Estructura y topologa del DNA y de la cromatina

Descubrimiento de la nuclena

Friedrich Miescher, trabajando en Tubingen en el laboratorio de Qumica-Biolgica de Felix Hopper Seyler, descubre en 1868 que los ncleos de clulas de pus se hinchan con lcali suave. El paper se publica en 1871.

Contexto: Darwin, Mendel, Pasteur.

Friedrich Miescher (1844 1895)

Experimentos hechos por Fred Griffith en 1928

Phoebus Levene (1869 1940) Hiptesis del tetranucleotido

Erwin Chargaff (1905-2002) Reglas de Chargaff

El principio transformante descubierto en 1944 por Avery, McLeod y McCarthy

Retrato de Oswald Avery en el hall de entrada de la Universidad de Rockefeller

El experimento de la juguera (the blender experiment, 1952)

Rosalind Franklin (1920-1958)

Kings College, Londres

Linus Pauling (1901-1994)

Universidad de California

Cavendish Laboratory Cambridge University

PNAS USA 39, 84-97, 1953

Destacar:

antiparalelismo efecto de no perpendicularidad importancia enlaces de hidrgeno base-stacking interactions

El stacking reduce la exposicin al agua de las secciones hidrofbicas de las bases, le da estabilidad a la estructura a travs de interacciones van der Waals y es el que provoca la rotacin del DNA. En (d) se muestra el estiramiento de la hlice por intercalacin de bromuro de etidio.

Superfice de van der Waals de un DNA de doble hebra coloreada por potencial electrosttico, destacando la carga negativa de los grupos -PO4-3.

Interacciones entre bases: puentes de hidrgeno de los pares A-T y C-G, y stacking de los pares A-C y T-G.

El DNA es muy flexible. Los 7 enlaces indicados en la figura pueden rotar. La rotacin del enlace nmero 4 de la furanosa es ms restringida y determina el tipo de pliegue de la ribosa (abajo).

Todos los tomos del anillo estn en el mismo plano, salvo el 2 o el 3

Consecuencias de la rotacin del enlace 7 (glicosdico) de la figura anterior

El syn se da solo en purinas, principalmente en Gs

El DNA Z se da preferentemente en secuencias GCGCGCGCy se favorece en DNA sobreenrollado

La transicin de DNA A o B a Z provoca un severo cambio estructural

Se postula que in vivo, cambios transientes de B a Z en regiones ricas en GC pueden constituir seales de expresin gnica

Justo en el lmite de las estructuras B/Z se produce una extrusin de un par de bases

Par de bases extrudo

Diferentes conformaciones del DNA

La forma B es la ms estable en condiciones fisiolgicas y es la descrita por W y C. La forma A aparece en soluciones ms saturadas y la forma Z se favorece con el sobreenrollamiento

Estructuras frecuentes en el DNA

DNA de hebra triple: la tercera es rica en pirimidinas

Enlaces de H de Hoogsteen

Enlaces de H Watson y Crick

Su significado fisiolgico, si es que tiene alguno, est en estudio. En la clula se forma (al menos) durante la invasin de la doble hebra mediada por el filamento de RecA.

El G-quadruplex
Cuatro Gs de un DNA rico en Gs se asocian en una ttrada va enlaces de Hoogsteen (G4-DNA). A la vez, dos o ms de estas ttradas pueden apilarse constituyendo la estructura denominada Gquadruplex. La estructura puede ser intramolecular si el DNA es ss bimolecular si es ds o tetramolecular. Se ha visto que los telmeros humanos (d(GGTTAG) forman quadruplex, lo que hace disminuir la actividad de la telomerasa.

Los nucletidos absorben en el UV

Recordar efecto hipercrmico

Gracias al efecto hipercrmico, la desnaturacin y la renaturacin (annealing) se pueden seguir espectrofotomtricamente a 260 nm. La renaturacin es mucho ms rpida cuando ya hay una fraccin de doble hebra

Denaturacin medida por efecto hipercrmico

El tm es f(G+C)

La concentracin de sal tambin afecta el tm

Secuenciacin por el mtodo de Sanger

(marcado en 5)

Fred Sanger, 1918Premio Nobel 1958 y 1980

Secuenciacin automatizada del DNA

Cada dideoxi est marcado con un fluorsforo diferente

Instrumentos para ultra-high-throughput DNA sequencing.

FLX system 454 Life Sciences, Roche

40 millones de bases / hora

Secuenciador Illumina
20 millones de bases / hora

Pirosecuenciacin con el 454 de Life Sciences (shotgun)

(a) DNA is isolated, fragmented, ligated to adapters and separated into single strands. (b) Fragments are bound to beads under conditions that favor one fragment per bead. The beads are compartmentalized in droplets of a PCR reaction mixture in oil emulsion and PCR amplification occurs within each droplet, resulting in beads each carrying ten million copies of a unique DNA template. (c) The emulsion is broken, the DNA strands are denatured, and beads carrying single-stranded DNA templates are deposited into wells of a fiber-optic slide. (d) Smaller beads carrying immobilized enzymes required for a solid phase pyrophosphate sequencing reaction are deposited into each well. (e) Scanning electron micrograph of a slide showing wells before bead deposition. (f) The 454 sequencing instrument comprising nucleotide solutions (i), a flow cell that includes the wellcontaining fiber-optic slide (ii), a CCD camera-based imaging assembly with its own fiber-optic bundle used to image the fiber-optic slide (part of iii), and a computer that provides the necessary user interface and instrument control (part of iii).

DNA polymerase (green oval) incorporates of the complementary base (blue G) generating PPi, which is converted to ATP by the sulfurylase. Luciferase converts luciferin to oxyluciferin producing light. The intensity of the light determines if there are more than one of these "letters" in a row.

En 1990, el costo de una secuencia era US$ 20/base. Hoy el costo es 10 8 veces menor

La paradoja c

La paradoja g
Nmero de genes que codifican para protenas en diversos organismos:

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae

4,288 6,241

Drosophila melanogaster
Caenorabditis elegans

13,601
19,099

Homo sapiens
Arabidopsis thaliana Populus trichocarpa

20,488
25,498 45,000

Relacin entre complejidad y RNA no codificante

Estructura del genoma humano

Genes copia nica*

DNA repetitivo ~ 85% del genoma

DNA espaciador

Secuencias funcionales

Secuencias de funcin desconocida

Telmeros: STRs (short tandem rep.) TTAGGG

Familias gnicas *

Minisatlite: VNTR (var. #. tand. rep.) 15-100 pb 10 a 50 veces

Microsatlite: SSRs (simple seq. repeats) 1-6 pb repeticin variable

Secuencias Mviles ~ 45% del genoma

Satlite, 5-10 pb centromrico

Dispersas: Actinas, histonas

En tandem: tRNAs, rRNAs

Transposones ~ 4%

Retrotransposones

* Las regiones codificantes por protenas y los intrones son un 1.5% y 20% del genoma, respectivamente

Tipo retrovirus LTRs ~ 8%

LINEs, ~ 5 kb hasta 850 mil veces ~ 21%

SINEs, ~ 0.3 kb un milln de veces ~ 13%

LINEs: Long interspersed nuclear elements. L1 y L2 son los ms abundantes. Son de ~ 5 kb y codifican por dos protenas: una que une ssRNA y otra que tiene actividad de transcriptasa reversa y RNAsa H. Por lo tanto, se copian a si mismas y copian a las SINEs. En el 5' UTR (untranslated region) contienen un promotor de la Pol II, mientras que el 3' UTR contiene una seal de poliadenilacin. SINEs: short interspersed nuclear elements. La ms abundante es Alu, de 280 pb, derivada de 7SL RNA, el que participa en el movimiento de protenas en el retculo endoplsmico. Tambin hay SINES que derivan de genes de tRNA. Son copiadas por RNA pol II y no codifican ninguna funcin. Se ha descrito que Alu RNA es un represor general de la transcripcin durante el heat shock, ya que se une a la Pol II inactivndola.
La insercin de LINEs y SINEs en genes da origen a enfermedades tales como neurofibromatosis, leucemia, -talasemia, distrofia muscular, hemofilia, etc. LINEs y SINEs se mueven copindose a si mismas y no como transposones. Por lo tanto, su movimiento alarga el genoma.

Alus

SINEs

LINEs

Retrotransposones
Microsatlite (SSR)

Secuencias de inters en los cromosomas

Los intrones constituyen el 20% del genoma humano

Topologa del DNA

DNA del bacterigago T4 afuera del virin

Cromosoma bacteriano afuera de la clula

El cromosoma bacteriano es 500 veces ms largo que la clula

Andamio de cromosoma eucaritico preparado con la tcnica de Laemmli

Topoismeros de un DNA circular

Separacin de topoismeros por cromatografa en geles de agarosa

Qu es Lk?

Linking number o nmero de enlace: vueltas completas de una hebra sobre la otra (o nmero de cruces en el plano x 2)

Un dficit de vueltas da origen a sobreenrollamiento negativo. Este se puede aliviar separando las hebras

Variaciones sobre el mismo tema

L=T+W
(Lk = Twist + Writhe) Writhe: contorsin del eje con respecto al plano Twist : torcin angular

El sobreenrollamiento puede ser plectonmico o solenoidal

Topoisomerasas en E. coli Enzima Tipo Gene Requer. ATP Actividad in vitro

Relaja SE decad/cadena desanuda/anu
Introduce SEdecad/cadena desanuda/anu

Rol in vivo
Relaja SE -

topA
gyrA gyrB

Gyrasa

Introduce SE -

III

topB
parC parE

Relaja SE decad/cadena desanuda/anu

Relaja SE + decad/cadena desanuda/anu

Relaja torque durante replicacin Relaja SE + -. Decadena, desanuda y segreg. cromosomal

IV

Todas las topoisomerasas cambian el Lk permitiendo el paso de una o dos hebras por un corte

Las topoisomerasas tipo I alteran el nmero de enlace (Lk) en una unidad

Las topoisomerasas tipo II alteran el nmero de enlace en dos unidades

Estructura de la cromatina en eucariotes

*Las histonas tienen pesos moleculares que varan segn la especie. Los datos de la tabla hacen referencia a histonas bovinas.

Las histonas son muy conservadas. Cambian 1% en 600 x 10 6 aos. (El citocromo c cambia un 1% en 20 x 106 aos) Son susceptibles de modificacin covalente por metilacin, acetilacin, ADPribosilacin y fosforilacin, constituyendo mecanismos de regulacin de la expresin genica (epigentica)

Esquema del nucleosoma (I)

El DNA da 1.8 vueltas alrededor del ncleo de histonas. Digestin de cromatina con nucleasas revela que se protegen 147 pb y que el DNA linker tiene 54 pb.

Los N-term de las ocho histonas del nucleosoma se proyectan fuera de l.

Esquema del nucleosoma (II)

azul: H3; rosado: H2B; verde: H4; naranja: H2A

Modificaciones covalentes de las histonas en sus extremos N-term

Son todas reversibles y juegan un rol fundamental en la estructura de la cromatina y la expresin gnica, aunque tambin hay algunas modificaciones en la superficie del core

*
Una sola molcula de ubiquitina no alcanza para conducir a una protena al proteosoma, pero si sirve para atraer otras protenas que se unen a ella

Epigentica
Regulacin de la expresin gnica mediante modificaciones qumicas reversibles a las histonas (ya nombradas) y metilaciones en el DNA (en C), los que dirigen la accin de complejos remodeladores de la cromatina y ncRNAs. Algunas de estas modificaciones pueden heredarse por una o ms generaciones, lo que podra considerarse un tipo de Lamarkismo. La epigentica es responsable de la diferenciacin celular en metazoos y de la inactivacin de uno de los cromosomas X en hembras

Alliance for the Human Epigenome and Disease

Existen tambin variantes de las cuatro histonas que con ayuda de chaperonas reemplazan a las cannicas cuando la clula lo requiere. Se sintetizan en cualquier momento del ciclo celular, no solo durante la fase S.

El dominio histone fold est presente en las 4 histonas del nucleosoma, no en la H1. Contiene unos 70 aa distribudos en 3 hlices unidas por 2 loops cortos. Este dominio, que no presenta una alta mantencin de secuencia, es fundamental en la interaccin de las histonas en el nucleosoma.

Se habla tambin de un cdigo de las histonas, representado por las modificaciones covalentes de stas y por la existencia de las variantes de las histonas. Este cdigo es ledo por complejos proteicos que reconocen ambas marcas y atraen las enzimas requeridas

Compactacin de los nucleosomas en la fibra de 30 nm

En la compactacin influyen las interacciones N-term de nucleosomas vecinos y tambin la histoma H1. En la clula hay una H1 por cada nucleosoma. Su unin al DNA entre nucleosomas cambia el curso del DNA, lo que se estima importante para la formacin de la fibra de 30 nm

La fibra de 30 nm (compactacin de 7x) H1 se une al linker

Niveles de compactacin de la cromatina

dem a la anterior, con ms detalle