ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE CIENCIAS QUMICAS CARRERA DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGA AMBIENTAL

INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

Prctica No 1

DATOS GENERALES

Estudiantes: Stalin Flores Rodrigo Guerrero Denis Pilco Jose Latorre Nivel: Quinto B Fecha de realizacin: 24/10/2013 Fecha de entrega: 31/10/2013

Cdigo: 2188 2172 2167 1979

1. TEMA: Columna de Winogradsky

2. OBJETIVOS 2.1.Objetivo General: 2.1.1 Comprobar con el uso de la columna de Winogradsky como los

microorganismos ocupan diferentes zonas para su desarrollo de acuerdo a cada una de las necesidades que este requiera. 2.2.Objetivos Especficos: 2.2.1 Identificar a los distintos microorganismos dependiendo de las zonas en las que se desarrollan. 2.2.2 Identificar cules son los ciclos que realizan los microorganismos y la interdependencia que llega a existir entre ellos. 2.2.3 Reconocer como es el tipo de interrelaciones que se dan en la Columna de Winogradsky entre los microorganismos.

3.

MARCO TERICO

Esta tcnica fue desarrollada inicialmente por el microbilogo ruso Sergei Winogradsky (1856-1953), quien us la columna para estudiar los microorganismos del suelo.(4) La columna de Winogradsky es un sistema que permite observar en el laboratorio el proceso evolutivo de los microorganismos, es decir, el proceso de adaptacin a los diferentes ambientes empleando diferentes estrategias para la obtencin de energa. (4) Una vez que se prepare la columna y se exponga a la luz solar, se desarrollar una sucesin de comunidades bacterianas interrelacionadas metablicamente, de un modo similar a lo que ocurre en la naturaleza, que se podrn observar fcilmente por su distinta coloracin. Adems, la columna es un sistema anxico en miniatura que puede usarse como suministro a largo plazo de bacterias para cultivos de enriquecimiento La columna de Winogradsky es una demostracin clsica de cmo los microorganismos ocupan microespacios altamente especficos de acuerdo con sus tolerancias medioambientales y sus necesidades vitales (requerimientos de carbono y energa) e ilustra como diferentes microorganismos desarrollan sus ciclos, y la interdependencia que llega a existir entre ellos (las actividades de un microorganismo permite crecer a

otro y viceversa). Esta columna es un sistema completo y autnomo de reciclamiento, mantenido slo por la energa de la luz. (2) Al pasar algunos das se diferenciacin claramente la formacin de tres estratos, se los identifica debido a su color caracterstico, los cuales presentamos a continuacin:

Figura 1. (Columna Winogradsky) ZONA AEROBIA (RICA EN OXGENO) La parte superior de la columna de agua puede contener abundantes poblaciones de bacterias de diferentes tipos. Son organismos aerobios que se encuentran habitualmente en los hbitats acuticos ricos en materia orgnica (estanques poco profundos, arroyos contaminados, etc). Suelen ser flagelados, lo que les permite moverse y establecerse en nuevas reas. Puede desarrollarse tambin microorganismos fototrfos variados procedentes directamente del agua o del barro utilizado originalmente en el montaje de la columna. La superficie del barro puede presentar en esta zona un ligero color castao. Esta es la parte de la columna ms rica en oxgeno y ms pobre en azufre. (1) ZONA MICROAERFILA: Es la zona en donde se guardan ambos gradientes, el oxigeno y el sulfuro de hidrogeno. Aparecen bacterias oxidadoras del azufre como Beggiatoa, Thiothrix o Thiobaccillus, que usan como fuente de carbono la materia orgnica, y oxidan el H2S que llega por

difusin desde las capas inferiores a azufre elemental. La reaccin qumica que se lleva a cabo es la siguiente: (1)

Son, por lo tanto, microorganismos mixotrofos. Estos gneros acumulan grnulos de azufre en sus citoplasmas por oxidacin del H2S que es muy baja, los grnulos de azufre elemental intracitoplasmtico presentes en estas bacterias empiezan a desaparecer por oxidacin total a sulfatos.(3) ZONAS ANAERBICAS Esta zona contiene H2S, en la zona anaerbica superior predominan las bacterias fotosintticas anaerobias, y en la columna se observan una serie de bandas de colores rojo y verdes: (1) Bacterias rojas no del azufre: Rhodospirillum, Rhodomicrobium o

Rhodopseudomona, son bacterias anaerobias fotoorgantrofas, que solo pueden realizar la fotosntesis en presencia de una fuente de carbono orgnico. Forman una capa de color rojo-anaranjado. Las bacterias verdes no del azufre son termfilas y, por lo tanto, no crecen en la columna a temperatura ambiente. Bacterias rojas del azufre (Chromatium, Thiospirillum, Thiocapsa, forman una capa roja-prpura). Bacterias verdes del azufre (Chloroblum, Pelodyctium). Estas bacterias son fotolittrofas y realizan una fotosntesis anoxignica, no producen oxigeno ya que no utilizan H2O como elemento reductor si no H2S, generando en este proceso sulfatos (SO42-). La reaccin que tiene lugar es la siguiente: (3)

Estos microorganismos aparecen como zonas de crecimiento en el lodo de la columna, pero tambin pueden desarrollarse en el agua si los fottrofos oxignicos son escasos. En la zona anaerbica ms profunda, de color negro intenso, aparecen microorganismos capaces de realizar respiracin anaerbica y fermentacin. Bacterias reductoras del sulfato (BRS): Desulfovibrio, Desulfobacter,

Desulfotomaculum, o Desulfomonas. Usan el sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas de azufre como el tiosulfato, y generan grandes cantidades de H2S que

reaccionar con el hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro de hierro (II), que precipita y da el color negro. Es por esto que, en la naturaleza, los sedimentos acuticos son frecuentemente negros. La reaccin sera la siguiente:

Bacterias fermentadoras Utilizan la celulosa del papel aportado como fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del gnero Clostridium. Clostridium: Son anaerobias estrictas, y no empiezan a crecer hasta que el oxgeno desaparece del sedimento.

Figura 2. (Microorganismos caracteristicos de la Columna de Winogradsky)

4.

MARCO PRACTICO

4.1. Materiales Preparacin Winogradsky Botelln de plstico Lodo Agua estancada Huevo cocido Hojarasca Papel picado Clavo Papel film de la Columna de Anlisis de la Columna de

Winogradsky 3 Pipetas de 10mL 3 Tubos de ensayo Centrfugador Asa de siembra Mechero Microscopio ptico Portaobjetos Cubreobjetos

4.2. Reactivos Preparacin de la Columna de Winogradsky 5g sulfato de calcio 5g carbonato de calcio Azufre Anlisis de la Columna de

Winogradsky Cristal violeta Lugol Decolorante Safranina Aceite de inmersin

4.3. Procedimiento: Preparacin de la Columna de Winogradsky

Cortar una cuarta parte del botelln

Se adiciona al frasco el papel picado con los restos de hojas secas y el huevo cocido

Se adiciona el CaSO4, el CaCO3, el S y el clavo

Se incuba a temperatura de 28 a 30C bajo luz incandescente por un mes

Se tapa para evaporacin

evitar

Se adiciona el lodo, el agua y se llena el frasco completamente

Anlisis de la Columna de Winogradsky

Obtener con las pipetas una muestra de cada estrato

Colocar en tres tubos de ensayo las muestras obtenidas hasta completar sus 3 cuartas partes

Centrifugar las muestras a 2000RPM en 10 min.

Fijar las muestras en los portaobjetos en medio asptico

Realizar la Tincin Gram

Observar con lentes de 10X, 40X y 100X

5.

GRFICOS

Foto1:Preparacion de la cama

Foto 2:Aadicion de lodo y Foto 3:Sellamiento de la agua estancada columna

Foto4:Extraccion de muestras Foto 5:Preaparacion de las Foto 6:Muestras despues de de diferentes sustratos muestras en la centrifuga la centrifugacion

Foto 7:Fijacion muestras

de

las Foto 8:Fijacion Muestras

de

las Foto 9:Tincion Gram de las muestras fijadas.

Foto 10:Sustrato 1

(40X)

Foto 11:Sustrato 2 ( 40x)

Foto 12:Sustrato 3( 40x)

6.

ANALISIS Y DISCUSION DE RESULTADOS:

En el presente laboratorio se recreo el experimento de columna de Sergi Winogradsky, a partir de la misma se pudo demostrar principalmente la forma en cmo los microorganismos ocupan "microespacios" o estratos los cuales son especficos para cada microorganismo de acuerdo a los distintos limites y barreras que se simulan dentro de la columna de Winogradsky, como por ejemplo los nutrientes, requerimientos de oxigeno, la temperatura, la radiacin, el PH, etc. De igual forma, su desarrollo debido a las interrelaciones que se registraron en la columna. Mediante los conocimientos previos de el experimento de Sergi Winogradsky se esperaba que en la columna se diferenciaran por lo menos 7 estratos o 7 capas de distintos colores correspondientes a una capa anaerobia(negro), capa de difusin(verde oscuro), capa verde, capa purpura/rojiza, capa color herrumbre, capa color marrn, capa de agua verde o transparente, sin embargo se visualizo nicamente tres capas muy poco diferenciadas y desiguales: una capa profunda de color negro, correspondiente a la anaerbica, una pequea capa intermedia de color rojizo y una capa superficial de color verde oscuro, estos resultados se obtuvieron debido a diversos factores, entre los cuales podemos citar: la falta de luz artificial o fuente lumnica, escases de nutrientes( hierro, oxigeno, fosforo, carbonatos, azufre, etc.), o un fallo sistemtico en la preparacin de la columna. De manera similar mediante conocimientos tericos previos se esperaba obtener 3 estratos o zonas distintas: una zona aerobia en la que se desarrollaran microorganismos fotottrofos, cianobacterias y algas que son los primeros que toman la fuente de energa en este caso la luz y el oxigeno y lo distribuyen a los dems gradientes en formas ms asimilables de manera que estos los puedan tomar, en la columna de Winogradsky correspondiente a la prctica, efectivamente se logr distinguir en la superficie la presencia de una delgada capa de color verde oscuro que se formo por la acumulacin verdosa como una especie de alfombra la misma que est conformada por las cianobacterias y las algas. Esta es la parte de la columna ms rica en oxgeno y ms pobre en azufre. Adems se observo gas en la columna de agua que podra corresponder a O2 de la fotosntesis de estos microorganismos. Mientras que en la segunda zona denominada zona microaeroflica donde la concentracin de oxigeno disminuye y la de azufre aparece progresivamente, siendo a su vez la zona donde ambas zonas tanto anaerbica como aerbica se sobreponen, se combinan o convergen, existiendo como

nutrientes oxigeno( en menor proporcin) y el acido sulfhdrico H2S (le da el olor caracterstico de la columna ya que tiene un fuerte olor a huevo podrido, consecuencia de la descomposicin de la materia orgnica) tambin en baja proporcin, aqu se esperaba la presencia de algas ms pequeas debido a la escases de oxigeno, lo que produce disminuye su desarrollo, bacterias gram positivas y negativas, bacterias oxidadoras del azufre(Thiobacillus, Beggiatoa), debido a la ausencia de oxigeno y la aparicin de fuentes de H2S, las mismas que utilizan como fuente de energa a la materia orgnica y oxidan el H2S, a esta clase de microorganismos se los denomina mixotrofos, y provee de azufre elemental a la zona anaerobia, y a la zona aerobia de oxigeno, correspondiendo a un ejemplo tpico de protocooperacion con la zona anaerobia porque ambos se dan nutrientes de azufre, y una relacin de comensalismo con la zona aerobia porque los mixotrofos toman el oxigeno de esta zona para su desarrollo, pero no benefician ni perjudican a la zona aerbica. Este estrato debe poseer una coloracin roja, obtenido por la formacin de agregados de microorganismos adheridos a las paredes del recipiente. Estos microorganismos serian las bacterias rojas no del azufre. En la columna de Winogradsky correspondiente a esta prctica de laboratorio, la zona microaeroflica era delgada y escasa, esto debido a que fuente de azufre as como el oxigeno necesario para que se desarrollen adecuadamente los microorganismos mixotrofos correspondientes a esta capa fueron deficientes. Finalmente en el tercer estrato donde se asienta el lodo es decir el lugar en el cual hubo una sedimentacin de materia orgnica se prevea que se una coloracin verde oscura y roja en la parte superior de esta zona, y una coloracin caf y negra en la parte inferior, la coloracin roja se debe a las bacterias rojas del azufre que forman una capa roja anaranjada, la coloracin verde en cambio se produce por las bacterias verdes del azufre, estas bacterias son fotolittrofas y realizan una fotosntesis anoxignica, generando en este proceso sulfatos (SO4)2 . En la zona anaerobia ms profunda, de color negro intenso, aparecen microorganismos capaces de realizar respiracin anaerbica y fermentacin( genero Amoebacter), estos microorganismos utilizan el sulfato y lo convierten en acido sulfhdrico, que ser tomado por las bacterias reductoras del sulfato, tambin se distinguen las bacterias que degradan la celulosa(tiras de papel peridico) como por ejemplo las bacterias del genero Clostridium, estas son anaerobias estrictas as que necesitan la ayuda de otro tipo de bacterias que son las anaerobias facultativas que reducen todo el oxigeno del medio para que dichas bacterias se desarrollen normalmente y puedan convertir la celulosa en glucosa y posteriormente

mediante la fermentacin de esta glucosa obtener su energa generando como producto de desecho, formas simples de compuestos orgnico , los cuales son tomados por las bacterias del azufre que necesitan compuestos orgnicos para su respiracin, es el caso de las fotosintticas anoxigenicas que en escases de oxigeno utilizan estos compuestos orgnicos para su fotosntesis, a esta interrelacin se la conoce como

(cometabolismo). Al visualizar la columna de Winogradsky de nuestra prctica se pudo notar que la parte inferior de esta zona correspondiente a las bacterias que degradan celulosa y microorganismos anaerobios es la ms distinguible y amplia, lo que demuestra que los requerimientos de dichos microorganismos fueron los adecuados, es decir la cantidad de materia orgnica (lodo), fuente de celulosa (papel peridico) fue la adecuada, sin embargo la parte superior de esta zona no present la coloracin esperada por lo que se comprueba lo dicho anteriormente, es decir que la fuete de azufre fue escasa. Al observar al microscopio muestras de las tres zonas previamente fijadas y despus de realizar la tincin gram se logr observar distintos microorganismos siendo las ms notorias y abundantes las algas, cianobacterias y bacterias gram-positivas, algunas bacterias gram-negativas y protozoos, las muestras tuvieron ciertos defectos debido a errores en el momento de la toma de la muestra con la pipeta, por lo que en las 3 muestras se evidencio la presencia de algas o restos de materia orgnica.

7.

OBSERVACIONES

7.1 Observaciones de la columna de Winogradsky

Fecha 19/09/2013

CAMBIOS DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKY Descripcin En el primer da se pudo observar una sola masa de lodo y agua de color grisceo sobre aquella masa, del botelln se emanaba un olor pestilente

26/09/2013

Ya pasada una semana se pudo observar que el papel film estaba con presencia de pequeas gotas de agua, se observaba una capa verde sobre el agua que conservaba el color grisceo. Del botelln se emanaba un olor pestilente.

03/10/2013

10/10/2013

17/10/2013

Ya pasadas dos semanas el papel film tiene mayor presencia de gotas de agua, el agua sobre la capa de lodo tenia un color ladrillo con tendencia a rojo, en la superficie del agua la capa verde observada anteriormente se volvi ms densa ya con presencia filamentosa de color verde obscuro. La capa de lodo comenz a obscurecer su color. Del botelln se emanaba un olor pestilente. Ya pasadas tres semanas la coloracin roja observada anteriormente parece sedimentarse con el lodo formando una capa roja muy delgada aproximadamente de unos 5mm. En el fondo de la capa de lodo comienzan a aparecer pequeas manchas amarillas que siguen un patrn lineal de forma lateral. En la superficie de la capa de agua ya se presencia una capa muy densa formada por algas. Del botelln se emanaba un olor pestilente. Ya pasadas cuatro semanas la capa de agua se vuelve muy turbia tomando un color verde azulado muy intenso, la capa de lodo en su mayora se vuelve de un color negro intenso manteniendo la coloracin roja en la parte superior y tambin la coloracin amarilla. Se mantiene la capa densa de algas. Del botelln se emanaba un olor pestilente.

24/10/2013

Ya pasadas cinco semanas la coloracin verde azulada del agua parece sedimentarse formando una capa del mismo color sobre la capa roja antes descrita la misma que ha ido perdiendo sus propiedades ya que ha su coloracin no es muy notoria. La coloracin amarilla ha logrado ocupar ms lugar en el fondo de la capa de lodo. La capa de algas comienza a sobre poblar la superficie de la capa de agua. Del botelln se emanaba un olor pestilente.

7.2. Observaciones de la columna en el microscopio

ZONA DE LA COLUMNA

CARACTERISTICAS DEL ESTRATO

MICROORGANISMOS Y TINCION GRAM 40X

ESQUEMA 100X

Algas (de forma alargada cilndrica) fotosintticas redonda, y (de bacterias forma

Algas fotosintticas Cianobacterias

cloroplasto

ZONA AEROBIA

encargado de la fotosntesis); microorganismos eran de

color verde (fotosntesis), se observo tambin gran

cantidad de flagelados de color verde, y clulas gram positivas de color azul, y gram negativas de color rosamorado. Microorganismos de color Chlorobium (bacterias del azufre) Cromatium (bacterias purpuras azufre) Galionella Protozoo del verdes

purpura, de forma redonda, formando (bacterias agregados purpuras del

azufre), la presencia de algas

ZONA MICROAERO FILICA

pero eran de menor tamao, clulas fotosintticas, en

menor densidad poblacional. Ademas se puede distinguir filamentos verdosos, nucleos. Algunos protozoos, que son mucho ms grandes que las bacterias Algas mucho ms pequeas (desarrollo mnimo debido a la falta de luz), gram

Amoebacter (bacterias purpuras azufre) Clostridium Desulfovibrio Algas pequeas del

Microorganismos

ZONA ANAEROBIA

positivos y negativos, se pudo observar adems agregados de color caf, de forma redonda que estaban muy dispersos, siendo estos en realidad fermentadores de

celulosa o productores de hidrxido de azufre

8.

CONCLUSIONES

 Se logr identificar en la parte superior de la columna que es ms rica en oxgeno y ms pobre en azufre abundantes poblaciones de microorganismos aerobios ,en la zona microaeroflica que es la zona en la que los

microorganismos solapan ambos gradientes, el de oxgeno y el de sulfuro de hidrgeno aparecen bacterias oxidadoras del azufre y en la zona anaerbica esta zona contiene H2S (procedente del fondo), en la zona anaerbica superior predominan las bacterias fotosintticas anaerobias y en la zona anaerobia ms profunda, aparecen microorganismos capaces de realizar respiracin anaerbica y fermentacin. Se pudo identificar como los microorganismos necesitan los unos de los otros para poder existir ya que en la zona inferior de lodos se desarrollan organismos que desarrollan procesos fermentativos que producen alcohol y cidos grasos como subproductos de su metabolismo y estos productos de "desecho" son a su vez el sustrato para el desarrollo de bacterias reductoras de sulfato, como resultado se liberan sulfuros que difunden a la zona superior oxigenada creando un gradiente en el que se desarrollan bacterias fotosintticas que utilizan el azufre y por encima de esta zona pueden desarrollarse las bacterias aerobias que no utilicen el azufre como suelen ser las cianobacterias y algas crecen en la parte superior y liberan oxgeno que mantiene aerobia esta zona y as los microorganismos trabajan entre s para desarrollarse en ptimas condiciones. Aqu juega un papel fundamental la exposicin constante a la luz luz ya que empieza a penetrarse hacia la regin inferior anaerbica, para facilitar el desarrollo de los microorganismos fotosintticos anoxignicos que proveen de CO2 es decir materia orgnica a los microorganismo de arriba que requieren de esta materia orgnica para su desarrollo y as comienza la relacin que estos microorganismos necesitan para su desarrollo. Se logr reconocer como es que las bacterias se relacionan entre si para poder desarrollarse sobre todo en el aspecto nutricional por ende se puede decir que hay una relacin de comensalismo al momento que las bacterias que desarrollan procesos fermentativos proveen de sustratos a las bacterias reductoras de sulfato dndose cometabolismo entre estos dos

microorganismos por lo general as se van a encontrar tambin relaciones de comensalismo ya que algunas bacterias a partir del H2S lo convierten a formas ms complejas para que lo usen otros microorganismos sin pedir nada a cambio aqu se da un comensalismo tambin se da sinergismo debido a que todo el acido sulfhdrico fue desplazado hacia la parte inferior por accin de los microorganismos formando sedimentos, y de ah que mediante las interrelaciones este fue subiendo para nutrir a los dems

microorganismos, tambin se elimino el oxigeno de la parte inferior por parte de las bacterias anaerobias facultativas que ayudo a que anaerobias estrictas se desarrollen.

9.

RECOMENDACIONES Recomendamos conseguir un buen lodo residual como agua estancada ya que de esto dependern mucho el desarrollo de los diferentes tipos de microorganismos en nuestra columna. Se recomienda triturar y homogenizar la hojarasca para poder dispersar por toda la superficie de la botella donde elaboraremos la columna posteriormente cuando se aada las dems sustancias incluyendo el lodo residual formar un mezcla, procurar que esta sea una mezcla homognea. Se recomienda que mientras ms expuesto a la luz se encuentre la columna el desarrollo de los microorganismos ser mucho ms rpido. Es recomendable rotar la columna con regularidad para que la fuente de luz sea homognea en todas partes de esta y no solo se pueda observar de un solo perfil. Recomendamos no agitar ni mover bruscamente la columna de winogradski al momento de trasladarla ya que podan mezclarse las zonas diferenciadas en la columna. Se recomienda no acercar de manera exagerada la columna al foco ya que esta transpirara mucho por efectos del calor y esto ser perjudicial en el desarrollo de nuestros microorganismos. Se recomienda el uso de mascarilla ya que el olor emanado al ser la columna descubierta es algo desagradable. Al momento de la extraccin de muestras se recomienda pipetas rotas o con un ancho orificio ya que de no ser as se taponarn y no podramos tomar buenas muestras. Se recomienda no succionar con la boca al momento de tomar las muestras de la columna ya que estas contienen algunos gases como el metano o sulfatos que de ser absorbidos por nosotros serian perjudiciales en nuestra salud.

 Se recomienda ser muy eficiente al momento de extraer las muestras con la pipeta para no mezclar el sustrato porque podramos encontrar microorganismos que no pertenecen a la muestra tratada. Se recomienda rotular las muestras con el nmero de grupo y de zona extrada con el fin de no confundirlas. Es una recomendacin importante al momento de la fijacin en placa trabajar cerca del rea estril para evitar contaminacin con otros microorganismos provenientes del aire.

10. BIBLIOGRAFA

Bibliografa: 1. Brock Biologa de los microorganismos 10 edicin (2003). J. Parker, J.M. Martinko,M.T. Madigan. Pearson Education.

2. Atlas, R. M., Bartha, R. 2002. Ecologa Microbiana y Microbiologa Ambiental. PEARSON EDUCACIN, S. A., Madrid, Espaa. Linknografa: Figura 1. (Columna de Winogradsky Esquema) 3. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioBiodiversidad.htm

Microbilogos Ilustres 4. http://microilustres.blogspot.com/2007/01/winogradsky-sergei-1856-1953.html

Figura 2. (Microorganismos representativos de la columna de Winograsky 5. http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/winogradsky.html