Guía laboratorio seguridad alimentaria

GUIA DE LABORATORIO
Unidad de Formacin Versin: Cdigo: 002

UC-BAC-ALI-GL001
Fecha:
Julio de 2.011
Manual de calidad Pgina 1 de 90
CONTROL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA
MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO CONTROL Y SEGURIDAD ALIMENTARIA
Elaborado por:
KAREN P MARTNEZ MARCIALES MICROBILOGA DE ALIMENTOS
Revisado por:
CLAUDA DIAZ MICROBILOGA INDUSTRIAL
Aprobado por:
CLAUDIA MONTEJO COORDINADORA DE BACTERIOLOGA Y LABORATORIO CLNICO
Fecha
Julio 31 de 2011
Fecha
Julio 31 de 2011
Fecha
Agosto de 2011
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Fecha:
Julio de 2.011
PRESENTACIN
Referirse a Control y Seguridad alimentaria, es hacer un enlace directo con la Microbiologa de los alimentos, teniendo en cuenta que es un campo de estudio muy dinmico que se desarrolla con rapidez, debido a los continuos brotes de enfermedades de origen alimentario, el temor a la contaminacin intencional de las fuentes de alimentos y, por supuesto, el renovado inters en los efectos benficos de las bacterias productoras de cido lctico. Con excepcin de algunos alimentos estriles, todos los dems albergan uno o ms tipos de microorganismos. Algunos de stos tienen funciones deseables en la comida, como en la produccin de alimentos fermentados naturalmente, en tanto que otros causan descomposicin de la comida y enfermedades de origen alimentario. Para estudiar el papel de los microorganismos en los alimentos y controlarlos cuando sea necesario, es importante aislarlos en un cultivo puro y estudiar sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas y genticas. El objetivo general de las Prcticas de Control y seguridad alimentaria es que el estudiante de 7 semestre de Bacteriologa y Laboratorio Clnico, se inicie en el conocimiento de la Microbiologa de los alimentos, en las caractersticas morfolgicas, fisiolgicas, y nutricin de los microorganismos, adems de adquirir las habilidades necesarias para las diversas prcticas de Laboratorio, protocolos, entre otros. Este Manual est dirigido a los estudiantes que iniciaran su experiencia en el manejo de los microorganismos relacionados con los alimentos, por lo que se considera de suma importancia incluir en la primera parte, una lista de recomendaciones relacionadas con las reglas generales de Laboratorio, y los principales procedimientos que el estudiante deber aprender para que manipule en forma adecuada los microorganismos patgenos de los alimentos, y as se logre garantizar su seguridad y la de sus compaeros. Este manual contiene 12 prcticas de Laboratorio, diseadas de manera tal que el estudiante se relacione gradualmente con todos los procedimientos, desde la aplicacin de las Buenas Prcticas de Laboratorio, toma de muestras, diluciones, hasta la fase analtica de los alimentos, recuento, lectura e interpretacin y presentacin de los resultados, que hace parte del Plan de estudios de Bacteriologa y Laboratorio Clnico de la Universidad de Santander, sede Ccuta. Se presenta la gua de presentacin de resultados, la cual contiene los aspectos bsicos de un artculo de investigacin, con miras a la preparacin y motivacin de los
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Julio 31 de 2011
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estudiantes a participar en diversos procesos que conlleven a la propuesta de ideas de investigacin dentro del marco de temas de Control y seguridad alimentaria. En cada prctica se incluye los objetivos, fundamento, materiales y equipos, reactivos y medios de cultivo a emplear, procedimientos descritos paso a paso, de los cuales, algunos se complementan con cuadros, figuras y esquemas. Para cada prctica de Laboratorio, se propone una consulta, que el estudiante deber resolver, recurriendo al material bibliogrfico sugerido al final del manual. Se considera que este Manual de Guas de Laboratorio, puede ser de gran utilidad para docentes, y estudiantes , est diseado de acuerdo a la infraestructura del Laboratorio, y a la programacin semestral de la asignatura, que tiene una intensidad de 3 horas de prctica y 1 hora de lectura e interpretacin.
Dra. Karen P. Martnez Marciales Microbiloga con nfasis en Alimentos Auditora de Calidad ISO 17025. E. Especializacin en Proteccin de alimentos Docente Investigador UDES sede Ccuta.
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Julio 31 de 2011
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RECOMENDACIONES PARA LOS ESTUDIANTES

Reglas obligatorias 1. Durante todas las prcticas de laboratorio, se deber ingresar al Laboratorio, con la bata ya puesta, la cual debe estar cerrada, y solo se quitara una vez se termine y se salga del laboratorio 2. El cabello deber estar siempre recogido, y se prohbe el uso de todo tipo de accesorios, tales como, pulseras, anillos, reloj, aretes, entre otros. 3. Se prohbe el uso del celular, salvo el caso de un suceso extremo, que deber ser informado a la docente. 4. Se deber hacer lavado de manos, antes, durante y despus de cada practica. 5. Evitar la acumulacin y disposicin de material u objetos no relacionados con la prctica, sobre el mesn de trabajo, colocar todos los objetos personales en el sitio que indique la docente. 6. No entrar y salir sin antes informar al docente o haber concluido el horario o sesin completa de la prctica.
Procedimientos de Laboratorio 1. Antes y despus de cada practica, los estudiantes debern limpiar y desinfectar los mesones de trabajo, as como se deber dejar completamente limpios todos los equipos y utensilios, empleados, como por ejemplo balanzas, licuadoras, entre otros. 2. En el momento del uso del mechero, este no debe estar cercano a los microscopios, ni de objetos personales, o cuadernos de apuntes. 3. Todos los materiales de desechos y restos de alimentos, debern ser dispuestos en los lugares y/ o recipientes que se tienen para tal fin. 4. En caso de una eventualidad, informar de inmediato a la docente, y tratar de conservar la calma en todo momento.
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Material indispensable para el desarrollo de las Practicas 1. Bata de laboratorio limpia, preferiblemente manga larga, y en buen estado. 2. Gorro o malla, tapabocas, guantes. 3. El presente manual, y la lectura de cada prctica previa a la sesin de clase. 4. Libreta de apuntes, cuaderno para el desarrollo y presentacin de las consultas. 5. Pao para limpieza, gel antibacterial o jabn lquido antibacterial, toallas desechables para el secado de las manos. 6. Marcador indeleble o sharpies. 7. Tijeras, fsforos, cinta de enmascarar. 8. Bolsas ziplok, pilas o gel de refrigeracin, cava de icopor o de plstico, debidamente rotuladas.
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Informe de Laboratorio
Para la asignatura de Control y Seguridad alimentaria del Programa de Bacteriologa y Laboratorio Clnico, se tendr en cuenta en la presentacin de los informes las siguientes pautas: 1. Titulo ( debe ser lo ms corto y claro posible ) mximo 8 palabras, si se incluye el nombre de un microorganismos, este debe ir en cursiva, utilizar los verbos adecuados. 2. Autores: apellidos, nombre, direcciones electrnicas, programa. 3. Resumen (mximo 250 palabras ) se incluye en este prrafo de redaccin que se realizo, el objetivo como se realizo, metodologa, cules fueron los resultados obtenidos, y conclusiones. Recuerda que aqu se plasma la motivacin al lector, y la importancia del tema. 4. Palabras claves: mnimo cinco 5. Introduccin: se redacta de lo general a lo especfico, teniendo en cuenta referencias internacionales, hasta locales. Una funcin importante de la introduccin es establecer la importancia de su informe. 6. Materiales y mtodos: se describe el diseo experimental tcnicas de investigacin, anlisis estadsticos utilizados en el estudio. Debe contener la informacin suficiente como para que el lector comprenda lo realizado y que a la vez sea breve. 7. Resultados y discusin: se pueden presentar en tablas y grficos. 8. Conclusiones 9. Bibliografa. Citar fuentes de manera correcta de acuerdo a las normas. 10. Anexos. Fotos, folletos, entre otros.
Tener en cuenta la presentacin en letra arial No 10, para ttulos y subttulos 14.
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GENERALIDADES DE LOS ANLISIS MICROBIOLGICOS DE LOS ALIMENTOS Y AGUAS.

Los productos alimenticios y el agua en general poseen una carga microbiana natural propia del alimento como tal o que fue adquirida durante su elaboracin y manipulacin. Para lograr determinar si esa concentracin microbiana esta dentro de los parmetros normales o sea que no posee una contaminacin alta por microorganismos propios o patgenos, es importante desarrollar un criterio Microbiolgico para determinar los limites Microbiolgicos que debe cumplir el producto de acuerdo a un plan de muestreo.
CRITERIO MICROBIOLGICO Un criterio Microbiolgico es un valor Microbiolgico (numero de microorganismos por gramo o mililitro ) Est compuesto por: - Un informe de los microorganismos relacionados o sus toxinas - Los mtodos analticos para su deteccin y cuantificacin. - Un plan definido del nmero de muestras de campo que sern tomadas y el tamao de unidad de muestra. - Limites Microbiolgicos en los alimentos Nivel de unidades de muestra que conforman el lmite Microbiolgico.
APLICACIN DE UN CRITERIO MICROBIOLGICO: Este puede darse en tres categoras: NORMA MICROBIOLGICA: La cual puede ser obligatoria. Este es un lmite Microbiolgico incorporado a una ley o decreto que rige para los alimentos y es dictado por el MINISTERIO DE PROTECCIN SOCIAL Y EL INVIMA. ESPECIFICACIN MICROBIOLGICA: es la que puede ser incorporada en un cdigo de naturaleza preventiva, el cual es utilizado para aumentar la seguridad que proporciona el cdigo relacionado con la higiene.
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GUA MICROBIOLGICA: Es la que puede ser usada en caso de no existir una norma o especificacin Microbiolgica para un alimento en particular.
En Colombia, las normas INVIMA (Instituto Nacional de Vigilancia y Control de medicamentos y alimentos) establecidas para diversos grupos de alimentos, fijan los criterios microbiolgicos tanto con carcter de recomendacin como obligatorio, para evaluar la inocuidad de un alimento dado, segn los lineamientos de la Comisin Internacional de Especificaciones Microbiolgicas para los Alimentos (ICMSF). Esta comisin (no gubernamental) proporciona asesoramiento cientfico en cuestiones de inters microbiolgico, con influencia en el comercio internacional de alimentos (1). No obstante en su amplia utilizacin, los criterios microbiolgicos y tambin los planes de muestreo no son entendidos completamente, especialmente en cuanto a su base estadstica (2). Tampoco es tarea fcil interpretar los resultados de los anlisis microbiolgicos cuando se contrastan con la normativa. El objetivo de este apartado del Manual de Control y Seguridad alimentaria, es facilitar la interpretacin de resultados de los anlisis microbiolgicos practicados a alimentos, cuando se contrastan con las normativas fijadas en los planes de atributos de dos y tres clases. En el desarrollo de esta revisin, se presentan algunos trminos y definiciones necesarios para entender los mismos y tambin se explica en qu consisten los planes de captacin de muestras. DEFINICIONES Criterio microbiolgico: El criterio microbiolgico define la aceptabilidad de un producto y/o ingrediente alimentario en base a la presencia o ausencia, o el nmero de microorganismos (y/o sus toxinas) por unidad de masa, volumen, rea o lote (3). El criterio microbiolgico contempla adems, los mtodos de ensayo para la deteccin o cuantificacin del o de los microorganismos, el plan que define el nmero de muestras del lote a ser analizadas; y el nmero de unidades de muestras defectuosas (4). Un criterio microbiolgico forma parte de una norma tcnica, ley o reglamento tcnico para controlar alimentos y/o ingredientes alimentarios. Incluye los requisitos microbiolgicos obligatorios y los requisitos microbiolgicos recomendados.
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Requisito microbiolgico obligatorio: Es el cumplimiento de los lmites establecidos para un microorganismo o grupo de microorganismos que debe ser analizado. El incumplimiento de estos lmites para el nmero de muestras analizadas constituye una violacin de la norma, ley o reglamento tcnico y estar sujeta a penalizacin por parte del organismo competente. Generalmente considera microorganismos patgenos de importancia para la salud pblica y en algunos casos debe considerar microorganismos no patgenos, pero relevantes como indicadores o como responsables de deterioro en un alimento en particular y de acuerdo con su tecnologa (4). Requisito microbiolgico recomendado: Es un microorganismo o grupo de microorganismos que debe ser analizado, aunque no rutinariamente, y el incumplimiento de los lmites establecidos para el nmero de muestras analizadas sirve para alertar al responsable del producto sobre la necesidad de identificar y corregir los factores causantes del problema (4). Valor n = Es el nmero de unidades de muestra (paquetes, envases, botellas, etc.) de un lote que se deben examinar para satisfacer un plan de muestreo dado. Valor c = Es la cantidad mxima de unidades que se permite excedan el criterio microbiolgico m. Cuando este nmero se excede, el lote se rechaza, aunque obligatoriamente no tenga que destruirse (5). Valor m = Es el nmero mximo de unidades formadoras de colonias (UFC) o nmero ms probable (NMP) sobre gramo o mililitro de alimento. En los planes de atributos de dos clases separa los alimentos en aceptables (valores iguales o inferiores a m) o inaceptables (valores superiores a m). En un plan de tres clases, m separa los productos de buena calidad (valores < m) de los aceptados marginalmente (valores > m). En las situaciones de presencia/ausencia de los planes de dos clases, es comn asignar el valor m = 0. Para los planes de tres clases, el valor m es un valor superior a 0. Los valores m estn asociados a las buenas prcticas de manufactura (6). Valor M = Es una cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC) o nmero ms probable (NMP) sobre gramo o mililitro de alimento que se usa para separar la calidad marginalmente aceptable de la inaceptable. M se utiliza en los planes de tres clases. Cifras mayores a M, en cualquiera de las unidades analizadas, son inaceptables y estn relacionadas con riesgo sanitario, indicadores sanitarios o con un deterioro potencial (7). El valor de M debe ser tan alto que su presencia constituya un peligro definitivo o un deterioro evidente.
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CONTROL MICROBIOLGICO DE LOS ALIMENTOS El control microbiolgico de los alimentos consiste en comprobar aspectos tales como estado de frescura, capacidad de conservacin, condiciones de higiene en la produccin y presencia de microorganismos patgenos (8). Larraaga y col. tambin establecen que para conocer la calidad de un lote de alimentos o controlar un proceso, se debe evaluar un determinado nmero de unidades de ese lote. Es a partir de los resultados obtenidos de esa muestra que se infiere sobre la calidad higinico-sanitaria del lote. Lote Se denomina as a la cantidad de alimentos fabricados y manejados en condiciones uniformes. En la prctica se trata usualmente de alimentos pertenecientes a una misma partida o, en el caso de un procedimiento continuo de fabricacin, los elaborados en un perodo de tiempo limitado, en un solo lugar por un mismo personal. Los fabricantes suelen utilizar cdigos para identificar los diferentes lotes (5). Plan o programa de muestreo Define el procedimiento de captacin de muestras y fija a priori los criterios de decisin (aceptacin o rechazo del lote), basndose en el anlisis de un nmero preestablecido de unidades de muestra mediante mtodos especificados (9). Para esto es imprescindible que las unidades de muestra seleccionadas sean representativas del lote al que pertenecen y, adems, que se tomen al azar, es decir de forma aleatoria, para que tengan todas la misma probabilidad de ser elegidas como componentes de la muestra (8). Muestra representativa Es aquella cuyas caractersticas son tan similares como sea posible, a las del lote de donde procede, es decir, en la muestra elegida han de estar representados, y en la misma proporcin, todos los posibles subgrupos que componen la poblacin total. Si las muestras no son apropiadamente recolectadas y manejadas de una forma asptica, o no son representativas del lote muestreado, los resultados del laboratorio no tendrn sentido.
El objetivo de la toma de muestra es suministrar informacin sobre las caractersticas microbianas de los alimentos, que teniendo en cuenta criterios previamente
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convenidos, puedan ser tiles para la aceptacin o rechazo de los lotes. Dicho objetivo determinar los detalles del procedimiento tales como tamao de muestra, frecuencia, punto de recogida y la hora de la toma de muestra (10). Tambin es imprescindible que el alimento, en el momento de su anlisis, presente las mismas condiciones microbiolgicas que tena al ser muestreado (11). PLANES DE MUESTREO Son utilizados para comprobar el "status" microbiolgico de un alimento, su acatamiento a las exigencias de seguridad y su elaboracin siguiendo las buenas prcticas higinicas durante y despus de su manufactura (7). Existen dos tipos de planes de muestreo. Uno es el plan de variables, en los que los recuentos de los microorganismos investigados siguen una distribucin logartmica normal. Esta informacin generalmente es del conocimiento de los encargados de las plantas de produccin de alimentos. El otro plan es el de atributos y se utiliza cuando se desconoce la distribucin previa de los microorganismos en un alimento. Planes de atributos Se aplican cuando no se cuenta con informacin acerca de los antecedentes del producto alimenticio y por tanto no se puede realizar un plan de muestreo que dependa de la distribucin de la frecuencia de los microorganismos en los lotes del alimento. Los planes de muestreo de atributos se clasifican como de dos y tres clases, dependiendo de si se puede permitir o no la presencia de una muestra positiva en cualquiera de las unidades de muestra (12). Este tipo de planes de atributos est recomendado para la aceptacin de productos alimenticios que llegan a puertos de entrada o sitios parecidos (5), pues es comn en esos lugares que al recibir partidas de alimentos, los mismos no traigan consigo informacin sobre la forma cmo fue procesado el alimento o sta sea insuficiente. Idealmente, el control microbiolgico de los alimentos se debe hacer en la etapa de produccin, proceso o preparacin para el consumo. Sin embargo, en muchos alimentos que se comercializan internacionalmente no existe el conocimiento del control de la fuente o de las condiciones existentes durante el procesamiento y manejo de esos alimentos. Por lo tanto, existe la necesidad de aplicar algn criterio para evaluar la aceptabilidad de los alimentos en el puerto de entrada de alimentos importados (13).
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Los planes de muestreo de atributos tambin implican el concepto de "eleccin de caso o categora", que se basa en el riesgo microbiolgico (12). El "caso o categora" es la clasificacin de los planes de muestreo que va del 1 (el menos crtico) al 15 (el ms estricto). La eleccin del caso y por lo tanto del plan de muestreo, depende de la gravedad relativa del peligro para la inocuidad alimentaria o para la salud del consumidor, en funcin de los microorganismos implicados y de la posibilidad de destruccin, supervivencia o multiplicacin de los microorganismos durante la manipulacin normal del alimento. Programas de atributos de dos clases (aceptacin o rechazo) En este tipo de programa, las pruebas microbiolgicas estn encaminadas a comprobar la presencia o ausencia de un microorganismo, generalmente patgeno, o puede ser un recuento en placa para comprobar si es inferior o superior a un nivel crtico. Ejemplo: Salmonella en 25 g: n = 5 c = 0 m = 0 Esto en la prctica significa que se eligen cinco unidades de muestra (n = 5) aleatoriamente de un mismo lote, para realizarles cinco anlisis de deteccin de Salmonella. Para decidir la aceptacin del lote en cuestin, se consideran los resultados. En ninguna de las unidades (c = 0) debe detectarse Salmonella (m = 0). Otro ejemplo de programa de dos clases sera: Coliformes fecales (NMP/g): n = 5 c = 2 m = 11 Lo que indica este ejemplo es que se deben analizar cinco unidades del producto escogido aleatoriamente. Si en dos unidades de muestra o menos (c = 2) se detecta hasta 11 NMP/g de coliformes , el lote se acepta respecto a esta caracterstica. Pero si en tres o ms se detecta presencia en cantidades mayores a 11 NMP/g, no se estara acatando el criterio microbiolgico, se incumplira con la norma correspondiente y, por tanto, se rechazara el lote (9). Programa de atributos de tres clases El diseo conveniente de los planes de muestreo de tres clases considera la inevitable variabilidad tecnolgica, as como la severidad deseada con la cual recuentos bacterianos altos encontrados en una unidad de muestra pueden conducir a rechazar un lote, aun cuando cumpla las condiciones de buenas prcticas de manufactura (14).
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En este programa se dan unos criterios microbiolgicos que permiten dividir la calidad del lote de alimentos en tres categoras o clases de atributos: aceptable, provisionalmente aceptable o marginal y rechazable. Se utilizan generalmente con los microorganismos indicadores de higiene (7). Para ello, se eligen dos niveles de recuentos (m y M). Si el recuento de cualquier unidad de muestra es superior a M, el lote de alimentos no es aceptable. Tampoco es aceptable el lote si existen ms unidades que las estipuladas en c, presentando recuentos entre m y M. La tercera opcin es aceptar el lote marginalmente, cuando igual o menor cantidad de unidades especificadas en c, tienen recuentos mayores que el valor m pero menores o iguales al valor M. Y la ltima alternativa es aceptar el lote cuando todas las unidades de muestra tienen valores microbiolgicos inferiores a m.
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Laboratorio No Tema: OBJETIVOS
01 NORMAS DE BIOSEGURIDAD- BPL- TOMA DE MUESTRAS
Familiarizar al estudiante con la correcta interpretacin y aplicacin constante de las BPL. Tener en cuenta las condiciones adecuadas para la toma de muestra Reconocer la importancia de las normas de bioseguridad NORMAS DE BIOSEGURIDAD Son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que all se desempean frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su mbito de trabajo, como hacia el exterior. El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la informacin que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Ser fundamental la realizacin meticulosa de cada tcnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja. NORMAS A TENER EN CUENTA Utilizar bata manga larga, limpia y cerrada. Mantener el cabello recogido, y protegido mediante gorro o malla. Utilizar el tapabocas correctamente. Lavar sus manos antes, durante y al finalizar el trabajo. Uso de calzado cerrado. Trabajar con orden, limpieza y sin prisa. Circular por el laboratorio con precaucin, sin interrumpir a los que estn trabajando.
Colocar la seal de riesgo biolgico en todos los laboratorios en los que se manipulen agentes de los grupos 2, 3 4. Nunca utilizar un equipo de trabajo sin conocer su funcionamiento. Antes de iniciar un procedimiento asegurarse de que el montaje est en perfectas condiciones. Tomar los tubos de ensayo con pinzas o con los dedos (nunca con las manos). El vidrio caliente no se diferencia del fro. Evitar que trabaje una sola persona en el laboratorio, especialmente cuando se realicen operaciones de riesgo, y utilizar vitrina, siempre que sea posible.
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Revisar peridicamente la ventilacin general, la instalacin elctrica y la de gases del laboratorio y mantenerlas siempre en perfectas condiciones.
Cuando sea preciso manipular productos que puedan originar emanaciones de sustancias peligrosas u olores desagradables, hacerlo bajo campana extractora, provista de filtros adecuados y someterla a un programa de mantenimiento preventivo acorde a sus caractersticas. Realizar peridicamente un inventario de los reactivos para controlar sus existencias y caducidad y mantener las cantidades mnimas imprescindibles. No utilizar frigorficos domsticos en el laboratorio. No comer, beber, fumar, usar cosmticos o guardar alimentos o bebidas en el laboratorio No pipetear con la boca. Utilizar pipeteador. Utilizar los POES recomendados para cada tipo de trabajo. Etiquetar adecuadamente los productos preparados en el laboratorio y no reutilizar los envases para otros productos. Dejar en completo orden y aseo el Laboratorio de Microbiologa de Alimentos. Recoger los reactivos, equipos, etc. al terminar el trabajo.
En el mesn de trabajo solo debe estar: materiales de la prctica, guas, apuntes.
BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO- GOOD LABORATORY PRACTICE Las Buenas Prcticas de Laboratorio son un sistema de calidad que involucra a la organizacin de un laboratorio de investigacin. Dicho sistema establece las condiciones bajo las cuales se planifican, realizan, controlan, registran, archivan e informan los estudios realizados por un laboratorio. Estas reglas son promulgadas por organismos como la Organization for Economic Cooperation and Development (OCDE), o la Food and Drug Administration (FDA) Incluyo dos definiciones ampliamente aceptadas:
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OCDE: "Las BPL es todo lo relacionado con el proceso de organizacin y las condiciones tcnicas bajo las cuales los estudios de laboratorio se han planificado, realizado, controlado, registrado e informado".
002
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AOAC:
"Las BPL son un conjunto de reglas, procedimientos operativos y prcticos establecidas por una determinada organizacin para asegurar la calidad y la rectitud de los resultados generados por un laboratorio".
Cul es el propsito de las BPL? Asegurar la calidad de los datos en los estudios realizados, cuestin de vital importancia ya que constituye la base de su aceptacin entre distintos organizaciones y pases. Dentro de este contexto las Buenas Prcticas de Laboratorio son un conjunto de reglas, procedimientos operativos y prcticas establecidas y promulgadas por un determinado organismo, que se consideran obligatorias y buscan asegurar la calidad e integridad de los datos producidos en determinados tipos de investigaciones o estudios. TOMA DE MUESTRAS Un protocolo de anlisis de alimentos correcto debe considerar : La heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos. El proceso de transporte de las muestras del sitio de recoleccin al laboratorio evitando la multiplicacin de los microorganismos presentes o la inactivacin de algn microorganismo y; Que es necesario detectar bacterias de la flora normal del alimento. La finalidad de una toma de muestra es obtener una parte representativa del producto, para luego someterlo a un determinado ensayo microbiolgico y conseguir resultados fiables sobre su estado, es necesario que el producto en el momento del anlisis, rena las mismas condiciones microbiolgicas que tenga al ser muestreado.
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CONDICIONES GENERALES BIOSEGURIDAD: Una vez ingresa el profesional a realizar la toma de muestra este debe tener un equipo completo de proteccin personal as: uniforme antifluidos o bata cerrada y limpia, (si lo amerita el uso de: guantes, gorro, tapabocas, y en caso de riesgo de salpicaduras se empleara mascarilla facial.) No se permite comer, beber, fumar en el momento de toma de muestra. Se exige el uso de calzado cerrado. Se debe realizar lavado de manos antes y despus de realizar el procedimiento. El personal antes llevar a cabo la toma de muestra debe conocer el manual de bioseguridad del laboratorio. El tiempo permisible entre la captacin de la muestra y el anlisis microbiolgico no debe ser mayor de 24 horas. Durante la toma de muestra y el transporte, la muestra NO debe ser expuesta al sol, ni a temperaturas superiores de 4 C .
EQUIPOS Y UTENSILIOS Para la toma de muestras de alimentos slidos, es necesario contar con la cava, las pilas de hielo completamente congeladas que permitan el transporte de las muestras a una temperatura no mayor de 4C, bolsas estriles con sellado hermtico, baja lenguas o cuchillos estriles, termmetro para registrar la temperatura. Equipo de apoyo: cinta, fsforos, mecheros, algodn, tijeras, marcadores de punta fina, lapicero. PREPARACION DE LOS RECURSOS PARA LA TOMA DE MUESTRA : TOMA DE MUESTRA PARA ALIMENTOS SLIDOS Materiales Cava Bolsas estriles , con sello de seguridad Termmetro Mechero , fsforos Pilas de hielo Cuchillo y bajalenguas estril
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Procedimiento: ENTIENDASE POR ALIMENTO SLIDO: PROTEINA CRUDA O COCIDA, PAN, GALLETAS, ENSALADAS, ARROZ, Y CUALQUIER TIPO DE ALIMENTO EN GENERAL. Acrquese al rea en donde debe tomar la muestra segn lo indicado por el sitio de toma de muestra. Tome la temperatura del alimento a ensayar. Destape el cuchillo estril o bajalenguas y proceda a tomar la muestra, calculando una toma de mnimo de 200 gramos. (aunque tambin es recomendable tomar la muestra con los mismos implementos con los que cuenta el establecimiento ) Introduzca rpidamente la muestra dentro de la bolsa estril. Marque inmediatamente la muestra Lleve a la cava Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de anotar el nombre del manipulador que preparo el alimento. Si es posible anote las condiciones higinicas sanitarias que usted observa en el momento de la toma para facilitar la interpretacin de los resultados. Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible a una temperatura no mayor de 4C. Una vez en el laboratorio refrigere la muestra hasta el momento en que se va a analizar.
TOMA DE MUESTRA PARA ALIMENTOS LIQUIDOS Materiales Cava Bolsas estriles, con sello de seguridad o frascos de vidrio estriles. Termmetro Mechero , fsforos Pilas de hielo Procedimiento: ENTIENDASE POR ALIMENTO LIQUIDO: LECHE, JUGOS, CAF, CHOCOLATE, BEBIDAS ENVASADAS, ETC.. Acrquese al rea en donde debe tomar la muestra segn lo indicado por el sitio de toma de muestra.
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Tome la temperatura del alimento a ensayar. Asegrese de que tome un mnimo de 100 ml de muestra Introduzca rpidamente la muestra dentro de la bolsa estril. Marque inmediatamente la muestra Lleve a la cava Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de anotar el nombre del manipulador que preparo el alimento, si es un jugo, preguntar si tiene azcar, hielo, y cual es la fruta con la que se preparo, adems de preguntar la procedencia del agua empleada en la preparacin. Si es posible anote las condiciones higinicas sanitarias que usted observa en el momento de la toma para facilitar la interpretacin de los resultados. Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible. Una vez en el laboratorio refrigere la muestra hasta el momento en que se va a analizar.
TOMA DE MUESTRAS CON HISOPOS En las superficies de contacto: Se pasan los hisopos por las areas seleccionadas, primero en forma horizontal y luego vertical, e inmediatamente se coloca el hisopo en el tubo. En las manos: se pasan los hisopos en toda la superficie de manos, en las palmas y entre los dedos, e inmediatamente se coloca el hisopo en el tubo. En la nariz: se coloca el hisopo en uno de los orificios de la nariz y se hace un movimiento circular que permita contactar el hisopo con la mucosa de la nariz, e inmediatamente se coloca el hisopo en el tubo. REGISTRO DE LA MUESTRA. Todas las muestras se cerrarn mediante precinto numerado, cuyos nmeros se asentarn en una planilla habilitada al efecto donde se consigne el da, la hora, contenido, condiciones de la muestra y volumen total del lote o partida que representa. La planilla ser firmada por el que extrae la muestra, el representante y testigo si correspondiera. ACONDICIONAMIENTO, REMISIN Y RECIBO DE LA MUESTRA. La preparacin de la muestra, su manipulacin y transporte, deber efectuarse de tal
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manera que impida su ruptura, alteracin o contaminacin, y se asegure que la muestra examinada por el laboratorio es la misma y est en las mismas condiciones originales de la recogida y documentada por la persona que efecto el muestreo. En el laboratorio se deber registrar el nmero de orden interno que se adjudique a la muestra; la firma del los estudiantes que la procesan con la fecha y hora correspondiente. Si la muestra no cumpliera con las condiciones generales y/o particulares para cada caso, ser rechazada, debiendo igualmente registrarse en el laboratorio el ingreso de la misma y las causas del rechazo. CONSULTA
1. Elabore un formato de acta de toma de muestras (creatividad, se deber disear un dibujo que distinga a cada grupo de trabajo, y un logo, lo que se usara durante todo el semestre) Favor tener en cuenta, que datos deben ir del sitio, de la muestra, y las condiciones que van a interferir en el resultado del anlisis de la muestra. 2. Elabore un glosario de 20 trminos relacionados con la prctica realizada. 3. Describa mediante un esquema, como se debe tomar correctamente la muestra de: Carne cruda, agua de llave o grifo. 4. Que es un autoclave? Cul es la forma forma correcta de manejarlo. 5. Elabore un cuadro con 5 errores en la toma de muestra y sus consecuencias. BIBLIOGRAFIA
http://www.microbiologiadealimentos.com/ http://gestion-ycalidad.blogspot.com/search/label/BUENAS%20PR%C3%81CTICAS%20%20LABORATORIO. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/higieneyseguridad.htm http://blogs.clarin.com/blogfiles/fundacion-agustinalerena/CienciasNaturales1.12ManualparalaTomadeMuestrasdeAlimentos.pdf
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Laboratorio No Tema: Objetivo
02 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGA
Conocer los diferentes conceptos sobre la preparacin de medios de cultivo como soporte para diferentes anlisis microbiolgicos. Indicar los diferentes pasos para la preparacin de los medios de cultivo teniendo en cuenta los mtodos de esterilizacin adecuados. Preparar los medios de cultivo adecuadamente teniendo en cuenta sus ingredientes y los clculos apropiados para todo el proceso.
Fundamento Uno de los procedimientos mas importantes para la identificacin de microorganismos en el laboratorio es la siembra en medios de cultivo como base para la propagacin de colonias que nos puedan contribuir para el anlisis e identificacin de bacterias, mohos y levaduras. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes Muchas bacterias son indistinguibles morfolgicamente por su gran parecidos y en ocasiones se tien igual, por esta razn no se pueden identificar solo en el microscopio, por lo tanto se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en diferentes medios de cultivo especiales que contienen productos que inhiben el crecimiento de la mayora de microorganismos excepto de la especie que deseamos averiguar. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas).
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CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1- Disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2- Consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio deshidratado podemos agregar agua destilado para que se disuelvan los componentes y se forme un medio lquido, solido o semislido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. 3- Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental.
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En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilicos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- Condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que preveer el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5- Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. 6- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. 7- Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los termfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saprofitos tienen rangos ms amplios. 8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante).
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TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Atendiendo a su estado fsico:
1. Lquidos 2. semislidos 3. slidos Atendiendo a su utilidad prctica:
1. Medios para aislamientos primarios: Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.) Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina) Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin.
2. Medios para identificacin: Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (OxidacinFermentacin), a travs de bateras bioqumicas.
Materiales y Equipos ITEM TIPO 01 MAT 02 MAT 03 MAT 04 MAT 05 MAT 06 MAT
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DESCRIPCIN Cajas de petri grande Cajas de petri pequeas Tubos de ensayo 9 ml Erlenmeyer Pipeta 10 ml Papel filtro
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07 08 Reactivos TEM 01
002
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EQUI EQUI
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Balanza Estufa o mechero
DESCRIPCIN Medios de cultivo deshidratados: Agua peptona, Agar Baird Parker, Agar Sabouraud, Agar Plate count, Agar Mossel, etc. 02 Agua destilada para diluir el medio deshidratado. Procedimiento PASO DESCRIPCIN 1 Leer cuidadosamente las instrucciones de preparacin del medio de cultivo asignado. 2 Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes. Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo. 3 Disolver la porcin pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar. 4 Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25C). Para ello se debe tomar una alcuota de 50 mL, medir el pH y de ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. 5 6 7 Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones sealadas. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribucin y fecha de preparacin. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones sealadas Si se presenta algn inconveniente, antes de su esterilizacin, el medio se puede almacenar por un periodo mximo de 12 horas bajo refrigeracin. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado es esencial que se efecten controles para confirmar que el medio es satisfactorio y cumple con el propsito de uso deseado. Por ello se deben realizar pruebas para verificar la esterilidad, pH, capacidad de promocin de crecimiento, etc.
Consulta 1. Realice un cuadro comparativo de los diferentes medios de cultivo, sus componentes y que microorganismos se logran identificar con s respectivo uso. 2. Organice un listado de medios de cultivos lquidos, semislidos y slidos utilizados comnmente en el laboratorio de microbiologa de alimentos. 3. Que medios de cultivo se esterilizan y cules no? Por qu se esterilizan? Y otros porque no
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Bibliografa Los medios de cultivo en microbiologa. http://www.danival.org/600%20microbio/6000notasmicro/medioscult/medios_110_algunos.html Medios de cultivo. Rev. 03-10-10. http://microbiologiadealimentos.com/ Manual de medios de cultivo en microbiologa. http://www.scribd.com/doc/8614571/ManualdeMediosdeCultivo
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Laboratorio No 03 Tema :PREPARACIN DE DILUCIONES, RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS, BACTERIAS PSICROFILAS, Y TERMOFILAS. OBJETIVOS Preparar una muestra de alimento para su anlisis microbiolgico. Adquirir destreza en el procedimiento de realizar diluciones progresivas de la muestra para poder realizar recuentos microbianos con una poblacin exacta de dicha muestra. Reconocer la importancia del anlisis de bacterias mesofilas, psicrofilas y termfilas FUNDAMENTO El anlisis de los alimento para determinar la existencia, tipo y nmero de microorganismos es bsico para la microbiologa de alimentos. Sin embargo ninguno de los mtodos utilizados habitualmente permite determinar el nmero exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmsfera, la composicin del medio y el tiempo de incubacin. DILUCIONES Si se sospecha que una muestra tiene una gran cantidad de microorganismos por ml o gr, la muestra se diluye. Al diluir lamuestra antes de hacer la prueba, se evita que las placas tengan exceso de colonias, permitiendo obtener diluciones con un nmero de colonias entre 25 y 250 Ufc/ml o gr. El plan de dilucin que ms frecuentemente se utiliza envuelve diluir la muestra por un factor de 10. La muestra se diluye con una solucin salina estril, 0.85% NaCl o de 0.1% peptona. Usualmente en este laboratorio se utilizan botellas de dilucin con un volumen de 90 99 ml.
Los mtodos bsicos utilizados para investigar el nmero total de microorganismos: Recuento en placa (SPC) para la determinacin del nmero de clulas viables Mtodo del nmero ms probable (MPN) de grmenes como clculo estadstico del nmero de clulas viables
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Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de clulas viables con capacidad reductora. Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como para las no viables. El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin del nmero de clulas viables o unidades formadoras de colonias en un alimento.
LOS RECUENTOS TOTALES DEBEN HACERSE EN FUNCIN DE UNO DE LOS SIGUIENTES FACTORES: Mtodo de muestreo utilizado. Distribucin de los microorganismos en la muestra. Naturaleza de la microflora del alimento. Naturaleza del alimento. Antecedentes del alimento. Adecuada nutricion del medio de cultivo. Temperatura y medio de incubacin. pH, aw, potencial de oxidacin reduccin del medio. Tipo de diluyente utilizado. Nmero relativo de microorganismos en la muestra.
El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: 34 C a > 90 C. En funcin de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos: Los que crecen bien a 7 C o por debajo de esta temperatura se le denominan psicrfilos Los que crecen entre 20 30 C, con una temperatura ptima de crecimiento est entre 30 40 C se le denominan mesfilos Los que crecen por encima de los 45 C se le denominan termfilos. . Este recuento se considera como indicador del grado de contaminacin de los alimentos en cualquier etapa del proceso de produccin, tambin se utiliza como indicador de la vida til de un producto. es utilizado para determinar si la limpieza, desinfeccin y el control de la temperatura durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento se han realizado de forma adecuada . Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de patgenos o sus toxinas.
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Este recuento NOSE HACE en productos terminados, ni productos fermentados, ya que por la manufactura de ese tipo de productos, el recuento no sera representativo.
MATERIALES Y EQUIPOS Descripcin Pipetas estriles de 1 ml. Cajas de petri estriles. Incubadora de 37C +/- 2C, 55C. Refrigerador 7C. Agar PLATE COUNT. PROCEDIMIENTO Descripcin Este mtodo se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, vertido en una placa de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es lquido, o con una cantidad determinada de suspensin madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensin madre. El recuento podr ser realizado utilizando un sembrador espiral (NF V08-100) Incubacin a 30 C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir del nmero de colonias obtenidas en las placas de Petri escogidas, calcular el nmero de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra. INCUBACION: MESOFILAS: 35C por 24 a 48 horas PSICROFILAS: 7C POR 7 a dias. TERMOFILAS: 55C POR 24 a 48 horas. CONSULTA 1. Mencione 5 ejemplos de cada una de las bacterias mencionadas en la prctica y diga en que tipo de alimentos las podemos encontrar. 2. Elabore el grafico donde se muestre claramente la forma de realizar diluciones de un alimento slido y de un alimento liquido. 2. Realice un cuadro comparativo preparacin de: Agua peptona al 1 y 2 % Agar plate count.
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sobre la fundamentacin, composicin y
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BIBLIOGRAFA http://www.ispch.cl/lab_amb/serv_lab/aerobios_micro.html http://www.cps.unizar.es/calidad/docs/guia.pdf http://www.microbiologiadealimentos.com/
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Laboratorio No Tema: Objetivos
04 RECUENTO DE COLIFORMES EN ALIMENTOS
Comprender y realizar adecuadamente la determinacin de Coliformes totales a partir de productos de origen animal o vegetal. Diferenciar las tcnicas de NMP y vertido en placa para recuento de coliformes. Analizar correctamente los resultados que se obtengan en cada prueba.
Fundamento Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el cido producido por la fermentacin de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitacin de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente estn rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersin y separacin. El medio chromocult es un agar selectivo para el crecimiento de coliformes totales y E. coli en muestras de aguas y alimentos, por la accin conjunta de las peptonas selectivas, piruvato y tampn de fosfatos que garantiza un rpido crecimiento tambin de coliformes con daos sublaterales. NOTAS Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de coliformes, debe considerarse lo siguiente: Si el alimento contiene mono o disacridos en alta s concentraciones, stos pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes a las de coliformes. El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de 3 h. a partir de su preparacin; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en bao de agua a 45 C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo. Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, ms adecuadas para los coliformes. El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubacin, especialmente la incubacin prolongada, pueden ocasionar la formacin de colonias rojas de cocos Gram positivos. El rango estadstico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (De sensibilidad del mtodo) es de 15 a 150 UFC por placa.
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El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos. Materiales y Equipos tem Tipo Descripcin 01 MAT .Cuchillo-cuchara. .Pipetas de 1ml y 10 ml. .Asa bacteriolgica. .Bolsas de polipropileno. .Gradilla. .Tubos de ensayo. .Cajas de petri. .Algodn y alcohol 70% .Asa de hockey. .Pipeteador. .Erlenmeyer. MEDIOS DE CULTIVO .Agar bilis verde brillante lactosa con campana de Durham. .Agar Chromocult .Agar EMB .Agua peptona 0.1% .Agua triptona.
02
EQU
.Homogenizador. .Incubadora. .Balanza
Reactivos tem Descripcin 03 Coloracin de Gram Reactivo de Kovacs
Procedimiento Paso Descripcin SIEMBRA EN CHROMOCULT

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Siembra por placa profunda: Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo y el recipiente que contiene la muestra a analizar. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inoculo. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio Chromocult fundido y mantenido a 45 1.0C en bao de agua. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. Mezclar cuidadosamente el inoculo con el medio, mediante seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri sobre una superficie horizontal fra. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35C, durante 24 2 h. Despus de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias. Las colonias tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un dimetro de 0.5 a 2.0 mm. Siembra por superficie Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo y el recipiente que contiene la muestra a analizar. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que al adicionar la correspondiente dilucin en el agar Chromocult ya solidificado no ocurran accidentes. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inoculo. Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril. Inmediatamente distribuir el vertido con el asa de hockey por todo el medio.
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Colocarlas en la incubadora a 35C, durante 24 2 h. Despus de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias. Las colonias tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un dimetro de 0.5 a 2.0 mm. PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES TOTALES (NMP)
1. 2. 3.
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Desinfectar con alcohol al 70% toda el rea de trabajo y el recipiente que contiene la muestra a analizar. Pesar 10 g o medir 10 ml de la muestra y realizar tres o ms diluciones de igual forma que para el recuento en placa. Sembrar por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones en tubos que contengan 10 ml de Bilis verde brillante lactosa con tubos Durham preparados a concentracin simple. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37C. Leer a las 24 horas los tubos positivos, los negativos reincubarlos otras 24 horas. Repicar mediante una asada todos los tubos positivos al agar EMB e incubar por 24 horas a 35-37C. Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados por crecimiento caracterstico en agar EMB (colonias con brillo verde metlico). Buscar en la tabla estandarizada el resultado de NMP. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Totales = No. de bacterias / g ml. PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES FECALES O TEST DE MAC- KENZI. Subcultivar todos los tubos positivos de coliformes totales en caldo Bilis verde brillante lactosa y agua triptona o medio SIM. Incubar por 24-48 horas a 44.5C en bao serolgico cuidando que el nivel del agua cubra el contenido de los tubos. Leer los tubos positivos de la siguiente forma: caldo Bilis verde brillante lactosa: se lee por turbidez y gas. Medio SIM o agua de triptona: Se adicionan 5 gotas del reactivo de Kovacs y se lee por formacin de un anillo rojo en la superficie del medio. Para que la prueba sea considerada positiva deben estar ambos tubos positivos. Anotar todos los tubos positivos y buscar en la tabla del NMP. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Fecales = No. de bacterias / g ml.
1. 2. 3.
4. 5.
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Consulta 1. A que se debe el color verde metlico de las colonias de E. coli en agar EMB. 2. En la tcnica del NMP que se tiene en cuenta para diferenciar coliformes totales , de fecales y de E. coli. Bibliografa .http://www.slideshare.net/bado/guas-microbiologa-de-alimentos. .Camacho, A., M. Giles, A. Ortegn, M. Palao, B.Serrano y O. Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
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05 RECUENTO DE Staphylococcus aureus Y MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
Realizar recuento de Staphylococcus coagulasa positiva a partir de alimentos de origen animal o vegetal. Reconocer e interpretar con habilidad el crecimiento de Staphylococcus aureus en los medios empleados. Realizar recuento de mohos y levaduras en productos de origen animal y vegetal.
Fundamento La intoxicacin estafiloccica se produce por el consumo de alimentos en los que se ha multiplicado S.aureus, produciendo toxinas muy termorresistentes, activas por va oral, que se encuentran ya preformadas en el alimento (Escobar, 1994, p 94). Los estafilococos enterotoxignicos pueden encontrarse, por lo tanto, ya en los alimentos en el momento de su obtencin, en especial en los de origen animal, o bien llegar posteriormente a ellos a partir principalmente de los manipuladores. Un alto porcentaje de personas sanas son portadoras de S.aureus en fosas nasales y faringe, tambin se encuentran en la piel, cuero cabelludo y, sobre todo en procesos cutneos (acn, furnculos, heridas infectadas) Los mohos y las levaduras estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo tanto se pueden encontrar como carga normal de los alimentos con bajo pH y Aw, alto contenido de slidos como sal o azcar, temperaturas bajas de almacenamiento o presencia de antibiticos, pues son capaces de desarrollarse en las condiciones ms adversas (Escobar, 1994, p 198). Estos microorganismos pueden utilizar sustratos complejos como: pectinas, hidratos de carbono, cidos orgnicos, protenas, lpidos, etc. Frecuentemente los mohos y levaduras son responsables del mal olor, sabor, decoloracin o pigmentacin de la superficie de los alimentos, son los grandes alteradores de frutas, hortalizas, leguminosas, tubrculos y granos.
RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS Materiales y Equipos tem Tipo Descripcin MAT Medios de cultivo
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Agua peptona 0.1% Agar Baird Parker Plasma fresco Infusin cerebro corazn Cuchillos-cucharas Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Placa petrifilm
02
EQU
Balanza Homogenizador Incubadora
Reactivos tem 0.1 0.2 0.3 Procedimiento Paso 1. 2. 3. 4.
Descripcin Coloracin de gram Agar azul de O-Toluidina Algodn y alcohol al 70% 36
5. 6. 7.
Elaborado por:
Preparar las muestras y realizar las diferentes diluciones. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Baird-Parker con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo. Marcar dos cajas de petri que contienen agar Baird-Parker, una como control del medio y otra como control del diluyente Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio Baird- Parker. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. Incubar por 24-48 horas a 35-37C. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas colonias caractersticas (negras, lustrosas, convexas,
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8.
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rodeadas de un halo claro dentro de anillos opacos). Realizar el conteo final multiplicando por el inverso de la dilucin. Reporte (UFC/ml o gr) CONFIRMACIN E IDENTIFICACIN STAPHYLOCOCCUS AUREUS DE
1. 2.
3. 4. 5.
6.
7.
Prueba de coagulasa Realizar la coloracin de gram a varias colonias caractersticas (raz cuadrada del total y no menos de 3 colonias) Observar al microscopio cocos grampositivos en racimos. Sembrar en igual nmero de tubos que contienen infusin cerebro corazn las colonias caractersticas y grampositivas. Incubar a 37 C por 24 horas. Transferir 0.3 ml de cada cultivo a tubos limpios y marcados como prueba de coagulasa que contienen 0.3ml de plasma fresco humano (o plasma de conejo) Incubar a 37 C por 4 horas, observar cada hora hasta la formacin del cogulo. Si despus de este tiempo da negativo, incubar hasta 24 horas. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias contadas y el nmero de confirmadas positivas, ejemplo: Total de colonias contadas en la dilucin 10-2 = 30 3000 Colonias elegidas para realizar la prueba de la coagulasa = 7 Positivas en la prueba de la coagulasa= 5 Reporte de Staphylococcus aureus coagulasa positiva: 3000 x 5 X= = 2142 = 2 x 103 bacterias / g ml. Determinacin de termonuclesa.
1. 2. 3.
Incubar las placas de Baird Parker positivas por 2 horas a 60C. Adicionar sobre las placas de Baird Parker 15 ml de agar azul de O- Toluidina DNA fundido a 45C. Incubar por 3 horas a 37 C. 4. Observar presencia de una zona rosada brillante sobre cada colonia de Staphylococcus aureus indica una prueba positiva. PLACA PETRIFILM
PASOS
1.
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Inocule 1 ml de la dilucin de la muestra y esprzalo.

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2. 3.
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5. 6.
Incube la placa a 35C durante 24 horas. Cuente las colonias confirmadas. Pase la placa a una segunda temperatura de incubacin de 62C por 1 hora para eliminar las nucleasas que no son termoestables. Incube nuevamente la placa a 35C por 1 a 3 horas Cuente las colonias confirmadas. Reporte (UFC/ml o gr)
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS Materiales y Equipos tem Tipo 01 MAT
02
EQU
Descripcin Medios de cultivo Agua peptona 0.1% Agar Ogy Cuchillos-cucharas Pipetas 1 y 10Ml Asa bacteriolgica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Algodn Placa petrifilm Homogenizador Balanza Incubadora
Reactivos tem
Descripcin Reactivos Materiales alcohol al 70% DETERMINACIN DE MOHOS Y LEVADURAS Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa. Seleccionar las cajas entre 20 y 100 colonias y multiplicar por el inverso de la dilucin. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilucin y No. del grupo. Marcar una caja como control del medio y otra como control del diluyente Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml del diluyente. Verter 15ml de agar Extracto de malta-oxitetraciclina (OGY) fundido a 45C en cada una de las cajas
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Procedimiento Paso 1.
2. 3. 4. 5.
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6. 7. 8. 9. 10.
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Mezclar de igual forma que para el recuento en placa. Dejar solidificar. Invertir las cajas e incubar a 22C por 5 a 7 das (envolver las cajas con papel Kraft). Sacar las cajas, evaluar el control del medio y del diluyente Seleccionar las cajas entre 20 y 100 colonias y multiplicar por el inverso de la dilucin. Reporte (UFC/ml o gr) PLACA PETRIFILM Inocule 1 ml de la dilucin de la muestra y esprzalo. Incube la placa a 35C durante 24 horas. Cuente las colonias confirmadas. Pase la placa a una segunda temperatura de incubacin de 62C por 1 hora para eliminar las nucleasas que no son termoestables. Incube nuevamente la placa a 35C por 1 a 3 horas Cuente las colonias confirmadas. Reporte (UFC/ml o gr)
Consulta 1. .Fundamento del agar OGY , y agar CGA. 2. Importancia de la determinacin de mohos y levaduras y en qu tipo de alimentos se determinan. 3. Importancia de la determinacin de staphylococus aureus y en qu tipo de alimentos se determina. Bibliografa http://multimedia.3m.com/mws/mediawebserver?mwsId=SSSSSu7zK1fslxtUmx_9Mxm Uev7qe17zHvTSevTSeSSSSSS-http://www.slideshare.net/bado/guas-microbiologa-de-alimentos.
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06 RECUENTO DE Bacillus cereus y Pseudomonas spp EN ALIMENTOS
Dar a conocer las bases para el reconocimiento analtico de Bacillus cereus y de Pseudomona spp en los alimentos. Reportar de forma correcta los anlisis realizados. Emitir un concepto sobre la calidad de los alimentos analizados. Realizar recuento de Bacillus cereus y Pseudomona a partir de los alimentos como ovoproductos.
Fundamento Bacillus cereus Es un microorganismo aerobio, Gram positivo, esporulado, comn en el suelo, vegetales, alimentos crudos y procesados. Cuando se encuentra un numero alto, mayor de 10 6 colonias por gramo, en un alimento, puede ocasionar intoxicacin alimentaria. Se presentan dos clases de enfermedades por la ingesta de alimentos contaminados con este microorganismo: Forma clsica. Los alimentos implicados mas comunes son, el arroz, las pastas y la arepa. Esta enfermedad tambin conocida como gastroenteritis o forma diarreica. Tiene un periodo de incubacin de 24 horas aproximadamente. Forma Emtica o llamada tambin intoxicacin: tiene un periodo de incubacin de 5 a 13 horas aprox. Es un microorganismo indicador de la calidad de las condiciones de almacenamiento de productos refrigerados, ya que su presencia en este tipo de alimentos, indica, que hubo una posible interrupcin en la cadena de fro. Los alimentos no deben permanecen a temperatura ambiente una vez cocidos, ya que cerca del 50% de los alimentos e ingredientes alimentarios estn contaminados hasta cierto punto (< 10/gr) por este organismos. La ingestin de alimentos que han sido conservados a temperatura ambiente despus de su coccin, permite que las esporas, las cuales sobreviven la ebullicin, germinen y se multipliquen a niveles altos y verter las toxinas al alimento para que finalmente provoquen la intoxicacin.
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Medios de cultivo, Equipos Y Materiales Item Tipo Descripcin 01 Medio Medios de cultivos Agua peptona 0,1% Agar Creus segn Mossel Agar Gelatina Agar Almidn Agar Citrato Simmons Agar Urea Agar SIM Caldo nitrato Caldo MR-VP Caldo MR-Glucosa (5%) Caldo MR-Xilosa (5%) Caldo MR-Arabinosa (5%) Caldo Cerebro corazn 02 EQUI Homogenizador Balanza Incubadora 03 MAT Cuchillos- cucharas Pipeta 1 y 10ml Asa bacteriolgicas Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayos Reactivos Coloracin de Gram. Reactivos de Kovacs Solucin lugol Griess Alfa naftol 5% KOH 40%
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Rojo de metilo Perxido hidrogeno 3% Oxidasa 1 2 3 4 Procedimiento Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa. Marcar tres cajas de petri que contienes agar Cereus segn Mossel con fecha, muestras dilucin, y numero del grupo . como control Marcar dos cajas que contienes agar Creus segn Mossel, una del medio y la otra como el control diluyente. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml de diluyentes en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio a Creus segn Mossel. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie que de seca Incubar por 24-48 horas 35-37C. seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y caractersticas (colonias rosadas con bordes regulares e irregulares. Con un halo denso a su alrededor debido a la lecitinaza). Realizar el conteo final del conteo final multiplicado contarlas colonias por el inverso de la dilucin y por 10. Tomar al menos tres UFC caractersticas, realizarles la prueba de la catalasa y al coloracin de Gram. se observa bastones Gram: si son catalasa positiva y ala coloracin de Gram se observa bastones Gram positivos con extremos mas o menos cuadrados, en cadenas Cortas o largas y entre lazadas con bacteriano realizar la identificaciones bioquimicas. IDENTIFICACIONES BIQUIMICAS DE BACILLUS CEREUS Subcultivar tres colonias caractersticas en caldo cerebro corazn . Realizar las siguientes pruebas bioqumicas. Hidrlisis de la gelatina: Siembre dos lines paralelas en agar gelatinas e incubar a 37C por 24h. Hidrlisis de almidn: Siembra dos lneas paralelas en agar almidn incubar a 37C por 24 horas Agar urea: inocular el fondo por picadura y el bisel por estra e incubar a 37C por 24 h. Agar citrato Simmons: inocular el fondo por picadura y el bisel en lnea e incubar a 37C por 24h. Movilidad: inocular el fondo ( agar SIM) por picadura e incubar a 37C por 24h .
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5 6 7
pasos
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.Reduccin de nitrato: caldo Nitrato . Produccin acetoina: caldo MR- VP. fermentacin de carbohidratos: Glucosa, Xilosa, Arabinosa.
Comparar los resultados con las caractersticas bioqumicas de Bacillus cereus Fundamento PSEUDOMONAS EN ALIMENTOS Son bacilos Gram Negativos, que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, agua, suelo, hortalizas, aves y productos marinos. Son aerobios facultativos, mviles por un flagelo polar (monotricos)o inmviles con raras excepciones, son oxidasa positiva, tienen un metabolismo estrictamente respiratorio (oxidativo) y no fermentativo: ciertas especies pueden atacar la glucosa y otros glcidos por va oxidativa, crecen en medios simples a temperaturas de 30C,produciendo pigmentos en la mayora de los casos. A nivel hospitalario se comporta como oportunistas produciendo infecciones y hasta septicemia, son carga normal de muchos alimentos produciendo alteracin de los mismos, su presencia en aguas recreacionales puede causar problemas de infecciones como conjuntivitis, otitis etc. Algunas especies de Pseudomonas pueden alterar los alimentos, dentro de las propiedades que las hacen importantes en los alimentos son: 1. Su capacidad para utilizar compuestos de carbono muy distintos. 2. Su capacidad para producir diversas sustancias que influyen desfavorablemente en el sabor. 3. Su capacidad para utilizar alimentos nitrogenados sencillos. 4. Su capacidad para sintetizar sus propios factores de crecimiento o vitaminas. 5. La actividad lipolitica y proteoltica de algunas especies. 6. Su tendencia aerobia que les permite un crecimiento rpido y obtener productos de oxidacin y mucosidad en aquellas superficies de los alimentos en las que es mas probable que exista una contaminacin masiva. 7. Su capacidad para crecer a temperaturas bajas. 8. La produccin de pigmentos por algunas especies. La mayor parte de las cepas producen piocianina, un pigmento de fenacina verde e hidrosoluble que imparte un Color verdoso al medio de cultivo. Es probable que la presencia de piocianina sea la nica caracterstica necesaria Para identificar una Pseudomona aeruginosa porque ningn otro no fermentador sintetiza este pigmento.
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La Pseudomona aeruginosa es la especie ms importante en la alteracin de los alimentos refrigerados debido a su carcter psicotrfico.
Materiales y Equipos tem Tipo Descripcin 01 MAT Pipetas estriles de 1 ml y/o de 0,1 ml Cajas de petri estriles con el medio slido Asas de hockey Pipeta 1 y 10ml Asa bacteriolgica Bolsas Polipropileno Gradillas Tubos de ensayo Cajas de Petri 02 EQUI Lmpara luz UV Incubadora a 30C+/-2C
Reactivos y medios de cultivo
tem
Reactiv o
Descripcin Agar Mossel Caldo casoy doble concentracin Caldo casoy concentracin simple Agar cetrimide Oxidasa
Solucin amortiguadora fosfato PH 7.2 Procedimiento Paso Descripcin 1 Preparar la muestra y diluciones de los homogeneizados, tal y como se ha mencionado anteriormente. 2 Transferir 0.1 ml de la dilucin de 10- 1 sobre la superficie de cajas de petri estriles, previamente marcadas, que contienen el medio de cultivo Agar Mossel . 3 Esparcir el inoculo con ayuda del asa de hockey sobre el medio de cultivo. 4 Dejar secar sobre una superficie completamente plana. 5 Hacer control de esterilidad del medio de cultivo, incubando una caja que contenga agar Mossel , sin adicin de la muestra, incubando a 37C +/- 2C. 6 Se invierten las cajas y se incuban a 30C+/-2C Por 48 horas.
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Seleccionar las cajas que presenten entre 20-200 colonias, que sean manitol negativas, con un halo denso de lecitinasa positivo
Interpretacin de los resultados. (CONFIRMACION BIOQUIMICA) REDUCCION DE NITRATOS A NITRITOS : -Tome una colonia y siembre en caldo nitrato, incube a 30C por 24 horas. - Compruebe la presencia de nitritos en el medio, aadiendo a cada tubo 1 ml de reactivo de Griess y observe el color que presenta: Positivo: color rojo. Negativo: incoloro. Confirmar al adicionar una mnima cantidad de polvo de Zinc: Color rojo (negativo) No hay cambio de color: (positivo) FERMENTACION DE GLUCOSA: -Tome una colonia sospechosa e inoclela en un tubo con glucosa. Al leer y observar cambio a color amarillo, es ndice de la fermentacin del azcar por este microorganismo. LICUEFACCION DE GELATINA: - Tome una colonia sospechosa e inoclela en agar gelatina. Incubar a 22C por espacio de 24 72 horas. Al leer si observa una consistencia liquida, la prueba se considerara positiva. HIDRLISIS DEL ALMIDON : - Tome una colonia y siembre por estra en agar almidn. Incube a 32C por 24-48 horas. Inunde la superficie con solucin lugol y observe la hidrlisis. PRUEBA DE VOGUES PROSKAUER: ( VP ): - Tome con el asa una colonia sospechosa y transfirala a un tubo con caldo VP e incube a 35C ( 24- 48 horas ) .Revele agregando alfa naftol y KOH. Negativo: sin color. Positivo: Anillo rojo en la superficie. Prueba complementaria: Gram: Bacilos +. Expresin de resultados Informar ufc/ gr o ml segn lo analizado. Procedimiento Paso Descripcin 1 Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene la muestra de agua a analizar. 2 Mezclar muy bien la muestra. 3 Adicionar la muestra de agua as: 10ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno en caldo casoy a doble concentracin. 1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno en caldo casoy a simple concentracin. 1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno en caldo casoy a simple concentracin a partir de una dilucin 1:10 de solucin buffer
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fosfat aun PH 7.0 Mezclar e incubar por 24 horas a 37C. Anotar los tubos que presentan crecimiento positivo (turbidez). Confirmar la presencia de Pseudomonas aeruginosa mediante un recipiente de todos los tubos positivos al agar cetrimide. Incubar a37C Por 24 horas Confirmar la presencia de Pseudomonas aeruginosa realizando la prueba de la oxidasa: colocar una colonia en la tirilla, adicionar una gota de agua destilada estril, y leer en los 60segundos siguientes. la aparicin de un color morado o azul indica prueba de oxidasa positiva. Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados por crecimiento en el agar cetrimide por formacin de un pigmento verde azulado, adems el olor caracterstico a frutas y la prueba de la oxidasa positiva Buscar en la tabla correspondiente y expresar el resultado como NMP de Pseudomonas aeruginosa/ 100 ml de agua Hidrlisis de la gelatina: zonas claras alrededor de las colonias luego de cubrir las colonias con reactivo sublimados con Hg Hidrlisis de almidn: zonas claras alrededor de las colonias luego de cubrir las colonias con lugol Agar urea: Tubos con reaccin acida(amarillos).,Urea Negativa. Agar Citrato Simmons: medio de cultivo verde citrato negativo. Movil: Crecimiento desplazado a travs de la lnea de siembra. Reduccin de nitratos: Aparicin de un color rojo luego de adicionar el reactivo de Griess. Produccin de acetoina: : Aparicin de un color rojo luego de adicionar el reactivo de alfa naftol y el hidrxido de potasio. Fermentacin de carbohidratos: (Glucosa, Xilosa, Arabinosa) Por medio de viraje del medio a amarillo.
Consulta 1. Fundamento del agar Mossel 2. Que es la asparagina? Para que se usa. 3. Existe probabiliad de encontrar Pseudomonas en agua envasada? Bibliografa P. R. Hayes.Food Microbiology and Hygiene.Editorial.Elsevier Applied Science Publishers Ltd.pg.39-147. ICMSF.Microorganismos de los alimentos .Tcnicas de anlisis microbiolgicas, Volumen 1 y 2 edicin, Editorial Acribia Zaragoza, Espaa, 1984.
1 2
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Laboratorio No Tema:
07 RECUENTO DE Clostridium SULFITO REDUCTOR Y PRUEBA DE ESTERILIDAD COMERCIAL
Objetivos Documentar el procedimiento para llevar a cabo el recuento de Clostridium Sulfito reductor en el anlisis de microbiologa de alimentos. Conocer y desarrollar el procedimiento para el anlisis microbiolgico de enlatados. Determinar la presencia de Clostridium sulfito reductores de muestras de alimentos. Familiarizarse con los mtodos de aislamientos de bacterias anaerbicas en alimentos. Conocer los peligros que ocasionan estos microorganismos en la salud del consumidor. Fundamento Clostridium Sulfito Reductor El grupo bacteriano de los sulfito-reductores est integrado por bacterias pertenecientes al gnero Clostridium que tienen en comn reducir el sulfito a sulfuro que en presencia de citrato frrico o cualquier otra sal de metales pesados, dan como resultado la formacin de colonias negras. . ste gnero est formado por ms de cien especies, los cuales son bacilos grampositivos, anaerobios, esporulados, ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales as como tambin en la flora intestinal de hombres y animales. En su mayora son saprofitos, pero los patgenos pueden causar graves enfermedades en el hombre como gangrena gaseosa, botulismo, ttanos, infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a antibiticos e intoxicaciones alimentarias. La capacidad para provocar enfermedad est vinculada a la posibilidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas mediante la formacin de esporas, crecer rpidamente y producir toxinas histolticas, enterotoxinas y neurotoxinas. Suelen usarse para apreciar la deficiente calidad higinica en la elaboracin del alimento, pudindose encontrar en el agua y productos de origen animal, su nmero es escaso en productos frescos, siendo la capacidad de esporular la que les confiere gran resistencia. De esta forma, los alimentos que pueden estar contaminados son: carnes vacuna, pollo, salsas cocinadas y no refrigeradas. Este anlisis es considerado como el recuento indicador ms importante de las
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bacterias anaerobias esporoformadoras. Se empleara para su crecimiento el medio de cultivo especifico, Agar SPS (Agar sulfito polimixina sulfadiazina) el cual es un medio selectivo para Clostridium perfringens y de esta forma determinar su presencia o ausencia en el anlisis Microbiolgico de alimentos de consumo humano. Los enlatados Los enlatados o tambin llamados conservas, incluyen aquellos productos, que generalmente esterilizados, permanecen sin contaminarse a temperatura ambiente, durante largos periodos de tiempo. Tienen una vida til que puede variar entre seis meses y varios aos. Se les consideran productos alimenticios preparados en recipientes metlicos, de vidrio, plstico, hojalata, que tienen cierre hermtico y han sido sometidos a un tratamiento que garantiza la destruccin de todas las formas bacterianas vegetativas o esporuladas y de cualquier enzima. Las caractersticas principales exigibles en una conserva o enlatado son: Inocuidad para el consumidor. Mantenimiento inalterable de sus caracteres organolpticos durante largos periodos de tiempo. Para lograr la inocuidad sera suficiente con emplear un tratamiento trmico elevado, que dara lugar a que los caracteres organolpticos del producto sufrieran una modificacin sensible. Por esta causa se suelen tener en cuenta dos conceptos respecto a la esterilidad de las conservas: Esterilidad Biolgica: significa que existe una ausencia total de microorganismos y sus toxinas, as como la inactivacin de enzimas celulares y microbianas. Esterilidad comercial: significa que NO deben existir formas vegetativas, esporas de bacteria patgenas o toxinas, ni microorganismos capaces de alterar el producto. Las enzimas celulares y microbianas se inactivan. En las conservas de esterilidad comercial se toleran esporas pertenecientes a la familia Bacillaceae, no patgenas, no toxigenicas, e inertes, es decir, incapaces de germinar. Materiales y Equipos tem 01 02
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Tipo EQU EQU

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Descripcin Estufa. Incubadora de 37C +/2C.

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MAT MAT MAT MAT MAT
Tubos tapa rosca estriles. Glicerina o aceite mineral. Pipetas estriles de 1 ml. Gradillas Mechero Bunsen
Reactivos tem Descripcin 01 Diluyente: Agua Peptona 02 Agar SPS (Sulfito-polimixina-sulfadiazina) Procedimiento para muestra de alimentos Paso Descripcin 1 Tomar la cantidad de muestra adecuada y agregarla en un recipiente estril con agua peptona. Realizar las diluciones deseadas (10-1, 10-2, 10-3) de los homogeneizados. 2 Transferir 1 ml de la dilucin 10-1 al tubo tapa rosca vacio estril, previamente marcado. 3 Calentar el tubo a 80C durante 10 minutos. 4 Pasar una vez calentado el tubo a un recipiente con agua fra (2C) por 5 minutos. 5 Agitar 6 Adicionar 10 ml de agar SPS previamente fundido y mantenido a 45C. 7 Dejar solidificar el tubo en posicin recta. 8 Ya slido el medio se adiciona glicerina o aceite mineral para crear atmsfera de anaerobiosis 9 Se tapan muy bien los tubos y se incuban a 37C+/-2C por 24 a 72 horas. 10 Si resulta ser positivo, se observara colonias de caracterstico color negro. Procedimiento para muestra de agua Paso Descripcin 1 Tomamos 5 tubos de ensayo a los cuales les agregaremos 5 mL de aguas servidas a cada uno. 2 Luego agregaremos el medio Wilson-Blair, previamente calentado (disuelto) en el bao Mara 3 El agua servida debe haber sido tambin
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calentada, previamente, en el bao Mara a 80 C por 10 min 4 Al medio le agregamos la solucin sulfatoferrosa 5 Luego incubamos los tubos en anaerobiosis a 37 C por 48 h. 6 Se observarn, de ser positivas, colonias negras en la profundidad. 7 Los resultados se dan en esporas de Clostridium sulfito reductoras/100 mL. Clculo e interpretacin de los resultados. Leer los tubos que presenten entre 5 a 50 colonias de color negro. Calcular el nmero de total de colonias multiplicando por el factor de dilucin. Expresin de resultados Los resultados se expresan como UFC (unidades formadoras de colonias) por gramo o mililitro segn corresponda.
La deteccin de Clostridium sulfito-reductores, as como su recuento, se puede tambin hacer : 1. Investigando el conjuntamente. recuento de formas vegetativas y esporuladas,
El medio utilizado es selectivo para grmenes sulfito- reductora de la mayor parte de los Clostridium, se reduce a sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro, que se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias. Se cuenta el nmero de colonias negras crecidas y se multiplica por el factor de dilucin del tubo, para obtener el recuento total de colonias de formas vegetativas y esporas de Clostridium sulfito- reductores, conjuntamente por gramo o mililitros. 2. Investigando la presencia de formas esporuladas.
Para obtener nicamente las formas esporuladas de Clostridium sulfito-reductores, se aprovecha su termorresistencia calentando a 80C el producto, la suspensin madre o las diluciones decimales, y enfriar inmediatamente bajo el grifo, de esta manera, se destruyen las formas vegetativas. Es importante, conocer que el medio agar SPS, se funde y se regenera calentndolo en agua hirviendo durante 10 minutos para expulsar el oxigeno.
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Despus se enfra hasta alcanzar 47-50 C, bajo un chorro de agua fra. Esterilidad comercial en CONSERVAS: Control de estabilidad: Control rutinario para comprobar las modificaciones que han sufrido las conservas tras una preincubacin previa. Se realiza en la fbrica antes de autorizar la salida de un lote. Pruebas: Diferencias envase conserva incubada testigo Variaciones en pH. Diferencias de anlisis bacterioscopico Control de esterilidad: Control que se realiza para comprobar un procedimiento de esterilizacin o si existieron problemas en el control anterior. Pruebas: Morfologa, flora microbiana revivificable Termorresistencia de la flora Temperatura optima de crecimiento. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LAS CONSERVAS: Para este anlisis es necesario dividir en varias etapas, que se describen a continuacin: 1. Lavado de envases: Antes de proceder al anlisis microbiolgico, es buena prctica lavar cada uno de los envases con agua jabonosa y aclarar despus con agua potable. 2. Examen macroscpico preliminar de los envases: Consiste en comprobar el estado de las conservas para descubrir posibles defectos o alteraciones tales como: Aspecto general Limpias Sucias Grasientas Abombamiento Normales Abombadas Estalladas Torsiones
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Manchas
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Oxido Rezumado Otras Normales Fisuras Roturas
Hermeticidad
3. Incubacin: Una vez realizado el examen externo de los envases, se someten a incubacin, SOLAMENTE los no alterados para controlar la estabilidad del producto. Dentro de los objetivos de la incubacin, se encuentran: Permitir la germinacin de las esporas aletargadas. Conseguir el crecimiento de microorganismos mesofilos y termfilos, utilizando tiempos de incubacin apropiados a temperatura adecuada. PROCEDIMIENTO DE INCUBACION Formar tres grupos con el material trado para la prctica: las unidades de muestra deben ser del mismo lote, en lo posible: Paso Descripcin 1 Grupo al que se le aplica temperatura de mesofilos: 37C durante 28 das. Practica: 8 das. 2 Grupo al que se le aplica temperatura de termfilos: 55C durante 10 das. Practica: 8 das. 3 Grupo que pertenece a temperatura ambiente y cuya utilidad es para que sea control. El desarrollo microbiano producido durante la fase de incubacin, puede dar lugar a la aparicin de unos signos no observados en el examen macroscpico preliminar y que revelan falta de estabilidad de la conserva. Las conservas o enlatados mantenidos en incubacin, debern ser observadas diariamente para comprobar si se producen alteraciones , y evitar, en caso de abombamiento, que pueda explotar. 4. Examen externo del envase despus de la incubacin: Es necesario que las conservas se estabilicen a temperatura ambiente durante 1 a 4 horas. A continuacin se examina la conserva para comprobar posibles alteraciones: Abombamiento ( de origen fsico, qumico, o biolgico ) Oxidacin Deformacin.
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5. Apertura del envase y toma de muestra para el anlisis: Estas operaciones deben ser extremadamente cuidadosas, con el fin de evitar contaminaciones externas que podrn FALSEAR LOS RESULTADOS. La persona que realiza las operaciones se lavara las manos correctamente, secndose solo con toallas desechables. Y usar guantes. Empapar algodn con alcohol sobre la tapa del envase. Evitar tocar el alimento con las manos, NO HABLAR. Cuando se trata de envases abombados, su apertura puede suponer un peligro para el manipulador, por lo que se tomaran medidas para protegerse de la salida violenta del contenido. Los recipientes se abren con el abrelatas previamente esterilizado. La apertura se hace a cierta distancia de la lnea de insercin de la tapa, para evitar contaminaciones, ya que el borde es difcil de desinfectar. Se debe flamear la tapa antes de abrirla. Recin abierto el envase, se comprueba visualmente el aspecto del producto, tomando nota de las posibles alteraciones. Examen del contenido de la lata: Olor: putrefacto, fecal, a acido sulfhdrico, a queso, a acido butrico. Aspecto: textura blanda, dura; consistencia: liquida, o viscosa; presencia de elementos extraos.
6. Examen interno del envase: Se extrae el producto para hacer un examen minucioso de la parte interna del envase, con el fin de descubrir alteraciones del color, de las paredes debidas a reacciones qumicas, as como lesiones de oxidacin y desprendimiento del esmalte protector. 7. Examen microscpico: En las conservas, los microorganismos se pueden encontrar en tres formas: vegetativas, esporuladas o esporas inertes. En general, una buena conserva, no debe contener ms de 2 a 3 bacterias muertas por campo microscpico, excepto en alimentos cuya elaboracin es consecuencia de una fermentacin biolgica. Cuando predominan cocos gram positivos, se sospecha de la presencia de la entero toxina estafiloccica Procedimiento para el anlisis Microbiolgico Paso Descripcin 1 Primero realizar dilucin hasta 10-1, dejar sedimentar de 3 a 5 minutos.
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Hacer una extensin fina del alimento sobre un portaobjetos bien limpio. 3 Aplicar coloracin de Gram 4 Examinar 10 a 20 campos distintos y contar las agrupaciones microbianas encontradas. 8. Interpretacin del control de estabilidad: De acuerdo con los exmenes ejecutados, para que la estabilidad de una conserva sea correcta, debe ocurrir: Que despus de la fase de incubacin no existan modificaciones del envase. Que despus de la incubacin no se observen modificaciones del contenido. Que la variacin del pH entre la conserva incubada y la no incubada sea igual o inferior a 0.5 unidades. Que la variacin del nmero de microorganismos observados en la conserva incubada con respecto a la no incubada sea inferior a 100. Consulta 1. Investigue para que clase o tipo de alimentos se debe realizar anlisis de esporas de Clostridium sulfito reductor. 2. En que radica la importancia de realizar el anlisis de esporas de Clostridium sulfito reductor? 3. Que son los enlatados? Como se clasifican? 4. Qu tipo de tratamiento reciben los siguientes alimentos previo a su enlatado, para ello elabore o busque diagramas de flujo de los procesos: a. salchichas b. atun Bibliografa Descripcin http://books.google.com.co/books?id=9EIfkks8uxMC&pg=PA74&lpg=PA74&dq=clostrid ium+sulfito+reductor+en+alimentos&source=bl&ots=RGeQZijeg&sig=8wyUZJ5085LdUtKa4CpFLul4rhc&hl=es&ei=JgeiTMLjCIH68Ab5mdXnCA&sa =X&oi=book_result&ct=result&resnum=8&ved=0CDAQ6AEwBw#v=onepage&q=clostri dium%20sulfito%20reductor%20en%20alimentos&f=false http://www.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf http://www.scribd.com/doc/6674027/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n14Aislamiento-e-identificacionde-Clostridium-perfringens http://www.webs.ulpgc.es/hica/PRAC/RUTPRAC/CONSERVAS/1OPCCONSERV.pdf http://www.cleanmasterltda.com/descargas/lecturas/botulismo.php http://www.conservasenlata.com/opinion_j.jsp ANEXOS No. Anexo Descripcin
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01
002
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Tubos estriles en anaerobiosis
02
Resultados positivos de sulfito- reductores en muestra de agua
03
Germinacin de esporas de Clostridium sulfito-reductores. Se observa un crecimiento confluente que impide el recuento. El agar se ha resquebrajado y elevado con motivo de la formacin de gas
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08 RECUENTO DE SALMONELLA SPP, Y LISTERIA MONOCYTOGENES
Familiarizar al estudiante con la investigacin de Salmonella y Listeria monocytogenes en muestras de alimentos. Conocer la importancia del reconocimiento de Salmonella como indicador de calidad en muestras de alimentos y su impacto sobre la salud Indagar sobre los alimentos que puedan contaminarse con Listeria monocytogenes Conocer el procedimiento de recuento para Listeria monocytogenes Aplicar mecanismos de prevencin de transmisin de: Listeria monocytogenes y Salmonella spp.
Fundamento LA SALMONELLA Es un gnero de bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que no desarrollan cpsula (excepto la especie S. typhi) ni esporas. Son bacterias mviles que producen sulfuro de hidrgeno (H 2S). Fermentan glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa. Es un agente productor de zoonosis de distribucin universal. Se transmite por contacto directo o contaminacin cruzada durante la manipulacin, en el procesado de alimentos o en el hogar, tambin por va sexual. Crece bien en los medios ordinarios de cultivo, sin requerir factores esenciales. En el hombre causa dos manifestaciones clnicas: fiebre tifoidea, y gastroenteritis (toxiinfeccin alimentaria) Los alimentos ms implicados son la carne y productos crnicos, la leche y los huevos. La refrigeracin de los alimentos y una correcta manipulacin y coccin son factores limitantes de la contaminacin. En los alimentos como consecuencia de la naturaleza de la contaminacin, se ven acompaadas de gran cantidad de Enterobacterias muy similares, de aqu la necesidad de su PRE-enriquecimiento. LISTERIA MONOCYTOGENES Bacilo Gram positivo, no ramificado y anaerobio facultativo capaz de proliferar en un amplio rango de temperaturas (1C a 45C) y una elevada concentracin de sal. Es
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catalasa positivo y no presenta cpsula ni espora. Tiene flagelos pertricos, gracias a los cuales presenta movilidad a 30C o menos, pero es inmvil a 37 C, temperatura a la cual sus flagelos se inactivan. es un importante agente causal de septicemias y meningitis principalmente entre los nios, ancianos, y personas inmunosuprimidas. Origina mastitis en las vacas, lo cual lleva implcito la dispersin de gran nmero de esas bacterias en la leche que sin duda, es el principal alimento transmisor de listeriosis. Los alimentos que con mayor frecuencia estn implicados en la transmisin de esta enfermedad son: leche cruda pasteurizada, el queso blando, carnes crudas y el pollo. La capacidad de Listeria monocytogenes de crecer a temperaturas de refrigeracin y su tolerancia a la sal y al nitrito sdico, hacen que esta bacteria pueda contaminar los alimentos refrigerados. Logra sobrevivir en la superficie de las carnes y durante la preparacin y almacenamiento de la leche en polvo. Es importante tener en cuenta el control de los manipuladores, higiene en la leche, brindar tratamiento adecuados a todo tipo de carnicos, y de igual forma a la leche. Materiales y Equipos (investigacin de SALMONELLA) Item Tipo Descripcin
01
MAT
02
EQU
- 2C.
Reactivos tem
Descripcin a estril ( 225 ml )
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Procedimiento Paso
Descripcin PRE-enriquecimiento en medio liquido no selectivo: en esta etapa se logra la revivificacin de las cepas de Salmonella lesionadas, se incrementa su vitalidad y se adquieren las condiciones fisiolgicas adecuadas para su perfecto desarrollo: - Se pesan aspticamente 25 gramos de la muestra. - Transferirlos a un frasco que contenga 225 ml de agua peptona estril. Mezclar e incubar a 37C por 18 a 20 horas. Enriquecimiento en medio liquido selectivo: en esta etapa se estimula y favorece el crecimiento de Salmonella, y se restringe la proliferacin de flora competitiva: - Inocular 1 ml del cultivo anterior sobre 10 ml de caldo selenito, incubado a 37C durante 18-24 horas. - La recuperacin ptima de Salmonella se obtiene entre los 42 a 43C.
Aislamiento diferencial sobre medios slidos selectivos: en esta etapa se restringe aun ms, el crecimiento de la flora competitiva, y se estimula el de Salmonella. - A partir de los cultivos obtenidos en el medio liquido selectivo, sembrar por agotamiento sobre: - Agar Salmonella- Shigella ( S.S ). - Agar XLD - Incubar a 37C durante 24 a 48 horas.
Confirmacin Bioqumica: - Se lleva a cabo con la utilizacin del sistema API 20E. - Aislar una colonia tpica de Salmonella - Incubar en cmara hmeda a 37C por 24 horas. - Revelar y leer de acuerdo a la codificacin. O realizar pruebas individuales de : TSI / LIA / KIA / CITRATO / UREA.
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Confirmacin serolgica: - Mediante la confirmacin serolgica se puede identificar

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Salmonella al nivel de especie. - Enviar muestra al servicio de Salud para esta identificacin - En casos positivos se repite el procedimiento para confirmar el reporte.
Materiales y Equipos (Listeria monocytogenes) ITEM 01 TIPO MAT DESCRIBCION
+/- 2C 02 Reactivos item EQU
descripcion
procedimiento PRE-enriquecimiento en medio liquido no selectivo: en esta etapa se logra la revivificacin de las cepas de Listeria monocytogenes, se incrementa su vitalidad y se adquieren las condiciones fisiolgicasn adecuadas para su perfecto desarrollo: - Se pesan aspticamente 25 gramos de la muestra. - Transferirlos a un frasco que contenga 225 ml de agua peptona estril o directamente al Caldo Fraser. Mezclar e incubar a 37C por 18 a 20 horas.
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Siembra en medios slidos diferenciales: A partir del cultivo anterior, sembrar una asada por aislamiento sobre
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3 Identificacin: realizar las pruebas de coloracin de Gram, oxidasa y catalasa A partir de las cepas que sean : Bacilos Gram positivos, catalasa positivas y oxidasa negativas, sern identificadas utilizando una batera de bioqumicas que incluya: Movilidad Fermentacin de carbohidratos. Siembra en TSI. Siembra en caldo VP RM.
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el agar Palcam, incubando a 37C por 24 horas.
Consulta 1. Consulte sobre la composicin, empleo e interpretacin de los medios que se usan para la determinacin de Salmonella spp, y Listeria monocytogenes. 2. Describa el crecimiento tpico de las colonias de Salmonella spp, y Listeria monocytogenes., segn cada medio de cultivo descrito para su aislamiento. 3. Elabore un cuadro sinptico donde describa las caractersticas bioqumicas de cada microorganismo. 4. Como define microorganismo emergente? Cual es su importancia? Mencione 4 ejemplos de bacterias emergentes.
5. Describa la enfermedad que produce Listeria y Salmonella, teniendo en cuenta: a. Periodo de incubacin b. Alimentos implicados c. Sntomas d. Prevencin de la contaminacin e. Tratamiento adecuado. Bibliografa Descripcin
www.aidelaboratorio.com/drupal-6.../index.php?q
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http://www.microbiologiadealimentos.com/doc/guias%20de%20laboratorio/PRACT _7-_Salmonella_-_Listeria.[1].pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella http://es.wikipedia.org/wiki/Listeria_monocytogenes http://www.cybertesis.edu.pe/sisbib/2004/centurion_pm/html/sdx/centurion_pm.html ANEXOS SALMONELLA SPP. Medios selectivos
AGAR SS: gar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento de Salmonella y de alguna especies de Shigella. Se dise para diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibicin de coliformes sin restringir el crecimiento de otros BGN patgenos. Salmonella y Shigella (y otros no fermentadores de lactosa) producen colonias transparentes, translcidas, mientras los pocos fermentadores de lactosa que se desarrollan dan colonias mucosas, rojizas.
AGAR XLD : agar BD XLD [agar xilosa-lisina-desoxicolato] es un medio moderadamente selectivo y de diferenciacin para el aislamiento y la diferenciacin de patgenos entricos gram negativos (Salmonella y Shigella) de muestras clnicas y no clnicas. Es adecuado en especial para el aislamiento de la especie Shigella. REACCION: Salmonella, positiva a H2S
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De rojo a amarillo con centros de color negro. Shigella, Salmonella, negativas a h2s y colonias rojas.
LISTERIA MONOCYTOGENES
Agar Palcam
GRAM POSITIVA de
Vista microscpica de Listeria monocytogenes en una tincin Gram bacilos cortos.
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Laboratorio No
09
Tema:
ANLISIS MICROBIOLGICO SUPERFICIES Y MANIPULADORES Objetivos
DE
AMBIENTES,
Documentar el procedimiento para llevar a cabo una correcta toma de muestra de Ambientes, superficies y manipuladores. Evaluar mediante la toma de muestras, y su posterior anlisis algunas de las condiciones higinico sanitarias de un lugar determinado de preparacin y manipulacin de alimentos. Familiarizar al estudiante en el tratamiento adecuado de toma de muestras, y las exigencias a nivel nacional e internacional sobre control de ambientes, superficies y manipuladores. Poner en evidencia la presencia de los microorganismos existentes en el ambiente, superficie y manipuladores. Optimizar la tcnica de escobillado con el fin de mejorar la eficacia de recuperacin de microorganismos adheridos a las superficies. Fundamento AMBIENTE El aire adems de partculas en suspensin, es portador de bacterias en forma vegetativa o esporuladas, esporos de hongos y virus. Por ello puede ser causa tanto de contaminacin de alimentos como de infecciones en el hombre. Para la preparacin de alimentos en general, se debe conocer y controlar la calidad microbiolgica del aire, ya que este podra ser fuente de contaminacin para el material con el que se labora. La evaluacin de la calidad microbiolgica del ambiente nos indica la cantidad de microorganismos que estn presentes en un rea determinada. Mientras mas limpia es un rea, menor ser el nmero de microorganismos presentes en el aire de la misma. Los microorganismos generalmente no estn flotando en al aire sino que se encuentran sobre partculas inertes, por ejemplo polvo, gotas de agua, etc., que le sirven como medio de transporte, y pueden encontrarse aislados o agregados. Existen diferentes mtodos que permiten evaluar la calidad microbiolgica del aire, uno de los ms utilizados es el mtodo de sedimentacin en placas de agar, que consiste en exponer placas con un medio de cultivo slido al ambiente durante un periodo determinado, incubar las placas y hacer el recuento de las colonias
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obtenidas. Con este mtodo se detectan los, microorganismos que caen sobre la superficie de la placa, lo cual simula lo que ocurre normalmente cuando se esta trabajando en esa rea. Esta prctica se realiza para asegurar la higiene del ambiente en contacto con los alimentos procesados. As mismo, podemos disear un plan para el seguimiento de la evolucin de la misma y la implantacin de posibles medidas correctoras. SUPERFICIE El control Microbiolgico de superficie nos proporciona informacin sobre la cantidad de microorganismos presentes sobre una superficie, la cual puede ser un equipo, mesn, ropa, manos del personal, etc. Se empleara el mtodo del Hisopo, para ello se define el rea donde se va a tomar la muestra, usando una plantilla de 5 x 4 cm 2, es decir un rea total de 20 cm2. Los controles microbiolgicos se realizan para asegurar la higiene de los elementos y superficies en contacto con los alimentos procesados. As mismo, podemos disear un plan para el seguimiento de la evolucin de dicha higiene y la implantacin de posibles medidas correctoras. MANUPULADORES Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador quien lo contamine durante el procesado. La persona que va a manipular un alimento tiene una abundante carga microbiana en la piel, pero nunca debern aislarse de ellas bacterias patgenas. Por lo tanto resulta evidente la necesidad de que el manipulador mantenga una perfecta condicin de higiene durante el procesado de los alimentos. Los microorganismos pueden pasar a los alimentos de diversas formas: Directamente: Existen microorganismos productores de enfermedades transmisibles por alimentos que se encuentran en la nasofaringe, piel y folculos pilosos. Por tanto, a travs de las gotitas de saliva que se emiten al hablar, toser, etc., y a travs del contacto de heridas e infecciones cutneas con los alimentos, pueden quedar stos contaminados. En este caso, se deber utilizar un vendaje impermeable o, lo que es mejor, si es posible abstenerse de manipular alimentos hasta que se haya producido la curacin. A travs de las manos: Las uas transportan microorganismos, son especialmente peligrosas despus del uso de los servicios higinicos debido a la gran cantidad de grmenes presentes en las heces. En algunas ocasiones, los manipuladores contaminan los alimentos con grmenes que
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se encuentran en su organismo. Cuando esto es consecuencia de una enfermedad en su fase aguda, el problema se reduce, pues el trabajador deja el trabajo por baja laboral; el problema es mucho mayor cuando la persona que elimina los grmenes no presenta ningn sntoma o es un portador, por lo que los anlisis microbiolgicos no siempre son eficaces para detectar los grmenes; lo ms adecuado es una correcta educacin y formacin sanitaria que evite estos riesgos.
materiales y equipos ( ambientes ) tem Tipo Descripcin 01 MAT Cava Cajas de petri que contienen los medios de cultivo. Cinta marcadores de punta fina lapicero reloj.
Reactivos tem Descripcin 01 agar plate count agar sabouraud
Procedimiento paso Descripcin 1. Identifique el ambiente a muestrear, anotando las actividades que all se llevan a cabo, y si ya se realizo previamente la higienizacin.
Ubquese en varios sitios del rea en donde usted va a ubicar las cajas de petri.
3.
Destape cuidadosamente la caja evitando tocar el interior, y expngala al medio durante 15 minutos.
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4.
002
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Transcurrido el tiempo, tape la caja inmediatamente, mrquela y llvela a la cava.
Para el caso de Mohos y Levaduras junte las cajas con ayuda de cinta de enmascarar para facilitar la incubacin, y asegure las otras cajas de manera que evite que se abran o se contaminen, se debe evitar la incorrecta manipulacin para no obtener resultados falsos.
6.
Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de anotar el nombre de los responsables de la higienizacin del lugar, as como quien acompaa en la toma de muestra.
7.
Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible
8.
Una vez en el laboratorio incube las muestras de acuerdo al grupo de microorganismos que busca y el medio empleado para ello.
Materiales y Equipos ( De Superficie ) tem tipo Hisopos o escobillones estriles estril. Plantillas estriles. Cava Cajas de petri estril reactivos tem descripcion Agar saboraud Agar Plate count
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Agar chromocult Procedimiento paso Descripcin 1. Identifique la superficie a muestrear: mesa de trabajo, tabla, olla, un plato, cuchillo, etc. Encienda el mechero en una zona que proporcione comodidad y seguridad Destape con cuidado la plantilla y ubquela en el sitio de toma Saque un hisopo estril y humedzcalo en el agua peptona Frote la superficie en dos sentidos dentro del rea delimitada ( plantilla ) corresponde a 20 cm2 Este procedimiento debe hacerse en 5 partes diferentes que representen
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6.
7.
Introduzca el escobilln en el tubo, quebrando la parte superior de madera que se descarta. Identifique el tubo y llvelo a la cava. Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de anotar el nombre del manipulador que realizo la higienizacin del lugar, o equipo o del utensilio. Si es posible anote las condiciones higinicas sanitarias que usted observa en el momento de la toma para facilitar la interpretacin de los resultados. Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible a una temperatura no mayor de 4C.
8. 9.
10.
11.
SIEMBRA
1.
A partir del tubo con el hisopo, transfiera 1 ml a cajas estriles

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2.
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Adicione agar Plate count para analizar aerobios mesofilos, agar chromocult y saboraud para analizar coliformes, mohos y levaduras respectivamente. Incube a las temperaturas y tiempos adecuados
3.
Materiales y Equipos ( Manipuladores ) tem tipo Descripcin 1 tubo con agua peptona estril Escobillones estriles 01 MAT Gradilla o frascos reactivos tem descripcin agar chromocult agar Baird Parker asa de jockey
Procedimiento Pasos Descripcin Identifique a la persona a quien va a tomar la muestra, anotando las 1. actividades que llevo a cabo antes de la toma y pregunte si ya se realizo previamente la higienizacin de sus manos 2. 3. Destape el tubo con agua peptona estril y humedezca el escobilln estril Solicite a la persona a quien va a tomar la muestra que abra las manos y facilite la toma dando la vuelta a sus manos una vez se tome la muestra de las palmas Frote cuidadosamente cada dedo, cada ua y en las zonas interdigitales Una vez realizado esto, introduzca el escobilln en el tubo con agua
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4. 5.
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6.
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peptona y quibrelo, tape, marque la muestra y guarde en la cava Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de anotar el nombre del manipulador y la actividad que realizaba previamente a la toma de muestra Observe si el manipulador tiene lesiones en sus manos o en sus uas, regstrelo e indague en caso de tener lesiones graves si esta en tratamiento o no para ello. Se debe indicar al manipulador que lave sus manos luego de efectuada la toma de muestra, ya que podran quedar restos del medio de cultivo en los dedos y as favorecer el crecimiento de los microorganismos. Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible, a una temperatura de 4C. Una vez en el laboratorio refrigere las muestras en caso de no realizar la siembra inmediatamente
7.
8.
9.
10.
SIEMBRA
1. 2. 3.
A partir del tubo con el hisopo, transfiera 1 ml a cajas estriles Adicione agar chromocult para analizar coliformes Adicione 0.1 ml sobre agar Baird parker, y distribuya el inoculo con ayuda del asa de jockey. Incube a las temperaturas y tiempos adecuados.
4.
Consulta 1. Que mtodos de toma de muestras actuales y rpidos de ambientes, manipuladores y superficies existen? Que ventajas presentan frente a los mtodos tradicionales empleados en la practica? 2. Como se informa correctamente cada uno de los anlisis realizados para ambientes, superficies y manipuladores? Justifique cada una de sus
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respuestas. 3. Que es y cual es la funcin de un medio de cultivo de transporte? Mencione ejemplos. 4. Que consecuencias tendr para un rea de preparacin de alimentos, el no realizar control riguroso de los ambientes, superficies y manipuladores, explique cada uno por separado. 5. Investigar acerca de cuales microorganismos podemos encontrar en el ambiente, superficie y manipuladores? 6. Cuales patologas pueden estar asociados con dichos microorganismos de cada uno de ellos? 7. Elabore un folleto creativo, en donde ilustre la importancia de realizar cada uno de estos anlisis, motivando a los sitios de preparacin de alimentos a que implementen este tipo de controles. Bibliografa Descripcin Daz, R., Gamazo C., Lpez-Goi, I. 1999. Manual Prctico de Microbiologa. Cap. 32: Cultivos de microorganismos del ambiente. 2 Ed. Editorial Masson S.A. Barcelona, Espaa. 151 pp. www.aidelaboratorio.com/drupal-6.../index.php?q.. www.microbiologiadealimentos.com/doc/.../PRACT_8_A..%5B1%5D.pdf essa.uncoma.edu.ar/academica/materias/microbiologia.../Cap1.pdf
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10 ANLISIS MICROBIOLGICO DE LECHE Y DERIVADOS LCTEOS
Conocer los anlisis microbiolgicos que se realizan a los derivados lcticos fermentados o no fermentados. Reconocer los microorganismos patgenos importantes que pueden llegar a contaminar esta clase de alimentos. Analizar y discutir los resultados obtenidos, y establecer comparaciones con la normatividad vigente que aplica para estos productos.
Fundamento Los derivados lcteos son productos elaborados a partir de la leche. Comprenden dos grandes grupos: a. Lcteos fermentados. b. Lcteos no fermentados. Dentro de los derivados lcteos ms comunes se pueden encontrar:
Leches Acidificadas como el yogurt y el kumis . Leches Reconstituidas . Productos Grasos como la mantequilla y la crema de leche . Leches Modificadas como la leche descremada, semidescremada y deslactosada. Leches Pulverizadas . Dulces de leche com o el arequipe y la leche condensada. Quesos frescos y maduros La produccin de derivados lcteos en el mundo nace de la necesidad que tuvo (Y tiene) el hombre para conservar la leche y segn algunos autores, esto se dio inicialmente con pueblos primitivos que transportaban la leche en estmagos de algunos animales, dentro de los cuales podemos encontrar cabras y ovejas, y que despus de largos viajes empezaba a coagularse de tal forma que se obtuvieron los primeros quesos . Luego se encontr que al acidificar la leche de manera controlada, se poda garantizar un mayor tiempo de duracin del producto si se comparaba con la leche recin ordeada, que es demasiado
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susceptible a la accin del medio ambiente. Otros empezaron a adicionar azcar, lo cual disminua la actividad acuosa y volva al producto final ms resistente a la descomposicin. Leche pasteurizada: La leche pasteurizada se obtiene despus del proceso de pasteurizacin, que consiste en el calentamiento de la leche cruda a altas temperaturas seguido de un rpido enfriamiento9. La leche pasteurizada es envasada en diferentes empaques para el consumo final. Leche en polvo: La fabricacin de leche en polvo requiere un proceso de pulverizacin. Primero se recibe la leche y se estandariza y homogeniza su nivel de grasa. Posteriormente es pasteurizada y mediante desecacin por cilindros o por pulverizacin se obtiene la leche en polvo; finalmente se empaca en recipientes de hojalata, bolsas de aluminio o de papel. Leches cidas: Para la obtencin de leches cidas (yogur) se agregan aditivos estabilizantes o vitaminas a la leche homogeneizada; despus el compuesto es sometido a tratamientos trmicos a diferentes temperaturas y luego se inocula e incuba con streptococcus, termofilus y el Lactobacilus bulgaricus. Terminados estos procesos, la mezcla se enfra, obtenindose el yogur base. A ste se agregan frutas, jarabes, saborizantes y colorantes, para producir yogures especiales. CONTROL MICROBIOLGICO DE LA LECHE: La leche como producto natural analizada contiene microorganismos deben ser estudiados por su utilidad y otros por la capacidad de alterar la composicin y caractersticas organolpticas de la leche y derivados lcteos o por ser agentes causales de enfermedad en los consumidores, es as que en ella pueden encontrarse microorganismos de los diferentes grupos: bacterias, hongos (mohos y levaduras) y virus, los cuales sern descritos brevemente a continuacin, de acuerdo a su importancia en la industria lctea. BACTERIAS Las bacterias. En la leche se pueden encontrar diverso gneros y especies bacterianas. Aquellas de mayor importancia en la industria lctea son las llamadas bacterias lcticas y las bacterias coliformes.
A) BACTERIAS GRAM. POSITIVAS: Bacterias lcticas:

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Son un grupo de bacterias de diferentes gneros, ampliamente distribuidas en la naturaleza. Se encuentran en el suelo y en cualquier lugar donde existan altas concentraciones de carbohidratos, protenas desdobladas, vitaminas y poco oxigeno. Son Gram positivas y su forma puede ser bacilar, cocoide u ovoide. Soportan pH 4 en leche. Son anaerbicas facultativas, mesfilas y termfilas y de crecimiento exigente. Pueden serhomo ferm entativas (ms del 90% de su metabolismo resulta en cido lctico) oheteroferm entativas (producen adems del cido lctico, otros cidos y gases). Aportan sabor y aroma, ya que como parte de su metabolismo fermentativo se da la produccin de acetaldehdo, diacetilo, acetoina, acetona, lactonas, cidos voltiles, alcohol y gas. Aportan beneficios para la salud de los consumidores, el cual se ha descrito como efecto probitico. Micrococcos: Dbilmente fermentadores, forman parte de la flora inocua que contamina la leche cruda. Tienen poca actividad enzimtica, por lo tanto son de muy poca importancia como agentes de adulteracin en la leche. Sin embargo por ser la flora ms abundante en leche cruda y tener cierta capacidad proteoltica pueden llegar a ser causante de alteraciones en leches pasteurizadas mal almacenadas. Estafilococos: Son anaerobios facultativos, fuertemente fermentadores. Son de gran importancia desde el punto de vista sanitario. Causan mastitis y pueden provocar enfermedades o intoxicaciones en los humanos. Staphylococcus aureus produce una exotoxina que causa fuertes trastornos intestinales en los humanos, la cual es termorresistente, por lo cual no es destruida con la pasteurizacin. El Staphylococcus epidermidis se ve implicado en algunos casos de mastitis, por lo cual puede llegar a contaminar la leche. Bacterias esporuladas: Los Bacillus son bacterias aerbicas con actividad enzimtica variada producen acidificacin, coagulacin y proteolisis. Los Clostridium son anaerobios estrictos, producen gas. Algunos producen toxinas patgenas (Clostridium botulinum). Ambos gneros son de poca importancia en leche cruda, su crecimiento es inhibido por las bacterias lcticas. Cobran importancia en productos lcteos como en leche pasteurizada, quesos fundidos, leches concentradas, quesos de pasta cocida. Resisten la pasteurizacin por su capacidad de producir esporas, las cuales solo se destruyen a temperaturas por encima de 100 C.
B) BACTERIAS GRAM. NEGATIVAS: Enterobacterias: Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son huspedes normales del intestino de los mamferos, por lo tanto su presencia en el agua y la leche se relaciona con contaminacin de origen fecal. Las enterobacterias son menos abundantes en la leche que otras bacterias gran negativas, sin embargo, tienen una gran importancia desde dos puntos de vista, higinico: ya que varias de estas
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especies tienen poder patgeno, de las cuales la ms temible es la Salmonella y otras que pueden provocar trastornos gastrointestinales (Yersinia, E. Coli, Shigella); y tecnolgico: ya que son bacterias heterofermentativas, grandes productoras de gas (carbnico e hidrogeno) adems producen sustancias viscosas y de sabor desagradable, todo lo cual conduce a la alteracin de la leche o subproductos. De las enterobacterias las ms comunes encontradas en los productos lcteos son las del grupo Coliformes (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter). La determinacin de su presencia indica calidad higinica de la leche cruda y pasteurizada. Pseudomonas: Ms del 50% de la flora Gram negativa de la leche cruda est representada por este gnero. Juegan un papel importante en la conservacin de productos lcteos, ya que adems de ser psicrfilas, varias especies tienen un gran poder proteoltico y lipoltico. Adems se ha descrito que algunas de estas enzimas resisten temperaturas por encima de los 80 C, por lo cual pueden causar alteraciones an en productos elaborados con leches pasteurizadas. Acromobacteriaceae: Este grupo de bacterias no fermentan la lactosa, no son proteolticas ni patgenas, pero representan las bacterias psicrfilas que crecen en las leches conservadas a baja temperaturas, algunas pueden producir sustancias viscosas y pigmentos. Se han descritos los gnerosFlavobacterium, Alcaligenes y Achromobacter. C) MOHOS Y LEVADURAS: No tienen importancia en leche fluida, sino ms bien en los productos. Algunas especies son utilizadas como cultivos lcteos para el afinado de los quesos madurados como el Penicillium candidum y Penicillium camemmberti en los quesos de corteza blanca como el Camembert y el Penicillium roqueforti en los quesos de pasta azul. Las levaduras al igual que los mohos son de poca importancia en la leche lquida y son fcilmente destruidos a temperaturas de pasteurizacin. En la leche se encuentran la especies Cndida cremoris, Saccharomyces lactis, Sacharomices kefir. Torula kefir se encuentra en los granos de kefir utilizados para producir esta bebida lctea, caracterizada por su sabor cido-alcohlico, producto de la fermentacin de la lactosa por estas especies. Materiales y Equipos ITEM TIPO DESCRIPCIN 01 MAT Cajas de petri grande 02 MAT Pipetas de 1 ml 03 MAT Tubos de ensayo 9 ml 04 MAT Pipeteadores 05 MAT Pipeta 10 ml 06 MAT Asa de Hockey 07 EQUI Estufa o mechero
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08 Reactivos TEM 01
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EQUI Incubadora
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DESCRIPCIN Medios de cultivo deshidratados: Agua peptona, Agar Baird Parker, Agar Sabouraud, Agar Chromoculth, etc. Procedimiento PASO DESCRIPCIN 1 Leer cuidadosamente las instrucciones para realizar el anlisis microbiolgico de productos lcteos. 2 Medir 11ml o gr del producto lcteo y mezclar en 99ml de agua peptona. 3 Realizar diluciones hasta 10-3 con 1ml de 100. 4 Tomar 1ml de cada dilucin y sembrar en el medio correspondiente por mtodo de placa profunda o de superficie segn corresponda. Incubar a 37C para Coliformes totales y fecales, Staphylococcus aureus y 25 C por 5 24h para Mohos y Levaduras. 6 Observar los resultados y realizar el informe final. Consulta 1. Nombre dos mtodos de conservacin para los productos lcteos. 2. Mencione algunas medidas preventivas para evitar la contaminacin de los productos lcteos. 3. Realice un diagrama de flujo acerca del procedimiento de obtencin de 5 derivados lcteos. 4. Elabora una cartilla que contenga en forma de glosario, todos los trminos que se tienen en cuenta para el procesamiento de la leche, y obtener derivados de ella. Guiarse por el decreto 616. Bibliografa http://www.scribd.com/doc/6906371/Microbiologia-de-Alimentos-Control-Microbiologico-de-La-Leche http://www.consumer.es/seguridad-alimentaria/sociedad-y-consumo/2003/01/29/4920.php http://www.engormix.com/MA-ganaderia-leche/industria-lechera/articulos/elaboracion-derivadoslacteos-como-t2604/472-p0.htm
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Laboratorio No Tema: OBJETIVOS
11 ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAS Y DE BEBIDAS REFRESCANTES ( Parte 1 )
Conocer el procedimiento de anlisis de aguas por la tcnica de Filtracin por membrana. Reconocer la importancia del estudio microbiolgico en el anlisis de aguas. Adquirir destreza en los tcnicas y procedimientos de un anlisis microbiolgico en aguas. Desarrollar el mtodo de numero ms probable y establecer comparaciones con el mtodo de filtracin por membrana.
FUNDAMENTO FILTRACIN POR MEMBRANA La filtracin es el proceso que consiste en separar un slido suspendido del liquido en el que esta suspendido al hacerlos pasar a travs de un medio poroso por el cual el liquido puede penetrar fcilmente. El lquido a filtrar se denomina suspensin, el lquido que se filtra, el filtrado, y el material slido que se deposita en el filtro se conoce como residuo. Esta tcnica de filtracin por membrana es eficaz para analizar la presencia de contaminacin microbiana o por partculas en las soluciones acuosas. Se empleara para su crecimiento el medio de cultivo especfico Agar Plate Count, Agar Chromoculth y agar Cetrimide, en donde se manifestar su presencia o ausencia en el anlisis Microbiolgico de agua apta para el consumo humano. NUMERO MAS PROBABLE La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales Biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase Confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinacin del nmero ms probable de microorganismos Coliformes fecales se
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realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h MATERIALES Y EQUIPOS Item Tipo FILTRACION DE MEMBRANA 01 MAT Pipetas estriles de 10 ml. Cajas de petri estriles con agar plate count, Membranas de 0.45m. Pinzas metlicas. 02 EQU Equipo completo de filtracin por membrana. Incubadora de 37C +/- 2C. DETERMINACION NUMERO MAS PROBABLE (NMP) Tubos. Pipetas. Pipeteador Campana durham Incubadora Lmpara de fluorescencia
01
MAT
02
EQU
REACTIVOS tem MEDIOS DE CULTIVO 01 Agar plate count, agar chromoculth y agar cetrimide., servido y solidificado en cajas de petri estriles. Medios de cultivo Caldo lauryl sulfato, agua peptona PROCEDIMIENTO FILTRACIN POR MEMBRANA Paso 1 Realizar limpieza y desinfeccin del rea de procedimiento Mezclar muy bien la muestra para asegurar de esta forma la homogeneizacin antes de preparar las diluciones correspondientes. En el archivo de toma de muestras debe aparecer el nombre de la muestra, con una descripcin detallada de la misma, teniendo en cuenta procedencia de la muestra, pH, cloro residual, etc. Registrar la muestra en el cuaderno con el nmero consecutivo correspondiente.
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Marcar el material a emplear con el cdigo de la muestra: frascos de dilucin y cajas de petri con el medio de cultivo. Agitar vigorosamente la muestra de agua para homogeneizar la flora que pueda contener. Preparar la dilucin 10-1, midiendo 10 ml de la muestra, y transferirlos a un frasco que contenga 90 ml de agua destilada estril. Segn el agua se realizan ms diluciones o solo se llega hasta 10-1, ya que son aguas tratadas Clculo e interpretacin de los resultados. Se observa el crecimiento y se hace el conteo total de la caja sembrada. Las colonias tpicas de coliformes totales tienen color rojo. Las colonias de coliformes fecales son de color violeta azulado. Las colonias de Pseudomona son de color verde, se deben confirmar con la prueba de oxidasa. El clculo de resultados se expresa mediante la siguiente frmula: Ufc / 100 ml = numero de colonias ---------------------------------- X 100 Volumen de muestra filtrada. Si se filtro la muestra a partir de una dilucin, tener en cuenta este factor al final del clculo de los resultados. Expresin de resultados los resultados se expresan como UFC( unidades formadoras de colonias ) por cada 100 mililitros de muestra
DETERMINACIN DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) Limpiar y desinfectar el rea donde se va a trabajar. Tomar 10 ml de la muestra (agua) se agrega a un recipiente con agua peptona estril de 90 ml mezclar. Realizar las diluciones hasta 10-3 En 9 tubos se le agrega 10 ml de caldo lauryl sulfato, los tres primeros tubos tienen concentraciones doble y los 6 tubos restantes concentraciones sencillas los tubos llevan campana de durham. Despus de realizar las diliciones, se toma de cada dilucin: 10-1 los tres primero tubos de concentracin doble 1 ml a cada tubo , dilucin 10-2 tres tubos de concentracin sencilla 1 ml a cada tubo, de igual manera la dilucin 10-3.
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Se lleva a incubar a 37 C/ 24 horas. RESULTADOS Si se observa crecimiento bacteriano con produccin de gas las 24h o antes, la presencia de bacterias coliformes fecales se considerar confirmada, prosiguiendo con el mtodo del filtro de membrana para conteo. Si se requiere el anlisis completo de coliformes totales, se llevan a la fase de confirmacin todos los tubos primarios en los que haya aparecido cualquier cantidad de gas o crecimiento cido a las 24h de incubacin. N.M.P. se calcula mediante tablas de estadstica que establecen la cantidad de bacteria. En base a los resultados de estos anlisis se establece el siguiente criterio para la aceptacin del agua potable para consumo.
Consulta 1. Cul es el decreto y resolucin actuales por las cuales se debe regir para el control de calidad de agua potable? 2. Cules son las caractersticas fsicas y qumicas que debe reunir un agua para consumo humano? 3. Que parmetros permiten diferenciar un agua cruda, un agua de pozo, con una muestra de agua potable? 4.Que otro tipo de anlisis se deben realizar para un estudio de anlisis de aguas?
Bibliografa http://www.microbiologiadealimentos.com/ http://www.latinpedia.net/ciencia/agua-potable/Analisis-microbiologico http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
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11 ANLISIS MICROBIOLGICO REFRESCANTES ( Parte 2)
DE
AGUAS
BEBIDAS
Conocer y diferenciar las caractersticas de las bebidas refrescantes. Desarrollar habilidades en el manejo de la tcnica de las placas Petrifilm, en el anlisis microbiolgico de aguas y bebidas refrescantes. Reconocer la flora predominante en la alteracin de este tipo de productos.
Fundamento Son bebidas no alcohlicas preparadas con agua potable o mineral y que lleva la adicin de uno o varias de las siguientes sustancias:

zumos de fruta extracto de frutas frutas, semillas, tubrculos disgregados agentes aromticos esencias naturales edulcorantes anhdrido carbnico
Se consumen en estado lquido para saciar la sed. Es uno de los campos que ms est progresando. Se distingue: agua gaseada, gaseosa, bebida de zumos de fruta, bebida de extractos, bebida de frutas, semillas o tubrculos, bebidas aromatizadas. AGUA DE SODA: Bebida blanda, sin alcohol. En sentido estricto es una bebida bicarbonatada. En un principio se llam agua de self, a las aguas carbonatadas que pretendan ser imitacin de agua mineral. El producto debe responder: PRINCIPALES COMPONENTES Edulcorantes Sacarosa: Se emplea un jarabe de concentracin adecuada que se expresa en grados Brik; tambin se emplean glucosa, fructosa, lactosa, maltosa siempre en forma soluble. Los edulcorantes naturales tienen la ventaja de que dan uniformidad al sabor as como sabor dulce que contraresta la acidez y cuerpo de la bebida. Las bebidas de cola contienen entre un 9 y un 10 % de jarabe, las bebidas de limn entre un 9,5 y un 10,5 % y los de naranja 13-13,5%. El edulcorante artificial resulta ms barato ya que
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su poder edulcorante es mayor, adems no aporta energa. cidos: Pueden ser ctrico, tartrico, fosfrico, lctico; otros menos empleados mlico, actico, adpico, fumrico. En cuanto a las concentraciones: 0,9% de tartrico, 0,6 de mlico, 0,3 de lctico, 0,7 de fosfrico. Para obtener una bebida de calidad no es necesario alcanzar estas concentraciones. El cido ctrico es muy soluble en agua, se mantiene muy bien en solucin. El tartrico se encuentra en la naturaleza como sal cida de potasio, muy soluble en agua, se utiliza mezclado con el cido ctrico. El lctico se emplea cuando se pretende conseguir sabores suaves y prolongados. Se exige que sea muy puro y casi siempre mezclado con ctrico.El fosfrico es el ms fuerte utilizado en industria en forma diluida, su mxima aplicacin es en bebidas tipo cola, no es vlido para gaseosas, limonadas, naranjadas. Esencias: Exentos de terpenos, proceden de extractos de frutas; limn y nuez moscada en bebidas tipo cola; esencias de limn verde, dulce, rosa en las limonadas; esencias de naranja dulce, amarga, mandarina, sabor sinttico de Jerez en naranjadas. Colorantes: Tanto naturales como artificiales. La tartracina en limonadas y naranjadas; el amarillo ocaso y el Ponceau en las naranjadas. En ocasiones se precisa un agente espumante: saponina que se sustituye por la esencia del regaliz. Tambin conservantes autorizados Materiales y Equipos Item Tipo Descripcin 01 MAT Hisopos estriles 02 Pipetas estriles de 1, 5 y 10 ml. 03 Cajas de petri esteriles 04 Pipeteadores 01 EQU Incubadoras a 37C. 02 Lmpara u.v 360 nm. Reactivos tem Descripcin 01 Peptonas de 90 ml, 9 ml. 01 Placas petrifilm de aerobios mesofilos, Coliformes, mohos y levaduras Procedimiento Paso Descripcin 1 PREPARACIN DE LA MUESTRA Agitar las botellas tapadas, invirtindolas varias veces. Flamear la tapa de la botella antes de abrirla, y flamear el destapador Deje reposar 10 minutos. Destape la botella, flamee la boca de la botella y vace el contenido en un
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erlenmeyer esteril. Agitar por rotacin en el recipiente por un tiempo de 30 segundos, con el objetivo de desprender todo el CO2 ( En caso de bebidas carbonatadas.) 2 EXAMEN DE BOTELLAS Y ENVASES Colocar 90 ml de agua peptona en cada botella Agitar
Sembrar 1 ml de la solucin en cada una de las placas de petrifilm. Se realiza anlisis de aerobios mesofilos, Coliformes totales y fecales, mohos y levaduras. EXAMEN DE TAPAS Utilice un hisopo estril, sumergido en 9 ml de diluyente, frote la parte interna de la tapa, y enjuague el hisopo y djelo en el tubo con el diluyente. Sembrar 1 ml de la solucin en cada una de las placas de petrifilm. Se realiza anlisis de aerobios mesofilos, Coliformes totales y fecales, mohos y levaduras. EXAMEN DEL PRODUCTO Se realizan diluciones hasta 10-3. Sembrar 1 ml de la solucin en cada una de las placas de petrifilm. Se realiza anlisis de aerobios mesofilos, Coliformes totales y fecales, mohos y levaduras.
Consulta 1. Defina cada uno de los productos que se consideran como bebidas refrescantes. 2. Elabore el diagrama de flujo del proceso de obtencin de una gaseosa, e identifique en el los posibles puntos de contaminacin, y las medidas preventivas para evitar cualquier salida de control. 3. Que normatividad existe en Colombia, que apliquen para este tipo de productos?
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Laboratorio No 12 Tema: ANLISIS MICROBIOLGICO DE PLATOS PREPARADOS Objetivo Determinar los tipos de anlisis microbiolgicos que se realizan para el examen de platos preparados. Identificar la flora tpica contaminante de este tipo de productos. Conocer algunas definiciones y clasificacin de estos alimentos. Realizar el protocolo de aislamiento de Listeria monocytogenes a partir de alimentos. Reconocer las caractersticas fisiolgicas y bioqumicas de esta bacteria relevantes para su identificacin en el laboratorio. Enunciar la importancia de L. monocytogenes en el campo de la microbiologa de alimentos. Fundamento Los platos preparados son alimentos que se elaboran partiendo de muy diversos productos que poseen, individualmente, una flora especifica. Por otra parte, estn sometidos a numerosas manipulaciones para su preparacin y conservacin (coccin, refrigeracin) que influyen notablemente sobre la naturaleza de dicha flora. La coccin puede ser un factor de seleccin de la flora esporulada que, cuando se produce un enfriamiento lento, origina una proliferacin considerable. A la inversa, el paso del almacenamiento en frio, a la exposicin a la temperatura ambiente, puede dar lugar a una multiplicacin excesiva de los contaminantes microbianos. Se trata de preparaciones culinarias, cocinadas o precocinadas, elaboradas a partir de muy diversos productos: Carnes de abasto, carne de aves, caza, pescados, moluscos, crustceos, huevos, etc. Acompaados de salsas, productos lcteos, verduras, legumbres, rellenos y otros. Los platos preparados son cada da ms numerosos y variados. Para que estos productos alcancen una buena calidad microbiolgica, es necesario: - Que las materias primas no estn contaminadas o lo estn minimamente. - Que durante su elaboracin se eviten nuevos aportes microbianos y la proliferacin de la flora presente. - Que se conserven adecuadamente despus de su elaboracin. Dada la gran diversidad de materias primas utilizadas en la elaboracin de platos preparados, es posible el aporte de flora indeseable muy variada, razn por la que se impone el control de cada una de ellas, as como de otros agente que, como las especias, son frecuentes vectores de contaminacin. Es evidente que no se deben mezclar materias primas de calidades microbianas distintas y no correctas.
Elaborado por:
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Aprobado por:
Fecha
Julio 31 de 2011
Fecha
Julio 31 de 2011
Fecha
Agosto de 2011
GUIA DE LABORATORIO

UC-BAC-ALI-GL001
Fecha:
Julio de 2.011
Durante la elaboracin del producto hay que evitar la proliferacin de los microorganismos presentes, procurando que no existan oportunidades que faciliten el crecimiento de los mismos. Es importante, despus de la coccin, someter el alimento a un enfriamiento rpido previo a su conservacin en frigorfico. Dicho enfriamiento no debe superar las dos horas: - En refrigeracin, a temperatura inferior a 3C. - En congelacin, a temperatura de -18C o inferior. En la fase de preparacin del plato, adems de evitar la proliferacin de la flora procedente de la materia prima, es necesario no aportar nuevos grmenes mediante manipulaciones poco higinicas o por utilizacin de material contaminado en un ambiente sucio. En el aspecto sanitario, los platos preparados pueden constituir un riesgo para el consumidor si estn mal elaborados o conservados, ya que casi todas las bacterias productoras de toxiinfecciones alimentarias se pueden encontrar en ellos, conocindose numerosos casos de enfermedades gastrointestinales de origen alimentario causadas por platos preparados, donde se han aislado Salmonella spp, S. aureus enterotoxignico, Clostridium perfringens,Bacillus cereus y otros. Los platos preparados, adems de ser inofensivos para la salud, deben mostrar un buen aspecto que los haga apetecibles y no rechazables. Para conseguirlo, los que no sean de consumo inmediato se conservaran en refrigeracin a temperatura inferior a 3C o en congelacin o ultra congelacin, a temperaturas de -10 -18C, respectivamente. La alteracin de estos productos se manifiesta por cambios en sus caracteres organolpticos (aspecto, gusto, olor) debido principalmente a la accin de bacterias psicotrficas (Pseudomonas, Achromobacter, etc.) levaduras y mohos. Los platos preparados destinados a ser conservados en caliente antes de su consumo, se mantendrn, inmediatamente despus de su preparacin, a una temperatura mnima de 65C en su parte profunda hasta el momento de su consumo, que tendr lugar en el transcurso del miso da. Estos alimentos, por sus caractersticas especiales, exigen un control microbiolgico muy estricto y constante de la materia prima, distintas fases de elaboracin y como producto terminado. DEFINICIONES:
Platos preparados: son los productos obtenidos por mezcla y condimentacin de alimentos de origen animal y/o vegetal, con o sin adicin de otras sustancias autorizadas, contenidos en envases apropiados, hermticamente cerrados o no, segn el procedimiento de conservacin utilizado, y dispuestos para ser consumidos, ya directamente o previo simple calentamiento o tras un tratamiento.
Aprobado por:
Fecha
Julio 31 de 2011
Fecha
Julio 31 de 2011
Fecha
Agosto de 2011
GUIA DE LABORATORIO

-
002
UC-BAC-ALI-GL001
Fecha:
Julio de 2.011
Plato precocinado: es el resultado de una preparacin culinaria completa, envasado y sometido a un procedimiento de conservacin de los citados adelante. Este plato necesita, por tanto, tratamiento domestico adicional. Plato cocinado: es el resultado de una preparacin culinaria completa, envasado y sometido a un proceso de conservacin de los citados aqu. Este plato se encuentra dispuesto para el consumo con calentamiento previo o sin l. Pueden expenderse platos cocinados en recipiente tapados y mantenidos, inmediatamente despus de la preparacin, a temperaturas iguales o superiores a 65C, medidos en la zona central del producto. Estos platos deben consumirse el mismo da de su preparacin y reciben el nombre de platos cocinados de consumo inmediato.
Refrigeracin: consiste en someter a los alimentos a la accin de bajas temperaturas, sin alcanzar las de congelacin. La temperatura de refrigeracin deber mantenerse uniformemente y sin cambios bruscos durante el periodo de conservacin y ser apropiada para cada tipo de producto. Congelacin: consiste en someter a los alimentos a un procedimiento industrial de frio que haga bajar la temperatura, en el centro geomtrico, como mximo a 10C bajo cero. No se fijan los tiempos o velocidades para alcanzar la congelacin, ya que son especficos de cada plato preparado.
Ultracongelacin: consiste en someter a los alimentos a un proceso realizado en instalaciones convenientes y especificas de modo que, partiendo de unas temperaturas muy bajas, se rebase rpidamente la zona de temperatura de mxima cristalizacin.
Materiales y Equipos Item Tipo Descripcin 01 MAT Pipetas de 1 ml, 5 ml, y 10 ml. 02 Asas de hockey 03 Papel filtro 01 EQU Balanzas 02 Licuadoras 03 incubadoras
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Julio 31 de 2011
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Julio 31 de 2011
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Agosto de 2011
GUIA DE LABORATORIO

UC-BAC-ALI-GL001
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Julio de 2.011
Reactivos tem Descripcin 01 Peptonas de 225 ml, 90 ml, 9 ml. 02 Agar plate count 03 Agar chromocult 04 Caldo selenito 05 Agar S.S 06 Agar XLD 07 Agar Baird Parker 08 Batera de pruebas bioqumicas 09 Placas petrifilm de aerobios mesofilos, Coliformes, y S. aureus. Procedimiento Paso Descripcin 1 Recuento de aerobios mesofilos: siembre 1 ml en profundidad de las diluciones 10-3 y 10-2 por duplicado. Adicione el agar SPC. Incube a 37C durante 24 a 48 horas. 2 Recuento de Coliformes totales: siembre 1 ml en profundidad de las diluciones 10-3 y 10-2 por duplicado. Adicione agar Chromocult . Incube a 37C durante 24 a 48 horas. 3 Recuento de coliformes fecales: siembre 1 ml en profundidad de las diluciones 10-3 y 10-2 por duplicado. Adicione agar Chromocult. Incube a 44C durante 24 a 48 horas. Investigacin de salmonella: pese 25 gramos de la muestra. Adicione 225 ml 4 de agua de peptona tamponada. Incube a 37C / 18 a 24 horas. Proceda como se ha explicado anteriormente. Realice las pruebas confirmativas. Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa (+): siembre o,1 ml de las 5 diluciones 10-2 y 10-1, sobre superficie de Agar Baird Parker. Extienda el inoculo con asa de Hockey. Incube a 37C / 24 a 48 horas. Proceda hacer las pruebas confirmativas como se ha explicado. De igual forma sembrar 1 ml en placa de petrifilm. Consulta 1. Investigue los parmetros que se deben tener en cuenta para correlacionar los resultados con la legislacin Colombiana. 2. En el Microproyecto de Proyeccin social, que se viene trabajando, aplicar esta prctica de Laboratorio para un plato preparado escogido. 3. Elaborar un plegable informativo, sobre Prevencin de la contaminacin de microorganismos en los alimentos.
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Bibliografa Descripcin www.invima.org.gov Revista electrnica de Espaa: Eroski Consumer. www.who.int/foodsafety
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Referencias bibliogrficas
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13. I.C.M.S.F. Microorganisms in foods. 2. Sampling for microbiological analysis: Principles and specific applications. Canada: Blackwell Scientific Publications, Univ. of Toronto Press; 1986. 14. Dahms S, Gildebrandt G. Some remarks on the design of three-class sampling plans. J. Food Protect. 1998; 61(6): 757-761. 15. Zea Z, Ros de Selgrad M. Evaluacin de la calidad microbiolgica de los productos crnicos analizados en el Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel" durante el perodo 1990-2000. Rev. Inst. Nac. de Hig. "Rafael Rangel". 2004; 35(1):1724. 16. Banwart G. J. Basic food microbiology. (2 ed.). New York, U.S.A.: An Avi Book; 1989
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