Universidad Nacional Andrs Bello Laboratorio Qumica Analtica e Instrumental QUI-141 Profesora: Karina Gonzlez

LABORATORIO 11:

Cromatografa en columna. Anlisis de tintas

Integrante: Eduardo Valderrama Curso: QUI141 Seccin 03 Fecha de entrega: sbado 23 de Noviembre del 2013

Introduccin
Las tcnicas cromatogrficas son ampliamente utilizadas para separar los componentes individuales de una mezcla y en variados casos, para identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatogrfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrn. La base de la tcnica es que cuando un determinado soluto interacta con dos fases, una de ellas, habitualmente slida, llamada fase estacionaria, experimenta una serie de procesos (adsorcin en fase slida, solubilizacin en cada fase, arrastre por la fase mvil, etc.) que, en ltimo extremo, llevan a que el soluto se reparta entre ambas fases. Una de las tcnicas cromatogrficas ms sencillas es la que se realiza en capa fina, llamada as porque la fase estacionaria es una capa fina de un material poroso (gel de slice, almina, etc.) extendida para su manejo mecnico sobre un soporte inerte. La fase mvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que emigra por la fase estacionaria debido, sobre todo, a la capilaridad. En su movimiento, arrastra ms o menos a los componentes de una mezcla en funcin de sus mayores o menores coeficientes de reparto. El coeficiente de reparto es poco empleado en la prctica. En su lugar, y relacionado con l, se emplea el denominado Rf, caracterstico de cada sustancia, definido como la relacin entre la distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase mvil. Las ms insolubles tendrn, en el disolvente empleado, un Rf prximo a cero, mientras las ms solubles se acercarn a uno. La cromatografa en columna se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna. La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicacin de presin (cromatografa flash). La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de sta un poco de algodn o lana de vidrio, para evitar que la slica o la almina queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrasada hasta el nivel del soporte. A continuacin se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogindose por lo general en tubos de ensayo. Una columna de cromatografa es un tubo de vidrio relleno con una sustancia slida de propiedades adsorbentes constituida por pequeas partculas: gel de slice y almina son las ms usadas. Este relleno es lo que se conoce en cromatografa como la fase estacionaria. A travs de la columna se har pasar una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada eluyente y/o fase mvil. La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequea cantidad de disolvente y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el mismo. A continuacin se pasa un flujo de eluyente a travs de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla son arrastrados por el eluyente a su paso, hacindoles avanzar a lo largo de la columna. Sin embargo, no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad, y esta es precisamente la clave de la cromatografa. Algunos compuestos se ven ms fuertemente retenidos por el adsorbente (fase estacionaria) y por lo tanto avanzarn ms despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarn a mayor velocidad. En general se dice que la separacin en la cromatografa se basa en la afinidad diferencial de los distintos compuestos por la fase mvil o la fase estacionaria.

En el presente prctico se realizan dos tipos de cromatografa: Cromatografa en capa fina y cromatografa en columna. Cada una de ellas posee una fase estacionaria y una fase mvil. La Clave principal es que los componentes de una mezcla se ven afectados entre la afinidad que tienen por la fase estacionaria, y la afinidad que tienen por la fase mvil.

Objetivos
Comprender y aplicar las tcnicas de laboratorio correspondientes para el anlisis de tintas presentes en lpices. Conocer la tcnica de cromatografa en columna, sus caractersticas y los factores que en ella intervienen. Separar los componentes de una muestra problema. Utilizar la cromatografa en capa fina y diversos patrones para identificar cualitativamente los componentes de la muestra problema.

Parte experimental
1. Materiales y reactivos:

Tubos de ensayo. Lpiz tinta Azul, Verde, Roja y Negro. Tubos de ensayos. Esptula. Gradilla. Varilla de vidrio. Vaso de precipitados de 100 Y 250 mL. Probeta de 100 mL. Soporte universal. Nuez. Mariposa (pinza para buretas).

Columna para cromatografa. Pipeta Pasteur. Slica gel G para columna. Diclorometano. Hexano. cido actico glacial. Etanol. Muestra problema n7 Cromatofolio. Capilares. Estndares de tintas.

2. Mtodos y Condiciones Experimentales: Preparacin de Columna: Se comenz traspasando la solucin problema de tinta de lpiz disuelta en Diclorometano a un tubo de ensayo cuidadosamente, observando de que no hubiesen partculas slidas. Se tom una columna cromatogrfica y se introdujo un trozo de lana de vidrio dentro de la columna ayudado de una varilla de vidrio. Se sujet la columna en posicin vertical en un soporte universal y se aadi hexano en la columna.
En un vaso de precipitados se prepar una suspensin de 19 gramos aproximadamente de slica gel en hexano y se introdujo en la columna. Luego se dej escurrir el solvente en un vaso precipitado y se observ la formacin de una columna de slica gel a medida que escurra el solvente, que alcanz una altura de 14 cm. Finalmente es dejo escurrir el disolvente hasta quedar al ras de la capa de slica gel observando que esta no se secase.

Sembrado y separacin de la muestra problema en la Columna: Se tom aproximadamente 1 ml de la muestra problema con una pipeta pasteur y se sembr en la columna, y luego se abri la llave de la columna para que esta quedase nuevamente al ras de la slica gel. Justo en este momento se agreg hexano suavemente con la pipeta pasteur y a medida que transcurra el proceso se empez a observar la separacin de 2 pigmentos de la muestra problema, siempre se agregaba hexano a medida que este goteaba para que no se secara la slica gel. Una vez se observ que no se seguan separando los pigmentos se comenz a agregar etanol y nuevamente se observ la separacin de los pigmentos, y del mismo modo una vez se observ que los pigmentos no se separaban se comenz a agregar la disolucin mezcla de etanol: cido actico glacial 1:1. Con esta ultima solucin agregada los componentes eluyeron hasta el final y el primer pigmento en llegar era de color verde que se recolect en un tubo de ensayo. Luego se recolect la fraccin de color azul en otro tubo de ensayo. Estos tubos se ensayo se llevaron a un bao de agua a 100C en la campana de extraccin para concentrar los extractos obtenidos. Sembrado de muestras y patrones (TLC): Las dos fracciones concentradas obtenidas se analizaron mediante cromatografa de capa fina, para determinar su composicin, para esto se sembraron en un cromatofolio y luego se sembraron los estndares de tinta de color azul, negro y verde. Luego se prepar la cmara cromatografa con etano y se dejo saturar. Se llev la placa con las muestra sembradas a la cmara cromatografica y se esper que el frente del solvente quedase a 1 cm de parte superior del cromatofolio. Finalmente se caracteriz la placa desarrollada y se calcularon los respectivos Rf. 3. Descripcin de la tcnica: La Cromatografa en Columna se usa para separar grandes cantidades de material: >100 mg. El proceso de cromatografa consta de una fase mvil (eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente). Los compuestos que componen la mezcla a separar son arrastrados por el eluyente a su paso, hacindolos avanzar a lo largo de la columna. La clave de la cromatografa en columna es que no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad. As algunos compuestos pueden ser fuertemente retenidos por la fase estacionaria (absorbente) y por esto estos compuestos avanzaran ms lentamente. De manera contraria, otros compuestos pueden quedar pobremente retenidos y avanzaran a una velocidad mayor. De este modo la separacin en cromatografa en columna se basa en la afinidad diferencial de los distintos compuestos por la fase mvil o la fase estacionaria.

El orden aproximado de elucin de compuestos y de polaridad es aproximadamente el que se indica:

En la cromatografa en capa fina (TLC) se emplea una capa plana y relativamente delgada de un material que a la vez es el soporte, o bien, cubre una superficie metal. La fase mvil se desplaza por la fase estacionaria por accin capilar. La aplicacin de la muestra es tal vez el aspecto ms decisivo de la cromatografa en capa fina y se efecta por contacto entre la placa y un capilar que contiene la muestra. Finalmente se pueden localizar los componente de la muestra despus de la separacin a simple vista o utilizar algn otro revelador fsico o qumico para este fin. Se pueden aplicar una diversidad de procedimientos para localizar los componentes de la muestra despus de la separacin. Para la separacin de aminocidos se utiliza un reactivo especfico, la ninhidrina, que sirve para localizar las especies separadas. Los valores de Rf (factor de retardo) se utiliza como referencia para establecer la identidad del anlisis con un cierto grado de seguridad. El factor de retardo para un soluto es: Rf = distancia recorrida por el compuesto desde el origen Distancia recorrida por el solvente desde el origen Ambas distancias lineales medidas desde la lnea de aplicacin. Los valores de Rf tienen la capacidad de variar desde 1, para los solutos que no se retrasan, hasta valores que se aproximan a cero.

Resultados
Caracterizacin de las manchas y Rf: Se obtuvieron dos fracciones en la cromatografa en columna, primera una de color verde y luego otra de color azul. Luego se hizo la cromatografa en capa fina obtenindose los siguientes resultados:

Siembra Azul

DM(cm) 2,1 3,7 4,1 4,2 4,8

DS(cm) 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1 7,1

Rf 0,2958 0,5211 0,5775 0,5915 0,6761 0,7606 0,8028 0,7606

Negro

Verde

5,4 5,7 5,4

Muestra Problema (Fraccin verde)

Caractersticas de manchas Mancha ovalada azul y alargada Mancha redonda celeste Mancha negra redondeada Mancha pequea redonda de color azul Mancha pequea redonda de color negro Mancha verde ovalada Mancha ovalada de color azul Mancha redonda de color verde Mancha ovalada de color azul Mancha redonda celeste pero de color muy tenue Mancha negra redondeada pero de color muy tenue

5,7 Muestra Problema (Fraccin Azul) 3,7 4,1

7,1 7,1 7,1

0,8028 0,5211 0,5775

Discusin
En la cromatografa en columna los compuestos de la muestra problema quedan disueltos en la fase mvil y al final de a poco salen de la columna cromatogrfica. En el procedimiento se observ que con el hexano la muestra no eluy a los 20 minutos y en el etanol eluy poco en el mismo tiempo, lo cual fue unos 4 cm en la columna y se form una fraccin anaranjada. Con la mezcla de etanol: cido actico glacial 1:1, se formaron dos fracciones en la columna, una superior de color azul y otra inferior de color verde en menos de 20 minutos. La mezcla etanol: actico glacial 1:1 es ms polar que el etanol y el hexano, por lo tanto los componentes se arrastraron a una mayor velocidad. Como la primera fraccin en salir fue la de color verde se dice que esta se retuvo menos en el solvente que la fraccin azul, por lo tanto la fraccin azul es mucho ms polar que la fraccin verde porque se retuvo ms tiempo en el solvente. Los disolventes polares compiten ms eficientemente con las molculas polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazar las molculas, incluyendo las ms polares, rpidamente a travs de la columna. Si el disolvente es muy polar la elucin ser muy rpida y generalmente habr poca separacin de los componentes de la mezcla, algo que no ocurri en el prctico ya que se alcanz a observar la separacin de ambas fracciones y la divisin existente entre ellas. As consideramos que la separacin en la columna fue exitosa ya que la eleccin del solvente que es el paso ms crucial en esta tcnica fue la correcta. Sobre la composicin de la muestra problema, est indudablemente contiene tinta verde, ya que la fraccin de color verde que se obtuvo present los mismas caractersticas que el estndar de tinta verde en la cromatografa de capa fina, es decir, las manchas obtenidas fueron muy similares y se obtuvieron los mismos Rf. Para la fraccin de color azul de la muestra problema se obtuvieron similares resultados al patrn de tinta de color azul, en la cromatografa de capa fina. Se observ que las manchas obtenidas para la fraccin de color azul eran muy tenues y difcil de visionar a simple vista, quizs porque falto seguir sembrando la muestra, a pesar de esto se logr calcular los Rf de dos manchas, 0,5211 y 0,5775, que son los mismos Rf para dos de las tres manchas que presenta el estndar de tinta azul, y por estos creemos que estos resultados son suficientes para decir que la muestra problema se compone de tinta azul. Los anteriores resultados de la composicin de la muestra problema y los Rf iguales entre las fracciones separadass y los estndares sugiere que se logr una correcta separacin de las tintas en la cromatografa en columna. La migracin de las sustancias de la mezcla a travs de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separacin, y por tanto la resolucin, aumenta con la longitud de la columna. De esta manera se formaron dos bandas caractersticas con una separacin entre ellas la de color azul y verde. Por lo tanto la resolucin obtenida utilizando la mezcla de etanol: cido actico 1:1 y los 19 cm de longitud de la columna fue lo suficiente como para obtener buenos resultados en la separacin de cada fraccin la muestra problema, estando cada una de ellas constituida por un solo tipo de tinta (confirmado por la cromatografa en capa fina).

Conclusin
Se aprendi y comprendi el mtodo de separacin de cromatografa en columna, sus caractersticas y los factores que en ella intervienen, realizando la separacin de una muestra problema de tintas de manera exitosa. Se concluye que la muestra problema analizada se compone de tinta azul y tinta verde, gracias a los resultados obtenidos y al anlisis de estos.

Bibliografa
Hans Beber, Wolfgang Walter. Manual de Qumica Orgnica. Editorial Revert S.A. Ao 1987. Captulo: Anlisis elemental orgnico cualitativo. Pgina 11. Douglas A. Skoog, Stanley R. Crouch, F. James Holler. Principios de Anlisis Instrumental; 6 Edicin, Editorial Cengage Learning Editores, Ao 2008, Captulo: Cromatografa por afinidad. Pginas: 848 - 850. J.M.Teijn Rivera, A.Garrido Pertierra. Fundamentos de Bioqumica Estructural; 2 Edicin, Editorial Tbar, Ao 2006, Captulo 4: Aminocidos: propiedades generales. Pginas: 67 68.