UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DECANATO

PROYECTO DE TESIS

TTULO: Caracterizacin de Bacillus spp. asociadas a la rizsfera de Jatropha curcas L., pin blanco, en Lambayeque y su potencial como promotoras del crecimiento de plantas, 2012 AUTORES: Est. Aguilar de la Cruz Heyner Isaac Est. Coral Cruz Jorge Eduardo PATROCINADORA: Dra. Blga. Carmen Rosa Carreo Farfn APROBADO POR:

______________________________ PRESIDENTE DEL JURADO

______________________________ MIEMBRO SECRETARIO

_____________________________ MIEMBRO VOCAL

________________________________ JEFE CENTRO DE INVESTIGACIN

______________________________ JEFE DE DEPARTAMENTO

______________________________ DECANO

Lambayeque, setiembre de 2012

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DECANATO

PROYECTO DE TESIS I. GENERALIDADES 1. Ttulo del proyecto Caracterizacin de Bacillus spp. asociadas a la rizsfera de Jatropha curcas L., pin blanco, en Lambayeque y su potencial como promotoras del crecimiento de plantas, 2012

2. Personal investigador 2.1 Autores Est. Aguilar de la Cruz Heyner Isaac Est. Coral Cruz Jorge Eduardo 2.2 Patrocinadora Dra. Blga. Carmen Rosa Carreo Farfn

3. Carrera profesional/especialidad Biologa/Microbiologa y Parasitologa

4. Tipo de investigacin: 4.1 De acuerdo al fin que persigue: Aplicada 4.2 De acuerdo a la tcnica de contrastacin: Descriptiva

5. Rgimen de investigacin Libre

6. Localidad e institucin donde se desarrollar el proyecto Lambayeque, Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas en la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. 7. Duracin del proyecto 8 meses

8. Fechas probables de inicio y trmino 8.1 Inicio: Julio, 2012 8.2 Trmino: Febrero, 2013

9. Cronograma de actividades 2012 Actividades Jul Ago Set Oct FASE DE PLANEAMIENTO Revisin bibliogrfica Elaboracin del proyecto Presentacin del proyecto Aprobacin del proyecto Implementacin del proyecto FASE DE EJECUCIN Recoleccin de muestras Procesamiento de muestras Registro de datos Anlisis estadstico de datos FASE DE COMUNICACIN Anlisis e interpretacin Elaboracin del informe Presentacin del informe X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Nov Dic Ene Feb 2013

10. Recursos disponibles 10.1 Personal El presente proyecto contar con el apoyo del personal tcnico del laboratorio de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. 10.2 Equipos e instrumentos Autoclave vertical, rango T 0-250 C, FANEN Balanza analtica, rango 0.01-150 g, EXCELL Cmara digital 14 mega pixeles, OLYMPUS Centrfuga GT-119-200, GREETMED Cocina elctrica, una hornilla, CHARITO Computadora Intel (R) Pentium (R) Dual CPU E2160 1.80 GHz Dispositivo de almacenamiento de informacin (USB) de 4Gb KINSTONG Espectrofotmetro digital, 335-1000 nm, GREETMED Estufa rango T 30-110 C, PRECISION SCIENTIFIC Horno con temperatura mxima de 200 C, THELCO Microscopio elctrico binocular, modelo L200, CARL ZEISS pH metro porttil, rango de pH 0.0 a 14.0, BIOCHEMICALS INTRUMENTS S.R.L

10.3 Materiales y reactivos Material de vidrio: Placas de Petri, portaobjetos, cubreobjetos, tubos de vidrio (13x100 mm y 15x150 mm), pipetas de 1 y 10 mL, matraces de 250 mL, vasos de precipitacin, viales. Material de metal: Gradillas, asas bacteriolgicas, pinzas, bisturs, tijeras. Material de plstico: Jeringas de 1 y 5 mL, tubos de centrfuga, bolsas. Medios de cultivo: Agar leche 1%, Agar nutritivo, Agar quitina coloidal 1 %; Agar Sundara Rao Sinha SRSM, Agar tripticasa soya, Caldo extracto de suelo 10 %; Caldo peptonado, Caldo tripticasa soya suplementado con triptfano, Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (Nfb) semislido. Reactivos y colorantes: Reactivos para tincin de Gram, solucin salina (NaCl 0,87 %, p/v).

10.4 Local Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa, seccin Biotecnologa Microbiana de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo en Lambayeque. 11. Presupuesto N de Partida 2.3.15.12 Cantidad Producto Material de escritorio Lpices Lapiceros Marcadores Correctores Cintas de embalaje Papel Kraft Papel bond A4 Cuadernos Rollos de pabilo Juegos de etiqueta Bienes de consumo Material de laboratorio Agar agar Agar nutritivo Agar quitina Agar tripticasa soya Medio Nfb Caldo tripticasa Peptona Solucin salina Placas de Petri Frascos de vidrio Tubos de dilucin Tubos de bioqumica Pipetas de 1 y 10 mL Asas bacteriolgicas Portaobjetos Cubreobjetos Algodn Material de limpieza Servicios Movilidad Publicaciones
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Marca

Presentacin

04 04 03 02 03 1/2 02 02 04 02 2.3.18.21 01 01 01 01 01 01 01 02 100 10 60 100 04 04 04 04 01 2.3.15.31 2.3.21.21

Mongol Pilot Artesco Artesco

Xerox Norma

Unidad Unidad Unidad Unidad Unidad Ciento Millar Unidad Unidad Docena

Precio S/. 118,00 4,00 12,00 6,00 5,00 3,00 14,00 50,00 6,00 12,00 6,00 4735,00 750,00 500,00 500,00 500,00 500,00 250,00 250,00 20,00 450,00 20,00 80,00 40,00 35,00 8,00 16,00 12,00 12,00 25,00 850,00 600,00

Merck Merck Merck Merck Merck Merck Merck Pyrex Pyrex Pyrex Pyrex Pyrex

kg kg kg kg kg kg kg Litro Unidad Unidad Unidad Unidad Unidad Unidad Caja Caja 500 g

2.3.22.44

2.3.21.23

2.315.99

01 01

Servicio de impresiones, encuadernacin y empastado Otros servicios de terceros Internet Equipamiento y bienes duraderos Cmara digital Olympus Dispositivo de Kingston Almacenamiento (USB) 4GB Imprevistos TOTAL

500,00

100,00 640,00 600,00 40,00

700,00 7668,00

12. Financiacin El presente proyecto ser financiado por los responsables, con ayuda del laboratorio de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Ciencias Biolgicas - Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

II.

PLAN DE INVESTIGACIN 1. REALIDAD PROBLEMTICA

La bioenerga y especialmente los biocombustibles son promovidos para fortalecer la independencia energtica, propiciar el desarrollo rural y reducir las emisiones de los gases de invernadero. El desarrollo de la bioenerga ofrece muchos beneficios, pero stos deben ser seleccionados y balanceados, con los impactos sobre la seguridad alimentaria. En este contexto, la Organizacin para la Alimentacin y la Agricultura de las Naciones Unidas (FAO), con la contribucin del Ministerio Federal de Alimentacin, Agricultura y Proteccin al consumidor de la Repblica Federal de Alemania, han ejecutado el proyecto Bioenerga y Seguridad Alimentaria (BEFS), a fin de determinar cmo el desarrollo de la Bioenerga puede ser implementado sin arriesgar la Seguridad Alimentaria. El proyecto cumple un marco analtico que ha sido implementado en Per, Tailandia y Tanzania. Bajo condiciones de secano, en la costa, no hay tierras disponibles para el desarrollo de cultivos relacionados a biocombustibles como son: Saccharum officinarum L. caa de azcar; Elaeis oleifera palma aceitera y Jatropha curcas L. pin blanco; sin embargo, con base a la disponibilidad de infraestructura de agua para riego existente, se puede afirmar que existe un potencial de tierras eriazas cercano a 200 000 ha ubicadas en zonas ridas entre las regiones de Piura y Lima, que podran destinarse a la implementacin de estos cultivos (FAO, 2010a). El pin blanco se siembra en pequeas parcelas y como cerco vivo. Recientemente se han instalado algunos ensayos en diversas localidades del pas, principalmente en la Costa Norte y en el Nororiente. Los primeros resultados indican rendimientos de 3 4 t ao-1. Siendo un cultivo bastante rstico, se podra sembrar en reas marginales de la costa (ridas y salinas); sin embargo, segn la evaluacin de aptitud de tierras (EAT) stas son consideradas como marginalmente o muy marginalmente aptas, es decir, presentan en trminos porcentuales entre 40 60 % y 20 40 %, respectivamente, de capacidad para llegar al rendimiento mximo alcanzable de 8 12 t ha-1 por cosecha. Segn lo expuesto, se ha determinado (FAO, 2010a) que en el Per los costos para la produccin de biodiesel a partir del pin blanco estaran entre 0,83 y 0,86 USD/L, superiores a los de la palma aceitera (0,23-0,31 USD/L) y los del etanol a partir de la caa de azcar (0,27-0,51 USD/L) y melaza (0,43-0,64 USD/L).

La investigacin en pin blanco tiene por finalidad obtener un paquete tecnolgico para incrementar el rendimiento y disminuir los costos de produccin de biodiesel. En este contexto, las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR), entre las que destacan las especies de Bacillus constituyen una alternativa que debe ser considerada, porque incrementan el rendimiento de los cultivos agrcolas a travs de mecanismos directos e indirectos. Entre los primeros se incluyen la sntesis de reguladores de crecimiento (auxinas, giberelinas, citoquininas), solubilizacin de minerales como los fosfatos, fijacin de nitrgeno atmosfrico, y estimulacin del sistema de absorcin de iones como los nitratos. Entre los mecanismos indirectos o de biocontrol se mencionan la competencia por un nicho ecolgico o por nutrientes, la interaccin directa con el patgeno por parasitismo y lisis enzimtica, la antibiosis, produccin de siderforos y la induccin de resistencia sistmica en las plantas. Bacterias como Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas y Streptomyces entre otros gneros, se encuentran en los suelos rizosfricos y han demostrado su efecto benfico en cultivos agrcolas; sin embargo, en Lambayeque no se han realizado estudios para investigar la presencia de estas bacterias en la rizsfera del pin blanco, con la finalidad de aislarlas, caracterizarlas y determinar su potencial como promotoras de crecimiento de las plantas. 1.1. Identificacin del problema Suelos poco aptos para la siembra de los cultivos relacionados a los biocombustibles y desconocimiento de la actividad benfica de los microorganismos de la rizsfera de las plantas. 1.2. Delimitacin del problema Caracterizacin de Bacillus spp. asociadas a la rizsfera de Jatropha curcas L. pin blanco en Lambayeque y su potencial como promotoras del crecimiento de plantas. 2. PROBLEMA CIENTFICO Cules son las caractersticas de Bacillus spp. asociadas a la rizsfera de Jatropha curcas L. pin blanco y cul es su potencial como promotoras del crecimiento de plantas? HIPTESIS Implcita.

3.

4.

JUSTIFICACIN E IMPORTANCIA La produccin de biodiesel en el Per est ligada al mercado de los aceites vegetales, por lo que sera difcil tener mrgenes provechosos de rentabilidad, ya que este producto, utilizado para consumo humano, es una materia prima costosa y en su mayora su produccin es de palma aceitera. Por tanto, el precio del biodiesel ser anlogo al de cualquier aceite vegetal que se produce a partir de palma aceitera, maz o especies oleaginosas como soya, canola o girasol y no constituira una alternativa para cumplir con los requerimientos de la norma peruana que en lo que respecta al biodiesel, en el 2009 comenz con la obligatoriedad del 2 % de mezcla y debi ser incrementado a 5 % al inicio del 2011. El pin blanco ofrece una materia prima de menor costo y a largo plazo la produccin de biodiesel es promisoria, as como la comercializacin de subproductos como la glicerina y la torta que permitiran darle un valor agregado; sin embargo, la capacidad del cultivo para competir a escala industrial es dudosa porque se desconoce su comportamiento agrcola y porque los suelos donde debe ser cultivado no presentan las condiciones ptimas para alcanzar el rendimiento adecuado. Como una alternativa est la posibilidad de utilizar bacterias del suelo como Bacillus spp., que a travs de diversos mecanismos benefician el desarrollo de las plantas y aumentan el rendimiento, por lo que se les denomina rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas, PGPR. El gnero Bacillus incluye una variedad de especies Gram positivas, no patognicas, con propiedades antagonistas. Son buenas secretoras de protenas y metabolitos, fciles de cultivar y altamente eficientes para el control de plagas y enfermedades. Los mecanismos de accin de Bacillus spp., incluyen competencia por espacio y nutrientes, antibiosis e induccin de resistencia frente a los patgenos. Adems, tienen efecto comprobado en la promocin de crecimiento de las plantas a travs de la fijacin de nitrgeno, solubilizacin del nutriente fsforo y produccin de reguladores del crecimiento como el cido indolactico. La capacidad de Bacillus spp., de formar esporas, que sobreviven y permanecen metablicamente activas bajo condiciones adversas, las hace apropiadas para la formulacin de productos viables y estables para el control biolgico. 5. OBJETIVOS 5.1 Aislar e identificar Bacillus spp. en la rizsfera de Jatropha curcas L. pin blanco en el distrito de Motupe, en Lambayeque. 5.2 Determinar in vitro el potencial biolgico de Bacillus spp. nativas como productoras de enzimas y cido indolactico, fijadoras de nitrgeno y solubilizadoras de fsforo.

5.3 Determinar in vitro el poder germinativo de Jatropha curcas L. pin blanco por efecto de Bacillus spp. nativas caracterizadas como promotoras del crecimiento de plantas. 6. ANTECEDENTES 6.1 Rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas En los suelos agrcolas existen microorganismos como las bacterias que pueden ser benficas y perjudiciales para la agricultura. Las bacterias benficas pueden establecer una relacin simbitica con las plantas o pueden ser de vida libre en el suelo, en cuyo caso se encuentran muy prximas a las races, en lo que constituye el suelo rizosfrico (Campos et al., 2007). Estas bacterias son denominadas rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas, PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria), trmino usado por primera vez por Kloepper para referirse a las bacterias capaces de inducir un efecto benfico en las plantas (Pea & Reyes, 2007). Las PGPR benefician a los cultivos agrcolas a travs de mecanismos directos e indirectos. Los directos se evidencian en ausencia de otros microorganismos en estudio, mientras que los mecanismos indirectos se pueden observar en la interaccin del microorganismo de inters con un fitopatgeno, mediante la cual se reducen los efectos dainos en el cultivo. Los mecanismos directos incluyen la sntesis de reguladores del crecimiento (auxinas, giberelinas, citoquininas), solubilizacin de minerales como los fosfatos, fijacin de nitrgeno atmosfrico, produccin de siderforos y estimulacin del sistema de absorcin de iones como los nitratos. Entre los mecanismos indirectos o de biocontrol se encuentran la competencia por un nicho ecolgico o por nutrientes, la interaccin directa con el patgeno (parasitismo y lisis enzimtica), antibiosis, produccin de siderforos e induccin de resistencia sistmica en las plantas (Nogales, 2005; Hernndez et al., 2006; Hernndez et al., 2009). Bacterias como Azospirillum, Herbaspirillium, Enterobacter y Azotobacter promueven el crecimiento de las plantas mayoritariamente a travs de mecanismos directos, as como Pseudomonas, Bacillus y Streptomyces lo hacen a travs de mecanismos indirectos; no obstante, todas las PGPR presentan un mayor o menor grado de efectividad en ambos mecanismos (Kloepper et al., 2004; Guillen et al., 2006; Idriss et al., 2007; Franco, 2009; Karnwal, 2009; Doumbou et al., 2010; Salaheddin et al., 2010; Cadena & Martnez, 2011). Al respecto, Bashan & Levanony (1990) y Bashan (1999) atribuyen el efecto de las PGPR a los que ellos denominan hiptesis aditiva, en la que ms de un mecanismo est involucrado en la asociacin planta-rizobacteria, los cuales operan simultneamente o en asociacin. La suma de los diferentes mecanismos refleja los cambios observados en el crecimiento de las plantas, cuando son cultivadas bajo condiciones ambientales propicias.
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El efecto positivo de las PGPR siempre est correlacionado con el incremento de longitud de las races laterales, as como el nmero y longitud de los pelos radiculares, cambios que finalmente se asocian con la sntesis de auxinas, citoquininas y giberelinas. Segn el modelo P. putida, las bacterias, as como las plantas sintetizan cido indolactico (AIA), que de por si estimula la divisin y alargamiento de las clulas, generando proliferacin radicular (nmero y longitud de pelos radiculares). El exceso de AIA tambin activa la enzima ACC sintetasa en las plantas y promueve la sntesis de cido-1-aminociclo-propano-1-carboxilico (ACC), que normalmente es un precursor del etileno, el cual a su vez inhibe la elongacin de las races en las plntulas. Cuando est presente P. putida, una parte significativa del ACC es exudado por las races y entonces es hidrolizado por las bacterias como fuente de nitrgeno, originando -cetobutirato y amonio (amino ciclo propano carboxilasa desaminasa, ACC desaminasa bacteriana), disminuyendo el ACC y por lo tanto el etileno, favoreciendo a su vez el incremento de la longitud radicular (Kloepper, 2003; Mantelin & Touraine, 2004). Los PGPR pueden fijar nitrgeno; sin embargo, no proveen a las plantas de grandes cantidades de este elemento, pero si tienen un gran impacto en la nutricin nitrogenada, directamente por la estimulacin de los sistemas de absorcin de iones como el nitrato e indirectamente por la proliferacin radicular. En laboratorio se ha demostrado que el nitrgeno incrementa su propia tasa de absorcin e induce ramificacin radicular; es decir, en presencia de nitratos se observa la expresin de los genes relacionados con su transporte y tambin elongacin de las races laterales por incremento de la actividad meristemtica de sus pices. El incremento de la superficie de las races y por lo tanto del volumen del suelo al que tienen acceso, as como la estimulacin de los sistemas de absorcin permite a su vez, aumento en la absorcin de nutrientes, especialmente nitrgeno, que conlleva a la acumulacin de biomasa area (Mantelin & Touraine, 2004). 6.2 Especies de Bacillus spp. como rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas Las bacterias del gnero Bacillus se caracterizan por ser Gram positivas con forma bacilar, aerobias estrictas o anaerobias facultativas que en condiciones estresantes forman una endospora que no deforma la estructura de la clula. Esta forma esporulada es resistente a las altas temperaturas y a los desinfectantes qumicos corrientes (Kokalis et al., 2006).

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La taxonoma de Bacillus segn Garrity, et al. (2004) es: Dominio Phyllum Clase Orden Familia Gnero : : : : : : Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus

Las especies de Bacillus actan como bacterias promotoras del crecimiento de las plantas mediante los mecanismos directos de produccin de enzimas, cido indolactico y siderforos, fijacin de nitrgeno, solubilizacin de fsforo y los mecanismos indirectos de antagonismo de hongos, bacterias fitopatgenas y fitonemtodos. Bacillus spp. produce antibiticos, lipopptidos con actividad surfactante y reducen las enfermedades de las plantas (Kokalis et al., 2006; Mrquez & Fernndez, 2006). En tres cepas de Bacillus amyloliquefaciens se demostr la presencia de fitasa extracelular (myo-inositol hexakisphosphate). La mayor actividad se detect en la cepa F2B45 y sus filtrados crudos diluidos estimularon el crecimiento de plntulas de maz bajo limitacin de fsforo y en presencia de fitato. La enzima fue producida principalmente en la fase de crecimiento exponencial y durante la transicin hacia la fase estacionaria. La capacidad de B. amyloliquefaciens para producir fitasas y permitir la disponibilidad de fsforo a partir de fitatos puede contribuir a la actividad promotora del crecimiento de las plantas. Los productos finales de la degradacin del fitano han sido identificados como mio-inositol trifosfatos y ortofosfatos, derivados del inositol que constituyen una fuente de nutrientes para las bacterias del suelo (Idriss et al., 2002). Tambin se ha determinado que algunas especies de Bacillus producen enzimas quitinolticas que degradan el polmero que forma parte de los hongos fitopatgenos como Rhizoctonia solani, causando deformacin y deterioro de las hifas (Reinoso et al., 2005). Utilizando tcnicas de anlisis fsico y gentico se demostr en B. amyloliquefaciens FZB42, la biosntesis de cido indolactico dependiente de la presencia de triptfano, que es uno de los principales componentes presentes en los exudados radiculares. El filtrado diluido o los cultivos de clulas estimularon el crecimiento de Lemmna minor; sin embargo, el efecto dependi de la concentracin del filtrado o de las clulas. Con una concentracin de 0,1 % el filtrado increment significativamente el peso de la biomasa fresca (17,5 mg) frente al control (14,1 mg) y con una concentracin de 0,5 % inhibi el crecimiento de las plantas (12,0 mg). El efecto fue ms significativo cuando se inocularon bacterias en una concentracin de 2 x 105 UFC mL-1 alcanzndose 19,3 mg de biomasa fresca. Por el contrario, con 1 x 107 UFC mL-1 se observ una reduccin significativa del peso (13,1 mg) de la biomasa (Idriss et al., 2007).
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Para demostrar la produccin de giberelinas por B. pumilus y B. licheniformis se realizaron bioensayos con la aplicacin de Paclobutrazol, un inhibidor de la biosntesis de estos reguladores del crecimiento y se demostr que los sntomas de enanismo inducidos en las plantas de Alnus glutinosa L. fueron revertidos con la aplicacin de extractos de cultivos de las especies de Bacillus, observndose incremento en la longitud de los tallos (5,4 cm en B. licheniformis; 5,1 cm en B. pumilus y 2,8 cm en el testigo) y en el rea foliar (10,4 cm2 con B. licheniformis; 9,6 cm2 con B. pumilus y 4,8 cm2 con el testigo). El anlisis por cromatografa de gases indic la produccin de giberelinas C19 bioactivas de los tipos GA1: 130-150 ng/mL, GA3: 50-60 ng/mL, GA4:8-12 ng/mL y GA20: 2-3 ng/mL (Gutirrez et al., 2001). Los filtrados de cultivos de B. amyloliquefaciens y B. subtilis presentaron actividad promotora del crecimiento, observndose elongacin en el test de colepteros de maz. B. amyloliquefaciens alcanz los mayores valores comparables con los del cido indolactico en concentraciones de 106107 mol L-1; sin embargo, al cuantificar se detectaron bajas concentraciones, de 10-8 a 10-9 mol L-1 de AIA. Segn los resultados, la concentracin de AIA encontrada no es equivalente a la de AIA necesaria para inducir los efectos observados en las plntulas, por lo que es posible que stos sean el resultado de ms de una sustancia promotora del crecimiento (Idriss et al, 2004). Diversos investigadores (Orozco & Martnez, 2009; Cuervo, 2010; Ros & Ziga, 2012), han reportado especies de Bacillus como fijadoras de nitrgeno en medio Nfb; sin embargo, tambin existen resultados contradictorios en donde se determin que la mejora en la toma de nitrgeno por las plantas inoculadas con B. amyloliquefaciens y B. pumilus no fue consecuencia de la fijacin de nitrgeno, porque las bacterias en el laboratorio no demostraron ser fijadoras. Las plantas liberaron mayores porcentajes de carbono en los exudados radiculares, por lo que se increment la actividad microbiana. A su vez, el proceso increment el nitrgeno disponible en el suelo y el flujo de nitrgeno hacia las races de las plantas (Adesemoye et al., 2009). En races de manglares negros (Avicennia germinans L.) y blancos (Laguncularia racemosa L.) se obtuvieron 30 aislamientos de bacterias solubilizadoras de fsforo, entre los que se identificaron B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. atrophaeus y Paenibacillus macerans. La actividad solubilizadora de fsforo se demostr por la formacin de halos transparentes alrededor de las colonias desarrolladas en medio slido con fosfato tribsico de calcio como fuente de fsforo (Vsquez et al., 2000).

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Se monitore el crecimiento vegetativo de Hordeum vulgare cebada en suelo esterilizado e inoculado con cuatro cepas de Bacillus spp. aisladas de la rizsfera de cebada y algodn, y que en laboratorio fijaron nitrgeno y solubilizaron fsforo. El fsforo disponible en el suelo se increment significativamente por la inoculacin de las semillas de cebada con Bacillus H-13 y Bacillus RCO1. Tambin se increment entre 8,9 a 16,7 % el peso de las races, frente al control no inoculado, as como el peso de los tallos entre 28,6 a 34,7 %. A su vez, se increment entre 20,3 a 25,7 % la biomasa total frente al testigo, valores superiores a 18,1 % obtenido con la aplicacin de fsforo, pero inferior a 31,1 % alcanzando con fsforo-nitrgeno (Cambolat et al., 2006). Las bacterias del gnero Bacillus son consideradas como ayudadoras de la micorrizacin (MHB, mycorrhizatium helper bacteria), concepto segn el cual estas bacterias no pueden estimular directamente el crecimiento de las plantas en ausencia de un apropiado hongo micorrtico. Para investigar este efecto se realiz la co-inoculacin del hongo micorrtico Pisolithus tinctorius con B. licheniformis y B. pumilus en Pinus pinea. Las bacterias del gnero Bacillus incrementaron el crecimiento de las plantas del pino. Debido a que se observ incremento en la longitud de las plantas inoculadas, por un mayor crecimiento de las zonas internodales pero no por un incremento en el nmero de nudos, se relacion el efecto biolgico con la produccin de giberelinas. Por su parte, el incremento de la superficie radicular se atribuy a la produccin de cido indolactico. A su vez, estas bacterias interfirieron con la sobrevivencia del micelio micorrtico, observndose disminucin en la concentracin de ergosterol (membrana citoplasmtica) y quitina (pared celular), considerados como indicadores de la biomasa fngica metablicamente activa y de la integracin del hongo en el sistema radicular, respectivamente (Probanza et al., 2001). Bacillus subtilis es conocido como antagonista de muchos hongos fitopatgenos, debido a la continua produccin de antibiticos, metabolitos voltiles, competencia por nutrientes, exclusin de sitios y colonizacin del patgeno por la bacteria (Butt et al., 1999, mencionados por Bernal et al., 2006). Con el objetivo de investigar la utilizacin de B. subtilis ATCC 6051, Pseudomonas aeruginosa 7NSK2, P. fluorescens CMR12 y Serratia phymuthica 1270, en el control de Stemphylium solani en Lycopersicon esculentum Mill. tomate, se realiz un experimento en invernadero. Los inculos se obtuvieron con las bacterias cultivadas en agar King B y la concentracin de las suspensiones celulares fue estandarizada a 108 UFC mL-1. Las aplicaciones foliares se realizaron cada 7 das, con un atomizador manual, inicindose 15 das despus del transplante hasta la fase fisiolgica de aparicin del tercer racimo floral. Todos los tratamientos presentaron efectividad frente al testigo. A los 21 das, los menores valores en el porcentaje de intensidad de ataque (5 y 8 %), se obtuvieron con oxidoruro de
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cobre y B. subtilis, respectivamente, sin diferencias significativas, concluyndose que esta bacteria antagonista constituye una alternativa de proteccin frente a los hongos causantes de manchas foliares en tomate (Bernal et al., 2006). Con Bacillus spp. la promocin del crecimiento vegetal est asociada generalmente al control biolgico a travs de la antibiosis (endotoxinas, siderforos), competencia por espacio o por nutrimentos, interaccin directa con el patgeno (microparasitismo y lisis enzimtica) e induccin de resistencia sistmica. La resistencia inducida es definida como un perfeccionamiento de la capacidad defensiva de la planta frente a un amplio espectro de patgenos y plagas, adquirida despus de un estimulo apropiado. La induccin de resistencia por rizobacterias es referida como resistencia sistmica inducida (ISR, induced systemic resistance) y no causa algn sntoma de necrosis en las plantas hospederas (Kloepper et al., 2004). Las especies de B. amyloliquefaciens, B. subtilis, B. pasteurii, B. cereus, B. pumilus, B. mycoides y B. sphaericus inducen significativas reducciones en la incidencia o severidad de varias enfermedades con una diversidad de hospederos. La ISR ha sido demostrada en invernadero y campo, en Lycopersicon esculentum Mill. tomate, Capsicum annuum aj, Citrullus vulgaris Schrad sanda, Beta vulgaris L. remolacha, Nicotiana tabacum L. tabaco, Cucurbita maxima Duch zapallo, Pinus pinea L. pino entre otros cultivos, para enfermedades como manchas foliares fungosas y bacterianas, virosis sistmicas, nematodos del nudo de la raz y hongos causantes de chupadera y tizn tardo. Los mecanismos para la ISR son similares en algunos casos a los de Pseudomonas; independientes del cido saliclico, pero dependientes del cido jasmnico, etileno y el gen regulador NPRI. En otros casos, los mecanismos son dependientes del cido saliclico e independientes del cido jasmnico y el gen NPRI (Kloepper, 2003; Kloepper et al., 2004). Se investig el potencial de mezclas de B. amyloliquefaciens, B. sphaericus y cinco cepas de B. pumilus para inducir resistencia sistmica a las enfermedades causadas por Ralstonia solanacearum en tomate, Colletotrichum gloeosporioides en aj, Rhizoctonia solani en Brassica oleracea L. var capitata col y el virus del mosaico (CMV) en Cucumis sativus pepinillo. Para determinar la compatibilidad in vitro, las siete cepas de Bacillus fueron evaluadas individualmente entre ellas y frente a tres de los patgenos identificados, no observndose algn efecto de antibiosis. A continuacin, se determin que cuatro (B. amyloliquefaciens ms B. pumilus y mezclas de cepas de B. pumilus) de las 21 combinaciones de Bacillus y una cepa de B. pumilus individualmente redujeron significativamente la severidad de las
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cuatro enfermedades frente al testigo, concluyndose que las mezclas de PGPR pueden inducir en un mayor grado la resistencia sistmica frente a hongos, bacterias y virus fitopatgenos en comparacin con los testigos (Jetiyanom & Kloepper, 2002). La resistencia sistmica inducida (ISR) es una respuesta de defensa de la planta ante la presencia y actividad de un agente biolgico no patognico, especfico, que reduce la severidad o la incidencia de la enfermedad o dao causado por un patgeno que se encuentra especialmente separado del agente inductor. La resistencia sistmica tambin puede ser inducida por sustancias qumicas o por la presencia de patgenos, denominndose entonces resistencia sistmica adquirida (SAR). Las diferencias entre ISR y SAR son el agente inductor y los signos que presenta la planta. ISR es un fenmeno independiente del cido saliclico, etileno y cido jasmnico y no produce la acumulacin de protenas relacionadas con la patogenicidad (PR). Estas protenas son acumuladas en la SAR inducida por patgenos o qumicos. (Chaves, 2007). Segn lo expuesto, en remolacha con B. mycoides y B. pumilus la resistencia sistmica se asoci con el incremento de la actividad peroxidasa y produccin de isozimas quitinasa y B, 1,3-glucanasa. En tabaco B. pumilus increment los niveles de cido saliclico. En races de guisantes se detect engrosamiento de las paredes de las clulas epidermales y corticales que limitaron la invasin por Fusarium oxysporum f. sp. pisi. Adems, las paredes celulares presentaron elevados porcentajes de callosa e infiltraciones de compuestos fenlicos. En plantas de Cucumber tratadas con B. pumilus se observ una rpida lignificacin en respuesta a Colletotrichum orbiculare y la actividad peroxidasa y superxido dismutasa (SOD) se increment frente a los testigos no tratados (Jetiyanom & Kloepper, 2002; Kloepper et al., 2004). En tomate cultivado en invernadero se investig la posibilidad de reducir la dosis del fertilizante qumico mediante su aplicacin combinada con B. amyloliquefaciens y B. pumilus. Segn la curva de respuesta a las diferentes dosis del fertilizante, los mayores valores en el peso de las plantas de tomate se alcanzaron con 100 % de fertilizante, no diferencindose significativamente del fertilizante ms Bacillus spp. (19,9 y 21,5 g respectivamente). Tambin se observ que en los tratamientos PGPR mas 80 y 70 % de fertilizante qumico se alcanzaron valores estadsticamente similares con los de 100 % de fertilizante sin PGPR (22,2; 21,3 y 19,9 g respectivamente), por lo que se concluy que las PGPR ms 75 % de la dosis del fertilizante qumico pueden utilizarse como parte de una estrategia en el manejo integrado del cultivo del tomate (Adesemoye et al., 2009).

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Bajo condiciones de campo se estudi el efecto de tres niveles de fertilizacin con nitrgeno (0,120 y 240 kg ha-1) en el crecimiento y componentes del rendimiento de Solanum tuberosum L. papa inoculada con Bacillus sp. OSU-142. Esta bacteria increment significativamente el peso de las plantas, nmero de tallos por planta y peso promedio de tubrculos, pero el incremento no fue significativo en el nmero total de tubrculos por planta y el nmero de tubrculos segn el tamao (<35mm, 35-50mm, >50mm), frente a los testigos. La inoculacin de Bacillus sp. en parcelas fertilizadas increment el rendimiento total de tubrculos frente a los testigos no fertilizados, alcanzando el mayor valor de 21,3 t ha-1 con la dosis 120 kgN ha-1. Segn los resultados, Bacillus sp. OSU-142 slo o en combinacin con el fertilizante qumico tiene un gran potencial para incrementar el rendimiento y sus componentes, adems, de reducir la necesidad del fertilizante qumico (Ekin et al., 2009). Nueve cepas de Bacillus spp. caracterizadas como promotoras del crecimiento de diferentes cultivos agrcolas fueron inoculadas en semillas de pin blanco con y sin la aplicacin del suplemento de quitina, determinndose que B. pumilus, B. circulans, B. lentus y B. polymyxa, junto a la quitina, as como B. polymyxa y Bacillus sp. sin quitina permitieron alcanzar 100 % de emergencia frente al testigo con 80 %. Por su parte, con B. pumilus suplementado con quitina se observ promocin del crecimiento de plntulas hasta los 42 das, incrementando la altura (113 %), peso de la biomasa area (360 %) y radicular (467 %), rea de hoja (256 %) y contenido de clorofila (74 %). A su vez, en las plntulas de semillas tratadas con esta bacteria sin quitina se increment la biomasa area (473 %), biomasa total (407 %) y el contenido de clorofila (82 %). Se concluy que B. pumilus solo o en combinacin con las otras bacterias mejoran el crecimiento inicial de las plntulas de pin blanco y por lo tanto pueden incrementar el establecimiento en campo (Desai et al., 2007). 6.3 Cultivo de Jatropha curcas L. pin blanco El pin blanco es una oleaginosa originaria de Mxico y Centroamrica, pero crece en la mayora de los pases tropicales. Es cultivada en Amrica Central, Sudamrica, Sureste de Asia, India y frica. (Figura 1). Su taxonoma mencionada por Recalde & Duran (2009) es: Reino Divisin Clase Orden Familia Gnero Especie : : : : : : : Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Euphorbiales Euphorbiaceae Jatropha Jatropha curcas L.
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El pin es una planta perenne, cuyo ciclo productivo se extiende entre 45 a 50 aos. Es de crecimiento rpido y con una altura normal de 2 a 3 metros. El grosor del tronco es de 20 cm con crecimiento desde la base en distintas ramas. La corteza es blanco griscea y exuda un ltex translcido. Normalmente se forman cinco races, una central y cuatro perifricas. Los tallos crecen con discontinuidad morfolgica en cada incremento. La corteza es de color verde amarillenta, plido y casi lisa, delgada como papel, con desprendimientos en tiras horizontales. La corteza interna blanca con rayas rojas, exuda una savia amarillenta y sabor astringente. A su vez, las hojas normalmente se forman con tres a siete lbulos acuminados, poco profundos y grandes con pecolos largos de 10 a 15 cm y de igual ancho. El haz es verde, el envs verde claro, glabro o este ltimo con pelillos finos (Recalde & Duran, 2009; Quimbayo, 2010). La inflorescencia del pin es una pancula, con las flores femeninas (10-20 %) en los pices del tallo principal y las ramas de las flores. Las flores masculinas son ms numerosas (80-90 %) y ocupan posiciones subordinadas en la inflorescencia. Las flores masculinas se abren durante un perodo de 8-10 das, mientras que las flores femeninas solo se abren durante 2-4 das. El desarrollo del fruto necesita 90 das, desde la floracin hasta que madura la semilla. El fruto es una cpsula drupcea verdosa-amarillenta y carnosa, pero caf oscuro o negro y dehiscente cuando est seca. La fruta produce tres almendras negras, cada una aproximadamente de 2 cm de largo 1 cm de dimetro. Las semillas (dos a tres por fruto), contienen un aceite no comestible que se puede utilizar directamente para aprovisionar de combustible lmparas y motores de combustin o se puede transformar en biodiesel. Adems, se usa para fabricar jabones y tambin se puede obtener un colorantes. Una vez colocada la semilla en el sustrato adecuado y con una buena humedad la geminacin toma 5 das. Se abre la cscara de la semilla, sale la radcula y se forman cuatro races perifricas pequeas. La germinacin es epgea (cotiledones surgen sobre la tierra). Poco despus que las primeras hojas se han formado, los cotiledones marchitan y se caen (Quimbayo, 2010; Prez et al., 2012). Actualmente, existen plantaciones o planes de instalacin de pin blanco en casi todo el mundo (frica, Asia, Centroamrica, Sur Amrica, Estados Unidos), debido a su alta adaptabilidad a diferentes tipos de suelos y su caracterstica txica, por lo cual, a diferencia de otros cultivos energticos, no compiten con la seguridad alimentaria. El rango de altitud en la que crece es de 0 a 1200 msnm (con preferencia 0-600 msnm), con un requerimiento de agua entre 200 a 2000 mm y con capacidad para soportar largos periodos de sequa. En la regin Lambayeque las parcelas de siembra se localizan en el distrito de Motupe en los sectores: Tongorrape, Chanduv, Motupe y Escusa Baraja, contndose en la actualidad con 33 ha de cultivo instaladas (Prez et al., 2012).

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La produccin de biodiesel a partir de pin y palma aceitera se inicia con el ingreso de la materia prima para la extraccin mecnica. El aceite obtenido se mezcla en la unidad adecuada con el material necesario para la transesterificacin ms un pequeo exceso del mismo catalizador. El producto de la reaccin compuesto por metilsteres (biodiesel), glicerina, metanol en exceso y catalizador, ingresa a la unidad de neutralizacin, donde con un cido mineral se neutraliza el catalizador remanente. Posteriormente en la unidad de destilacin al vacio se despoja al producto de los voltiles, fundamentalmente compuestos por alcohol metlico. Los vapores de metanol se condensan y se envan al tanque de almacenamiento para ser nuevamente introducidos en el ciclo. El producto de fondo de la unidad de destilacin, que contiene al biodiesel, glicerina y sales se enva a la unidad de decantacin continua, en la cual se separa el biodiesel del resto de los productos. La fase ligera (biodiesel) se enva a la columna de lavado, mientras que la fase pesada (glicerina bruta) que contiene aproximadamente 90% de glicerina, eventuales impurezas y sales discurren al tanque de almacenamiento. En la columna de lavado, el biodiesel se lava retirando la trazas de glicerina que pudiera contener y el producto lavado de la parte superior de la columna se separa, y se lleva a la unidad de secado y se almacena (FAO, 2010b).

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Figura 1. Planta de Jatropha curcas L. pin blanco.

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7. MATERIALES Y MTODOS 7.1 Materiales 7.1.1 Material biolgico El material biolgico estar conformado por muestras de suelo rizosfrico de pin blanco cultivado en el distrito de Motupe, en Lambayeque, por cepas nativas de Bacillus spp. y semillas de pin blanco. 7.1.2 Material de laboratorio Placas de Petri. Lminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos. Viales. Pipetas de 1 y 10 mL Tubos de vidrio (13x100 mm y 15x150 mm). Agitadores de vidrio. Asas bacteriolgicas. Algodn de 500 g Gradillas. 7.1.3 Medios de cultivo Agar leche 1 % Agar nutritivo. Agar quitina coloidal 1 % Agar tripticasa soya. Agar Sundara Rao Sinha, SRSM. Caldo extracto de suelo 10 % Caldo nutritivo. Caldo peptonado. Caldo tripticasa soya suplementado con triptfano. Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol, (Nfb) 7.1.4 Reactivos y colorantes Colorantes para tincin de Gram. Perxido de hidrgeno. Tiras reactivas para oxidasa. Azul de bromotimol. Reactivo de Salkowski. Solucin oxidante para determinacin de amonio. Solucin salina esterilizada 0,87 % (p/v)

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7.2 Mtodos 7.2.1 Poblacin y muestra de estudio La poblacin estar constituida por bacterias del gnero Bacillus, presentes en el suelo rizosfrico de pin blanco y se trabajar con las bacterias aisladas de 54 muestras, durante setiembre a diciembre de 2012. El nmero de muestra fue calculado segn la frmula mencionada por Alvitres (2000), tomando en cuenta una prevalencia del 90 % (Desai et al., 2007).

Donde: n = Tamao de muestra Z = 1,96 ( = 0,05); valor estndar P = tasa de prevalencia (0,90) presencia de Bacillus en rizsfera de pin blanco q = tasa de ausencia 1-p (0,10) t = error permitido (0,08) ( ) ( ( )( ) )

7.2.2 Variables en estudio Las variables cualitativas sern las cepas nativas de Bacillus spp. productoras de enzimas y cido indolactico, fijadoras de nitrgeno, solubilizadoras de fsforo y que no afecten negativamente el poder germinativo del pin blanco. 7.2.3 Tipos de estudio y diseo de contrastacin de hiptesis El trabajo de investigacin ser descriptivo y transeccional (Hernndez et al., 2003) y para contrastar la hiptesis se utilizar el diseo de una sola casilla (Alvitres, 2000), segn el cual se aislar e identificar Bacillus spp. y se determinar la produccin de enzimas y cido indolactico, el nitrgeno fijado y el fsforo solubilizado, as como el efecto en el poder germinativo del pin blanco. 7.2.4 Zona de muestreo Para aislar Bacillus spp. durante setiembre a noviembre de 2012 se colectarn 54 muestras de suelo rizosfrico de pin blanco, en campos comerciales del distrito de Motupe, provincia de Lambayeque (Figura 2).

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Figura 2. Ubicacin geogrfica de la zona de muestreo correspondiente al distrito de Motupe, provincia de Lambayeque, en el departamento de Lambayeque, 2012.

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7.2.5 Obtencin de muestras de rizsfera En la zona rizosfrica de plantas de pin blanco se extraern aproximadamente 100 g de suelo. Cada una de las muestras se depositarn en bolsas plsticas debidamente etiquetadas e inmediatamente se transportarn para su procesamiento en el laboratorio de Microbiologa y Parasitologa, seccin Biotecnologa Microbiana de la Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, en Lambayeque. 7.2.6 Aislamiento e identificacin de Bacillus spp. Para el aislamiento de Bacillus spp. segn Ros y Ziga (2012), cada muestra de suelo rizosfrico de pin blanco se tamizar y del material obtenido se tomarn 10 g para realizar diluciones en solucin salina esterilizada (0.87 % NaCl p/v) hasta 10-2. Esta dilucin se llevar a tratamiento trmico a 80 C durante 10 minutos y luego se enfriar rpidamente. A continuacin, se tomar una alcuota y se sembrar mediante la tcnica de estra sobre la superficie de agar nutritivo (Anexo 1) en placas de Petri. Se incubar en aerobiosis a 30 C durante 24 horas y se realizar tincin de Gram a las colonias desarrolladas. En caso de observar bacilos Gram positivos, catalasa positivos, sern cultivados en viales con agar tripticasa soya (TSA) constituyendo los cultivos puros que sern guardados en refrigeracin (8 C). El gnero Bacillus se identificar segn el Manual de Bergey de Bacteriologa Sistemtica (Vos et al., 2001) identificando la posicin de las esporas, crecimiento a 45 y 65 C; pH 5,7; NaCl 3,5 y 7 %; utilizacin del citrato como fuente de carbono y energa, prueba de oxidacin fermentacin (O-F); pruebas de oxidasa y catalasa, crecimiento anaerobio en glucosa; produccin de cido a partir de arabinosa, manitol y xilosa; hidrlisis del almidn, gelatina y casena; reduccin de nitratos y produccin de acetona o 2,3 butanodiol en la prueba de Voges-Proskauer (Guilln et al., 2006; Cuervo,2010). 7.2.7 Produccin de enzimas Cada una de las cepas nativas de Bacillus spp. sern sembradas mediante la tcnica de estra sobre agar leche 1 % y agar quitina coloidal al 1 % (Anexo 2) y sern incubadas a 30 oC por 48 y 120 horas, respectivamente, en aerobiosis, para la investigacin de la produccin de proteasas (Carreo y Muoz, 2012) y quitinasas (Franco, 2009). a. Proteasas Se observarn las colonias bacterianas desarrolladas sobre agar leche 1 % en busca de halo de hidrlisis (zona clara alrededor de la colonia). La casena es la protena principal de la leche y se presenta como una solucin coloidal responsable del aspecto blanco y opaco. Cuando los microorganismos producen caseinasa, hidrolizan la protena originndose derivados solubles y cristaloides y

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observndose un halo transparente alrededor de las colonias formadas (Wiseman, 1985; Carrillo, 2003). b. Quitinasas Se observarn las colonias bacterianas desarrolladas sobre agar quitina coloidal al 1 %, en busca del halo de hidrlisis a su alrededor. La quitina es degradad por las quitinasas, enzimas que hidrolizan un enlace entre dos unidades de N-acetil glucosamina (NAG) consecutivas, observndose un halo de hidrlisis alrededor de las colonias (Hoster et al., 2005). 7.2.8 Deteccin y cuantificacin de cido indolactico (AIA) producido in vitro Para la deteccin y cuantificacin de cido indolactico producido in vitro segn la reaccin colorimtrica de Salkowski descrita por Mantilla (2007) cada cepa nativa de Bacillus spp. ser cultivada en caldo nutritivo por 24 horas, de donde se tomarn 0,6 mL para inocularlos en 5 mL de caldo tripticasa soya suplementado con triptfano (Anexo 3). Despus de la incubacin a 30 C por 72 horas en agitacin constante (150 rpm), los cultivos sern centrifugados a 2000 rpm durante 15 minutos. A continuacin, 0,4 mL de cada uno de los sobrenadantes se depositarn en tubos, se agregarn 1,6 mL del reactivo de Salkowski modificado (Anexo 3) en una relacin 1:4 se mezclarn y se dejarn en reposo durante 30 minutos en oscuridad. La positividad a la produccin de cido indolactico estar dada por la aparicin de una coloracin violcea y se leer la absorbancia en espectrofotmetro de luz visible a 530 nm. Las concentraciones se calcularn en una recta patrn que se obtendr con diluciones sucesivas de una solucin 100 ppm de cido indolactico. 7.2.9 Deteccin y cuantificacin de nitrgeno fijado in vitro Para la deteccin y cuantificacin de nitrgeno fijado in vitro por las cepas nativas de Bacillus spp. nativas, se seguir la metodologa descrita por Lara et al. (2007) y Cadena & Martnez (2011). Cada una de las cepas de Bacillus spp. sern sembradas por puntura en 6 mL de medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol (Nfb) semislido (Anexo 4), a razn de una cepa por tubo. La incubacin se realizar en aerobiosis a 30 C, hasta por 1 semana y se considerarn como bacterias fijadoras de nitrgeno los tubos donde se observe el viraje del indicador del verde al azul y la presencia de una pelcula gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie. Para la cuantificacin del nitrgeno fijado, segn el mtodo colorimtrico del fenolhipoclorito (Anexo 4) cada una de las cepas nativas de Bacillus spp. cultivadas en agar nutritivo por 24 horas, sern inoculados en tubos de 15 x 150 mL conteniendo 5 mL de caldo extracto de suelo 10 % (Anexo 4) y se incubarn a 30 C por 72 horas en agitacin constante (150 rpm).
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A continuacin, se agregarn 15 mL de KCl 2M, se agitarn a 150 rpm durante 1 hora y se dejarn en reposo por 1 hora adicional, para despus tomar 10 mL del sobrenadante y centrifugarlos (2000 rpm) durante 20 minutos. Luego, los sobrenadantes se vertern en tubos de dilucin y se aadirn 0,4 mL de nitroprusiato de sodio 0,5 %; 0,4 mL de solucin alcohlica de fenol 10 % y 1 mL de solucin oxidante. Los tubos se agitarn para mezclar y se dejarn en reposo durante 1 hora adicional. La positividad a la fijacin de nitrgeno estar dada por la aparicin de una coloracin azul y se leer la absorbancia en espectrofotmetro de luz visible a 632,9 mm. Las concentraciones se calcularn en una recta patrn obtenida con diluciones sucesivas de una solucin de 100 ppm de cloruro de amonio. 7.2.10 Deteccin y cuantificacin de fsforo solubilizado in vitro Para la deteccin y cuantificacin de fsforo solubilizado in vitro por las cepas nativas de Bacillus spp. se utilizar la metodologa descrita por Vsquez et al (2011). Cada cepa nativa de Bacillus spp. ser sembrada mediante la tcnica de estra en agar para aislamiento de microorganismos solubilizadores de fsforo, Sundara Rao Sinha Medium, SRSM (Anexo 5). Las placas de Petri se incubarn a 30 C hasta por 96 horas y las colonias solubilizadoras de fsforo sern reconocidas por el cambio de color del indicador al amarillo y formacin de un halo traslcido alrededor de la colonia. Despus, las colonias se cultivarn nuevamente por dos veces consecutivas en agar SRSM para verificar la actividad solubilizadora de fsforo y se medir el halo de las colonias que conservan su capacidad para solubilizar fsforo. Para la cuantificacin de fsforo solubilizado, se obtendr el inculo de cada una de las cepas de Bacillus spp. solubilizadoras de fsforo cultivadas en 1 mL de caldo SRSM a 30 C durante 20 horas en agitacin constante (150 rpm). A continuacin, 0,6 mL de cada uno de los cultivos bacterianos sern inoculados en frascos con 20 mL de caldo SRSM e incubados a 30 C, con agitacin constante (150 rpm) hasta por 96 horas. A partir del momento de la inoculacin (0 horas) y cada 24 horas, hasta las 120 horas, se tomarn submuestras de 3 mL de caldo SRSM en los que se determinar el pH y se cuantificar el fsforo soluble mediante el mtodo colorimtrico del molibdato segn Rodier & Rodi, 2005(Anexo 5).

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7.2.11 Efecto de cepas nativas de Bacillus spp. en el poder germinativo de Jatropha curcas L. pin blanco Con cada cepa nativa Bacillus spp. cultivada en caldo nutritivo hasta alcanzar la fase exponencial, se obtendr una suspensin con una concentracin de 108 clulas/mL y despus se mezclar con un adherente constituido por una solucin de sacarosa al 10 % previamente esterilizada (8 mL de inculo ms 2 mL de solucin). Ambos sern homogenizados por movimientos de rotacin durante 2 minutos e inmediatamente despus sern vertidos sobre semillas de pin blanco en bolsas plsticas de primer uso, a razn de 100 mL por kg de semilla, correspondiente a 3,6 mL para 36 g de semilla por bolsa El material biolgico ser homogenizado por 10 minutos y despus se secar en estufa a 30 C durante 30 minutos para favorecer la adhesin del inculo a las semillas (Cadena & Martnez, 2011). En bandejas de plstico de 20 x 14 cm, en cuyo fondo se colocarn tres capas de papel toalla esterilizado y humedecido con agua destilada esterilizada y con la ayuda de pinzas estriles, se depositarn 15 semillas de pin blanco inoculadas con Bacillus spp. (en tres hileras a razn de cinco semilla por hilera). El procedimiento se realizar por triplicado para cada una de las cepas nativas de Bacillus spp. seleccionadas, teniendo como testigo semillas tratadas con caldo nutritivo no inoculado y semillas no tratadas. Las bandejas se taparn con una gasa estril y se mantendrn a temperatura ambiente (28 C), realizando riegos intermediariamente. Asimismo, cada da se contarn las semillas germinadas hasta alcanzar el mximo de germinacin. Los resultados sern expresados como porcentaje de germinacin. 7.2.12 Anlisis de los datos Los datos obtenidos sern ordenados en tablas y figuras que permitan determinar el potencial de las cepas nativas de Bacillus spp. como promotoras del crecimiento en plantas. En el presente trabajo se utilizarn los programas Microsoft Office Word y Excel versin 2007.

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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9 FECHA DE PRESENTACIN Setiembre de 2012

Dra. Blga. Carmen Rosa Carreo Farfn

.. Aguilar de la Cruz Heyner Isaac Responsable

.......... Coral Cruz Jorge Eduardo Responsable

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ANEXO 1 Medios de cultivo para el aislamiento, y mantenimiento de Bacillus spp. (Segn Ros & Ziga, 2012)

Agar nutritivo (AN) Componentes Peptona Extracto de carne Agar agar Agua destilada Ajustar el pH a 7,0 Esterilizar en autoclave a 121 C y 15 lb de presin. g/L 5,0 3,0 15,0 1000 mL

Agar tripticasa soya (TSA)

Componentes Triptona Peptona Extracto de levadura Glucosa Cloruro de sodio Agar agar Agua destilada Esterilizar en autoclave a 121 C y 15 lb de presin.

g/L 15,0 5,0 3,0 5,0 5,0 15,0 1000 mL

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ANEXO 2 Medios de cultivo para la deteccin de proteasas y quitinasas in vitro a. Agar leche 1 % (en Carreo y Muoz, 2012) Componentes Triptona Extracto de levadura Glucosa Agar agar Leche evaporada Agua destilada g/L 5,0 2,5 1,0 15,0 10 mL 980 mL

b. Agar quitina coloidal 1% (en Franco, 2008) Componentes g/L Solucin Stock K2HPO4 3 % (p/v) 10,0 mL Solucin Stock MgSO47H2O 1.5 % (p/v) 10,0 mL Solucin Stock (CaCl2 0,5 %,FeCl3 0,06 %, NaCl 0,5 % p/v) 10,0 mL NH4Cl2 1,0 Quitina coloidal 1 % (p/v) 10,0 Agar agar 15,0 Mezclar los componentes y llevar a volumen con agua destilada, calentar al fuego durante 5 minutos para disolver las sales, ajustar el pH a 6,8. Autoclavar (15 libras de presin y 121 C). Servir en placas de Petri esterilizadas.

Obtencin de la quitina de camarn Colocar 10 g de cscara de camarn en 100 mL de H3PO4 al 85 %, dejar reposar 24 horas a temperatura ambiente (25 C) y agitar eventualmente para bajar la espuma. Los grnulos de quitina precipitan con agua destilada. Para separar los grnulos del cido utilizar cuatro capas de gasa y filtrar al vaco en un matraz kitasato. Lavar con agua destilada hasta quitar el exceso de cido y neutralizar el pH. Agregar alcohol etlico 96 % y dejar secar extendido en papel absorbente. A continuacin, esterilizar en autoclave y guardar en refrigeracin hasta su uso posterior.

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ANEXO 3 Deteccin y cuantificacin de cido indolactico producido in vitro mediante la reaccin colorimtrica de Salkowski (en Mantilla, 2007) a. Caldo tripticasa soya (en Garca y Muoz, 2009) (g/L) suplementado con triptfano

Componentes Peptona de casena Peptona de harina de soya D (+) Glucosa (o dextrosa) Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Triptfano Agua destilada en cantidad suficiente

g/L 17,0 3,0 2,5 5,0 2,5 0,01 1L

b. Reactivo para la deteccin y cuantificacin de cido indolactico producido in vitro (en Mantilla, 2007)

Componentes Agua destilada cido sulfrico concentrado Cloruro de fierro 0,5 M en agua destilada

mL/L 250,0 150,0 7,5

La solucin de cloruro de fierro 0,5M se obtiene al mezclar 1,61 g de cloruro de fierro (FeCl3) con 20 mL de agua destilada

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c. Procedimiento para elaborar la curva de calibracin para cuantificar cido indolactico, AIA (en Mantilla, 2007) c.1. Fundamento de la reaccin de Salkowski Mediante la reaccin de Salkowski se detectan grupos indol presentes en el medio de cultivo y la concentracin de indol es directamente proporcional a la intensidad de color rojo producido. A su vez, el cambio de color es el resultado de una reaccin oxidativa con el cido sulfrico, donde por medio de una transaminacin un grupo amino es sustituido por el cloro proveniente del FeCl 3, originando un compuesto visible de color rosado a rojo en el caso del indolactico. Otras coloraciones indican la presencia de productos intermedios de la sntesis del cido indolactico, que pueden ser generados a partir del triptfano. c.2. Preparacin de diluciones a partir de una solucin madre de AlA Para obtener una curva patrn de cido indolactico, preparar una solucin madre de 100 g. mL-l, para lo cual se pesan 10 mg de cido indolactico y se disuelven con unas gotas de NaOH en un matraz aforado a 100 mL. A continuacin, enrasar con agua bidestilada y agitar hasta homogenizar. Posteriormente se realizan las siguientes diluciones: N de tubo Solucin patrn (100 gmL-1) [L] * 0 20 40 60 80 100 150 200 300 400 500 600 H2O bidestilada [L] 1000 980 960 940 920 900 850 800 700 600 500 400 Concentracin A IA (m g L - 1) 0 2 4 6 8 10 15 20 30 40 50 60

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12

*1000 L = 1 mL

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c.3. Procedimiento para la cuantificacin de AIA por colorimetra Obtenidas las concentraciones parciales de AIA extraer de cada tubo 0,4mL de solucin, verter en tubos de 13 x 75 mm y agregar 1,6 mL de reactivo de Salkowski (1:4). Dejar en reposo en oscuridad por 30 minutos. Observar la presencia de una coloracin rojiza en los tubos. A continuacin, leer la absorbancia de cada dilucin en espectrofotmetro a 530 nm. Una vez obtenida la absorbancia en todas las concentraciones de cido indolactico, corregir los valores y mediante regresin lineal en el programa Microsoft Excel 2007, obtener la ecuacin de la recta y el coeficiente de correlacin lineal (r2) que deber ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersin homognea de los valores sobre la recta.

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ANEXO 4 Deteccin y cuantificacin de nitrgeno fijado in vitro mediante el mtodo indirecto de valoracin del in amonio empleando la tcnica colorimtrica de Berthelot (fenol hipoclorito) a. Medio libre de nitrgeno con azul de bromotimol, nfb Componentes cido mlico KOH K2HPO4 FeSO4.7H2O MnSO4.7H2O MgSO4.7H2O NaCl CaCl2 Na2MoO4 Azul de Bromotimol (0,5 % m/v en etanol) Biotinol Agua destilada en cantidad suficiente g/L 5,0 4,0 0,5 Trazas 0,01 0,01 0,02 0,01 0,002 2,0 mL 0,5 mL 1000 mL

Ajustar el pH a 6,8-7,0 con NaOH. Para obtener medio semislido aadir 2 g de agar agar. Para medio slido aadir 20 mg de extracto de levadura y 15 g de agar.

a. Caldo extracto de suelo al 10 % Componentes K2HPO4 MgCl2 MgSO4.7H2O FeCl3 CaCl2 Triptona Extracto de levadura Extracto de suelo al 10 % Agua destilada g/L 0,4 0,1 0,05 0,01 0,1 1,0 1,0 250 mL 750 mL

Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10 %, depositar en un matraz 250 g de suelo agrcola y 500 mL de agua destilada. Hervir 2 horas, completar a 500 mL con agua destilada y filtrar el sobrenadante. Tomar 25 mL del filtrado y completar a 500 mL con agua destilada.

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b. Reactivos Cloruro de potasio 2 M Cloruro de potasio Agua destilada Solucin alcohlica de fenol 10 % Fenol concentrado Alcohol 97 Nitroprusiato de sodio 0,5 % Nitroprusiato de sodio Agua destilada Solucin oxidante Citrato de sodio Hidrxido de sodio Hipoclorito de sodio 5 % leja comercial Agua destilada

149,12 g 1000 mL 10 mL 90 mL 0,5 g 100 mL 20 g 1g 2 mL 100 mL

d. Procedimiento para elaborar la curva de calibracin para cuantificar el in amonio (Lara et al., 2007) d.1 Fundamento del mtodo colorimtrico de Berthelot (fenolhipoclorito) Se basa en la formacin de un color azul intenso de indofenol, que resulta de la reaccin del in amonio (NH4) con los compuestos fenlicos en presencia de un agente oxidante el cual puede ser hipoclorito de sodio u o-fenol; y la presencia de un catalizador, principalmente nitroprusiato de sodio o de potasio. El mecanismo de la reaccin depende de la luz presente, la temperatura ambiente, catalizadores y pH alcalino. Cuando se utiliza fenol o sodio la reaccin puede ser representada de la siguiente manera: NH3 + 2C6H60-+ 3ClOO = C6H4= N-C6H4-O + 2H2O + OH- + 3Cl-

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d.2 Preparacin de diluciones a partir de una solucin madre de NH 4Cl Para obtener la curva patrn se prepara una solucin madre de 100 ppm de NH4CI, para lo cual se pesa 0,1 g de NH4CI y se disuelve en 1 L de agua bidestilada. Posteriormente, a partir de la solucin madre se efectan las siguientes diluciones: NH4Cl Solucin patrn H2 O bidestilada (Ug/mL = ppm) N de tubo [mL] [mL] NH4Cl [g /mL= 1 0,0 10,0 0 ppm] 2 0,2 9,8 2 3 0,4 9,6 4 4 0,6 9,4 6 5 0,8 9,2 8 6 1,0 9,0 10 7 1,5 8,5 15 8 2,0 8,0 20

d.3 Procedimiento para la cuantificacin de amonio por colorimetra Obtenidas las diluciones, agregar a cada tubo 0,4 mL de solucin alcohlica de fenol al 10 %; 0,4 mL de nitroprusiato de sodio al 0,5 % y 1 mL de solucin oxidante, luego agitar para mezclar y dejar en reposo durante 1 hora. Observar una coloracin que varia del verde azul al azul intenso en funcin de la concentracin de amonio. Leer la absorbancia de cada dilucin en el espectrofotmetro a 632,9 nm. Una vez obtenida la absorbancia de todas las concentraciones de amonio, corregir los valores y mediante regresin lineal con el programa Microsoft Excel 2007, obtener la ecuacin de la recta y el coeficiente de correlacin lineal (r 2) que deber ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersin homognea de los valores sobre la recta.

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ANEXO 5 Deteccin y cuantificacin de fsforo solubilizado in vitro a. Agar Sundara Rao Sinha SRSM (en Vazquez et al., 2000) Componentes Glucosa Fosfato triclcico Sulfato de amonio Cloruro de potasio Sulfato de magnesio Sulfato de manganeso Sulfato de fierro Cloruro de sodio Extracto de levadura Prpura de bromocresol Agar agar Agua destilada en cantidad suficiente pH g/L 10,0 05,0 00,5 00,2 00,3 00,004 00,002 05,0 00,5 00,1 15 1000 mL 07,2

Como fuente de fosfato se puede usar fosfato biclcico (1 g/L de fsforo), fosfato triclcico (1 g/L de fsforo) y roca fosfrica (0,2 % de fsforo).

b. Mtodo colorimtrico del Molibdato para cuantificar fsforo soluble (Rodier y Rodi, 2005) b.1. Fundamento En medio cido y en presencia de molibdato amnico, los ortofosfatos forman un complejo fosfomolbdico que, reducido por el cido ascrbico, desarrolla una coloracin azul susceptible de una determinacin colorimtrica y cuya aparicin se acelera utilizando el catalizador emtico, tartrato doble de antimonio y potasio. b.2 Limpieza de los recipientes de vidrio Para la limpieza del material de vidrio no utilizar detergentes que contengan fosfato. Lavarlos con cido clorhdrico diluido y enjuagarlos cuidadosamente con agua destilada.

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b.3 Reactivos Solucin de cido sulfrico 5N cido sulfrico (d=1.84) Agua destilada hasta enrase Solucin de molibdato amnico 4 % Solucin de cido ascrbico cido ascrbico Agua destilada hasta enrase Solucin de emtico (preparar al momento del uso) Tartrato doble de antimonio y potasio Agua destilada hasta enrase Reactivo para determinacin de ortofosfatos cido sulfrico 5 N Solucin de molibdato amnico Solucin de cido ascrbico Solucin de emtico Solucin madre de 0,2 mgl-1 de fsforo Fosfato monopotsico previamente desecado en estufa a 100 C: Agua destilada hasta enrase Solucin hija de 2 mgl-1 de fsforo Diluir 1 mL de solucin madre en 99 de agua destilada (1/100) b.4 Preparacin de la curva de calibracin Colocar en una serie de matraces aforados de 25 mL: Nmero de matraces Solucin de fsforo de 2 mgL-1 (mL) Agua bidestilada (mL) Reactivo indicador (mL) Agua destilada hasta enrase (mL) Correspondencia de fsforo en mgL
-1

14 mL 100 mL 20 mL 1,76 g 100 mL 0.0274 g 100 mL 40 mL 12 mL 24 mL 4 mL 877 g 100 mL

T 0 20 4 25 0

I 1 19 4 25 0,1

II 2 18 4 25 0,2

III 5 15 4 25 0,5

Esperar 20 minutos y efectuar las lecturas en el espectrofotmetro a la longitud de onda de 690 nm en cubetas de 10 cm. Construir la curva de calibracin. Los datos de la absorbancia corregida se analizan mediante regresin lineal con el programa Microsoft Excel 2007 para obtener la ecuacin de la recta y el coeficiente de correlacin lineal (r2) que deber ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersin homognea de los valores sobre la recta.

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b.5 Procedimiento para cuantificar fosfatos en la muestra Introducir 20 mL de la muestra a analizar en un matraz aforado de 25 mL Aadir 4 mL de reactivo indicador, completar el volumen a 25 mL con agua destilada. Esperar 20 minutos y efectuar la lectura en el espectrofotmetro de luz visible con una longitud de onda de 690 nm. Tener en cuenta el valor ledo para el testigo. Obtener los resultados en la curva de calibracin. Para una muestra de 20 mL, la curva indica el contenido de fsforo expresado en miligramos por litro. La coloracin es estable 24 horas.

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