Introduccin a la histologa y tcnicas histolgicas bsicas

La histologa estudia la estructura microscpica de tejidos, clulas, rganos y sistemas. El cuerpo est compuesto de clulas, matriz intercelular y lquido extracelular (lquido tisular). El lquido extracelular, derivado del plasma, transporta nutrientes, oxgeno y molculas de sealamiento hacia las clulas, u desde elles transporta productos de desecho y el dixido de carbono hacia la sangre y los vasos linfticos.

Microscopa de luz
Preparacin de los tejidos
Las diversas tcnicas histolgicas pretenden conservar lo ms posible el estado natural en vivo de los tejidos. Las etapas incluidas son fijacin, deshidratacin y aclaramiento, inclusin en un medio estable, seccin en cortes delgados, montaje y tincin. Fijacin La fijacin con sustancias qumicas retarda las alteraciones tisulares subsecuentes a la muerte y conserva la configuracin normal de los tejidos. El fijador ms comn es la formalina amortiguada. Estas sustancias permiten el entrecruzamiento de las protenas y, por tanto, conservan una imagen del tejido similar al vivo. Deshidratacin y aclaramiento Por su alto contenido de agua, el tejido debe ser deshidratado con una serie gradual de baos de alcohol, comenzando con alcohol al 50% hasta alcanzar el alcohol al 100%. Posteriormente, el tejido se aclara con xileno, una sustancia miscible en parafina que lo torna transparente. Inclusin Para poder distinguir entre s las clulas, el tejido debe incluirse en un medio apropiado. Para la microscopa de luz, el medio habitual de inclusin es la parafina. El tejido se coloca en un recipiente con parafina fundida hasta que se infiltra por completo. Posteriormente, se forma un bloque de parafina que incluya al tejido. Seccin El bloque de tejido se secciona con un micrtomo. Para la microscopa de luz, el grosor de cada corte flucta entre 5 y 10 m. Las muestras congeladas en nitrgeno o congeladas rpidamente en un criostato se seccionan a temperaturas bajo cero con una hoja de acero enfriada.

Montaje y tincin Los cortes se montan en portaobjetos de vidrio recubiertos con algn adhesivo. Para poder distinguir sus distintos componentes, el tejido debe teirse. La tincin para microscopa de luz emplea principalmente colorantes hidrosolubles, por lo que primero debe eliminarse la parafina del corte y rehidratarse el tejido para poder teirlo. Ya teido, el corte vuelve a deshidratarse para poder montarlo definitivamente en un cubreobjetos. Los colorantes histolgicos se agrupan en tres clases: Colorantes que diferencian los componentes cidos y bsicos de la clula Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriz extracelular Sales metlicas que se precipitan en los tejidos y forman depsitos de metales en ellos Los colorantes ms comunes son hematoxilina y eosina (H y E). La hematoxilina es una base que tie de azul los componentes cidos de la clula (el ncleo, rico en ADN y ARN, y las regiones con abundantes ribosomas son elementos basfilos que se tien de azul oscuro). La eosina es un cido que tie de rosa los componentes bsicos de la clula (estos componentes acidfilos abundan en el citoplasma, que se tie de rosa). Algunos colorantes, como el azul de toluidina, se polimerizan cuando se exponen a concentraciones altas de polianiones en el tejido. Estos agregados tienen un color diferente al de sus monmeros. El azul de toluidina, por ejemplo, tie de azul los tejidos, excepto los que son ricos en polianiones (como la matriz cartilaginosa y los grnulos de las clulas cebadas), que se tien de prpura. Un tejido o componente que muestra metacromasia se denomina metacromtico.

Microscopa de luz
El microscopio de luz emplea una serie de lentes que amplifican las imgenes. La luz, proveniente de una bombilla elctrica, se concentra en un haz enfocado por la lente condensadora. El haz de luz atraviesa desde abajo el tejido y penetra en una de las lentes del objetivo; estas lentes estn asentadas en una torreta movible localizada arriba del espcimen. Generalmente se cuenta con cuatro lentes objetivos, que proporcionan amplificaciones baja (4x), media (10x), alta (40x) y con aceite (100x). La imagen de las lentes del objetivo se amplifica adicionalmente en un factor de 10 por las lentes del ocular, consiguiendo aumentos totales de 40, 100, 400 y 1,000. Las lentes del ocular enfocan la imagen resultante en la retina del ojo. La imagen proyectada en la retina est invertida de derecha a izquierda y al revs. La calidad de una imagen tambin depende de la resolucin de las lentes, su capacidad para mostrar la separacin de dos objetos. La calidad de una lente depende de la proximidad de su resolucin al lmite terico de 0.25 m, determinado por la longitud de onda de la luz posible.

Interpretacin de cortes microscpicos Los cortes histolgicos, bidimensionales, deben interpretarse como cortes tridimensionales.

Procedimientos avanzados de observacin

Histoqumica Los mtodos histoqumicos y citoqumicos permiten localizar constituyentes qumicos especficos de tejidos y clulas. Estos mtodos aprovechan la actividad enzimtica, reactividad qumica y otros fenmenos fisicoqumicos del elemento en cuestin. Las reacciones de inters se evidencian por la formacin de precipitados coloreados insolubles. Una reaccin histoqumica emplea el cido perydico de Schiff (PAS), que forma un precipitado magenta con molculas ricas en glucgeno y carbohidratos. La histoqumica permite localizar enzimas mostrando el producto de la reaccin enzimtica y no la enzima misma. El reactivo promueve que el producto se precipite en el sitio de reaccin y se reconozca como un depsito metlico o de color.

Inmunocitoqumica La inmunocitoqumica permite ubicar con ms exactitud diferentes enzimas y macromolculas. Para esto debe desarrollarse un anticuerpo contra la molcula a localizar y ste debe marcarse con un colorante fluorescente (fluoroscena o rodamina). Existen dos mtodos de marcado con anticuerpo: directo e indirecto. En el mtodo directo se marca el anticuerpo contra la molcula con un colorante fluorescente. Luego, se hace reaccionar el anticuerpo con la macromolcula y se observa el complejo resultante con un microscopio de fluorescencia. En el mtodo indirecto, ms sensible que el directo, se prepara un anticuerpo marcado con fluorescencia contra el anticuerpo primario para la molcula de inters. Una vez que el anticuerpo primario reacciona con el antgeno, la preparacin se lava para eliminar el anticuerpo no unido; posteriormente se aade el anticuerpo marcado para que reaccione con el complejo antgeno-anticuerpo. Esto forma un complejo secundario visible con microscopa de fluorescencia. La inmunocitoqumica puede emplearse en la microscopa electrnica si se marca el anticuerpo con ferritina, una molcula electrodensa, en lugar de un colorante fluorescente.

Autorradiografa La autorradiografa (radioautografa) permite localizar e investigar una secuencia temporal de fenmenos. El mtodo requiere la incorporacin de un istopo radioactivo, generalmente tritio ( 3H), en el compuesto estudiado. Despus de inyectar el compuesto radiomarcado en un animal se obtienen especmenes de tejido a intervalos de tiempo determinados. El tejido es procesado en la forma usual y se coloca en un portaobjetos que, en lugar de sellarse con un cubreobjetos, se recubre con una delgada capa de emulsin fotogrfica. El tejido se coloca en una caja oscura durante algn tiempo para que las partculas emitidas del istopo radioactivo expongan la emulsin sobre los sitios en los que se localiza el istopo. La emulsin se revela como una fotografa y se dejan grnulos de plata sobre sus porciones expuestas. Posteriormente, el espcimen se sella con un cubreobjetos y se observa con un microscopio de luz. Los grnulos de plata aparecen sobre las regiones que incorporaron el compuesto radiactivo.

Microscopa electrnica
En los microscopios de luz, las lentes enfocan luz visible (un haz de fotones). En los microscopios electrnicos, los electromagnetos enfocan un rayo de electrones. La longitud de onda de un haz de electrones es mucho ms corta que la de la luz visible, por lo que, en teora, los microscopios electrnicos deberan tener un poder de resolucin de 0.005 nm. En la prctica, la resolucin del microscopio electrnico de transmisin (MET) es de ~0.2 nm, y la del microscopio electrnico de barrido (MEB) se aproxima a 10 nm. Los microscopios electrnicos modernos pueden amplificar hasta 150,000 veces un objeto.

Microscopa electrnica de transmisin

Los cortes para microscopa electrnica de transmisin se preparan siguiendo las etapas de la tcnica histolgica para microscopa de luz. No obstante, el poder de resolucin mayor del ME requiere entrecruzamientos proteicos ms finos y especficos, por lo que deben usarse fijadores especiales, como las disoluciones amortiguadas de glutaraldehdo, paraformaldehdo, tetrxido de osmio y permanganato de potasio. Estos fijadores, adems de preservar finos detalles, actan como colorantes electrodensos. La inclusin se realiza en medios como la resina epxica, que permiten obtener cortes ultradelgados, de 25 a 100 nm, que no absorben el haz de electrones. Los haces de electrones salen del ctodo, un filamento de tungsteno, hacia el nodo, una placa metlica con un agujero central. Una carga diferencial de unos 60,000 voltios colocada entre el ctodo y el nodo proporciona a los electrones que atraviesan el agujero del nodo una elevada energa cintica.

El haz de electrones se enfoca en el espcimen mediante electromagnetos, anlogos a las lentes condensadoras. Los metales pesados que tien los tejidos y se precipitan preferencialmente en membranas lipdicas reducen la energa cintica de los electrones que interactan con el tejido. Cuanto ms pesado sea el metal que encuentra un electrn, menos energa ser retenida. Los electrones que atraviesan el espcimen se someten a los campos electromagnticos de varios electromagnetos adicionales, que enfocan el haz en una placa fluorescente. Conforme los electrones chocan con la placa, su energa cintica se convierte en puntos de luz, cuya densidad es directamente proporcional a la energa cintica del electrn. La placa fluorescente te puede sustituirse con una pelcula sensible a electrones, que produce un negativo a partir del cual pueden imprimirse fotomicrografas en blanco y negro.

Microscopa electrnica de barrido

El MEB, empleado para observar la superficie de un espcimen slido, muestra una imagen tridimensional del objeto. El espcimen se prepara de una forma especial que permite depositar en su superficie una capa delgada de un metal pesado, como oro o paladio. Conforme el haz de electrones explora la superficie de la muestra, algunos se reflejan (electrones retrodispersos) y otros se expulsan (electrones secundarios) desde la capa de metal pesado. Los electrones retrodispersos y secundarios son capturados por detectores de electrones y se interpretan y muestran en un monitor como una imagen tridimensional que puede fotografiarse o digitalizarse.

Tcnica de fractura por congelacin (criofractura)

Las estructuras lipdicas se revelan mediante fractura por congelacin (criofractura). Los especmenes congelados son tratados con criopreservadores que evitan el dao mecnico. Conforme la hoja de corte fra choca con el espcimen congelado, se producen fracturas a lo largo de planos de segmentacin, regiones de menor unin molecular. La fractura suele ocurrir entre las hojas interna y externa de la membrana. La cara de la fractura se recubre en un ngulo con platino y carbn evaporados: esto forma acumulaciones de platino slo en un lado de la proyeccin, generando una rplica de la superficie. Posteriormente, el tejido es digerido y la rplica se examina con el MET. Este mtodo permite observar protenas transmembranales.