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Trabajo Prctico N 1
MITOSIS
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Reconocer microscpicamente las distintas fases de la divisin mittica y
algunas de sus caractersticas.-
MATERIALES A UTILIZAR
Raicillas jvenes de Allium cepa (cebolla), herramientas de laboratorio e
instrumental ptico adecuado. Se utiliza como material biolgico a la cebolla por la
facilidad para obtener sus preparaciones cromosmicas, esto se debe a que posee pocos
cromosomas (2n=16) y los bulbos enrazan fcilmente generando abundante material.-
CICLO MITTICO
Simultneamente a las observaciones que realiza en los puntos anteriores deber
registrar los parmetros necesarios para el anlisis del ciclo mittico.
1) Calcular el ndice mittico a partir de 250 clulas observadas barriendo el
campo ptico de derecha a izquierda y de arriba hacia abajo, de acuerdo con la frmula
siguiente:
IM =
x 100
IF =
x 100
TCNICA OPERATORIA
Una de las tcnicas mas frecuentemente empleadas en el estudio de cromosomas
mitticos se denominada tcnica de aplastamiento (squashing), mediante la cual se
puede hacer recuentos cromosmicos y estudiar la morfologa de los cromosomas, y
consiste de los siguientes pasos:
1) Poner a enraizar bulbos (o semillas) y cortar las races enteras cuando
alcanzan entre 5 mm y 1 cm, es decir mientras las clulas del pice se hallan en
crecimiento activo.
2) Sumergir las raicillas durante 1 a 4 horas en algn veneno mittico para
inhibir la formacin del huso acromtico. Los venenos mas utilizados son las soluciones
acuosas saturadas de paclosol (Paradiclorobenceno), gamexane y alfa-bromonaftaleno
(Naftalina) y, tambin, solucin de colchicina al 0,05-1% o solucin 0,002 M de 8Hidroxiquinoleina; la eleccin de inhibidor depender del material biolgico en estudio.
Como resultado de dicha inhibicin se acumulan clulas en Metafase, los cromosomas
se distribuyen por toda la clula en lugar de hallarse amontonados en la regin
ecuatorial y, adems, los cromosomas se contraen facilitando el estudio de su
morfologa.
Aclaracin: este paso solo se efecta si se desea estudiar la morfologa de los
cromosomas metafsicos, si el objetivo planteado es estudiar los estados normales de la
mitosis debe suprimirse.
3) Fijar en una solucin de alcohol etlico y cido actico glacial en proporcin
3:1 durante 12 a 24 hs (en caso de apuro se puede reducir el tiempo a 1 2 hs)
Cerutti, J. C. 2009. Gua de laboratorio de Gentica General de la
Licenciatura en Gentica. Universidad Nacional de Misiones.
Griffiths, A.; Miller, J; Suzuki, D.; Lewontin, R. y Gelbert, W. 2003.
Gentica. 7ma Edicin. Traducido de la sexta edicin en ingls de la obra An
introduction to Genetic Analysis. McGrawHill. Interamericana. Madrid.
Espaa.
Griffiths, Anthony. 2004. Gentica Moderna. Ed. Mc Graw Hill. Espaa.
Lacadena, J. R.1999. Gentica. Ed. Sntesis Madrid.
Snchez Monge, R. y Jouve, N. 1989. Gentica. Ed. Omega. Barcelona.
Saiman B.; Mola L.; Hopp, E. 2008. Gua de laboratorio de Gentica I.
Universidad Nacional de Buenos Aires.
Strickberger, M. 1982. Gentica. Ed. Omega. Barcelona.
Klug, W. S.; Cummings, M. R. 1999. Essentials of Genetics. 3 Edition.
Pearson Prentice Hall. New Jersey.
Klug, W. S; Cummings, M. R. y Charlotte, A. Spencer. 2006. Conceptos de
Gentica. Ed. Pearson Prentice Hall. Espaa
Trabajo Prctico N 2
MEIOSIS
OBJETIVO
Reconocer las distintas fases de la divisin meitica y algunas de sus
caractersticas ms sobresalientes. Comprender la importancia de cada una de las etapas
de este proceso biolgico.
MATERIALES A UTILIZAR
Gnadas masculinas de ortpteros de distintos gneros y especies. Se utiliza este
material biolgico dado que posee slo cromosomas telocntricos y facilita la
interpretacin de las configuraciones cromosmicas observadas. Instrumental ptico y
herramientas de laboratorio adecuadas.
TRABAJO A REALIZAR EN EL LABORATORIO
1) Obtener preparados temporarios que se realizarn durante la clase prctica
siguiendo las instrucciones de la tcnica operatoria que se detalla a continuacin.
2) Observar y dibujar, en forma esquemtica, clulas en diferentes fases de
divisin (Interfase, Leptotene, Cigotene, Paquitene, Diplotene, Diacinesis, Metafase I,
Anafase I, Telofase I, Metafase II, Anafase II, y Telofase II). En cada uno de los
esquemas remarcar las caractersticas sobresalientes de la etapa, por ejemplo:
a) Dibujar detalladamente un bivalente (II) en paquitene, donde se vea la
organizacin cromomrica y el apareamiento crommero a crommero. Observar la
heteropicnosis positiva del univalente sexual X.
b) En diplotene temprano observar y dibujar la repulsin precoz de los extremos
del bivalente y la heteropicnosis positiva del cromosoma X. Notar que ste ltimo est
compuesto por dos cromtidas hermanas.
c) En diplotene avanzado observar la repulsin de los homlogos y dibujar un
bivalente en el que sean notorias las 4 cromtidas que lo componen. Dibujar el X
hetrocromtico.
d) En diacinesis graficar la configuracin de los bivalentes y destacar la
heterocromaticidad del X con respecto a los autosomas.
e) En diplotene, diacinesis y metafase I marcar los quiasmas proximales,
intersticiales y distales, sealndolos con una flecha y colocando las iniciales qp, qi y
qd. En las clulas dibujadas calcular el coeficiente de terminalizacin de quiasmas, que
es la proporcin de quiasmas distales (qd) con respecto al total de quiasmas en la clula.
TCNICA OPERATORIA
Introduccin Terica
Se estudiar la meiosis en gnadas masculinas de distintas especies de Acrdidos
(Orthoptera) de la provincia de Misiones. Los testculos de estos insectos, si bien de
morfologa general variable, presentan una estructura folicular tpica. Los folculos son
sacos ciegos ms o menos alargados que desembocan en un conducto deferente comn.
En cada folculo la meiosis es cstica, y en la regin apical del folculo se encuentra la
zona germinal en donde se producen las espermatogonias. Un cisto consiste de un grupo
de espermatogonias que provienen por mitosis de una nica clula original, que entran
simultneamente en meiosis y la cumplen en forma sincrnica. Por tal motivo en un
cisto todas las clulas se encuentran en el mismo estado de divisin; cuanto ms distal
es un cisto dentro del folculo ms avanzado es el estadio meitico en que se encuentran
las clulas.
Obtencin de preparaciones citogenticas temporarias
1) Despus de eterizar al animal, extraer los testculos practicando una incisin
dorso lateral a la altura del 2 segmento abdominal y ejercer una presin leve sobre el
abdomen para que los testculos emerjan.
2) Pegar los testculos a un papel de filtro debidamente rotulado; fijarlos en una
solucin 3:1 de metanol absoluto : cido actico glacial durante 30 a 120 min como
mnimo. El material fijado se puede conservar a 4 en el mismo fijador o en etanol al
70%.
3) Colocar entre 2 y 6 folculos (de acuerdo a su tamao) sobre un portaobjetos,
agregar una gota de hematoxilina frrica u orcena lactopropinica al 2%. Dilacerar el
material con una barra de metal (hierro) de extremo plano.
4) Colocar un cubreobjetos, no flamear. Realizar el squash de la manera habitual
y sellar el preparado con solucin de goma o cera depilatoria, segn el tratamiento que
se practique posteriormente. Los preparados pueden hacerse permanente transcurridas
dos horas como mnimo.
Obtencin de preparaciones permanentes
a) Por congelacin:
1) Retirar el sellador con ayuda de un bistur u hoja de afeitar. Evitando los
deslizamientos del cubreobjetos, limpiar los restos de sellador con papel absorbente
embebido con xilol.
2) Congelar el preparado colocndolo sobre un trozo de hielo seco (30 seg), por
exposicin a un flujo continuo de CO2 o por inmersin en nitrgeno lquido.
3) Saltar el cubreobjetos con ayuda de un bistur u hoja de afeitar.
4) Sumergir el portaobjetos y el cubreobjetos en alcohol absoluto durante 1
minuto.
5) Lavar el portaobjetos con alcohol absoluto 2 3 veces.
6) Colocar una gota de medio de montaje soluble en alcohol (Euparal). En el
caso de utilizar un medio montaje soluble en xilol (Xam o DePeX), realizar un pasaje
por xilol antes del montaje definitivo.
7) Colocar un nuevo cubreobjetos limpio y seco.
8) El cubreobjetos original se trata de manera similar al portaobjetos y se asocia
con un nuevo portaobjetos limpio y seco.
9) Si se observa alguna turbidez generada por hidratacin, calentar suavemente a
la llama hasta que desaparezca. Nunca debe hervir el medio de montaje definitivo.
10) Estacionar durante 24 hs. a 37C antes de observar para que se seque el
medio de montaje.
Aclaracin: es aconsejable el uso de cubreobjetos siliconados para evitar que las
clulas se adhieran a l y, de esta forma, trabajar nicamente con el portaobjetos al
hacer permanente la preparacin.
b) Desprendimiento del cubreobjetos por inversin:
1) Retirar el sellador con ayuda de un bistur u hoja de afeitar evitando que se
deslice el cubreobjetos.
2) Limpiar los bordes del cubreobjetos con xilol y luego con cido actico 45%
para eliminar los restos de sellador.
3) Colocar el preparado de manera invertida (con el cubreobjetos hacia abajo)
dentro de una Caja de Petri y sobre una varilla de vidrio doblada en U, agregar cido
actico al 10% y esperar hasta el desprendimiento del cubreobjetos.
4) Lavar dos veces el portaobjetos con alcohol 96, 1 minuto cada vez, dejando
gotear el alcohol desde el borde del vidrio.
5) Repetir el procedimiento anterior con alcohol etlico absoluto. Evitar la
desecacin.
6) Agregar una gota de Euparal y continuar el procedimiento como en la tcnica
anterior. En caso de utilizar medios de montajes solubles en xilol, realizar previamente
un lavado con este hidrocarburo.