FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACIN DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

REA DE MICROBIOLOGIA

Prcticas de Laboratorio de Microbiologa UNIVERSIDAD DEL CAUCA

DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO Y EL EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES EN UN CULTIVO BACTERIANO.

Gua No. 7

1. INTRODUCCIN Las bacterias, al igual que los dems seres vivos requieren de una serie de condiciones o factores ambientales para el desarrollo celular y conformacin de poblaciones y comunidades. Los factores pueden diferenciarse en abiticos, referidos a aquellos relacionados con aspectos propios del medio donde se desarrollan, como la temperatura, el pH, los gases respiratorios (O2 y CO2), las radiaciones (lumnicas, sonoras, electromagnticas), la presin (atmosfrica, hidrosttica, osmtica) y la presencia de nutrientes y en biticos, referidos a aquellos relacionados con las interrelaciones que se dan entre las diversas poblaciones y comunidades. Cuando la bacteria encuentra condiciones propicias para su desarrollo o se adapta a las nuevas condiciones del medio, ocurre inicialmente un crecimiento en masa celular y posteriormente, en el nmero de clulas a medida que avanza el tiempo. Estos cambios pueden representarse mediante una curva, la cual ha sido denominada curva de crecimiento, tal como se presenta a continuacin:

Las etapas de la curva de crecimiento son: Fase Lag: Las clulas bacterianas se aclimatan al nuevo ambiente y las caractersticas de estas. En esta fase se da inicialmente un crecimiento en masa celular y luego comienzan a formarse nuevas clulas si se encuentran las condiciones
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apropiadas para ello. Fase de crecimiento exponencial: La poblacin bacteriana se incrementa exponencialmente (el mismo nmero de clulas por la misma unida de tiempo). Las clulas se han adaptado al ambiente. Fase estacionaria: La tasa de crecimiento disminuye por la acumulacin de desechos metablicos y el agotamiento de los nutrientes. La tasa de crecimiento iguala la tasa de mortalidad. Fase de muerte: La poblacin bacteriana disminuye por el agotamiento total de nutrientes, los efectos txicos de los desechos metablicos y las modificaciones sustanciales en el ambiente.

2. OBJETIVOS Establecer la curva de crecimiento de un cultivo bacteriano. Identificar el efecto de algunos factores ambientales en el desarrollo de un cultivo bacteriano.

3. CONSULTAS PRELIMINARES Cules son los factores ambientales determinantes del crecimiento y desarrollo bacteriano? Cul es el principio de operacin de un espectrofotmetro? Qu es la densidad ptica de un cultivo bacteriano? 4. MATERIALES MATERIAL Cajas de Petri Tubo de ensayo con tapa Asa bacteriolgica Mechero Cultivo bacteriano 5. REACTIVOS
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CANTIDAD 10 2 1 1 1

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SUSTANCIAS* Agar nutritivo Caldo nutritivo

No hay restriccin de seguridad por el uso de los medios de cultivo. 6. EQUIPOS EQUIPOS* Incubadora Espectrofotmetro SQ118 Bao de Mara Cmara flujo laminar con luz UV CANTIDAD 1 1 1 1

La incubadora y el bao de mara debern estar previamente calibrados a la temperatura requerida. No manipular el equipo y mantenerlo cerrado. Abrir solamente para incluir el cultivo a incubar. 7. PROCEDIMIENTO 7.1 DETERMINACIN BACTERIANO. DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO

Transfiera con el asa bacteriolgica una porcin de cultivo bacteriano a un tubo de ensayo conteniendo cinco (5) mL de caldo nutritivo. Prepare dos cultivos (2 tubos de ensayo) para obtener una rplica. Determine el porcentaje de transmitancia (%T) de los cultivos inicialmente preparados en la parte anterior, utilizando el espectrofotmetro previamente calibrado a 660 nm. Coloque los cultivos a incubar en bao de mara a 35 - 37 C, realizando agitaciones suaves cada cinco minutos para asegurarse de distribuir las clulas y los nutrientes. Realice lectura del porcentaje de transmitancia de sus cultivos en el espectrofotmetro cada 10 minutos hasta obtener la curva de crecimiento de su cultivo. Convierta el porcentaje de transmitancia obtenido en cada lectura a el valor de densidad ptica (D.O.) del cultivo, aplicando la frmula: D. O. = 2 log %T Con los valores convertidos realice la curva de crecimiento de su cultivo bacteriano, cruzando las variables tiempos versus densidad ptica.

7.2. DETERMINACIN DEL EFECTO DE ALGUNOS FACTORES AMBIENTALES EN UN CULTIVO BACTERIANO. Inocule los medios de cultivo slidos (Agar Nutritivo) proporcionados con la bacteria a
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estudiar. Asegrese de realizar una buena distribucin de clulas sobre la superficie del medio de cultivo. A cada grupo se le proporcionarn los siguientes medios: a. Agar nutritivo con las siguientes concentraciones salinas: 0,5%, 5%, 10% y 15% de NaCl. b. Agar nutritivo con pH modificado a: 4, 7, 8, 9 c. Agar nutritivo estndar el cual ser irradiado con luz ultravioleta durante 5 minutos. Antes de realizar la irradiacin, debe cubrir una mitad de la caja de cultivo con una cartulina. Una vez termine la irradiacin, tape su cultivo y llvelo a la incubadora. Precaucin: no se exponga a la luz ultravioleta ni mire directamente a la lmpara Incube sus cultivos a 35 2 C durante 24.

8. OBSERVACIONES, CLCULOS Y RESULTADOS Al finalizar el perodo de incubacin, realice sus observaciones y anote los resultados. Realice la curva de crecimiento para su cultivo, sealando las diferentes fases de la curva y explicando las posibles desviaciones con relacin a lo esperado tericamente. 9. PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS Cules son los mecanismos de accin sobre las clulas bacterianas de cada uno de los factores ambientales estudiados (pH, presin osmtica e irradiacin)? 10. RECUPERACIN, DESACTIVACIN Y/O ALMACENAMIENTO TEMPORAL DE LOS RESIDUOS. Los residuos resultantes corresponden a cultivos bacterianos, los cuales se inactivan y esterilizan en autoclave. Una vez terminado el proceso de esterilizacin, los residuos se disponen en bolsas termoresistentes, se dejan enfriar hasta solidificacin y se almacenan temporalmente bajo congelacin, La disposicin final se hace mediante el servicio de recoleccin de residuos biolgicos contratado por la Universidad con la Administracin Municipal. 11. BIBLIOGRAFA BENSON, HAROLD. 1981. Microbiological applications. A laboratory manual in general
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microbiology. Wm. C. Brown Company Publishers. Iowa. MADIGAN M. T., MARTINKO J.M. y PARKER J. BROCK. Biologa de los microorganismos. Octava edicin. Pearson Prentice Hall, Madrid,2004.

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