LAPORAN TERBAIK PRAKTIKUM BIOKIMIA

AKTIVITAS SPESIFIK ENZIM -AMILASE

Disusun Oleh : 1 2 3 4 $ Istiana Sulisminawati Zasrie Putri Oktaviani Nor Sri Inayati alih Pur!o "tomo %itria &usumawati 24030110120011 24030110141009 24030110141020 2403011014102# 24030110141034

JURUSAN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG 2013

'(S)*'&
)elah +ilakukan ,er-o!aan .'ktivitas S,esi/ik 0n1im 23'milase4 yan5 !ertu6uan untuk menentukan aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase hasil isolasi +an ,emurnian awal7 Prinsi, ,er-o!aan ini a+alah kemam,uan en1im 23amilase untuk mem!entuk 1 m5 5lukosa8satuan waktu inku!asi ,a+a kon+isi tem,eratur +an ,9 tertentu: +an ,enentuan aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase yan5 !er+asarkan ,a+a unit aktivitas en1im 23amilase8m5 ,rotein7 ;eto+e yan5 +i5unakan +alam ,er-o!aan ini a+alah nelson3soumo5yi: lowry: +an s,ektro/otometri7 9asil yan5 +i,eroleh a+alah 9asil yan5 +i,eroleh a+alah en1im yan5 le!ih murni7 &a+ar 5lukosa ,a+a sam,el a+alah #:032unit ,a+a ekstrak kasar: 0:12$<unit ,a+a /raksi I +an 0:0=$1unit ,a+a /raksi II7 Den5an nilai a!sor!ansi ,a+a ekstark kasar 0:20<: ,a+a /raksi I 0:0$$:+an ,a+a /raksi II 0:0=$17 &a+ar ,rotein ,a+a sam,el yaitu ,a+a ekstrak kasar se!esar 2:$<0<$m58m>: ,a+a /raksi I $:099$m58m>:+an ,a+a /raksi II se!esar 4:<#<m58m>7 Den5an nilai a!sor!ansinya a+alah 0:293 ,a+a ekstrak kasar: 0:$=2 ,a+a /raksi I +an 0:$44,a+a /raksi II7 Se+an5kan aktivitas s,esi/ik en1im al,ha amilase yaitu ,a+a ekstrak kasar se!esar 2:34#unit8m5 ,rotein: ,a+a /raksi I se!esar 0:024#unit8m5 ,rotein +an /raksi II se!esar 0:01<=unit8m5 ,rotein7

&ey wor+: en1im23amilase: nelson somou5yi:lowry:s,ektro/otometri

P0*?O(''N @ '&)IAI)'S SP0SI%I& 0NZI; 3';I>'S0 I7 )"B"'N P0*?O(''N ;enentukan aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase hasil isolasi +an ,emurnian awal II7 )INB'"'N P"S)'&' 271 0n1im 0n1im meru,akan ,rotein yan5 !er/un5si se!a5ai !iokatalis +alam sel hi+u,7 0n1im telah !anyak +i5unakan +alam !i+an5 in+ustri ,an5an: /armasi +an in+ustri kimia lainnya7 Dalam !i+an5 ,an5an misalnya amilase: 5lukosa3isomerase: ,a,ain: +an !romelin: se+an5kan +alam !i+an5 kesehatan -ontohnya amilase: li,ase: +an ,rotease7 0n1im +a,at +iisolasi +ari hewan: tum!uhan +an mikroor5anisme7 &ele!ihan en1im +i!an+in5kan katalis !iasa a+alah : +a,at menin5katkan ,ro+uk !eri!u kali le!ih tin55iC !eker6a ,a+a ,9 yan5 relati/ netral +an suhu yan5 relati/ ren+ahC +an !ersi/at s,esi/ik +an selekti/ terha+a, su!trat tertentu7
0n1im D su!strat &1 &2 &om,leks &3
0n1im D Pro+uk

&esetim!an5an untuk ,em!entuk a+alah :

&m E Den5an 0s a+alah kom,leks en1im su!strat: 0 a+alah en1im: S a+alah su!strat : +an &m a+alah teta,an kesetim!an5an7 F'1mi: 200#G 272 &om,onen 0n1im su!strat 0n1im meru,akan senyawa or5anik !eru,a ,rotein yan5 !er/un5si se!a5ai katalis +alam meta!olisme tu!uh: sehin55a +ise!ut 6u5a !iokatalisator7

&om,onen ,enyusun en1im ter+iri +ari : 17 ',oen1im: yaitu !a5ian en1im akti/ yan5 tersusun atas ,rotein yan5 !ersi/at la!il Fmu+ah !eru!ahG terha+a, /aktor lin5kun5an: +an 27 &o/aktor:yaitu kom,onen non ,rotein yan5 !eru,a : a7 Ion3ion anor5anik FaktivatorG (eru,a lo5am yan5 !erikatan lemah +en5an en1im: %e: ?a: ;n: Zn: &: ?o7 Ion klori+a: ion kalsium meru,akan -ontoh ion anor5anik yan5 mem!antu en1im amilase men-erna kar!ohi+rat FamilumG !7 u5us ,rostetik (eru,a senyawa or5anik yan5 !erikatan kuat +en5an en1im: %'D F%lavin '+enin Dinu-leoti+eG: !iotin: +an heme meru,akan 5u5us ,rostetik yan5 men5an+un5 1at !esi !er,eran mem!eri kekuatan ekstra ,a+a en1im terutama katalase: ,eroksi+ae: sitokrom oksi+ase7 -7 &oen1im (eru,a molekul or5anik non ,rotein kom,leks: se,erti N'D FNi-otineami+e '+enine Dinu-leoti+eG: koen1im3': ')P: +an vitamin yan5 !er,eran +alam memin+ahkan 5u5us kimia: atom: atau elektron +ari satu en1im ke en1im lain7 F9erliyana: 200=G 273 Si/at3si/at 0n1im 17 0n1im a+alah Protein Se!a5ai ,rotein en1im memiliki si/at se,erti ,rotein: yaitu san5at +i,en5aruhi oleh kon+isi lin5kun5an: se,erti suhu: ,9: konsentrasi su!stratG7 Bika lin5kun5annya ti+ak sesuai: maka en1im akan rusak atau ti+ak +a,at !eker6a +en5an !aik7 27 (eker6a se-ara khusus8s,esi/ik Setia, en1im memiliki sisi akti/ yan5 sesuai hanya +en5an satu 6enis su!strat: artinya setia, en1im hanya +a,at !eker6a ,a+a satu su!strat yan5 -o-ok +en5an sisi akti/nya7 37 (er/un5si se!a5ai katalis

;enin5katkan ke-e,atan reaksi kimia tan,a meru!ah ,ro+uk yan5 +ihara,kan tan,a ikut !ereaksi +en5an su!stratnya: +en5an +emikian ener5i yan5 +i!utuhkan untuk men5uraikan suatu su!strat men6a+i le!ih se+ikit7 47 Di,erlukan +alam 6umlah se+ikit *eaksi en1imatis +alam meta!olisme hanya mem!utuhkan se+ikit sekali en1im untuk setia, kali reaksi7 $7 (eker6a !olak3!alik 0n1im ti+ak mem,en5aruhi arah reaksi: sehin55a +a,at !eker6a +ua arah F!olak3!alikG7 'rtinya en1im +a,at men5uraikan su!strat men6a+i senyawa se+erhana: +an se!aliknya en1im 6u5a +a,at menyusun senyawa3senyawa men6a+i senyawa tertentu7 #7 0n1im !ersi/at khusus terha+a, suatu su!strat tertentu yan5 +a,at +iikat +an 6enis reaksinya7 <7 &er6a en1im +i,en5aruhi oleh lin5kun5an: se,erti oleh suhu: ,9: konsentrasi: +an lain3lain FDeswita: 200#G 274 0n1im amilase 0n1im amilase +a,at meme-ah ikatan3ikatan ,a+a amilum hin55a ter!entuk maltosa7 '+a ti5a ma-am en1im amilase yaitu 23amilase: H3 amilase: +an I3amilase7 J3amilase ter+a,at +alam saliva Flu+ahG +an ,an-reas7 0n1im ini meme-ah ikatan 1:4 yan5 ter+a,at +alam amilum +an +ise!ut en+o amilase se!a! en1im ini meme-ah !a5ian +alam atau !a5ian ten5ah molekul amilum7 K3amilase terutama ter+a,at ,a+a tum!uhan +an +inamakan ekso amilase se!a! meme-ah +ua unit 5lukosayan5 ter+a,at ,a+a u6un5 molekul amilum se-ara !erurutan sehin55a ,a+a akhirnya ter!entuk maltose7 I3amilase telah +iketahui ter+a,at +alam hati7 0n1im ini +a,at meme-ah ikatan 1:4 +an 1:# ,a+a 5liko5en +an men5hasilkan 5lukosa7 FDarma6ana an+ '5ustina: 200=G

'milsse meru,akan en1im yan5 !er/un5si meme-ah ,ati atau 5liko5en7 Senyawa ini !anyak ter+a,at +alam hasil tanaman +an hewan7 'milase +a,at +ikelom,okkan men6a+i ti5a 5olon5an en1im: yaitu : a7 23amilase: yan5 meme-ah ,ati se-ara a-ak +ari ten5ah atau +ari !a5ian +alam molekul +an karenanya +ise!ut en+oamilase7 !7 H3amilase: yan5 men5hi+rolisis unit3unit 5ula +ari u6un5 molekul ,ati: karenanya +ise!ut eksoamilase7 -7 I3amilase: yan5 +a,at memisahkan 5lukosa +ari terminal 5ula non ,ere+uksi su!strat ,ati7 FDeswita: 200#G 27$ 0n1im 23amilase 0n1im al/a amilase meru,akan salah satu 6enis en1im yan5 !er,eran atau !er/un5si men5hi+rolisis atau meme-ah molekul3molekul ,ati men6a+i molekul3molekul lain yan5 le!ih se+erhana se,erti +ekstrin: maltosa: +an 5lukosa7 ;ekanisme ker6a +ari en1im al/a amilase a+alah +en5an -ara meme-ah ikatan 231:4 5likosi+ik rantai 5lukan ,ati7 0n1im en1im al/a amilase !eker6a o,timum ,a+a ,9 sekitar # +an ,a+a suhu #0o?7 Bika suhu +itin5katkan: ,9 o,timum 6u5a menin5kat sam,ai sekitar <7 Bika 23amilase !erasal +ari (a-illus li-heni/ormis maka akan men5hi+rolisis ,ati +en5an hasil utama maltoheksosa: malo,entosa +en5an 6umlah 5lukosa yan5 le!ih tin55i F= L 10MG7 en1im al/a amilase mam,u menin5katkan rasa manis ,a+a ekstrak sari !uah karena aktivitas en1im al/a amilase yan5 mam,u men5hi+rolisis ,ati ,a+a ,isan5 men6a+i 5ula lain yan5 le!ih se+erhana7 FDarma6ana an+ '5ustina: 200=G 27# 'ktivitas S,esi/ik 0n1im 'ktivitas s,esi/ik hanya +a,at +i5unakan untuk ,re,arat en1im yan5 murni: yaitu 6umlah satuan en1im ,er mili5ram en1im ,rotein: teta,i aktivitas s,esi/ik +a,at ,ula +itentukan ,a+a en1im ti+ak murni7 'ktivitas s,esi/ik en1im murni menun6ukkan +era6at kemurnian en1im +alam suatu sam,el7

(ila !erat molekul en1im +iketahui: maka aktivitasnya +a,at +inyatakan +alam !entuk aktivitas molekular a+alah 6umlah satuan su!strat ,ermikromol en1im7 'tau +a,at ,ula +iartikan se!a5ai 6umlah molekul su!strat +i u!ah setia, menit oleh setia, molekul en1im7 'ktivitas molekuler meru,akan si/at en1im in+ivi+u: 6a+i +a,at +5unakan untuk menentukan kemurnian en1im se,erti halnya aktivitas en1im7 F'1mi: 200#G 27< 'ktivitas 23amilase 'ktivitasnya +iukur +en5an men5ukur hasil +e5ra+asi ,ati: !iasanya +ari ,enurunan ka+ar ,ati yan5 larut atau +ari ka+ar +ekstrinnya +en5an men55unakan su!strat 6enuh7 9ilan5nya su!strat +a,at +iukur +en5an ,en5ukuran +era6at ,ewarnaan io+ium terha+a, su!strat7 Se,erti telah +iketahui: ,ati yan5 men5an+un5 amilosa !ereaksi +en5an io+ium men5hasilkan warna !iru: se+an5kan +ekstrin !ila !ereaksi +en5an io+ium akan !erwarna -oklat7 Disam,in5 itu: keakti/an 23amilase +a,at 6u5a +inyatakan +alam !er!a5ai -ara: misalnya +en5an ,e5ukuran viskositas +an 6umlah ,ere+uksi yan5 ter!entuk7 &inetika reaksi 23amilase meman5 a5ak sulit: se!a! si/at hi+rolisisnya !eranekara5am terha+a, !er!a5ai su!strat: a,ala5i !ila hasil hi+rolisis ,ertama ternyata men6a+i su!strat !aru la5i en1im yan5 sama sam,ai men5hasilkan maltose +an triosa7 >a6u hi+rolisis akan menin5kat !ila tin5kat ,olimerisasi menurun +an la6u hi+rolisis akan le!ih -e,at ,a+a rantai lurus7 9i+olisa amilosa akan le!ih -e,at +ari ,a+a hi+rolisis rantai yan5 !er-a!an57 Se,erti amilo,ektin atau 5liko5en7 F(aha5iawati: 200$G 27= Penentuan 'ktivitas 0n1im 23amilase ;eto+e yan5 +i5unakan +alam men5ukur aktivitas en1im 23amilase yaitu meto+e s,ektrometri7 Prose+urnya !eru,a ,enentuan ,ro+uk F5lukosaG +en5an !antuan sinar: sesuai hukum lam!ert3(eer : 3>o5 ) E ' E N 7 ! 7 -

Dimana : ) E transmitansi ' E a!sor!ansi N E koe/isien ekstin5si molar ! E te!al kuve - E konsentrasi "ntuk menentukan !anyaknya ,ro+uk 5lukosa yan5 ter!entuk +ari reaksi en1imatis maka +i5unakan kurva stan+ar 5lukosa7 Pro+uk +inyatakan +alam satuan unit aktivitas yan5 +i+e/inisikan !anyaknya mol 5lukosa +an reaksi en1imatis ,a+a kon+isi o,timum7 F*o-hima: 200$G 279 &lasi/ikasi +an struktur ,rotein Se-ara umum ,rotein +a,at +ikate5orikan menurut ti,e tu5as yan5 +ilaksanakan yaitu : 17 Protein struktural : )er+iri atas molekul ,an6an5: liat +an ti+ak larut 27 Protein 5lo!ular : (entuknya !ulat +an larut +alam air7 37 Protein kon/i5urasi : ;eru,akan ,rotein yan5 !ersenyawa +en5an 1at lain> Protein mem,unyai struktur se!a5ai !erikut: aG Struktur ,rimer : Struktur keran5ka kovalen +an +eret resi+u asam amino7 !G Struktur sekun+er : Struktur kon/ormasi resi+u asam amino +ekat ,oli,e,ti+a7 -G Struktur tersier : Struktur ,rotein yan5 rantai keeseluruhannya 3 +imensi +G Struktur kuertener : Struktur antaraksi antara su! unit ,rotein F(io5en:200=G 2710 S,ektro/otometer "A3AIS

Se-ara umum semua molekul +a,at menyera, ra+iasi +alam +aerah "A3AIS karena mereka men5an+un5 elektron yan5 +a,at tereksitasi ke tin5kat ener5inya yan5 le!ih tin55i7 Pan6an5 5elom!an5 yan5 ter6a+i ter5antun5 ,a+a !e!era,a kuat elektron ini terikat ,a+a molekul7 '!sor!ansi larutan !ertam!ah +en5an ,en5uraian kekuatan sinar: !ila konsentrasi materi yan5 +ilewati -ahaya !ertam!ah maka -ahaya le!ih !anyak +isera,7 Ba+i a!sor!ansi !er!an+in5 lurus +en5an kete!alan ! +an +en5an konsenttrasi -7 FSari:200#G 2711 )ekhnik Sentri/u5asi )ekhnik sentri/u5asi a+alah suatu tekhnik ,emisahan !er+asarkan si/at ,artikel +alam me+an 5aya sentri/u5al7 Partikel yan5 !er!e+a !erat 6enis: ukuran +an !entuknya men5en+a, searah +en5an 5aya sentri/u5al +en5an ke-e,atan !er!e+a7 Partikel yan5 akan +i,isahkan !iasanya +isus,ensi +alam me+ium -air yan5 +imasukan +alam ta!un5 sentri/u5al yan5 +a,at +item,atkan +alam rotasi yan5 !er,utar: rotor terletak ,a+a ,usat sum!u simetri7 F(aha5iawati: 200$G 2712 ;eto+e Nelson3Soumo5yi Penentuan aktivitas en1im 23amilase +ilakukan +en5an meto+e s,ektro/otometri +i mana +ilakukan ,enentuan terha+a,,ro+uk en1imnya yaitu 5lukosa +en5an meto+eNelson3Souma5yi yan5 ,rinsi,nya a+alah ,emanasan 5ula +en5an larutan alkali +ari tem!a5a tartrat +an ter!entuk -u,ri oksi+a7 F'1mi: 200#G 2713 ;eto+e >owry Protein +en5an asam /os/otun5stien3/os/omoli!+at ,a+a suasana alkali akan mem!eri warna !iruyan5 intensitasnya ter5antun5 ,a+a konsentrasi ,rotein7 >arutan ' ter+iri atas /os/otun5stein: /os/omoli!+at7 >arutan ( F2M Na2?O3 +alam N94O9 0:1 N: ?uSO4 +an Na3& tartrat 2MG7 ?ara ,enentuannya a+alah se!a5ai !erikut: 1 ml larutan ,rotein +itam!ah

0:$ ml lowry (: +i5o6o5 +an !iarkan 20 menit7 Selan6utnya +iamati OD nya ,a+a O yan5 ter,ilih7 ?ara lowry 20 kali le!ih sensiti/ ,a+a -ara "A atau !uret7 F'1mi: 200#G ;eto+e >owry meru,akan ,en5em!an5an +ari meto+e (iuret7 Dalam meto+e ini terli!at 2 reaksi7 'walnya: kom,leks ?uFIIG3,rotein akan ter!entuk se!a5aimana meto+e !iuret: yan5 +alam suasana alkalis ?uFIIG akan tere+uksi men6a+i ?uFIG7 Ion ?uD kemu+ian akan mere+uksi rea5en %olin3?io-alteu: kom,leks ,hos,homoli!+at3,hos,hotun5stat F,hos,homoly!+otun5stateG: men5hasilkan hetero,olymoly!+enum !lue aki!at reaksi oksi+asi 5u5us aromatik Frantai sam,in5 asam aminoG terkatalis ?u: yan5 mem!erikan warna !iru intensi/ yan5 +a,at +i+eteksi se-ara kolorimetri7 &ekuatan warna !iru terutama !er5antun5 ,a+a kan+un5an resi+u try,to,han +an tyrosine3nya7 &euntun5an meto+e >owry a+alah le!ih sensiti/ F100 kaliG +ari,a+a meto+e (iuret sehin55a memerlukan sam,el ,rotein yan5 le!ih se+ikit7 (atas +eteksinya !erkisar ,a+a konsentrasi 0701 m58m>7 Namun meto+e >owry le!ih !anyak inter/erensinya aki!at kesensiti/annya7 F'rie S: 2009G 2714 Penentuan &a+ar Protein Pen5ukuran konsentrasi ,rotein se-ara akurat men6a+i san5at ,entin5 ,eranannya men5in5at hasil ,eneta,an ini +i5unakan +alam ,erhitun5an lain: se,erti ,enentuan aktivitas en1im7 &esalahan +alam ,eneta,an ka+ar ,rotein akan !er!untut ,a+a kesalahan3kesalahan +i ,erhitun5an selan6utnya7 (er!a5ai meto+e analisis kuantitati/ telah +itawarkan +en5an kele!ihan mau,un kelemahan masin53masin57 Se-ara umum: meto+e analisis kuantitati/ ,rotein +i5olon5kan +alam: S,ektro/otometri: 3S,ektro/otometri"A 3 &olorimetri

Aolumetri: 3 ;eto+e &6el+ahl F+i+asarkan ,a+a analisis Nitro5enG 3 )itrasi /ormol &uanti/ikasi ,rotein se-ara kolorimetrik ,a+a +asarnya ter!a5i +alam 2 5olon5an: yaitu !er+asarkan ,en5ikatan +en5an 1at warna Fdye-bindingG +an ,em!entukan kom,leks +en5an tem!a5a Fcopper-chelatingG7 ;eto+e3meto+e !er+asarkan ,en5ikatan +en5an 1at warna meli,uti: ;eto+e (ra+/or+ F?oomassie (lueG ;eto+e Ninhy+rin ;eto+e (romo-resol reen ;eto+e 0rythrosin3( ;eto+e 3P:3Q:$P:$Q3tetra!romo,henol,htalein ethyl ester F)(P00G ;eto+e Roo+war+Ss *ea5ent & ;eto+e3meto+e !er+asarkan ,em!entukan kom,leks +en5an tem!a5a meli,uti: ;eto+e (iuret ;eto+e >owry F%olin3?io-alteuG ;eto+e (i-in-honini- '-i+ F(?'G ;eto+e %e?l3 F'rie S: 2009G

271$ Stan+ar Protein Pemilihan stan+ar+ ,rotein meru,akan ,enentu ke!erhasilan analisis kuantitati/7 (ovine Serum 'l!umin F(S'G a+alah ,rotein yan5 umum +i5unakan se!a5ai stan+ar+ +alam ,eneta,an ka+ar ,rotein7 (S' !anyak +i,ilih karena tin5kat kemurniannya yan5 tin55i +an har5anya relati/ murah7 Stan+ar+ ,rotein lain yan5 !isa +i5unakan a+alah (ovine amma lo!ulin F(? G: terutama untuk ke,erluan kuanti/ikasi men5hasilkan warna yan5 san5at miri, +en5an FI5 G7 anti!o+i karena (? immuno5lo!ulin

>arutan in+uk FstokG stan+ar+ ,rotein !iasanya +i!uat +alam konsentrasi 1 3 $ m58m>: namun ti+ak menutu, kemun5kinan +i!uat larutan stok +en5an konsentrasi yan5 le!ih !esar7 ;isalkan larutan stok stan+ar+ ,rotein yan5 in5in +i!uat a+alah 1 m58m> se!anyak 100 m>: maka +itim!an5 100 m5 (S' kemu+ian +ilarutkan +alam 100 m> akua+es Fse!aiknya !e!as ?O2G7 Perlu +i-atat: ketika larutan stok +i!uat: 6an5an +iko-ok: karena akan !eraki!at +enaturasi ,rotein Fteramati se!a5ai !uih +i ,ermukaan larutanG7 "ntuk mem!antu ,elarutan ,rotein: -uku, +ia+uk ,erlahan7 Sim,an larutan stok ini F!ila !elum +i5unakanG +alam /ree1er Fatau le!ih !aik ,a+a suhu 320o?G7 F'rie S: 2009G 271# Suhu o,timum 0n1im 23amylse 'ktivitas en1im al/a3amilase +ari isolat Bacillus s,7 ;II310 memerlukan ,9 o,timum <:0 +an suhu o,timum $03#0o?7 0n1im al/a3 amilase terse!ut sta!il ,a+a ,9 <:0 selama 24 6am ,a+a suhu 40 o? +an ,a+a suhu <0o? selama $ menit7 Si/at kinetika en1im yan5 +itun6ukkan oleh nilai &m a+alah 0:1#9M terha+a, su!strat soluble starch setara +en5an 1:#9 m58ml7 0n1im terse!ut memiliki a/initas -uku, !aik terha+a, su!strat +an mam,u men-a,ai ke-e,atan katalitik maksimum ,a+a konsentrasi su!strat yan5 ren+ah F1:$M !erat8volumeG7 F*i-hana: ;7D: 2001G 271< Raktu inku!asi o,timum en1im 23amylase Raktu inku!asi selama 30 menit yan5 mem!erikan aktivitas a 3amylase tertin55i se!esar 1:14 unit8m>7 F unawan: In+ra7 200=G 271='nalisa (ahan 271=71 'milum Polisakari+a yan5 !anyak ter+a,at +ari tum!uhan: +alam !ahasa sehari3hari +ise!ut ,ati: ter+a,at ,a+a um!i: +aun: !atan5: +an !i6i3!i6ian7 )er+iri atas +ua ma-am ,olisakari+a yaitu amilosa +an amilo,ektin7

FPoe+6ia+i: 1994G 271=72 lukosa (; :#0:1#: larut +alam larutan /ehlin5: tollens +an eter: sulit larut +alam alkohol: memiliki +ua 6enis yaitu D35lukosa +an >3 5lukosa7 FDaintith: 1994G 271=73 ZnSO4 Senyawa kristalis larut air: !erwarna ,utih: +i!uat lewat ,emanasan !i6ih 1ink sul/i+a +iu+ara +an melarutkan +an men5kristalisasi sul/atnya7 FDaintith: 1994G

271=74 (aFO9G2 Pa+atan ,utih: se-+ikit larut +alam air: !entuk yan5 umum a+alah oktahi+rat: monoklinik: titik leleh <=0?7 FDaintith: 1994G 271=7$ 'kua+es ?airan tak !erwarna: titik leleh 00?: titik +i+ih1000?: ti+ak !er!au +an ti+ak!erasa: ter+iri +ari satu molekul 92O +en5an ikatan 9O9 10$0 FDaintith: 1994G 271=7# *ea5en >owry 3 3 *ea5en lowry ' >arutan asam ,hos,o3/un5ati-3,hos,o3moly!+i-7 *ea5en lowry ( 100 ml 2M Na2?O3 +alam larutan NaO9 0:1 N +en5an 1 ml ?uSO47 $92O 1M +an 1 ml natrium3kalium tartat 2M7 FDaintith: 1994G 271=7< (u//er Phos/at

3 >arutan ' E 0:2 ; larutan Na3Phos,at mono!asis F2<:= 5 +alam 1000 mlG 3 >arutan ( E 0:2 ; larutan Na3,hos,hat +i!asis F$2:#$ 5G FDaintith: 1994G 271=7= *ea5en Nelson3Somou5yi 3 *ea5en ' 12 5 &7Na tartat : 1:# 5 Na3!ikar!onat: 14:4 5 Na3sul/at anhi+rat: 2:4 5 Na3kar!onat anhi+rat +ilarutkan +en5an akua+es7 3 *ea5en ( 2 5 ?uSO47$92O +itam!ah 1= 5 Na2SO4 anhi+rat +ilarutkan sam,ai 100 ml F*ea5en Nelson Soumo5yi : 1 !a5ian Nelson ' D 1 !a5ian Nelson 'G FDaintith: 1994G

III7

;0)OD0 P0*?O(''N 371 'lat +an (ahan 37171 'lat 17 )a!un5 reaksi 27 Sentri/u5e 37 Inku!ator 47 Pi,et tetes 37172 (ahan 17 Sam,el en1im 27 amilum 37 larutan 5lukosa 47 akua+es $7 (aFO9G2 372 ?ara ker6a 37271 Penentuan aktivitas en1im 23amilase 1 ml larutan amilum )a!un5 reaksi #7 ?uSO4 <7 (u//er /os/at =7 *ea5en Nelson3Soumo5yi 97 *ea5en >owry $7 elas ukur #7 elas !ekker <7 S,ektro/otometer "A3AIS

Penam!ahan 0:1 ml larutan en1im Penam!ahan 3:9 ml !u//er /os/at Peniku!asian ,a+a ) 400? selama 30 menit7 9asil

37272 Penentuan ka+ar 5ula ,ere+uksi +en5an meto+e Nelson3Somou5yi 0:1 ml larutan inku!asi )a!un5 reaksi Penam!ahan akua+es 1:$ ml Penam!ahan 0:2 ml larutan (aFO9G2 0:01; Penam!ahan larutan ZnSO4 0:2 ml 0:01 ; Pen55o6o5an +an sentri/u5asi 1 ml su,ernatan )a!un5 reaksi Penam!ahan 1 ml rea5en Nelson3Somou5yi Pemanasan selama 1$ menit Pen+in5inan Penam!ahan 1 ml rea5en arsenomoli!+at Pen5en-eran +en5an air hin55a volumemen6a+i 10 ml Penentuan konsentrasi +en5an s,ektro/otometer "A3AIS ,a+a O E $20 nm Pen5ulan5an terha+a, larutan stan+ar 5lukosa

9asil 37273 Penentuan ka+ar ,rotein +en5an meto+e lowry 0:2 ml larutan en1im )a!un5 reaksi Penam!ahan 1 ml rea5en ? Penam!ahan 0:1 ml rea5en D Pen+iaman 30 menit Pen5ukuran a!sor!ansi ,a+a O E <$0 nm Pen5ulan5an terha+a, !lanko 9asil IA D')' P0N ';')'N
No Perlakuan 9asil

Penentuan aktivitas en1im 23amilase 1 ml larutan amilum 1M D 0:1 ml en1im D 3:9 ml !u//er /os/at: inku!asi

Penentuan ka+ar 5ula ,ere+uksi +en5an meto+e Nelson3Soumo5yi 30:1 ml larutan inku!asi D 1:$ ml akua+es D 0:2 ml (aFO9G2 0:01 ; D ZnSO4 0:2 ml 0:01 ;: ,en55o6o5an sentri/u5asi 10 menit a7 ekstrak kasar !7 /raksi I -7 /raksi II 31 ml larutan su,ernatan D 1 ml rea5en Nelson3 soumo5yi: +i,anaskan +alam larutan men+i+ih selama 1$ menit: +i+in5inkan a7 ekstrak kasar !7 /raksi I

>arutan keruh >arutan keruh >arutan keruh

>arutan !iru >arutan !iru >arutan !iru

-7 /raksi II 3Penam!ahan 1 ml larutan moli!+at: ,en5en-eran a7 ekstrak kasar !7 /raksi I -7 /raksi II 3Penentuan konsensentrasi +en5an s,ektra "A a7 ekstrak kasar !7 /raksi I

>arutan !iru >arutan !iru >arutan !iru

'!sor!ansi 0:20< '!sor!ansi 0:0$$ '!sor!ansi 0:0$#

-7 /raksi II Penentuan ka+ar Protein meto+e >owry 3Penam!ahan larutan sam,el +en5an 1 ml rea5en ?: ko-ok 7 a7 ekstrak kasar !7 /raksi I -7 /raksi II 3Penam!ahan 0:1 ml rea5en D: ko-ok a7 ekstrak kasar !7 /raksi I -7 /raksi II 3Pen5ukuran a!sor!ansi a7 ekstrak kasar !7 /raksi I -7 /raksi II

>arutan !enin5 >arutan !enin5 >arutan !enin5 >arutan !iru >arutan !iru ,ekat >arutan !iru

'!sor!ansi 07293 '!sor!ansi 0:$=2 '!sor!ansi 0:$44

IA7

9IPO)0SIS Per-o!aan .'ktivitas S,esi/ik 0n1im 23'milase4 !ertu6uan untuk menentukan aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase hasil isolasi +an ,emurnian awal7 Prinsi, ,er-o!aan ini a+alah kemam,uan en1im 23amilase untuk mem!entuk 1 m5 5lukosa8satuan waktu inku!asi ,a+a kon+isi tem,eratur +an ,9 tertentu: +an ,enentuan aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase yan5 !er+asarkan ,a+a unit aktivitas en1im 23amilase8m5 ,rotein7 ;eto+e yan5 +i5unakan +alam ,er-o!aan ini a+alah nelson3soumo5yi: lowry: +an s,ektro/otometri7 9asil yan5 +i,eroleh a+alah en1im al,ha amilase yan5 le!ih murni +en5an aktivitas s,esi/ik en1im al,ha amilase tertentu7

AI7

P0;('9'S'N Per-o!aan aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase !ertu6uan untuk menentukan aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase hasil isolasi +an ,emurnian awal7 Prinsi, ,er-o!aan ini a+alah kemam,uan en1im 23amilase untuk mem!entuk 1 m5 5lukosa8satuan waktu inku!asi ,a+a kon+isi tem,eratur +an ,9 tertentu: +an ,enentuan aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase yan5 !er+asarkan ,a+a unit aktivitas en1im 23amilase8m5 ,rotein7 ;eto+e yan5 +i5unakan +alam ,er-o!aan ini a+alah nelson3soumo5yi: lowry: +an s,ektro/otometri7 ;eto+e nelson3somou5yi +i+asarkan ,a+a ,emanasan 5ula +en5an larutan alkali dari tembaga tartarat dan terbentuk cupri oksida.
Metode lowry adalah pengukuran kadar protein yang didasarkan pada pembentukan kompleks yang disebabkan adanya reaksi antara basa tembaga dengan protein.sedangkan metode spektrofotometri adalah penyerapan cahaya pada panjang gelombang tertentu yang diukur dalam bentuk absorbansi. Sampel yang digunakan adalah ubi jalar yang merupakan sumber karbohidrat. En im !amilase merupakan en im yang dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan !1"# glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam molekul" baik pada amilase maupun amilopektin.

>an5kah awal ,er-o!aan ini a+alah +en5an menam!ahkan en1im hasil

/raksinasi +alam amilum 1M7 Di5unakan amilum karena en1im 23amilase +a,at men5hi+rolisis amilum7 &emu+ian +ilakukan ,enam!ahan !u//er /os/at +alam -am,uran terse!ut7 %un5si ,enam!ahan !u//er PO# adalah
sebagai larutan penyangga agar p$!nya tidak berubah. %i mana akti&itas !amilase berada pada range p$ '"#!("#" maka digunakan buffer )* # dengan p$ ("1 +buffer asam," di mana p$ ini merupakan p$ optimum akti&itas !amilase. -ika p$!nya di atas p$ optimum maka en im akan mengalami deprotonasi atau perubahan p$. .ila p$ berada di atas maupun di bawah p$ optimum maka dapat menyebabkan en im terdenaturasi" sehingga akti&itas en im menurun.

Setalah ,enam!ahan !u//er /os/at: -am,uran +iinku!asi ,a+a suhu 400/ karena suhu tersebut merupakan suhu optimum akti&itas en im !amilase. $al ini sebanding dengan energi akti&asi +Ea, untuk setiap en im membentuk kompleks en im!substrat dan kemudian membentuk produk dan en im kembali. -ika suhu inkubasi lebih tinggi maka protein akan terdenaturasi yang mengakibatkan akti&itas en im menurun. .egitu pula jika diinkubasi pada temperatur yang lebih rendah maka akti&itas en im !amilase kurang optimal. )enginkubasian ini bertujuan agar en im !amilase dapat bekerja sempurna dalam mengidrolisiss amilum menjadi glukosa. #717 Penentuan ka+ar 5ula ,ere+uksi +en5an meto+e Nelson3Soumo5yi Per-o!aan ini !ertu6uan untuk ,enentuan ka+ar 5ula ,ere+uksi +en5an men55unakan meto+e Nelson3Soumo5yi7 Penentuan ka+ar 5ula ,ere+uksi meru,akan wu6u+ +ari u6i akti/itas en1im 23amilase7 'ktivitas en1im meru,akan unit aktivitas en1im ,ermili5ram ,rotein: se+an5kan satu unit aktivitas en1im 23amilase meru,akan kemam,uan en1im 23amilase yan5 menye!a!kan ter!entuknya 1m5 ,ro+uk 5lukosa +ari su!strat amilum ,ersatuan waktu inku!asi ,a+a kon+isi tem,eratur +an ,9 tertentu7 "6i aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase +iawali +en5an reaksi en1imatis: yaitu +en5an menam!ahkan larutan amilum 1M +an !u//er /os/at ke +alam en1im

kasar +an en1im halus7

S
2su!strat

0S

P
en1im ,ro+uk

0n1im

en1im3su!strat

Pa+a reaksi en1imatis +i,erlukan ,roses inku!asi: +imana ,a+a ,roses inku!asi ini ter6a+i kontak antara en1im 23amilase +en5an su!strat +alam mem!entuk ,ro+uk yaitu 5lukosa7 *eaksi :
CH 2OH O OH OH
CH2 OH OH OH O

CH2 OH O O OH OH
CH2 OH O OH OH

D (u//er %os/at

al/a 3 amilase

O9 9O

CH 2OH O OH OH

O9

9O

Maltosa

0lukosa

&a+ar 5ula ,ere+uksi +a,at +itentukan +en5an meto+e Nelson3 Soumo5yi7 Penam!ahan larutan (aFO9G2 bertujuan untuk meminimalisasi
masuknnya oksigen dari luar ke dalam larutan yang dapat mengoksidasi kupri oksida +/u2*, dan penambahan 1nS*# bertujuan untuk mengendapkan protein. Supernatan yang terbentuk ditambahkan reagen 2elson!Soumogyi dan dipanaskan dengan tujuan untuk mempercepat reaksi. )enambahan reagen 2elson!Soumogyi menyebabkan terbebtuknya kupri oksida. 3eagen /u!tartrat akan direduksi oleh glukosa" hal ini karena glukosa mempunyai gugus gula pereduksi" yaitu gugus aldehid.

*eaksi re+uksi ?u24 5

?u24 4 e 2 ?u 4 4 2 *$! /u24

Ion ?u4 akan mengendap sebagai /u2* dalam suasana basa 5

/u2* 4 $2*

*eaksi ter!entuknya ku,ri oksi+a :

CHO H OH H H C C C C OH H OH OH H CHO C C C C OH H OH OH

?u2D
'lkali

OH H H

?u2O

CH 2OH

CH 2OH

0lukosa

asam %!glukonat

;eto+e Nelson3Soumo5yi men5analisa se-ara kuantitati/ ,ro+uk reaksi en1imatis !eru,a 5lukosa: akan teta,i meto+e ini memiliki kekuran5an karena 5ula non ,ere+uksi FsukrosaG ti+ak +a,at ter+eteksi +an hanya !isa men+eteksi 5ula ,ere+uksi F5lukosa3/ruktosaG ,a+ahal ,ro+uk +ari ,eme-ahan amilum oleh en1im 23amilase !ukan 5lukosa melainkan maltosa: sukrosa +an 5ula non ,ere+uksi yan5 lain7 ula +a,at +ire+uksi +en5an sinar "A karena memiliki elektron3 elektron yan5 +a,at tereksitasi +ari kea+aan +asar ketin5kat ener5i yan5 le!ih tin55i7 (iasanya transisi elektron +ise!a!kan oleh elektron T +imana +alam molekul 5lukosa men5an+un5 5u5us kar!onil yan5 +i!entuk oleh elektron T7 Penentuan ka+ar 5lukosa +ilakukan +en5an men5ukur a!sor!ansi larutan terse!ut +en5an men55unakan s,ektro/otometer "A3AIS ,a+a O $20 nm7 Pan6an5 5elom!an5 $20 nm ini meru,akan ,an6an5 5elom!an5 maksimum: +imana ter6a+i sera,an maksimum oleh larutan 5lukosa7 &a+ar 5ula ,ere+uksi +itentukan +en5an mem!an+in5kan a!sor!ansi larutan sam,el terha+a, kurva larutan stan+ar 5lukosa7 9asil yan5 +i+a,atkan a+alah larutan !erwarna !iru +en5an nilai a!sor!ansi yan5 +i+a,at a+alah ,a+a ekstrak kasar se!esar 0:20<C/raksi I se!esar 0:0$$C+an /raksi II se!esar 0:0$#7 Se+an5kan ka+ar 5lukosanya a+alah #:032unit untuk ekstrak kasar" 0"12'6unit untuk fraksi 7 dan 0"08'1unit untuk fraksi 77. #727 Penentuan ka+ar Protein +en5an ;eto+e >owry Per-o!aan ini !ertu6uan untuk menentukan ka+ar ,rotein +en5an meto+e lowry7 Penentuan ka+ar ,rotein +en5an meto+e lowry +i+asarkan ,a+a warna kom,leks yan5 yan5 +i!entuk: +imana intensitas warnanya !ervariasi !e+asarkan 6enis,rotein atau 6umlah asam amino aromatik ,a+a ,rotein7 Rarna yan5 tim!ul +ise!a!kan oleh reaksi tem!a5a alkali +en5an ,rotein7 *ea5en yan5 +i5unakan a+alah rea5en %olin ?io-alteu yan5

meru,akan -am,uran natrium tun5stat +an natrium moli!+at +alam asam7 ?am,uran asam ini akan mere+uksi ,rotein yan5 +i5unakan +alam ,er-o!aan melalui ,en5uraian ?u2D sehin55a -am,uran asam ini kehilan5an satu atau le!ih atom oksi5en +an kom,leks !iru yan5 +ihailkan meru,akan kom,leks antara ,rotein +en5an ?u2D.

Struktur kom,leks !iru :

HN R O CH C HN NH

?u2D

C HC NH

O R

Penentuan kuantitati/ ka+ar ,rotein se-ara lowry +i+asarkan ,a+a a!sor!ansi sinar oleh kom,leks !iru7 '!sor!ansi +iukur +en5an men55unakan s,ektro/otometri "A3AIS ,a+a O <$0nm7 9asil yan5 +i,eroleh a+alah larutan !erwarna!iru +on5ker +en5an nilai a!sor!ansi sam,el yan5 +i,eroleh yaitu ,a+a ekstrak kasar se!esar 07293 m5 9m:; fraksi 7 sebesar 0"'82mg9m:;dan fraksi 77sebesar 0"'##mg9m:. Sedangkan nilai akti&itas spesifik en im !amilase pada ekstrak kasar adalah sebesar 2"<#( unit9mg protein" pada fraksi 7 yaitu 0"02#( unit9mg protein dan pada fraksi 77 sebesar 0"0168 unit9mg protein

AII7 P0N")"P <71 &esim,ulan <7171 Penentuan aktivitas en1im 23amilase +a,at +i lakukan +en5an meto+e s,ektro /otometri men55unakan meto+e Nelson3soumo5yi +an >owry <7172 &a+ar 5ula ,ere+uksi ,a+a ekstrak kasar a+alah #:032unit: ,a+a /raksi I a+alah 0:12$< unit +an ,a+a /raksi II a+alah 0:0=$1 unit <7173 &a+ar ,rotein en1im +alam ekstrak kasar a+alah 2:$<0<$ m58m>: +alam /raksi I a+alah $:099$m58m> +an ,a+a /raksi II a+alah 4:<#<m58m> <7174 Nilai aktivitas s,esi/ik en1im 23amilase yaitu ,a+a ekstrak kasar se!esar 2:34#unit8 m5 ,rotein: ,a+a /raksi I se!esar 0:024#unit8 m5 ,rotein: +an ,a+a /raksi II a+alah se!esar 0:01<= unit8m5 ,rotein

AIII7 D'%)'* P"S)'&' '1mi: 200#: Penentuan &on+isi O,timum %ermentasi 's,er5illus Ory1ae "ntuk Isolasi 0n1im 'milase Pa+a ;e+ium Pati (i6i Nan5ka: >a!oratorium &imia Burusan P;IP' %&IP "niversitas *iau: Pekan!aru Daintith: 1994: &amus >en5ka, &imia: 0rlan55a: Bakarta7 Darma6ana 'n+ '5ustina: 200=: Pen5aruh &onsentrasi 0n1im 23'milase )erha+a, Si/at %isik Dan Or5anole,tik %iltrat: (alai (esar )eknolo5i )e,at una L >i,i: Su!an5 9ar+6ono: 2001: S,ekstrosko,i: li!erty: Uo5yakarta >ehnin5er: 1999: (iokimia Dasar: 0rlan55a: Bakarta Poe+6ia+i: 1994: Dasar3+asar (iokimia: "I Press: Bakarta Rinarno: 19=3: &imia Pan5an +an Bakarta i1i: P) rame+ia Pustaka "tama:

>0;('* P0N 0S'9'N

Semaran5: 24 Novem!er 2012 Praktikan:

Istiana Sulisminawati 24030110120011

Zasrie Putri Oktaviani

2#0<01101#100=

Nor Sri Inayati

>tomo

0alih )urbo

240301101410 20

2403011014102(

%itria &usumawati 240301101410<#

;en5etahui: 'sisten

*eny In5emer S B2?009044

>';PI*'N Penentuan &a+ar lukosa '!sor!ansi Nelson3Somou5yi 3 0kstrak kasar 3 %raksi I 3 %raksi II A analisa Asam,el Atotal Aen1im t inku!asi ka+ar 5lukosa: @E :0:20< :0:0$$ :0:0=$1 : 0:1 m> : $m> : $m> : 0:1m> : 40 meniit

0kstrak kasar

@E

E 1:<3<4

E #:032 unit 3 %raksi I

@E

E 0:03#2 E 0:12$< unit 3 %raksi II

@E

E 0:024$ E 0:0=$1 unit

Penentuan &a+ar Protein '!sor!ansi >owry 3 0kstrak kasar 3 %raksi I 3 %raksi II /aktor ,en5en-eranF/,G : 0:293 : 0:$=2 : 0:$44 : <

ka+ar ,rotein E

3 0kstrak kasar

&a+ar ,rotein E

E 2$<0:<$V58m> E 2:$<0<$ m58m> 3 %raksi I

&a+ar ,rotein E

E $099:$V58m> E $:099$ m58m> 3 %raksi II

&a+ar ,rotein E

E 4<#<V58m> E 4:<#< m58m> 'ktivitas s,esi/ik en1im 23amilase

'ktivitas s,esi/ik E

3 0kstrak kasar

'ktivitas s,esivik E

E 2:34# unit8m5 ,rotein 3 %raksi I

'ktivitas s,esi/ik E

E 0:024# unit8m5 ,rotein

3 %raksi II

'ktivitas s,esi/ik E

E 0:01<= unit8m5 ,rotein