ENVELHECIMENTO

Estudo histoqumico e quantitativo do Colgeno Drmico Facial: efeitos da aplicao tpica de estriol em mulheres menopausadas
M. M. Camargo, Granja C. N. Battlehner, K. Z. Goldman, C. B. David, E. G. Caldini n

Introduo As mulheres representam mais da metade da populao mundial e sua longevidade atual, em pases desenvolvidos, situa-se na oitava dcada; no ltimo tero de sua vida, a mulher sofre os efeitos indesejveis da falncia ovariana resultando em atrofia de diversos rgos, aumento de doenas cardiovasculares e alteraes cutneas relacionadas com o envelhecimento. Estudos histolgicos demonstram que estas alteraes podem estar correlacionadas a modificaes dos constituintes drmicos como as fibras do sistema elstico (Lavker et al., 1987; VitellaroZuccarello et al., 1994), as fibras de colgeno (Shuster e Bottoms, 1963; Uitto et al., 1989a, 1989b), os proteoglicanos e a gua (Potts et al., 1984).

Embora a terapia de reposio hormonal (TRH) tenha contribudo para a atenuao dos efeitos deletrios da menopausa ao nvel de sade global da mulher, os estudos realizados do pouca nfase a seus efeitos benficos sobre a pele, inclusive no ponto de vista esttico (Maheux et al., 1994). As modificaes estruturais da pele, sob efeito estrognico, so acompanhadas por modificaes ultra-estruturais dos fibroblastos drmicos (Carlisle e Montagna, 1979). Sabe-se que fibroblastos da derme humana possuem receptores de estrgeno (Hasselquist et al. 1979). Mtodos imunohistoqumicos j revelaram que a melhora esttica na pele facial de mulheres menopausadas, com o uso tpico de estriol, correlaciona-se com a presena de maior quantidade de colgeno tipo III (Schmidt et al.,1996). Ao contrrio da estrona e do estradiol, o estriol tem sido indicado para uso tpico prolongado, pois no so detectados efeitos sistmicos, tanto pela anlise de esfregaos vaginais como atravs de dosagens de LH, FSH e prolactina (Kainz et al., 1993; Schmidt et al., 1994). Tendo em vista a necessidade de parmetros quantitativos para avaliao das variaes estruturais que contribuem

para a melhoria esttica da pele e a disponibilidade de um estrognio tpico desvinculado de efeitos sistmicos, este trabalho pretende investigar (associando-se um mtodo histoqumico para identificao do colgeno a tcnicas morfomtricas) as modificaes qualitativas e quantitativas das fibras que contm colgeno na derme de fragmentos de pele facial de mulheres menopausadas, antes e depois da aplicao tpica diria de gel contendo estriol.

Casustica e Mtodos
Casustica e Tratamento Participaram deste estudo 14 mulheres menopausadas sem TRH h pelo menos dois anos, pacientes do Ambulatrio da Sociedade Brasileira de Medicina Esttica - Regional So Paulo. Todas as pacientes foram fotografadas e foi colhida uma amostra de tecido da regio pr-tragal esquerda, por meio de um dispositivo de punch de 3 mm de dimetro, antes do incio do tratamento. Todas foram orientadas para a aplicao tpica diria de gel aquoso contendo estriol a 0,1 %, aps higiene facial, noite, durante 3 meses consecutivos. Aps este perodo, foram feitas outras fotografias e novas amostras de tecido foram obtidas das pacientes, desta vez direita.
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Avaliao Fotogrfica Quinze pessoas desvinculadas do protocolo foram tomadas como avaliadores e instrudos a observar os diapositivos obtidos das pacientes antes e aps o protocolo de tratamento, atentando para as rugas. Os diapositivos de cada paciente foram mostrados aos pares (pr- e pstratamento), identificados apenas com letras A e B (colocadas aleatoriamente nas imagens de um mesmo par), pedindo-se ao avaliador que indicasse em qual das duas imagens as rugas lhe pareciam mais evidentes. Auto-Avaliao Ao final do tratamento, todas as pacientes responderam a uma questo tipo mltipla escolha: O que voc acha da sua pele aps o tratamento? As cinco alternativas possveis aparecem na Tabela 1. Mtodos Histolgicos Os fragmentos de pele foram fixados em formol a 4% em tampo fosfato, includos em parafina e os cortes histolgicos obtidos foram submetidos colorao pela eosinahematoxilina e pelo Picrossrius-hematoxilina para estudo histoqumico sob luz polarizada e estudo quantitativo do colgeno. Mtodo Histoqumico da Picrossrius-polarizao Trata-se de um mtodo histoqumico,

pois a colorao com o Picrossrius adiciona uma grande quantidade de molculas do corante paralelamente s molculas de colgeno, obtendo-se, desta forma, um aumento da birrefringncia especificamente das estruturas que contem colgeno, quando se observa o corte de tecido sob luz polarizada (Junqueira et al.,1979). Alm disso, estas fibras assumem cores e intensidades de birrefringncias diferentes, resultantes de seus padres de agregao fsica; assim sendo, fibras finas aparecem como estruturas de cor esverdeada fracamente birrefringentes, enquanto as fibras grossas so caracterizadas por sua forte birrefringncia e pelas cores amarela ou vermelha. A observao de que os colgenos dos Tipos I, II e III mostram diferentes cores e intensidades de birrefringncia num mesmo corte histolgico (Junqueira et al., 1978) pode ser explicada pelo fato amplamente conhecido de que estes diferentes colgenos intersticiais apresentam padres distintos de agregao fsica. Esta a razo pela qual nunca foi alegado que ocorre uma interao qumica diferencial entre o Picrossrius e os diferentes tipos de colgeno. Assim sendo, o mtodo de identificao histoqumica do colgeno foi utilizado, no pela sua propriedade de distinguir entre os diferentes tipos genticos de colgeno, mas sim pela sua capacidade de

distinguir entre Fibras Finas e Fibras Grossas que contm colgeno , supondo que as finas so aquelas recentemente sintetizadas e que se tornam mais espessas medida que o tempo passa. Mtodo Morfomtrico Para a determinao da frao de rea de fibras que contm colgeno finas e esverdeadas (Fibras Finas) e das fibras que contm colgeno grossas amareladas ou vermelhas (Fibras Grossas) foram analisados ao acaso 06 campos da derme, em cada corte, com a objetiva de 40x, em um microscpio de polarizao, onde se acoplou um retculo (sistema teste coerente) ocular (Gundersen et al., 1988). Em cada campo foram contados pontos que se sobrepuseram s Fibras Finas, pontos que se sobrepuseram s Fibras Grossas, pontos que se sobrepuseram s fibras Elastticas, pontos que se sobrepuseram a outras estruturas pertencentes na derme (como por exemplo, clulas ou espao interfibrilar, vasos e os diversos anexos epidrmicos). Aplicou-se o teste Fmx para se testar a homogeneidade das varincias e a seguir, para se estabelecer a existncia de diferenas significativas entre os dados obtidos antes e aps o tratamento, foram utilizados o teste t-pareado (para variveis que apresentaram homogeneidade de varincia) e o teste no-paramtrico de Wilcoxon pareado (para aquelas no homogneas).

Tabela 1. Alternativas e resultado da pergunta de auto-avaliao respondida pelas mulheres aps o tratamento

Resultados
Resultados da avaliao fotogrfica Os resultados mostram que em 89,5% das vezes o avaliador indicou a fotografia da face pr-tratamento como aquela onde as rugas eram mais evidentes (Figura 1). Resultados da auto-avaliao A Tabela 1 mostra a distribuio das respostas pergunta feita pelo pesquisador. Deste modo, 11 pacientes (79%) consideraram que houve uma grande melhora e estavam satisfeitas com a aparncia facial global.

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Figura 1. Fotografias ilustram o aspecto da regio peri-orbital de uma paciente pr- (A) e ps-tratamento (B).

Resultados da anlise histolgica O estudo anatomopatolgico dos cortes histolgicos (corados pela Hematoxilina-eosina) mostra que 10, dentre as 14 mulheres participantes do estudo, apresentaram amostras de pele facial correspondentes a padro diagnstico de elastose actnica de diferentes graus acometendo diferentes regies da derme. O estudo pelo mtodo da Picrossriuspolarizao mostrou que as fibras que contem colgeno presentes na derme, antes do tratamento tpico com estriol, na sua grande maioria, se apresentam estruturadas em feixes grossos, compactos, paralelos superfcie epidrmica. interessante notar que estas fibras grossas de colgeno, ao serem analisadas atravs do mtodo da Picrossrius-polarizao apresentavam uma forte birrefringncia amarelo-avermelhada, caracterstica do colgeno tipo I. Nota-se ainda um reduzido espao interfibrilar e o aplainamento

da juno dermo-epidrmica (Figura 2). J nos preparados obtidos a partir de bipsias ps-tratamento possvel observar, com o mtodo da Picrossrius-polarizao, o aparecimento, na derme superficial, de rede fibrilar rica em colgeno, formada por fibras finas, esverdeadas sob luz polarizada, e que deixam mais espaos interfibrilares. Estas caractersticas nos levam a supor que o estriol promove a substituio dos grossos feixes grossos de colgeno (presentes na derme superficial antes do tratamento) por uma delicada rede de fibras finas, permitindo a existncia de abundante quantidade de substncia fundamental amorfa que, juntamente com as clulas ocupam os espaos interfibrilares (Figura 3) . Estes resultados foram observados em todos os 14 casos estudados, sem nenhuma exceo. Resultados morfomtricos Foram calculadas as densidades de

rea (ou seja, a rea percentual que cada componente ocupa na rea da derme) correspondentes s Fibras Finas e Grossas de colgeno e s Fibras Elastticas, alm da densidade total de rea do colgeno. O resultado da contagem encontra-se resumido na Tabela 2. As Fibras Finas de colgeno dominam a regio superficial da derme na pele facial aps a estrogenioterapia tpica (p<0,001), enquanto que as Fibras Grossas de colgeno dominam a derme antes do tratamento. J para as Fibras Elastticas no foram observadas diferenas significativas antes e aps o tratamento. O Grfico 1 ilustra estes dados. Porm, quando se analisa a frao de rea relativa ao colgeno total da derme antes e aps o tratamento verifica-se que no houve aumento significativo. Foi estabelecido ainda que a relao entre a rea total de colgeno e a rea elasttica tambm permaneceu igual antes e aps o tratamento.
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Grfico 1. Densidades de rea ocupadas pelas fibras de colgeno finas e grossas e pelas fibras elastticas. Notar o grande aumento da frao ocupada pelas Fibras Finas de colgeno, que correspondem quelas que apresentam uma fraca birrefringncia esverdeada quando estudadas pelo mtodo da Picrossriuspolarizao. Notar ainda que a frao de rea ocupada pelo material elasttico no foi afetada pelo tratamento.

uma tcnica morfomtrica simples pode ser aplicado para a quantificao das mudanas na organizao do colgeno que ocorreram devido ao tratamento com estriol. Os nossos resultados indicam que existe uma associao entre o uso tpico de estriol e a modificao do tipo de trama colagnica encontrada na derme e so coerentes com os estudos de Schmidt et al. (1996), que demonstraram um aumento de colgeno tipo III em condies experimentais semelhantes, pois conhecido o fato que colgeno de tipo III (antigamente denominado de reticulina) forma fibras finas compostas por fibrilas delicadas, frouxamente dispostas mostrando uma fraca

A relao entre a densidade de rea de fibras de colgeno Finas e Grossas tambm apresenta uma diferena significativa antes e aps o tratamento, o que indica uma mudana de padro na constituio colagnica da derme aps o tratamento.

Discusso
O presente estudo mostra que o mtodo da Picrossrius-polarizao (explorando o fato que a birrefringncia do colgeno aumenta medida que cresce o dimetro de suas fibras) associado a
Figura 2. Fotomicrografias de um corte histolgico, corado com Picrossrius-hematoxilina, obtido da pele facial de uma paciente antes do tratamento tpico com estriol (x 420). Na fotomicrografia A, observa-se a epiderme (E) e a derme (D), na qual predomina uma densa trama de fibras que contem colgeno, corado em vermelho intenso. Notar que esta trama compacta est constituda por fibras grossas (setas), com pouco espao interfibrilar, poucos vasos, caracterizando um tecido conjuntivo muito denso no modelado. Quando se observa esta mesma regio sob a luz polarizada (fotomicrografia B) pode-se notar que as fibras colgenas apresentam-se sob a forma de fibras grossas, fortemente birrefringentes, de colorao amarela a avermelhada. Embora as fibras estejam distribudas nas trs direes do espao, v-se que esto preferencialmente dispostas de modo paralelo juno dermo-epidrmica. O asterisco mostra os tonofilamentos de queratina da epiderme (E), que por apresentaram molculas em organizao paracristalina (assim como o colgeno), mostram-se birrefringentes sob luz polarizada.

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Figura 3. Fotomicrografias de um corte histolgico, corado com Picrossrius-hematoxilina, obtido da pele facial da mesma paciente aps o tratamento tpico com estriol. (x 420). E: epiderme; D: derme. A fotomicrografia A, feita sob luz convencional, mostra que a derme est constituda por uma delicada trama de fibras de colgeno finas, que contrasta muito com a trama densa que se observa antes do tratamento (comparar com a Figura 2 A). Notar a quantidade maior de espaos interfibrilares, que no tecido vivo esto ocupados pela substncia fundamental amorfa intersticial. Sob luz polarizada (fotomicrografia B), esta trama mostra-se constituda por finas fibras de colgeno fracamente birrefringentes, de colorao esverdeada, que brilham contra o fundo escuro. Nota-se ainda que estas fibras esto dispostas em todas as direes sem orientao preferencial. As setas mostram estas delicadas fibras e as cabeas-de-seta apontam para fibras grossas, fortemente birrefringentes como aquelas que dominavam a derme antes da aplicao tpica de estriol (comparar com a figura 2 B). interessante observar a maior quantidade de elementos vasculares. Notar que as papilas drmicas mostram-se muito mais acentuadas; esta caracterstica, juntamente com o novo padro de agregao do colgeno, nos permite supor uma remodelao drmica obtida com o tratamento.

birrefringncia de colorao esverdeada quando analisado pela Picrossrius-polarizao (Junqueira et al., 1978), o que corresponde exatamente aos nossos achados na derme superficial aps a estrogenioterapia tpica. Na pele de indivduos jovens de diversas espcies animais (ratos, camondongos, ces, porcos e humanos) h uma distribuiTabela 2. Dados referentes s densidades de rea ocupadas pelas fibras que contm colgeno (Finas e Grossas) e pelas Fibras Elastticas

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o diferencial dos tipos genticos de colgeno, sendo que o colgeno Tipo I mais profundo (derme reticular) e o colgeno Tipo III est presente nas camadas mais superficiais (Junqueira et al., 1983). Nos casos aqui estudados, na derme superficial da pele de aspecto envelhecido, antes da aplicao tpica de estriol, encontramos fibras colgenas espessas, densamente agrupadas e com intensa birrefringncia de colorao amarela ou avermelhada, que correspondem ao padro atribudo descrito por Junqueira et al. (1978) para fibras de colgeno tipo I; estes achados sugerem que o processo de envelhecimento leva substituio do padro jovem da derme papilar (rica em colgeno Tipo III) por um tecido fibroso (rico em colgeno Tipo I). Os nossos resultados quantitativos demonstram que a aplicao tpica de estriol foi capaz de reverter este padro de envelhecimento cutneo, promovendo o aparecimento de fibras finas de colgeno, que voltam a prevalecer na derme superficial. lcito supor que, aps o tratamento, o restauro do componente colagnico no tenha sido isolado, mas sim acompanhado pela remodelao dos outros componentes da matriz extracelular, como os proteoglicanos (Silbert, 1973) e a gua (Nimni e Harkness, 1988), o que, em ltima anlise, devolveria, em to pouco tempo os padres jovens de visco-elasticidade da pele, responsveis pela melhor aparncia esttica. Os resultados demonstram ainda que a frao de rea do colgeno superficial total conservou-se inalterada. Assim, pode-se dizer que a melhor aparncia esttica referida se deve mais mudana no padro de agregao do colgeno do que a um aumento na sua densidade total. Observou-se ainda que a relao entre a rea total de colgeno e a rea elasttica permaneceu igual aps o tratamento, indicando que a melhora esttica da pele depende mais do tipo de colgeno presente e de sua organizao do que da quantidade de material elasttico existente.
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n M. M . Camargo, K . Z . Gold M. Z. Gold. B . David - Ambulatrio da C. B. man, C

Sociedade Brasileira de Medicina Esttica Regional - So Paulo

n Gr anj a C. N. Ba tt l e h n e r , ra ja at E. G. Caldini - Laboratrio de Biologia

Celular do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Correspondncia: Profa. Dra. Elia Garcia Caldini Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Av. Dr. Arnaldo, 455 - sala 1113 - Cep 04012-903 So Paulo SP Brasil