celda de muestra (Figura 1B, panel superior). El calor asociado con la interaccin de unin se obtiene por integracin de los picos en la trama de potencia frente al tiempo (Figura 1B, panel inferior) y la correccin posterior de las contribuciones de calor adicionales mencionados anteriormente [10]. Los valores de los parmetros se estiman a continuacin por anlisis de regresin no lineal. La gama y el espaciamiento de las concentraciones de ligando aadido a menudo pueden estar diseados para permitir estimaciones para entalpa, la afinidad y la estequiometra dentro de un nico experimento [10]. La mayor parte del ligando aadido se convierte en obligado durante las inyecciones iniciales, debido al exceso de macromolculas, y da una medida de dH. El cambio de calor se hace ms pequeo a lo largo de la valoracin cuando los sitios de macromolculas disponibles estn llenos, y algunos de los ligandos aadidos permanecen libres en solucin. Esta parte de la curva de valoracin permite la estimacin de Kd. Suponiendo que se conocen con precisin las concentraciones de macromolculas funcionales y ligandos, a continuacin, la estequiometra se mide fcilmente de la deplecin del ligando total para dar una concentracin de ligando libre inferior. Exmenes tiles de las fuentes de error dentro del ITC y algunos experimentos han sido descritos por Tellinghuisen [11-13]. Otro parmetro que puede ser determinado por el ITC a diferentes temperaturas es el cambio en la capacidad calorfica con la unin, Cp (a veces conocido como 'calor especfico'), que est influenciada por el nmero de estados de energa accesibles. Este es un parmetro termodinmico importante, debido a que controla las magnitudes de dH y dS :

(vi) Cada uno de los parmetros detallados anteriormente refleja la caracterstica de los complejos menores. Por ejemplo , un G negativo indica que el complejo , N L , tiene menos energa libre que la suma de la energa libre de N y L. La unin se ve favorecida en condiciones estndar slo si G es negativo , por lo tanto, los valores negativos de delta H y los valores positivos de dS promueven la formacin de complejos . Un valor negativo para Cp indica que el complejo tiene una capacidad calorfica inferior ( se requiere menos energa para producir un aumento de la temperatura ) que los radicales libres. ITC se ha utilizado ampliamente para asignar firmas termodinmicas a las interacciones no covalentes . Los cambios de entalpa observados surgen principalmente como resultado de los cambios en las interacciones de enlaces de hidrgeno [ 14,15 ] , con la magnitud dependiente de longitudes y ngulos de enlace y el signo depende de si hay una ganancia neta (negativo ) o prdida (positivo ) de H, nmero de enlaces o la fuerza . Los valores de entropa favorables son a menudo asociados con la liberacin de molculas de agua desde una interfaz de unin , mientras que , los valores de entropa negativa desfavorables suelen estar vinculadas a las restricciones conformacionales [ 16,17 ] . Los valores negativos (a menudo grandes) de Cp , junto con los cambios de entropa favorables mencionados anteriormente , se han utilizado como un indicador de las interacciones hidrofbicas [ 18,19 ] . ITC en el descubrimiento de frmacos Caracterizacin de preparaciones de protenas Es esencial que la calidad de una preparacin de protena sea suficientemente alta para permitir una interpretacin inequvoca de los resultados del ensayo. El mtodo ITC es una poderosa herramienta para la evaluacin de preparaciones de protena, ya que no slo da una medida precisa de Kd, sino que tambin permite la medicin de la estequiometra de unin y d H. Las evaluaciones de calidad se pueden hacer, sin la necesidad de desarrollar un nuevo ensayo, la protena es generada utilizando varios protocolos de purificacin y almacenamiento. Este enfoque ha sido utilizado para evaluar las preparaciones de la enzima acil-protena portadora enoil reductasa (ACPER) utilizados para los estudios cinticos y estructurales [20]. Validacin del ensayo Los ensayos empleados en la identificacin y seleccin secundaria deben ser capaces de detectar fiablemente compuestos activos. Es la naturaleza directa y de alta precisin de ITC que lo hace particularmente valioso en la industria farmacutica, donde las presiones para un rpido rendimiento puede conducir a protocolos de ensayo menos rigurosos. ITC se puede utilizar como un punto de referencia para evaluar los datos procedentes de otros ensayos de unin o mediciones de cintica enzimtica. Esto es particularmente til cuando la evaluacin de los ensayos que son indirecta, depender de reactivos inmovilizados o implican sustratos modelo [21]. Caracterizacin

Con frecuencia de larga duracin, las protenas complejas se sustituyen por las construcciones ms cortas, a veces contienen mutaciones, lo cual facilita el descubrimiento de frmacos. La validez de estas sustituciones se debe verificar, por lo que las conclusiones falsas no estn dibujados sobre SAR para la protena autntica [16]. itc est en condiciones de probar construcciones de protenas, ya que no requiere el desarrollo de un nuevo ensayo, es preciso y no requiere protenas catalticamente activas. Por ejemplo, el ITC se utiliz para verificar que 24 kDa y 43 kDa fragmentos de ADN girasa eran modelos vlidos de la enzima de longitud completa [22]. Evitando equivalencia cintica La naturaleza directa de ITC muestra que las protenas que interactan (por ejemplo, una enzima y su sustrato de protena) se pueden estudiar por separado, dando una ventaja sobre los ensayos que requieren ambas protenas. Los mtodos que emplean ambas protenas simultneamente estn sujetos al fenmeno de la cintica de equivalencia, donde la unin a cualquiera de los resultados de asociados en el mismo, o, ecuaciones dosis-respuesta similares y as impide la identificacin de la protena transportadora. El valor de la utilizacin de ITC de esta manera ha sido reconocida en los estudios de las vas de sealizacin y utilizado ampliamente la asociacin de los anlogos de fosfotirosina con dominios SH2 [23-27].