Imunobiossensores Capacitivos

Tiago Carvalho Monteiro
Licenciado em Biologia Celular e Molecular

Imunobiossensores capacitivos
interdigitais com camadas sensveis micro
e nano-estruturadas

Dissertao para obteno do Grau de Mestre em Biotecnologia

Orientador: Ricardo Franco, Professor Auxiliar, REQUIMTE,
Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de
Lisboa
Co-orientador: Rui Igreja, Professor Auxiliar, CENIMAT,
Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de
Lisboa
Co-orientador: Pedro Sanguino, Investigador em ps-
doutoramento, REQUIMTE, Faculdade de Cincias e
Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa

Jri:

Presidente: Prof. Doutor Pedro Miguel R. Viana Baptista
Arguente: Prof. Doutora Maria Gabriela Machado de Almeida
Vogal: Prof. Doutor Jos Ricardo Ramos Franco Tavares

Novembro de 2013

DIREITOS DE CPIA

iii

Direitos de Cpia

Imunobiossensores capacitivos interdigitais com camadas sensveis micro e nano-estruturadas

Indicao dos direitos de cpia em nome de Tiago Carvalho Monteiro, aluno n. 36454 do Mestrado
em Biotecnologia, da Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, referente
dissertao com o ttulo Imunobiossensores capacitivos interdigitais com camadas sensveis micro e
nano-estruturadas.
A Faculdade de Cincias e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa tm o direito, perptuo e sem
limites geogrficos, de arquivar e publicar esta dissertao atravs de exemplares impressos
reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser
inventado, e de a divulgar atravs de repositrios cientficos e de admitir a sua cpia e distribuio
com objetivos educacionais ou de investigao, no comerciais, desde que seja dado crdito ao autor e
editor.

AGRADECIMENTOS

v

Agradecimentos
Comeo por agradecer ao Professor Doutor Ricardo Franco por me ter acolhido no seu laboratrio e
pela orientao que me deu na realizao deste trabalho.
Um agradecimento ao Professor Doutor Rui Igreja por me ter concedido a oportunidade de
desenvolver parte do meu trabalho no seu laboratrio e igualmente pela orientao dada.
A todos os que me acompanharam no laboratrio 603 (Nanobiotechnology), Isabel Silva, Joo Luz,
Ins Osrio, Leonor Ricardo, Ins Gomes e Carlos Salazar, um muito obrigado por todo o apoio,
esprito, nimo, caf e M&Ms. Sem vocs no teria sido a mesma coisa.
Ao Doutor Pedro Sanguino, um forte agradecimento pelas inmeras horas de trabalho em conjunto e
apoio dado ao longo deste ano.
Aos meus amigos e companheiros de mestrado, Miguel Fernandes, Tiago Dias, Marisa Silva, Cristiana
Morais, Ins Pedras, Duarte Martins, Jos Silva, Toms Calmeiro e Lus Antunes, um obrigado por os
momentos passados nestes dois ltimos anos.
E para os meus amigos e famlia do mundo acadmico, em especial ao Valter Fernandes, Tiago
Pedreira, Andr Gonalves, Aristides Mendes, Tnia Santos e Ricardo Morgado, sai um fortssimo
grito acadmico FRA!
Ao Ncleo de Tiro com Arco, malta da folia, em especial ao Nuno Pombo, Ricardo Rosa, Ana
Rodrigues, Joo Granado, Ricardo Silva, Filipe Martins, Eli Martins, Samuel Incio, Joo Almeida,
Ricardo Mendona, Ricardo Marreiros, Maria Joo, Carolina Mendes, Fernando Oliveira, Ana
Coutinho, Jos Flechas, Duarte Brando, Andr Moleiro, Carolina Meixeiro, Diana Bordalo, um
grande obrigado por todos os momentos de aprendizagem, brincadeira e pelo apoio que me deram.
Agradeo a todos os que me acompanharam ao longo desta viagem pela gloriosa FCT.
Aos meus amigos de longa data, Ricardo Oliveira, Cristiana Serra, Ins Loureno, Ins Santos,
Mariana Arajo, Diane Pereira, Pedro Rodrigues, Pedro Dionsio, Vasco Franco e Rosa Faria, um
abrao daqueles.
Mnica Cavaco, por toda a tua alegria. No sers esquecida.
Aos meus pais, irm e avs, pelo apoio, educao e amor que sempre me deram. No estaria onde
estou sem vocs ao meu lado.
Por fim, um agradecimento especial Cludia Fernandes por me fazer ver sempre o lado positivo e
por nunca me deixar desamparado. Obrigado por todo o teu apoio e companheirismo.
A vs todos, um muito obrigado!

RESUMO

vii

Resumo
No presente trabalho foi desenvolvido um sistema de imunodeteo, baseado num biossensor
capacitivo que integra um par de microeltrodos interdigitais (transdutor). superfcie dos
microelctrodos testaram-se dois tipos de matrizes de suporte diferentes para imobilizao de
anticorpos membrana comercial de Fluoreto de Polivinilideno (PVDF) e camada de nanopartculas
de xido de Zinco (nanobastonetes de ZnO). O objetivo da utilizao destas matrizes especficas foi
maximizar a distribuio dos anticorpos detetores ao longo da regio de interao do campo eltrico
criado pelo transdutor. A abordagem inovadora deste trabalho (maximizar a distribuio dos
anticorpos atravs da utilizao de matrizes de suporte sobre o transdutor) pretende ser uma alternativa
simples e econmica utilizao de nanoeltrodos, mais dispendiosos e de fabrico complexo.
As membranas de PVDF foram alvo de estudo sobre a influncia de um pr-tratamento com lcool na
capacidade de difuso dos antignios na membrana, bem como do processo de bloqueamento da
membrana com Albumina do soro bovino e leite magro em p habitualmente usados em
imunoensaios para aumentar a especificidade de ligao do antignio ao anticorpo. A deposio da
camada de nanobastonetes de ZnO foi realizada durante quatro intervalos de tempo diferentes (1,5, 3,
5 e 7 horas), de forma a selecionar as condies para maior revestimento da rea superficial do
transdutor.
Como modelos representativos das interaes anticorpo/antignio foram utilizados dois sistemas
distintos: anticorpo anti-PfHsp70 e respetivo antignio PfHsp70 (Plasmodium falciparum Heat Shock
Protein 70); anticorpo anti-HRP e respetivo antignio HRP (Peroxidase de Rbano).
Cada sensor foi analisado por Espectroscopia de Impedncia (de 40 Hz a 110 MHz), de forma a
detetar alteraes de capacidade e impedncia resultantes da interao anticorpo/antignio. Os
sensores com membrana de PVDF registaram variaes de capacidade baixas (inferiores a 1 pF), mas
foram capazes na sua maioria de distinguir entre solues sem e com antignio. Nos sensores com
nanobastonetes de ZnO, a presena do antignio HRP produziu um sinal distinto em relao aos
controlos negativos (soluo tampo e antignio no-especfico). Em todos os sensores (com PVDF e
ZnO), a maior variao da capacidade na presena do antignio foi observada entre 1 e 10 kHz,
sugerindo que este intervalo de frequncias ideal para imunodeteo por Espectroscopia de
Impedncia.

Palavras-chave: biossensores capacitivos, microeltrodos interdigitais, Espectroscopia de Impedncia,
membranas de PVDF, nanobastonetes de ZnO, imunodeteo.

ABSTRACT

ix

Abstract
The aim of the present work consisted in developing a system for immunodetection based on a
capacitive biosensor with interdigitated microelectrodes (transducer). Two different types of 3-
dimensional matrixes for the immobilization of antibodies were tested on the microelectrodes surface
Polyvinylidene Fluoride (PVDF) commercial membrane and a layer of Zinc Oxide nanoparticles
(ZnO nanorods). The objective of these matrixes was to maximize the distribution of probes across the
measuring zone probed by the electric field created with the transducer. This new approach of
combining matrixes with microelectrodes in order to maximize the probes distribution aims to be a
simple and economic alternative to the use of more expensive nanoelectrodes with complex
manufacture.
Three technical aspects regarding the PVDF membranes were studied: the influence of the membrane
pretreatment with alcohol on the penetration capability of the antigen solution across the matrix; the
antibody and antigen diffusion across the matrix; the membrane blocking process with bovine serum
Albumin (BSA) and non-fat milk usually used in immunoassays for a more specific binding of
antigen to antibody. The ZnO nanorods layer coating was performed during four different time
windows (1.5, 3, 5 and 7 hours) in order to choose the condition that allowed the best coating area.
Two distinct systems were applied as representative models for the antibody/antigen binding event:
antibody anti-PfHsp70 and its antigen PfHsp70 (Plasmodium falciparum Heat Shock Protein 70);
antibody anti-HRP and its antigen HRP (Horse Radish Peroxidase).
Each sensor was analyzed by Impedance Spectroscopy (from 40 Hz to 110 MHz), in order to detect
changes in capacity or impedance as a direct result of antibody/antigen binding event. The sensors
with PVDF membranes registered small capacity changes (lower than 1 pF), but most of them were
able to distinguish between solutions with and without the antigen. The sensors with ZnO nanorods the
presence of the HRP antigen produced a distinct signal from the negative controls (buffer solution and
non-specific analite). In all the sensors both PVDF and ZnO the major capacity change caused by
the antigens presence was observed between 1 and 10 kHZ, suggesting that this frequency range is
suitable for imunodetection by Impedance Spectroscopy.

Keywords: capacitive biosensors, interdigitated microelectrodes, impedance spectroscopy, PVDF
membranes, ZnO nanorods, immunodetection.

NDICE DE CONTEDOS

xi

ndice de Contedos
Agradecimentos ....................................................................................................................................... v
Resumo .................................................................................................................................................. vii
Abstract .................................................................................................................................................. ix
ndice de Figuras .................................................................................................................................. xiii
ndice de Tabelas ................................................................................................................................. xvii
Lista de Abreviaturas............................................................................................................................ xix
1 Introduo ........................................................................................................................................ 3
1.1 Objetivos do trabalho .............................................................................................................. 3
1.2 Biossensores Conceitos gerais .............................................................................................. 3
1.2.1 Reconhecimento .............................................................................................................. 5
1.2.2 Transduo ...................................................................................................................... 5
1.2.3 Imobilizao .................................................................................................................... 6
1.3 Biossensor capacitivo interdigital............................................................................................ 7
1.3.1 Conceitos gerais .............................................................................................................. 7
1.3.2 Espectroscopia de Impedncia ...................................................................................... 10
1.4 Anticorpos Elemento de biorreconhecimento .................................................................... 12
1.5 Malria .................................................................................................................................. 15
1.5.1 Doena, transmisso e diagnstico ................................................................................ 15
1.5.2 Heat Shock Protein 70 como antignio de P. falciparum ............................................. 19
1.6 O Sensor proposto imunobiossensor capacitivo com microeltrodos interdigitais ............ 20
2 Parte Experimental ........................................................................................................................ 27
2.1 Materiais e reagentes ............................................................................................................. 27
2.2 Procedimentos gerais ............................................................................................................. 27
2.2.1 Sobrexpresso da PfHsp70 em E. coli Rosetta Blue ..................................................... 27
2.2.2 Purificao, concentrao e quantificao da PfHsp70 ................................................. 28
2.2.3 Produo, purificao e concentrao do anticorpo anti-PfHsp70 ................................ 28
2.2.4 Biossensor capacitivo interdigital com membrana comercial de PVDF ....................... 29
2.2.4.1 Eltrodos interdigitais de 50 m com matriz de imobilizao em PVDF (IDC
PVDF
) 29
2.2.4.2 IDC
PVDF
I anti-PfHsp70 imobilizado ...................................................................... 29
2.2.4.3 IDC
PVDF
II PfHsp70 imobilizado ............................................................................ 30
2.2.4.4 IDC
PVDF
III teste com HRP em membrana humedecida ......................................... 30
2.2.4.5 IDC
PVDF
IV teste com HRP (antignio especfico) e PfHsp70 (antignio no
especfico) ................................................................................................................................. 31
2.2.4.6 IDC
PVDF
V fixao da membrana de PVDF com cola epxi .................................. 31
2.2.4.7 Espectroscopia de Impedncia .................................................................................. 32
NDICE DE CONTEDOS

xii

2.2.5 Estudo do suporte de imobilizao em PVDF ............................................................... 33
2.2.5.1 Efeito do pr-tratamento da membrana de PVDF com lcool na penetrao da
soluo com antignio ............................................................................................................... 33
2.2.5.2 Otimizao do processo de bloqueio das membranas de PVDF ............................... 34
2.2.6 Difuso do antignio e anticorpo atravs da membrana de PVDF ................................ 36
2.2.6.1 Difuso de antignio atravs da membrana de PVDF ............................................... 36
2.2.6.2 Difuso de anticorpo atravs da membrana de PVDF ............................................... 36
2.2.7 Biossensor capacitivo interdigital com nanobastonetes de ZnO ................................... 37
2.2.7.1 Deposio de seeds de ZnO sobre os eltrodos interdigitais de 10 m ..................... 37
2.2.7.2 Crescimento de nanobastonetes de ZnO sobre os microeltrodos interdigitais ........ 37
2.2.7.3 Silanizao dos nanobastonetes de ZnO e reticulao do anticorpo anti-HRP ......... 38
2.2.7.4 Teste dos biossensores com HRP (antignio especfico) e PfHsp70 (antignio no
especfico) ................................................................................................................................. 39
2.2.7.5 Espectroscopia de Impedncia .................................................................................. 39
3 Resultados: Apresentao e Discusso .......................................................................................... 43
3.1 Sensor com membrana comercial de PVDF .......................................................................... 43
3.1.1 Teste do sensor na deteo de PfHsp70 e anti-PfHsp70, enquanto analitos, por EI ..... 44
3.1.2 Influncia do pr-tratamento da membrana de PVDF com lcool na penetrao da
soluo de antignio atravs da matriz .......................................................................................... 49
3.1.3 Otimizao do processo de bloqueio da membrana de PVDF ...................................... 53
3.1.4 Difuso do anticorpo e antignio atravs da membrana de PVDF ................................ 58
3.1.5 Deteo do analito especfico HRP ............................................................................... 61
3.1.6 Fixao da membrana de PVDF sobre o transdutor, mediada por um filme de cola
epxi ....................................................................................................................................... 62
3.2 Sensor com nanobastonetes de ZnO ...................................................................................... 64
3.2.1 Deposio e caraterizao dos nanobastonetes de ZnO superfcie do transdutor ....... 64
3.2.2 Deteo do antignio HRP ............................................................................................ 66
4 Concluses e Perspetivas Futuras .................................................................................................. 73
5 Referncias Bibliogrficas ............................................................................................................ 79
6 Anexos ........................................................................................................................................... 85
6.1 Anexo I Variao da capacidade e impedncia para o sensor IDC
PVDF
II .......................... 85
6.2 Anexo II Composio elementar da membrana de PVDF tratada com tampo PBST....... 86
6.3 Anexo III Confirmao da presena do antignio HRP na membrana do sensor IDC
PVDF
IV
............................................................................................................................................... 87
6.4 AnexoIV Determinao da espessura do filme fino de cola epxi ..................................... 87
6.5 Anexo V Sntese de nanobastonetes de ZnO sobre o transdutor realizada a quatro
intervalos de tempo diferentes ........................................................................................................... 88
NDICE DE FIGURAS

xiii

ndice de Figuras
Figura 1.1 Esquema geral de um biossensor. O analito (losango vermelho) reconhecido pelo
biorrecetor (Y verde). Interao resultante transformada num sinal eltrico pelo transdutor e
registado pelo sistema digital de aquisio de dados. ............................................................................. 4
Figura 1.2 (a) Esquema geral de um biossensor capacitivo interdigital e (b) representao da
configurao interdigital dos eltrodos. .................................................................................................. 8
Figura 1.3 Condensador de placas paralelas constitudo por duas placas de um metal condutor
separadas por um meio dieltrico (no condutor). .................................................................................. 9
Figura 1.4 (a) Onda sinusoidal da tenso (V) e corrente (I) em funo do tempo (t), com desvio de
fase u. (b) Grfico Nyquist onde est expresso o mdulo da impedncia |Z|, o ngulo desvio de fase u
e a componente real (eixo das abcissas) e imaginria (eixo das ordenadas) da impedncia. Figura
adaptada
17
. ............................................................................................................................................. 11
Figura 1.5 Estrutura geral de um anticorpo. Figura adaptada
18
. ......................................................... 13
Figura 1.6 Regies variveis e hipervariveis do anticorpo. Figura adaptada
18
. ................................ 14
Figura 1.7 Ciclo de vida do protozorio Plasmodium sp. .................................................................. 16
Figura 1.8 Esquema geral de um RDT. I a amostra biolgica que contm o antignio (A)
colocada em contato com a tira de nitrocelulose (D). II ligao do antignio ao anticorpo conjugado
com nanopartculas de Ouro, formando um complexo. III os complexos difundem pela tira de
nitrocelulose e so capturados pelos anticorpos imobilizados na linha de teste (B); os anticorpos
conjugados que no ligaram antignio difundem pela tira de nitrocelulose e so capturados na linha de
controlo (C). Esquema no est escala. .............................................................................................. 18
Figura 1.9 Biossensores capacitivos interdigitais (IDC): a) IDC com membrana de PVDF comercial
colada sobre os microeltrodos interdigitais (50 m) de Ouro; b) IDC com nanobastonetes de ZnO
sintetizados superfcie dos microeltrodos interdigitais (10 m) de Ouro (ampliao dos
nanobastonetes obtida por SEM). .......................................................................................................... 21
Figura 1.10 Estrutura qumica do Fluoreto de Polivinilideno (PVDF). ............................................. 22
Figura 1.11 Imobilizao do anticorpo anti-HRP sobre nanobastonetes (nanorods) de ZnO por
reticulao: a) silanizao dos nanobastonetes com MPTMS; b) ligao do anticorpo ao Sulfo-SMB;
c) imobilizao do anticorpo sobre o nanorod atravs da ligao entre o MPTS e o Sulfo-SMB.
Esquema no est escala. .................................................................................................................... 23
Figura 1.12 Esquema da reao de oxidao do substrato cromogneo ABTS, catalisada pela enzima
HRP. A oxidao do substrato concomitante com um aumento da tonalidade verde da soluo. ..... 24
Figura 2.1 (a) Analisador de Impedncia 4294A e (b) cmara de vcuo. .......................................... 33
Figura 2.2 Contacto entre pontas de medio e eltrodos do biossensor capacitivo interdigital no
interior da cmara de vcuo. .................................................................................................................. 33
Figura 2.3 Reator de sntese de nanobastonetes de ZnO com controlo de temperatura e agitao. ... 38
NDICE DE FIGURAS

xiv

Figura 3.1 Corte transversal da membrana comercial de PVDF. Imagem SEM realizada no Centro de
Investigao de Materiais da Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa
(CENIMAT, FCT-UNL). ...................................................................................................................... 43
Figura 3.2 Variao da capacidade (a) e impedncia (b) em funo da frequncia no sensor com
anticorpo anti-PfHsp70 (33 g/mL) imobilizado na membrana de PVDF, em duas condies: teste
sem antignio aplicao de tampo PBST; teste com antignio aplicao de PfHsp70 em tampo
PBST (31 g/mL). ................................................................................................................................. 44
PBST (62 g/mL). ................................................................................................................................. 46
PBST (93 g/mL). ................................................................................................................................. 46
Figura 3.5 Comparao da variao de capacidade do IDC
PVDF
I, no teste com antignio, para as
concentraes de 33, 66 e 100 g/mL de anticorpo anti-PfHsp70 imobilizado na membrana de PVDF.
............................................................................................................................................................... 47
PVDF
II, no teste com anticorpo, para as
concentraes de 33, 66 e 100 g/mL de antignio PfHsp70 imobilizado na membrana de PVDF. .... 48
Figura 3.7 Influncia do tratamento prvio da membrana de PVDF na capacidade de penetrao da
soluo de antignio: PVDF seco membrana seca (carter hidrofbico); PVDF hidratado
membrana tratada previamente com Isopropanol 50% (v/v) e hidratada (carter hidroflico). ............. 50
anticorpo anti-HRP (100 g/mL) imobilizado na membrana de PVDF, em duas condies: teste sem
antignio aplicao de tampo PBST; teste com antignio aplicao de HRP em tampo PBST (59
g/mL). .................................................................................................................................................. 51
Figura 3.9 Capacidade nominal de dois sensores IDC
PVDF
(A e B) para as frequncias 1 kHz (), 10
kHz (), 100 kHz () e 1000 kHz (), ao longo de 6 adies de tampo PBST (100 L) sobre a
membrana de PVDF sem anticorpo. Entre cada adio de soluo as membranas dos sensores foram
reidratadas. A adio 0 representa a capacidade inicial do sensor. ....................................................... 52
Figura 3.10 Otimizao do processo de bloqueio das membranas de PVDF com BSA. Ensaio A
bloqueio com 100 L de BSA 0,2% (p/v) durante 1 hora (a). Ensaio B bloqueio com 100 L de BSA
0,2% (p/v) durante 16 horas (b). Ensaio C bloqueio com soluo de BSA 5% (p/v) durante 1 hora (c).
A membrana de PVDF sem antignio e a membrana de PVDF apenas com antignio constituem o
NDICE DE FIGURAS

xv

controlo negativo e positivo, respetivamente. Cada membrana de PVDF foi produzida em duplicado.
............................................................................................................................................................... 54
Figura 3.11 Otimizao do processo de bloqueio das membranas de PVDF com leite em p. Ensaio
D bloqueio com soluo de leite em p 5% (p/v) durante 1 hora (a). Ensaio E bloqueio com
soluo de leite em p 5% (p/v) durante 1 hora e aumento da concentrao de anticorpo imobilizado
para 200 g/mL (b). A membrana de PVDF sem antignio e a membrana de PVDF apenas com
antignio constituem o controlo negativo e positivo, respetivamente. Cada membrana de PVDF foi
produzida em duplicado. ....................................................................................................................... 57
Figura 3.12 Determinao da distribuio do anticorpo atravs da membrana de PVDF aps o
processo de imobilizao. Membrana de referncia () fluorescncia de fundo da membrana de
PVDF. Membrana tratada com anticorpo () fluorescncia emitida pelo fluorforo FITC conjugado
com o anticorpo anti-IgG de rato. ......................................................................................................... 59
Figura 3.13 Difuso do antignio HRP atravs da membrana de PVDF com anticorpo anti-HRP
imobilizado e bloqueada com leite em p 5% (p/v). Uma segunda membrana de PVDF, no tratada,
foi colocada sob a membrana com anticorpo, de forma a captar o antignio que atravessasse
completamente a membrana superior. ................................................................................................... 60
PVDF
IV, para membranas com o
anticorpo anti-HRP testadas na ausncia de antignio (tampo PBST), na presena de antignio HRP
(antignio especfico) e teste com PfHsp70 (antignio no especfico). O anticorpo anti-HRP (200
g/mL, 100 L) foi imobilizado nas membranas, com bloqueio posterior com leite em p 5% (p/v).
Sobre os respetivos sensores foram aplicados 100 L de soluo de HRP (117 g/mL) ou de PfHsp70
(187 g/mL). ......................................................................................................................................... 61
PVDF
V, para o teste sem antignio
(tampo PBST), teste com antignio HRP (analito especfico) e teste com PfHsp70 (analito no
especfico). No fabrico do sensor foi utilizada cola epxi para fixar a membrana sobre os
microeltrodos. Anticorpo anti-HRP (200 g/mL, 100 L) foi imobilizado nas membranas, com
bloqueio posterior com leite em p 5% (p/v). Sobre os respetivos sensores foram aplicados 100 L de
soluo de HRP (117 g/mL) e PfHsp70 (187 g/mL). ....................................................................... 63
Figura 3.16 Caraterizao dos nanobastonetes de ZnO sintetizados superfcie do transdutor.
Imagem SEM realizada no Centro de Investigao de Materiais da Faculdade de Cincias e
Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (CENIMAT, FCT-UNL). .............................................. 66
Figura 3.17 Avaliao da estabilidade dos nanobastonetes de ZnO aps contato com a soluo de
tampo PBS. O transdutor com nanobastonetes foi lavado duas vezes com tampo PBS. As
nanoestruturas permaneceram intactas aps o contato com o tampo, como se pode observar nas
regies circuladas a vermelho. .............................................................................................................. 66
NDICE DE FIGURAS

xvi

Figura 3.18 Comparao da componente real (Z
Re
) e imaginria (Z
Im
) da impedncia para cada passo
da construo e teste dos trs sensores: a) sensor testado com tampo PBS; b) sensor testado com
soluo de PfHsp70 (analito no especfico); c) sensor testado com antignio HRP (analito especfico).
............................................................................................................................................................... 67
Figura 3.19 (a) Comparao da variao da capacidade do sensor IDC
ZnO
para as solues de tampo
PBS, PfHsp70 (analito no especfico) e antignio HRP (analito especfico). (b) Confirmao da
presena do antignio HRP no sensor atravs da oxidao do substrato ABTS. Apenas a soluo em
contato com o sensor com HRP sofreu alterao de cor, confirmando a presena do antignio. ......... 69
antignio PfHsp70 (33 g/mL) imobilizado na membrana de PVDF, em duas condies: teste sem
anticorpo aplicao de tampo PBST; teste com anticorpo aplicao de anti-PfHsp70 em tampo
PBST (141 g/mL). ............................................................................................................................... 85
PBST (283 g/mL). ............................................................................................................................... 85
PBST (429 g/mL). ............................................................................................................................... 86
Figura 6.4 Confirmao da presena do antignio HRP na membrana do sensor IDC
PVDF
IV: (a)
sensor com HRP presente na membrana, confirmado pela alterao de cor da soluo de ABTS; (b)
controlo negativo onde no se observa alterao de cor da soluo de ABTS (sensor com PfHsp70). 87
Figura 6.5 Determinao da espessura do filme fino de cola epxi entre o substrato de vidro e a
membrana de PVDF. A membrana de PVDF (120 m); B filme fino de cola epxi (50 m); C
substrato de vidro (1 mm). .................................................................................................................... 87
Figura 6.6 Sntese de nanobastonetes de ZnO sobre o transdutor realizada em quatro intervalos de
tempo diferentes: (a) 1,5 horas; (b) 3 horas; (c) 5 horas; (d) 7 horas. ................................................... 88

NDICE DE TABELAS

xvii

ndice de Tabelas
Tabela 1.1 Resumo das dificuldades apresentadas pelos mtodos atuais convencionais para
diagnstico de malria
26
. ....................................................................................................................... 19
Tabela 2.1 Condies de imobilizao do anticorpo, bloqueio e lavagens das membranas de PVDF
nos ensaios de otimizao do processo de bloqueio. ............................................................................. 35
Tabela 3 Composio elementar de uma seo de membrana de PVDF tratada com tampo PBST. A
percentagem de cada elemento foi determinada por Espectroscopia de Energia Dispersiva. ............... 86

LISTA DE ABREVIATURAS

xix

Lista de Abreviaturas
ABTS 2,2-Azina-bis(3-Etilbenzotiazolina-6-cido Sulfnico)
Anti-HRP anticorpo policlonal anti-Peroxidase de Rbano
Anti-PfHsp70 anticorpo monoclonal anti-Hsp70 de Plasmodium falciparum
BSA Albumina do soro bovino
C Capacidade
HRP Peroxidase de Rbano
I(t) Corrente
IDC Sensor capacitivo interdigital
IDC
PVDF
Sensor capacitivo interdigital com membrana de PVDF
IDC
ZnO
Sensor capacitivo interdigital com nanobastonetes de ZnO
PBS Tampo Fosfato salino
PBST Tampo Fosfato salino com Tween-20
PCR Polimerase Chain Reaction
PfHsp70 Heat Shock Protein 70 de Plasmodium falciparum
PVDF Fluoreto de Polivinilideno
Q Carga
RDTs Rapid diagnostic tests
V(t) Tenso
Z Impedncia
Z
Im
Componente imaginria da impedncia
ZnO xido de Zinco
Z
Re
Componente real da impedncia

CAPTULO 1 INTRODUO

INTRODUO
3

1 Introduo
1.1 Objetivos do trabalho
O objetivo principal deste trabalho consistiu no desenvolvimento de um sistema de imunodeteo,
baseado num biossensor capacitivo que integra um transdutor com um par de microeltrodos
interdigitais. Como modelos representativos das interaes anticorpo/antignio foram utilizados: a)
anticorpo monoclonal anti-PfHsp70 e o respetivo antignio PfHsp70 (marcador molecular de
Plasmodium falciparum (Pf), agente etiolgico da malria); b) anticorpo policlonal anti-Peroxidase de
Rbano (HRP) e o respetivo antignio HRP. De forma a maximizar a distribuio das biomolculas ao
longo da zona de interao do campo eltrico criado pelo transdutor, foram analisadas duas
alternativas de matriz de suporte imobilizao (camada sensvel): a) membrana comercial
Immobilon-P de Fluoreto de Polivinilideno (PVDF) colada sobre o transdutor; b) camada de
nanopartculas de xido de Zinco sintetizada superfcie do transdutor.
A membrana de PVDF foi alvo de estudo sobre o efeito do pr-tratamento com lcool na penetrao
das solues atravs da matriz, sobre a capacidade de difuso das biomolculas, bem como do
processo de bloqueio. Para a camada de nanopartculas de xido de Zinco estudou-se o tempo de
sntese (1,5, 3, 5 e 7 horas), de forma a selecionar a condio que produzisse a melhor camada
superfcie do transdutor.
Cada sensor foi caraterizado por Espectroscopia de Impedncia num intervalo de frequncia de 40 Hz
a 110 MHz, de forma a detetar alteraes na capacidade e impedncia do sistema resultantes das
interaes anticorpo/antignio.

1.2 Biossensores Conceitos gerais
A criao do conceito de um biossensor data de 1962 e foi atribuda a Leland C. Clark Jr. O
dispositivo proposto por Clark consistia num eltrodo de Oxignio com uma membrana interior
semipermevel a Oxignio e uma membrana de dilise acoplada, contendo a enzima Oxidase da
Glucose. O aparelho era capaz de determinar a concentrao de Glucose presente numa amostra,
atravs da diminuio proporcional da concentrao de Oxignio medida durante a oxidao da |-D-
Glucose
1,2
.
O sensor de glucose construdo por Clark foi a base de inmeras variaes de sensores posteriores. Em
1975 foi lanado comercialmente o primeiro sensor de Glucose amperomtrico, baseado no modelo de
Clark, cujo alvo de deteo era o Perxido de Hidrognio formado aps oxidao da |-D-Glucose
1,2
.
INTRODUO
4

Um biossensor descrito como um aparelho analtico que integra um elemento biolgico e um
elemento transdutor fsico-qumico e que produz um sinal eltrico proporcional presena e/ou
concentrao de um ou mltiplos analitos existentes numa amostra
1,35
. portanto um dispositivo
capaz de detetar analitos recorrendo a interaes mediadas pelo elemento biolgico, convertendo a sua
presena num sinal eltrico mensurvel e quantificvel. Em termos de vantagens que o caracterizem,
um biossensor deve ser um dispositivo de fcil utilizao, autnomo, pouco dispendioso (geralmente
biossensores comerciais), rpido a fornecer informao, robusto, sensvel e preciso, que necessita de
um pequeno volume de amostra e que, na maioria das vezes, pode ser reutilizvel
4,5
. Desde a sua
gnese, os biossensores tm tido grande aplicao nos campos da medicina, controlo de processos
farmacolgicos, segurana alimentar e monitorizao ambiental
4,6
.
Um sistema completo de medida com um biossensor integra normalmente trs componentes
principais: um elemento biolgico (biorrecetor), um elemento transdutor e um sistema de aquisio de
dados
14
. O biossensor pode ainda ter associado um componente de preparao da amostra, tal como
um sistema de filtrao composto por membranas (ex.: sensor de Glucose moderno)
2,5
. O biorrecetor
responsvel pela deteo do analito, pode ser constitudo por uma variedade de agentes biolgicos, tais
como, microrganismos, protenas, cidos nucleicos, ou por agentes que mimetizam propriedades
biolgicas de catlise ou afinidade (ex.: molculas sintticas)
1,4
. Da interao entre o biorrecetor e o
analito resulta uma modificao fsico-qumica do meio (ex.: aumento de massa, alterao de cor,
alterao de potencial, variao de temperatura) que medida e transformada pelo transdutor num
sinal eltrico
13
. Por ltimo, o sinal eltrico produzido convertido e apresentado pelo sistema de
aquisio de dados num formato capaz de ser analisado e interpretado
2,3
. Na Figura 1.1 encontra-se um
esquema geral de um biossensor.

Figura 1.1 Esquema geral de um biossensor. O analito (losango vermelho) reconhecido pelo biorrecetor (Y
verde). Interao resultante transformada num sinal eltrico pelo transdutor e registado pelo sistema digital de
aquisio de dados.

INTRODUO
5

1.2.1 Reconhecimento
O elemento biolgico responsvel pela especificidade e sensibilidade do biossensor
5
. A escolha do
biorrecetor deve ter em conta o analito a detetar, bem como a sua concentrao, a natureza da amostra
(ex.: gota de sangue, gs, tecido) e o tipo de medio a efetuar
1
. Consoante a natureza do elemento
biolgico incorporado, os biossensores podem ser classificados em dois grupos
catalticos/metablicos ou de afinidade
3
.
Os biossensores catalticos tm como elementos biolgicos enzimas, organelos, tecidos e
microrganismos e servem-se dos produtos gerados durante a atividade metablica (metabolitos ou
calor), quando na presena da molcula-alvo, como intermedirios no processo de deteco
3
. O sinal
produzido proporcional concentrao dos produtos formados ou ao calor libertado, durante a
atividade metablica.
No caso dos biossensores de afinidade a deteo feita atravs da ligao especfica do analito ao
elemento biolgico, sem produo de metabolitos. Estes sensores baseiam-se na afinidade entre
anticorpo-antignio, hibridao entre cadeias de DNA complementares e recetores celulares (ex.:
afinidade entre neurorrecetores e neurotransmissores)
3
. Neste tipo de biossensor, as interaes no-
especficas devem ser minimizadas tanto quanto possvel de forma a garantir que o sinal produzido
seja exclusivamente proporcional ligao dos analitos s biomolculas imobilizadas no sensor
3
.

1.2.2 Transduo
O transdutor o elemento do biossensor responsvel pela transformao do sinal biolgico num sinal
eltrico, que por sua vez pode ser amplificado, medido, registado e analisado. A escolha do tipo de
elemento transdutor integrado no dispositivo deve ter em conta a natureza do sinal biolgico e o tipo
de medio que se pretende efetuar (por exemplo, utilizao de um sistema de eltrodos para medir a
alterao de potencial resultante da oxidao ou reduo de um substrato enzimtico)
13
. O biossensor
tambm pode ser classificado de acordo com o tipo de transdutor aplicado:
- Calorimtrico mede variaes de calor provocadas por reaes exotrmicas desencadeadas
pela interao entre o elemento biolgico e o analito. A variao da entalpia do sistema
proporcional concentrao do analito presente
3
.
- tico mede a alterao de propriedades (ex.: amplitude, energia, polarizao, fase) da luz
emitida pelo dispositivo, resultante da interao entre o biorrecetor e o analito. O princpio de
deteo pode basear-se em colorimetria (alterao de cor da amostra), interferometria
(diferena de fase entre ondas que atravessam a amostra), luminescncia e fluorescncia. Os
INTRODUO
6

transdutores ticos oferecem inmeras possibilidades de biossensores, uma vez que podem ser
usados virtualmente em todos os tipos de espectroscopia tica
3,5,7
.
- Baseado em massa mede pequenas alteraes de massa utilizando transdutores
piezoeltricos de onda acstica. O elemento transdutor ressoa a uma determinada frequncia
por aplicao de um sinal eltrico. Quando o elemento biolgico localizado superfcie do
transdutor se liga ao analito, ocorre um aumento da massa do sistema, resultando numa
diminuio proporcional da frequncia de ressonncia
3,7
.
- Eletroqumico mede o sinal eletroqumico produzido pela interao bioqumica do elemento
biolgico e analito. A reao bioqumica resultante produz ou consome espcies eletroativas
(ies ou eletres), alterando as propriedades eletroqumicas da amostra que so detetadas pelo
biossensor. Consoante a propriedade analisada, o sensor pode ser classificado como
potenciomtrico (deteta alterao do potencial da amostra), amperomtrico (mede a corrente
gerada entre dois eltrodos por determinado potencial), condutimtrico ou impedimtrico
(mede alteraes de condutividade ou de impedncia eltrica da amostra, respetivamente)
3,6
.

1.2.3 Imobilizao
Para que o biossensor se mantenha funcional durante o seu tempo de vida necessrio que o elemento
biolgico esteja protegido e ligado de forma eficaz ao dispositivo. Devido sua natureza, o biorrecetor
um elemento frgil, suscetvel de degradao ou inativao causadas por alteraes de pH,
temperatura ou pela presena de outras espcies reativas
1
. A imobilizao do elemento biolgico numa
matriz estvel pode prolongar o tempo de vida operacional e aumentar a termoestabilidade do
biorrecetor
8
.
A escolha do suporte de imobilizao deve ser feita tendo em conta a natureza do elemento biolgico,
o tipo de medio a realizar, as condies do meio em que o dispositivo ser utilizado e ainda a
natureza da amostra.
Os processos de imobilizao de biomolculas em suportes so variados, mas podem dividir-se
geralmente em mtodos fsicos e qumicos. Os mtodos fsicos (ex.: adsoro, encapsulao,
imobilizao em matrizes) so simples, mas a interao entre o suporte e a biomolcula fraca,
podendo resultar na perda do elemento biolgico. Os mtodos qumicos so mais complexos,
requerendo muitas vezes o uso de solventes adicionais. No entanto, em comparao com os mtodos
fsicos, a fora da interao entre o biorrecetor e o suporte superior, tratando-se muitas vezes de
ligaes covalentes (ex.: reticulao ou cross-linking)
8
. Os processos de imobilizao mais utilizados
na construo de biossensores so
6
:
INTRODUO
7

- Adsoro fsica a ligao das biomolculas superfcie do sensor resulta da combinao de
foras Van der Waals, hidrofbicas, inicas e pontes de hidrognio. O mtodo bastante
simples, no entanto, as biomolculas no esto ligadas fortemente ao sensor, podendo libertar-
se com alguma facilidade.
- Imobilizao covalente sobre a superfcie a superfcie do sensor modificada de forma a
apresentar grupos funcionais onde as biomolculas se podem ligar. O mtodo produz uma
distribuio e densidade homognea das biomolculas, bem como uma maior
reprodutibilidade e homogeneidade da superfcie do sensor. Pode tambm reduzir ou at
mesmo eliminar situaes de instabilidade, difuso ou agregao das biomolculas.
- Imobilizao dentro de matrizes as biomolculas so imobilizadas no interior de matrizes
porosas polimricas, geralmente de poliacrilamida, amido, alginato, slica gel, cloreto polivinil,
acetato de celulose. Este mtodo apresenta a desvantagem de as biomolculas poderem
escapar da membrana durante a utilizao do sensor, diminuindo a sensibilidade.
- Reticulao entre molculas consiste na ligao intermolecular por reticulao de
biomolculas com reagentes bi ou multifuncionais. Este mtodo cria vrias camadas de
material que podem diminuir a atividade dos elementos biolgicos, bem como dificultar os
processos de difuso, podendo representar um entrave ao bom funcionamento do sensor.
- Encapsulao as biomolculas so revestidas por uma membrana, formando uma matriz de
encapsulao porosa, que facilita o processo de ligao ao sensor. A matriz protege o material
biolgico das condies fisiolgicas externas. No entanto, o mtodo apresenta limitaes em
termos difusionais para o interior da matriz e na reprodutibilidade em termos da dimenso da
cpsula.
Como suportes de imobilizao tm sido utilizados suportes slidos, membranas de dilise, lipossomas,
fibras ocas, microcpsulas, gis, superfcies automontveis, matrizes de Slica-gel, materiais
polimricos (ex.: Quitosano) e nanomateriais
810
.

1.3 Biossensor capacitivo interdigital
1.3.1 Conceitos gerais
O biossensor capacitivo interdigital consiste num dispositivo que integra um elemento biolgico
imobilizado sobre um sistema de dois eltrodos planares. O dispositivo mede alteraes nas
propriedades dieltricas do meio (junto superfcie dos eltrodos) como resultado da interao entre o
biorrecetor e o analito
1113
.
INTRODUO
8

Um biossensor capacitivo interdigital comum composto por um substrato (suporte) inerte (no
condutor), uma camada sensvel (finita), resultante da imobilizao de um elemento de
reconhecimento biolgico superfcie do transdutor, e uma camada de ar (infinita)
13
. superfcie do
substrato (geralmente um suporte de vidro) so depositados os eltrodos (realizados com metais
condutores, constitudos geralmente por Paldio, Titnio, Platina ou Ouro) numa configurao planar
que se assemelha a dedos entremeados, da qual resulta a designao interdigital. Esta configurao
permite um espaamento muito prximo entre dois dedos adjacentes, sendo o espao vazio entre
eles preenchido por um material dieltrico (no condutor)
11,12
. Na Figura 1.2 est representado um
esquema geral de um biossensor capacitivo interdigital.

Figura 1.2 (a) Esquema geral de um biossensor capacitivo interdigital e (b) representao da configurao
interdigital dos eltrodos.

O elemento de reconhecimento biolgico imobilizado sobre o material dieltrico ou diretamente
neste. Quando ocorre uma alterao no material dieltrico, resultante de uma reao bioqumica ou de
um fenmeno de ligao entre biorrecetor e analito (ex.: complementaridade entre cadeias de cidos
nucleicos, interaes anticorpo/antignio, neurorrecetor/neurotransmissor), as propriedades dieltricas
do meio entre os eltrodos variam, provocando uma alterao da capacidade do sistema
11
. A
capacidade definida como a aptido do sistema para armazenar carga eltrica. Na sua forma mais
simples a capacidade descrita como o quociente entre a carga (Q) armazenada sobre a tenso (V)
aplicada (ver Equao 1). O dispositivo que possui capacidade um condensador e consiste em duas
placas de metais condutores separadas por um meio isolante (dieltrico). Desta forma, os biossensores
capacitivos interdigitais comportam-se como um condensador de placas paralelas (ver Figura 1.3)
11,14
.
A capacidade de um condensador de placas paralelas dada pela Equao 2
11
.

(1)
(a) (b)
INTRODUO
9

Figura 1.3 Condensador de placas paralelas constitudo por duas placas de um metal condutor separadas por
um meio dieltrico (no condutor).

(2)

onde c a constante dieltrica do meio entre as placas, c
0
a permitividade do vcuo (8,85419 pF/m),
A e d so a rea das placas e distncia entre elas, respetivamente.

Em meados da dcada de 80 foi publicado o primeiro artigo referente a um sensor de afinidade com
um transdutor capacitivo. A medio era feita em meio lquido e o princpio de deteo consistia em
observar alteraes nas propriedades dieltricas, distribuio de carga e conformacionais resultantes da
formao do complexo anticorpo/antignio superfcie de um microeltrodo interdigital
11,15
. Apesar
da inovao, os primeiros sensores capacitivos interdigitais apresentavam uma grande lacuna, pois as
variaes das propriedades dieltricas registadas eram pequenas
15
. O problema residia no facto de a
regio de distribuio do campo eltrico (ordem dos m) ser muito superior camada sensitiva criada
pela imobilizao do biorrecetor superfcie do eltrodo (1 a 100 nm no caso de protenas
imobilizadas; at 200 nm no caso de cadeias de cidos nucleicos). A camada sensvel representava
uma pequena frao do sinal captado pelo campo eltrico, sendo que a maioria do sinal era composto
por rudo provocado pela movimentao de cargas provenientes da soluo, mascarando assim as
interaes que ocorriam diretamente superfcie do microeltrodo
11
. Uma forma de resolver este
problema consiste no desenvolvimento de eltrodos interdigitais nanoescala. Neste tipo de eltrodos,
a regio de distribuio do campo eltrico (ordem dos nm) reduzida para cobrir quase
exclusivamente a camada sensvel superfcie do eltrodo, minimizando a influncia do rudo de
fundo provocado pela soluo. Como consequncia, os biossensores capacitivos interdigitais
constitudos por nanoeltrodos apresentam maior sensibilidade face aos sensores com microeltrodos
15
.
INTRODUO
10

Os biossensores capacitivos interdigitais tm atrado ateno na rea da qumica eletroanaltica nos
ltimos anos devido s suas caractersticas e vantagens em termos de aplicaes prticas
11,12,16
:
a) O mtodo de deteo no requer a utilizao de sondas marcadas, como por exemplo, cadeias
de oligonucletidos marcadas com fluorforo, sendo suficientemente sensvel para detetar
alteraes conformacionais resultantes da interao entre o elemento de reconhecimento e o
analito. Os sensores apresentam-se como um sistema de fcil utilizao capaz de efetuar
medies diretas.
b) A configurao interdigital planar aplicada resulta numa maior rea superficial dos eltrodos,
bem como numa camada sensorial maior. Esta geometria permite, portanto, uma maior
sensibilidade para alteraes que ocorram superfcie dos eltrodos quando comparado com o
modelo convencional de deteo de variaes superfcie de um nico eltrodo de trabalho.
c) A escala reduzida dos eltrodos interdigitais (200 nm a 50 m) permite maior portabilidade
em comparao com os eltrodos convencionais e a utilizao de pequenos volumes de
reagentes e amostra.
d) A configurao interdigital dos eltrodos apresenta uma vantagem adicional face ao modelo
da clula eletroqumica convencional (trs eltrodos: referncia, trabalho e secundrio), uma
vez que no necessita de um terceiro eltrodo.

1.3.2 Espectroscopia de Impedncia
A Espectroscopia de Impedncia (EI) um mtodo de anlise que caracteriza a impedncia de um
sistema, sendo sensvel a fenmenos de superfcie e de alteraes das propriedades dieltricas do meio.
Por estas razes, a EI uma tcnica muito interessante na rea dos biossensores como mtodo de
deteo da ligao entre o elemento de reconhecimento biolgico do sensor e o analito
12,17
.
A impedncia de um sistema determinada atravs do registo da corrente em resposta aplicao de
uma tenso sinusoidal de baixa amplitude (geralmente 5-250 mV). Com esta relao, a impedncia (Z)
pode ser definida como o quociente entre a tenso aplicada (V) e a corrente gerada (I) em funo do
tempo (t)
11,12,17
:

(3)

(4)
INTRODUO
11

(5)

A impedncia um valor complexo, uma vez que a tenso e a corrente podem variar tanto em
amplitude como em fase. A impedncia pode ser expressa pelo seu mdulo (|Z|) e ngulo do desvio de
fase (u) ou pela sua parte imaginria (Z
Im
) e parte real (Z
Re
) (ver Figura 1.4)
11,12
:

(6)

(7)

(8)

(9)

onde f a frequncia (Hz); u o ngulo do desvio de fase () entre a tenso V(t) (V) e a corrente I(t)
(A); |Z|, Z
Re
e Z
Im
so respetivamente o mdulo, componente real e componente imaginria da
impedncia (O); C a capacidade (F); tano a tangente de perdas.

Figura 1.4 (a) Onda sinusoidal da tenso (V) e corrente (I) em funo do tempo (t), com desvio de fase u. (b)
Grfico Nyquist onde est expresso o mdulo da impedncia |Z|, o ngulo desvio de fase u e a componente real
(eixo das abcissas) e imaginria (eixo das ordenadas) da impedncia. Figura adaptada
17
.
(a)
(b)
INTRODUO
12

Uma caracterstica importante da EI e da qual resulta a sua classificao de mtodo de espectroscopia
que permite obter informao sobre a impedncia do sistema num largo espectro de frequncias
(desde Hz at MHz), uma vez que a tenso e a corrente so dependentes da frequncia, como se pode
verificar nas Equaes 4 e 5. Esta caracterstica uma vantagem quando o sistema em estudo no
conhecido e permite a caracterizao de superfcies, camadas, membranas e de sistemas de troca e
difuso de analitos
11,17
.
Para se obter uma correta caraterizao da impedncia do sistema em estudo necessrio observar as
seguintes condies
12
:
- A resposta do sistema deve estar relacionada exclusivamente com o sinal de perturbao
aplicado, sendo para isso necessrio assegurar que os estmulos externos (ex.: flutuaes de
temperatura e humidade) se mantm constantes, no influenciando a medida.
- O sistema deve reagir linearmente com o sinal de perturbao, pelo que a impedncia deve ser
independente da amplitude da tenso aplicada.
- O sistema deve permanecer estvel durante a realizao da medio e no deve sofrer
alteraes provocadas pela aplicao da perturbao.
- A impedncia deve ser uma funo contnua e finita no intervalo de frequncia aplicado na
medio.
Para alm da caraterizao do sistema, a EI permite recolher informao com fins analticos. Quando
ocorre uma alterao no sistema provocada pela presena do analito, os elementos constituintes da
impedncia (capacidade ou resistncia) variam. A variao total da impedncia pode ento ser
correlacionada com uma alterao de concentrao no meio ou com um evento de ligao entre um
biorrecetor e o respetivo analito. Pode ainda efetuar-se uma medida mais simples, por determinao da
impedncia num pequeno intervalo de frequncias ou apenas numa frequncia especfica onde as
alteraes forem mais acentuadas
12,15
.

1.4 Anticorpos Elemento de biorreconhecimento
Os anticorpos so glicoprotenas produzidas por clulas B do sistema imunitrio, caracterstico dos
animais vertebrados. Os anticorpos so responsveis pela deteo e inativao de agentes invasores
externos (patognicos) ao organismo, desencadeando uma resposta imunitria. Coletivamente
designam-se por imunoglobulinas (Ig) e representam cerca de 20% das protenas totais presente no
plasma. Os agentes patognicos (ex.: macromolculas, vrus, bactrias, eucariontes unicelulares) que
desencadeiam uma resposta imunitria, tendo por isso um anticorpo associado, designam-se por
antignios. A regio de um antignio que reconhecida pelo anticorpo denomina-se determinante
INTRODUO
13

antignico ou eptopo. Os anticorpos so capazes de distinguir antignios bastante semelhantes, como
por exemplo, duas protenas que diferem entre si num nico aminocido ou mesmo dois ismeros
18
.
Estruturalmente os anticorpos so macromolculas em forma de Y com dois locais de ligao de
antignio nas regies N-terminais (ver Figura 1.5). A estrutura bsica de um anticorpo composta por
quatro cadeias polipeptdicas: duas cadeias idnticas leves (cadeias L) e duas cadeias idnticas pesadas
(cadeias H). As cadeias L so constitudas por cerca de 220 aminocidos, enquanto as cadeias H so
constitudas por 440 aminocidos. As quatro cadeias esto ligadas entre si por uma combinao de
ligaes no-covalentes e pontes dissulfureto. Cada local de ligao de antignio constitudo por
uma cadeia L e H (ver Figura 1.5). A regio flexvel permite que a distncia entre os dois locais de
ligao varie, aumentando a eficincia da ligao de antignios ao anticorpo
18
.

Figura 1.5 Estrutura geral de um anticorpo. Figura adaptada
18
.

Nos mamferos existem cinco classes de imunoglobulinas (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), que diferem no
tipo de cadeia H (o, o, c, e , respetivamente). Cada cadeia H confere uma conformao distinta
regio central e C-terminal da prpria cadeia, pelo que cada classe de imunoglobulinas tem
propriedades caractersticas. As cadeias leves tambm diferem quanto ao tipo, podendo ser do tipo k
ou . Das cinco classes, a imunoglobulina G (IgG) a que est presente em maior quantidade no
sangue
18
.
A diversidade dos locais de ligao de antignio resulta da variabilidade da sequncia de aminocidos
das regies N-terminais das cadeias L e H (ver Figura 1.6). A diversidade ocorre em trs pequenas
regies hipervariveis da regio varivel de ambas as cadeias, sendo que apenas 5 a 10 aminocidos
em cada regio hipervarivel formam o local de ligao de antignio, pelo que o tamanho do eptopo
reconhecido pelo anticorpo relativamente pequeno. O evento de ligao entre anticorpo e antignio
INTRODUO
14

reversvel, sendo a fora da interao determinada pela soma da contribuio de vrias interaes no-
covalentes (pontes de hidrognio, interaes hidrofbicas, foras Van der Waals) e interaes inicas
18
.

Figura 1.6 Regies variveis e hipervariveis do anticorpo. Figura adaptada
18
.

Os imunobiossensores incorporam a especificidade da interao entre anticorpo e antignio com o
mecanismo de transduo na gerao de um sinal
4,5
. Como elemento de biorreconhecimento os
anticorpos apresentam a especificidade e sensibilidade necessrias para baixos nveis de deteo
molecular, donde resulta a sua grande aplicao na rea dos biossensores
5
.
Os anticorpos incorporados num sensor podem ser de trs tipos: policlonal, monoclonal ou fragmentos
de anticorpos
4,5
:
- Policlonais resultam da resposta imunitria inata de um organismo vertebrado a um agente
patognico. So produzidos por diferentes clulas B contra vrios eptopos diferentes. Os
anticorpos policlonais so produzidos normalmente atravs da imunizao de um animal
vertebrado (por exemplo, coelho ou rato) com determinado antignio, sendo que aps o
perodo de incubao extrado soro do animal. O soro policlonal apresenta ento uma
populao grande e diversificada de anticorpos especficos para eptopos diferentes do mesmo
antignio. Um mtodo alternativo de produo de anticorpos policlonais consiste na
inoculao por via oral de galinhas, recolhendo posteriormente a gema dos ovos, que contm
anticorpos transferidos pela progenitora
4,5,19
.
- Monoclonais so produzidos pela mesma linhagem de clulas B, pelo que todos reconhecem
o mesmo eptopo do antignio. O mtodo de produo de anticorpos monoclonais consiste na
imunizao de um animal vertebrado, posteriormente clulas B do bao, fundindo-as com
clulas de mieloma, formando um hibridoma (clula imortal secretora de anticorpos). Os
hibridomas so selecionados para o anticorpo desejado e so cultivados, geralmente, em
bioreactores de onde so extrados finalmente os anticorpos
20,21
.
INTRODUO
15

- Fragmentos os anticorpos so lisados em fragmentos das regies que os constituem, atravs
do recurso a proteases (pepsina ou papana). Apenas o fragmento da regio de ligao do
antignio (Fab antigen-biding fragment) que tem interesse prtico para a aplicao em
imunossensores. Os fragmentos de anticorpo podem ainda ser digeridos em fragmentos de
cadeia simples varivel (scFv single chain variable fragment), sem que haja perda de
especificidade
4
.
Os anticorpos monoclonais integrados em sensores permitem a obteno de testes mais especficos.
Porm o processo de fabrico dos anticorpos monoclonais mais dispendioso e a sua manuteno
mais difcil, quando comparados com os anticorpos policlonais
5
. Por sua vez os fragmentos de
anticorpos apresentam uma vantagem na sua aplicao em imunossensores face s macromolculas
inteiras. Os anticorpos tm propenso para se ligar de forma assimtrica superfcie de imobilizao
do sensor, o que leva a que muitos apresentem uma orientao que no favorece a ligao ao antignio,
diminuindo a especificidade e reprodutibilidade do sistema. Os fragmentos so simtricos e permitem
uma imobilizao mais homognea, com maior propenso ao reconhecimento do antignio, pois o
impedimento estereoqumico menor
4
.

1.5 Malria
1.5.1 Doena, transmisso e diagnstico
A malria uma doena provocada por um parasita intracelular do gnero Plasmodium. O parasita
um protozorio (eucarionte unicelular) transmitido pela picada de 60 mosquitos fmea do gnero
Anopheles (vetor de transmisso) e que infecta as hemcias do Homem. A malria provocada por
cinco espcies diferentes: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. knowlesi. A forma de
malria mais mortal atribuda espcie P. falciparum e predominante do continente africano. A
espcie P. vivax menos perigosa, mas mais disseminada, enquanto as restantes espcies so mais
raras
2224
.
O processo de infeo tem incio quando o mosquito se alimenta, injetando esporozotos de
Plasmodium na corrente sangunea do hospedeiro humano (ver Figura 1.7). Uma vez chegados ao
fgado, os esporozotos invadem os hepatcitos, multiplicam-se e diferenciam-se em merozoitos. O
ciclo de reproduo assexuada tem incio quando os merozoitos so libertados para a corrente
sangunea e infetam as hemcias, multiplicando-se no seu interior. Uma frao de merozoitos
libertada das hemcias para a corrente sangunea e diferencia-se em gametcitos (forma transmissvel
do parasita). Quando um novo mosquito se alimenta, os gametcitos so ingeridos e diferenciam-se
em gmetas, iniciando o ciclo de reproduo sexuada. Cada gametcito pode dar origem a um
macrogmeta feminino ou at oito microgmetas masculinos. A fecundao ocorre no intestino do
INTRODUO
16

mosquito, pelo que o zigoto diferencia-se numa forma mvel capaz de penetrar a parede do intestino,
formando ocitos. Com o passar do tempo, os ocitos aumentam em tamanho e rebentam, libertando
esporozotos que migram para as glndulas salivares do mosquito, podendo ento iniciar um novo
ciclo de infeo
23,24
. Os sintomas da malria surgem ao fim de 10 a 15 dias aps a picada do mosquito
e incluem febre, dor de cabea e vmitos, sendo semelhantes aos sintomas de uma gripe. Quando no
tratada, a infeo pode conduzir morte do hospedeiro
25
.

Figura 1.7 Ciclo de vida do protozorio Plasmodium sp.

Os dados da Organizao Mundial de Sade relativos malria para o ano de 2010 estimam que tero
ocorrido 219 milhes de casos (intervalo de 154 a 289 milhes) de pessoas infetadas e 660 mil mortes
(intervalo de 610 a 971 mil) confirmadas. No ano de 2011, a estimativa global do nmero de pessoas
em risco de contrair a doena rondou os 3,3 mil milhes, sendo que 80% dos casos verificados e 90%
das mortes ocorreram no continente africano, afetando principalmente crianas com menos de 5 anos e
mulheres grvidas
22
.
Na atualidade a deteo da malria feita com recurso a microscopia (tica ou de fluorescncia),
testes com recurso a PCR (Polymerase Chain Reaction, tcnica de deteo ao nvel molecular) e testes
rpidos de diagnstico (RDTs Rapid Diagnostic Tests)
26,27
. Das trs alternativas possveis, apenas os
INTRODUO
17

RDTs permitem o diagnstico de malria em reas remotas onde no existem condies de suporte,
como eletricidade, nem superviso por tcnicos especializados. Os RDTs so dispositivos que detetam
antignios peptdicos produzidos pelo Plasmodium sp. presentes no sangue dos pacientes crnicos ou
recentemente infetados, num curto intervalo de tempo. A maioria destes dispositivos presentemente
disponveis comercialmente so especficos para a deteo da espcie P. falciparum, atravs do
reconhecimento da protena HRP2 (Histidine-rich Protein 2) ou pLDH (parasite-specific Lactate
Dehydrogenase) presente numa amostra de sangue
26,27
. Os RDTs podem ainda detetar a presena das
restantes espcies atravs da deteo da presena do antignio Aldolase de Plasmodium, comum ao
ciclo glicoltico das cinco espcies
27
. Na sua forma mais simples, os RDTs consistem em tiras de
nitrocelulose contendo os anticorpos especficos conjugados com um marcador (ex.: nanopartculas de
Ouro)
27,28
. O teste baseia-se num princpio imunocromatogrfico (ver Figura 1.8). Uma extremidade da
tira de nitrocelulose imersa na amostra biolgica lquida (ex.: sangue) que contm o antignio
especfico. O lquido percorre a superfcie da tira de nitrocelulose por capilaridade, arrastando o
antignio nela contido. Na tira de nitrocelulose existem dois anticorpos que reconhecem dois eptopos
distintos do antignio, sendo que um est conjugado com o marcador e o outro est imobilizado numa
superfcie slida. Ao percorrer a tira de nitrocelulose, o antignio liga-se ao anticorpo conjugado com
marcador e o complexo recm-formado deslocado no sentido do fluxo da amostra, ao longo da tira.
O anticorpo imobilizado reconhece o antignio ligado ao complexo, sendo que h uma acumulao do
complexo na regio da tira de nitrocelulose onde est imobilizado o anticorpo. A acumulao de
marcadores nesta regio gera um sinal colorido (formao de uma tira vermelha no caso das
nanopartculas de Ouro enquanto marcador). O anticorpo conjugado com o marcador que no ligou
antignio continua a difundir ao longo da tira de nitrocelulose e capturado por um anticorpo
secundrio imobilizado mais adiante. semelhana do sinal gerado para o complexo com antignio, a
acumulao de anticorpo conjugado que no ligou antignio tambm gera um sinal colorido, que serve
de controlo positivo para a difuso da amostra ao longo da tira de nitrocelulose
27,28
.

INTRODUO
18

Figura 1.8 Esquema geral de um RDT. I a amostra biolgica que contm o antignio (A) colocada em
contato com a tira de nitrocelulose (D). II ligao do antignio ao anticorpo conjugado com nanopartculas de
Ouro, formando um complexo. III os complexos difundem pela tira de nitrocelulose e so capturados pelos
anticorpos imobilizados na linha de teste (B); os anticorpos conjugados que no ligaram antignio difundem pela
tira de nitrocelulose e so capturados na linha de controlo (C). Esquema no est escala.

Quando as condies de utilizao so ideais, os RDTs podem apresentar uma sensibilidade de >100
parasitas/L de sangue e fornecer resultados rpidos em apenas 15-20 minutos
27
. Comparativamente, a
deteo por microscopia tica efetuada por um tcnico experiente pode apresentar uma sensibilidade
entre 50 a 500 parasitas/L. A deteo por microscopia de fluorescncia apresenta uma sensibilidade
inferior a 100 parasitas/L. As tcnicas de biologia molecular para a deteo de sequncias de cidos
nucleicos especficas do parasita so capazes de detetar 5 ou menos parasitas por L de sangue, sendo
ento o mais sensvel de todos os mtodos disponveis de diagnstico de malria. No entanto, os
mtodos atuais continuam a apresentar dificuldades na sua aplicao prtica enquanto ferramentas de
diagnstico. Na Tabela 1.1 esto sumarizados as desvantagens apresentadas por cada mtodo de
diagnstico.

INTRODUO
19

Tabela 1.1 Resumo das dificuldades apresentadas pelos mtodos atuais convencionais para diagnstico de
malria
23,26,27
.
Microscopia PCR RDTs
Gera muitos falsos-negativos. Sujeitos a limitaes por parte
tcnica do operador.
Propensos deteriorao
por exposio a
temperatura e humidade.
Requer mo-de-obra
qualificada.
Custo elevado associado. Propensos deteriorao
devido a falha no fabrico.
Necessita de suportes que no
so facilmente encontrados em
zonas remotas (eletricidade).
Requerem material e mo-de-
obra qualificada.
Sensibilidade do teste
depende da tcnica do
operador.
Resultados tm de ser
avaliados por operadores
diferentes de forma a resolver
situaes discordantes.
Deteo realizada num
laboratrio, demorando 5 a 8
dias para produzir um
resultado.
Falta de confiana na
exatido e fiabilidade do
teste.

Para alm dos antignios HRP2, pLDH e Aldolase de Plasmodium utilizados nos RDTs, outros
antignios podem ser usados como marcadores etimolgicos de P. falciparum, como o caso da
protena PfHsp70 (Heat Shock Protein 70 de P. falciparum).

1.5.2 Heat Shock Protein 70 como antignio de P. falciparum
As Heat Shock Proteins (HSP) so protenas altamente conservadas e que existem em quase todas as
formas de vida. A sua funo consiste em atuar como chaperonas moleculares, ligando-se a protenas
desnaturadas, ajudando no seu processo de enrolamento para a conformao nativa A Heat Shock
Protein 70 (Hsp70) uma das maiores famlias de HSP. A expresso de Hsp70 induzida em resposta
a condies de stress, geralmente trmico; no entanto, algumas protenas so expressas de forma
constitutiva
29
.
Estruturalmente a Hsp70 uma protena de aproximadamente 70 kDa constituda por trs domnios: a)
domnio ATPase N-terminal com 45 kDa; b) domnio de ligao do substrato (protenas) com 15 kDa;
c) domnio C-terminal com 10 kDa
29,30
. A Hsp70 induzvel do protozorio P. falciparum (PfHsp70)
contm os trs domnios tpicos da famlia e expressa em todos os estgios do ciclo de vida do
parasita. Apesar das suas caractersticas estruturais, a PfHsp70 ainda no foi caracterizada em termos
INTRODUO
20

das suas propriedades bioqumicas e funes enquanto chaperona
30
. Uma hiptese da sua funo
enquanto chaperona reside no facto de o ciclo de vida do parasita alternar entre dois habitats distintos
o vetor de transmisso mosquito fmea (animal de sangue frio) e o hospedeiro humano (animal de
sangue quente) , sendo a expresso de PfHsp70 em resposta s alteraes fisiolgicas uma estratgia
de sobrevivncia empregue pelo protozorio. Outra hiptese da sua funo enquanto chaperona
relaciona-se com o aumento da temperatura no interior do hospedeiro humano at 41 C, como
resultado da resposta do sistema imunitrio.
Em termos da sua utilizao como marcador molecular, nveis elevados de PfHsp70 j foram
encontrados no fgado do hospedeiro humano durante a fase de reproduo assexuada do parasita
30
.
Desta forma, a PfHsp70 apresenta-se como uma forte candidata a marcador molecular de P.
falciparum.

1.6 O Sensor proposto imunobiossensor capacitivo com microeltrodos interdigitais
O sensor proposto neste trabalho consiste num biossensor capacitivo interdigital (IDC) para
imunodeteo, constitudo por microeltrodos de ouro com configurao interdigital, depositados
sobre um substrato de vidro. superfcie dos microeltrodos foi adicionada uma matriz de suporte
imobilizao de biomolculas, constituindo a camada sensvel do dispositivo. Quanto composio da
matriz de suporte foram analisadas duas configuraes: a) membrana comercial Immobilon-P de
Fluoreto de Polivinilideno (PVDF) colada sobre os microeltrodos (IDC
PVDF
); b) nanobastonetes de
xido de Zinco (ZnO) sintetizados diretamente sobre os microeltrodos (ver Figura 1.9) (IDC
ZnO
). Os
microeltrodos do sensor IDC
PVDF
apresentam uma largura e espaamento de 50 m, enquanto os
microeltrodos do sensor IDC
ZnO
apresentam uma largura e espaamento de 10 m. A zona de deteo
(sobre os microelctrodos) dada pela frmula
IDC
=2(G+W), onde G e W representam,
respetivamente, o espaamento e largura
13,31
. Para o sensor IDC
PVDF
, essa zona (medida na vertical)
de 200 m, enquanto no sensor IDC
ZnO
de 40 m. Cada sistema foi analisado por EI de forma a
detetar variaes na capacidade e impedncia, tanto durante a fase de construo do sensor, como no
teste da deteo.

INTRODUO
21

Figura 1.9 Biossensores capacitivos interdigitais (IDC): a) IDC com membrana de PVDF comercial colada
sobre os microeltrodos interdigitais (50 m) de Ouro; b) IDC com nanobastonetes de ZnO sintetizados
superfcie dos microeltrodos interdigitais (10 m) de Ouro (ampliao dos nanobastonetes obtida por SEM).

As camadas constitudas pelas matrizes adicionadas sobre o transdutor, alm de fornecerem um
suporte imobilizao do biorrecetor, permitem a sua distribuio ao longo da zona de deteo. Desta
forma, as alteraes registadas pelo sensor sero devidas principalmente ligao entre o anticorpo e
antignio e no o resultado de alteraes na camada localizada sobre a regio de imobilizao, como
acontece com os sensores IDC convencionais, onde a maior parte da regio de deteo ocupada por
ar ou meio lquido.
As membranas comerciais de PVDF permitem um processo de imobilizao das biomolculas simples
e barato, sobre microeltrodos com dimenses superiores a 50 m, o que representa uma vantagem
sobre os sensores com nanoeltrodos, que requerem processos de fabrico mais dispendiosos e
complexos. O PVDF um polmero hidrofbico composto por flor e carbono (ver Figura 1.10) que
pode ser utilizado para formar filmes finos com espessura entre 9 a 110 m, nomeadamente por spin-
coating. Comercialmente so produzidos filmes com maiores espessuras (0,5 e 1 mm). Os filmes de
(a)
(b)
INTRODUO
22

PVDF so utilizados frequentemente como filtros e membranas de Western blott
32,33
. As membranas
de PVDF apresentam elevada afinidade para protenas, resistncia qumica e elevada fora mecnica,
podendo ser reutilizadas em immunodeteo
3234
. A ligao de protenas s membranas de PVDF
feita por um processo de adsoro fsica ou fisissoro, resultante de interaes hidrofbicas entre os
aminocidos hidrofbicos da protena e os domnios hidrofbicos do polmero. A imobilizao das
protenas feita ao longo da profundidade da membrana
33
. O polmero de PVDF apresenta ainda um
peso reduzido, podendo ser ligado a superfcies sem as alterar ou danificar
32
.

Figura 1.10 Estrutura qumica do Fluoreto de Polivinilideno (PVDF).

Os nanobastonetes de ZnO so estruturas semicondutoras com uma das dimenses nanoescala (1 a
100 nm)
35,36
. Enquanto nanomaterial, o ZnO apresenta uma cintica de transferncia eletrnica rpida,
um ponto isoeltrico elevado (9,5), uma razo rea superficial/volume elevada, estabilidade qumica,
atividade eletroqumica, propriedades piezoeltricas e biocompatibilidade
3739
. A soma destas
propriedades torna as estruturas de ZnO bastante atrativas para a rea dos biossensores, nomeadamente
como matrizes de suporte imobilizao de protenas. A imobilizao pode ser feita por adsoro
fsica ou por reticulao, usando um ou dois agentes de reticulao (cross-linkers) para fazer a ponte
entre a protena e a estrutura metlica
37,38
. Na Figura 1.11 est exemplificada a ligao do anticorpo
anti-HRP superfcie da nanopartcula de ZnO por reticulao (procedimento aplicado neste trabalho).
O agente de reticulao Sulfo-SMB liga-se ao anticorpo atravs dos grupos aminas livres (-NH
2
) e ao
agente de reticulao MPTMS atravs do seu grupo tiol (-SH), ligando covalentemente o anticorpo ao
ZnO. Este tipo de imobilizao no promove qualquer orientao especfica do anticorpo, uma vez que
os resduos que contm aminas (ex.: lisinas) podem estar localizados em grande parte da
macromolcula. No entanto, os anticorpos imobilizados segundo este procedimento ainda mantm
uma capacidade de ligao significativa
40
. A facilidade e simplicidade do processo de imobilizao
referido representa uma vantagem face aos mtodos que permitem uma orientao especfica dos
anticorpos procedimentos mais complexos, com condies agrestes e elevada perda de anticorpo
durante o procedimento. O processo de imobilizao de protenas nos nanobastonetes de ZnO por
reticulao mais complexo face imobilizao nas membranas de PVDF. No entanto, devido
INTRODUO
23

ligao covalente entre as nanoestruturas e as protenas, o risco de perda de material biolgico menor
durante as lavagens dos sensores nas fases de fabrico e teste.

Figura 1.11 Imobilizao do anticorpo anti-HRP sobre nanobastonetes (nanorods) de ZnO por reticulao: a)
silanizao dos nanobastonetes com MPTMS; b) ligao do anticorpo ao Sulfo-SMB; c) imobilizao do
anticorpo sobre o nanorod atravs da ligao entre o MPTS e o Sulfo-SMB. Esquema no est escala.

Como modelos de estudo da interao anticorpo/antignio, foram utilizados dois conjuntos: a)
anticorpo monoclonal anti-PfHsp70 e PfHsp70 (marcador molecular de P. falciparum) como
antignio; b) anticorpo policlonal anti-HRP e Peroxidase de Rbano (HRP) como antignio. A HRP
representa uma famlia de enzimas produzidas na raiz do Rbano (Armoracia rusticana) que catalisam
a reduo de muitos substratos (ex.: fenis aromticos, cidos fenlicos, aminas), acoplada
converso de Perxido de Hidrognio em gua, com formao de radicais livres. A enzima tem grande
utilidade comercial, bem como aplicao na investigao biomdica, sendo vulgarmente utilizada
como marcador de sondas em imunoensaios e sensores
5,17,41,42
. No presente trabalho, a utilizao de
HRP em conjunto com o substrato reativo cromogneo ABTS (ver Figura 1.12) permitiu verificar a
sua presena nas matrizes de suporte, razo pela qual a enzima foi escolhida como antignio modelo.
INTRODUO
24

Figura 1.12 Esquema da reao de oxidao do substrato cromogneo ABTS, catalisada pela enzima HRP. A
oxidao do substrato concomitante com um aumento da tonalidade verde da soluo.

CAPTULO 2 PARTE EXPERIMENTAL

PARTE EXPERIMENTAL
27

2 Parte Experimental
2.1 Materiais e reagentes
Todos os reagentes utilizados eram do maior grau de pureza disponvel.
2,2'-Azino-Bis(3-Etilbenzotiazolina-6-cido Sulfnico) (ABTS) (A1888), Ampicilina (A9393),
Anticorpo policlonal anti-IgG de ratinho (F9137), cido Bicinconnico (BCA) (B9643), Albumina do
Soro Bovino (BSA) (A7030), Cloranfenicol (C0378), Glicerol (G789-3), Imidazole (I-0125), Isopropil
|-D-1-Tiogalactopiranosida (IPTG) (I5502), Hidrxido de Sdio (S5881), (3-
Mercaptopropil)trimetoxisilano (MPTMS) (175617), Peroxidase de Rbano tipo II (HRP) (P8250),
Sulfato de Cobre(II) (4% p/v) (C2284), 2,2,4-Trimetilpentano (32291), Tween 20 (P1379) e Nitrato
de Zinco (96482) foram adquiridos na Sigma-Aldrich.
Acetato de Zinco (131775), cido Sulfrico (131058.1212), Burato de Sdio (131644.1211), Estrato
de Levedura (403687.1210), Perxido de Hidrognio

(30% p/v) (121076.124), Cloreto de Sdio
(131659.1211), Triptona (403682.1210) e Ureia (131754.1211) foram adquiridos na Panreach.
Fosfato de Potssio monobsico (30407), Fosfato de Potssio dibsico (04248) e Cloreto de Potssio
(31248) foram adquiridos na Riedel-de Han. Etanol absoluto (4127022) e Trizma
TM
(Tris) (489983)
foram adquiridos na Carlo Erba Reagents. Sulfo-MBS (22312) proveio da Thermo Scientific. Agar LB
(1.10283.0500) proveio da Merck. Agarose Ni-NTA proveio da Qiagen. Isopropanol foi adquirido na
Scharlau. Acetona proveio de Valente & Ribeiro, LDA. Anticorpo policlonal para Peroxidase de
Rbano (anti-HRP) (ABIN398438) foi adquirido em antibodies-online.
Membranas de PVDF Immobilon-P (IPVH10100) foram adquiridas na Merck Millipore.
Todas as solues foram preparadas em gua desionizada (Mili-Q), salvo indicao contrria.

2.2 Procedimentos gerais
2.2.1 Sobrexpresso da PfHsp70 em E. coli Rosetta Blue
Placas de isolamento constitudas por meio Agar LB (3,7% p/v) com Ampicilina (100 g/mL),
Cloranfenicol (34 g/mL) e Tetraciclina (12,5 g/mL) foram inoculadas com cultura stock E. coli
Rosetta Blue, contendo o vetor de expresso pQE30/PfHsp70
30
. As placas de isolamento foram
incubadas durante 16 horas a 37 C. Selecionaram-se duas colnias isoladas e inocularam-se 40 mL de
meio LB (Triptona 10 g/L, Estrato de Levedura 5 g/L, Cloreto de Sdio 10 g/L) com Ampicilina (100
g/mL), Cloranfenicol (34 g/mL) e Tetraciclina (12,5 g/mL), posteriormente incubados a 210 rpm,
durante 16 horas a 37 C. O inculo foi diludo em 2 L de meio LB (com antibiticos referidos
PARTE EXPERIMENTAL
28

anteriormente nas mesmas concentraes) e incubado a 210 rpm e 37 C, at obter densidade tica a
600 nm (DO
600 nm
) entre 0,5 e 0,6. Neste ponto induziu-se a cultura com IPTG (concentrao final 1
mM) e incubou-se a 210 rpm durante 16 horas a 37 C.

2.2.2 Purificao, concentrao e quantificao da PfHsp70
A cultura previamente crescida foi centrifugada a 11305 g durante 30 minutos a 4 C. O pellet foi
ressuspenso em tampo de lise (Ureia 8 M; Cloreto de Sdio 300 mM; Imidazole 10 mM; Tris 10 mM
pH 8; lizosima 1 mM; 800 L de inibidor de protease) com uma pequena quantidade de Dnase. O
pellet ressuspenso foi levado French Press (French pressure cell, Thermo Electron Corporation),
com 3 passagens a 2000 psi. O lisado resultante foi centrifugado a 8228 g durante 1 hora a 4 C.
Recolheu-se o sobrenadante ao qual adicionaram-se 800 L de inibidor de protease e Glicerol (10%
v/v em relao ao volume final).
Misturou-se o sobrenadante com 10 mL de resina Agarose Ni-NTA, previamente equilibrada com
tampo de lavagem (Imidazole 10 mM; Cloreto de Sdio 300 mM; Tris 10 mM pH 8), sob agitao
suave durante 2 horas a 4 C. A resina foi transposta para uma coluna cromatogrfica e fez-se passar o
tampo de lavagem at obter uma DO
280 nm
inferior a 0,1. A partir deste ponto adicionou-se o tampo
de eluio (Imidazole 100 mM; Cloreto de Sdio 300 mM; Tris 10 mM pH 8) coluna at obter uma
DO
280 nm
inferior a 0,1.
Procedeu-se concentrao do eludo, recorrendo a centricons com um limite de excluso de 3 kDa
(Amicon Ultra-4, Millipore), centrifugando 2 vezes a 4800 g durante 15 minutos a 4 C. A troca do
tampo de eluio para tampo Burato de Sdio (Burato de Sdio 150 mM, Cloreto de Sdio 100 mM,
pH 8) foi feita nas mesmas condies do passo de concentrao.

2.2.3 Produo, purificao e concentrao do anticorpo anti-PfHsp70
A produo e purificao do anticorpo monoclonal anti-PfHsp70 foram realizadas no Instituto de
Medicina Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa (Portugal) pela Doutora
Cludia Cunha.
A concentrao do anticorpo e troca de tampo Tris-HCl 1M pH 9 para tampo Fosfato de Sdio 20
mM pH 7 foram efetuadas utilizando centricons com limite de excluso de 3 kDa, centrifugando a
7500 g em ciclos de 5 minutos a 4 C.

PARTE EXPERIMENTAL
29

2.2.4 Biossensor capacitivo interdigital com membrana comercial de PVDF
2.2.4.1 Eltrodos interdigitais de 50 m com matriz de imobilizao em PVDF (IDC
PVDF
)
Os microeletrdos interdigitais foram produzidos no Centro de Investigao de Materiais da Faculdade
de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (Portugal). So constitudos por uma dupla
camada de Crmio e Ouro (com espessuras de 10 e 40 nm) sobre um substrato de vidro e apresentam
uma largura e espaamento de 50 m entre pistas, cobrindo uma rea de 0,7 cm
2
.
De forma a remover quaisquer impurezas presentes superfcie, os microeltrodos foram lavados com
soluo Piranha (cido Sulfrico e Perxido de Hidrognio numa razo volumtrica 1:1) durante 15
minutos, seguidos de 3 lavagens de 5 minutos com gua Mili-Q. Seguidamente foram secados com
rgon.
Colou-se manualmente uma membrana de PVDF (0,7 cm
2
; 120 m de espessura; poros com 0,45 m
de dimetro;) sobre a superfcie dos microeltrodos, com uma gota de cola Cianoacrilato (Ceys) e
deixou-se secar durante 16 horas a 25 C.

2.2.4.2 IDC
PVDF
I anti-PfHsp70 imobilizado
Imobilizao de anti-PfHsp70 nas membranas de PVDF em concentraes diferentes
Os procedimentos de transferncia do anticorpo e antignio foram adaptados do manual da Merck
Millipore
33
. As membranas de PVDF coladas sobre os eltrodos interdigitais foram submetidas a um
pr-tratamento de forma a ficarem hidratadas, que consistiu na lavagem com Isopropanol (50% v/v)
durante 15 segundos, seguida de lavagem com gua Mili-Q durante 2 minutos e um passo de
equilbrio em tampo PBS (Fosfato de Potssio monobsico 1,5 mM, Fosfato de Potssio dibsico 7,2
mM, Cloreto de Potssio 2,7 mM, Cloreto de Sdio 137 mM) durante 5 minutos. Seguidamente
procedeu-se imobilizao de anticorpo nas membranas humedecidas, depositando-se 50 L de
soluo de anti-PfHsp70 em tampo PBS (33, 66 e 100 g/mL), durante 1 hora a 25 C. Aps a
incubao, os biossensores foram lavados com tampo PBS durante 5 minutos (3 vezes), sob agitao
manual e secados a 210
-2
mbar durante 30 minutos.

Teste da resposta dos biossensores com PfHsp70 na membrana de PVDF seca
As membranas de PVDF no foram reidratadas, eliminando a necessidade do passo de bloqueamento
com BSA
33
. Depositaram-se 50 L de PfHsp70 em tampo PBST (PBS com Tween-20 0,05% v/v)
PARTE EXPERIMENTAL
30

concentrao de antignio correspondente ao dobro das moles de anticorpo imobilizado,
respetivamente sobre as membranas durante 1 hora a 25 C. Aps a incubao, os biossensores
foram lavados com tampo PBS durante 5 minutos (3 vezes), sob agitao manual e secados a 210
-2


2.2.4.3 IDC
PVDF
II PfHsp70 imobilizado
Imobilizao de PfHsp70 nas membranas de PVDF em concentraes diferentes
As membranas de PVDF coladas sobre os eltrodos foram hidratadas (ver seco 2.2.4.2),
procedendo-se imobilizao de 50 L de PfHsp70 em tampo PBS (33, 66 e 100 g/mL) durante 1
hora a 25 C. Aps a incubao, os biossensores foram lavados com tampo PBS durante 5 minutos (3
vezes), sob agitao manual e secados a 210
-2

Teste da resposta dos biossensores com anti-PfHsp70 na membrana de PVDF seca
Depositaram-se 50 L de anti-PfHsp70 em tampo PBST concentrao de anticorpo correspondente
ao dobro das moles de antignio imobilizado, respetivamente sobre as membranas secas, durante 1
hora a 25 C. Aps a incubao, os biossensores foram lavados com tampo PBS durante 5 minutos (3
vezes), sob agitao manual e secados a 210
-2

2.2.4.4 IDC
PVDF
III teste com HRP em membrana humedecida
Imobilizao de anti-HRP nas membranas de PVDF e bloqueio com BSA
As membranas de PVDF coladas sobre os eltrodos foram hidratadas (ver seco 2.2.4.2) e procedeu-
se imobilizao de 100 L de anti-HRP em tampo PBS (100 g/mL) durante 1 hora a 25 C. Aps a
incubao, os biossensores foram lavados com tampo PBS durante 5 minutos (3 vezes), sob agitao
manual. Seguidamente depositaram-se sobre as membranas 100 L de BSA em tampo PBST (0,2%
p/v), durante 1 hora a 25 C. Para remover BSA que no tenha ligado membrana, os biossensores
foram lavados com tampo PBS durante 5 minutos (3 vezes), sob agitao manual e secados a 210
-2


PARTE EXPERIMENTAL
31

Teste da resposta dos biossensores com HRP na membrana de PVDF humedecida (hidroflica)
A deposio de antignio em condies hidroflicas requereu um pr-tratamento da membrana com
Isopropanol (ver seco 2.2.4.2), seguido da deposio de 100 L de HRP em tampo PBST (59
g/mL) sobre um dos sensores, temperatura ambiente durante 1 hora. O controlo foi feito
depositando 100 L de tampo PBST sobre o outro sensor, temperatura ambiente durante 1 hora. Os
biossensores foram lavados com tampo PBS durante 5 minutos (3 vezes), sob agitao manual e
secados a 210
-2

2.2.4.5 IDC
PVDF
IV teste com HRP (antignio especfico) e PfHsp70 (antignio no especfico)
Imobilizao de anti-HRP nas membranas de PVDF e bloqueio com leite em p
As membranas de PVDF coladas sobre os eltrodos foram hidratadas (ver seco 2.2.4.2) e procedeu-
se imobilizao de 100 L de anti-HRP em tampo PBS (200 g/mL) durante 1 hora a 25 C. Aps a
incubao, os biossensores foram lavados com tampo PBS durante 10 minutos (3 vezes), sob agitao.
As membranas foram bloqueadas com soluo de leite em p em tampo PBST (5% p/v), durante 1
hora a 25 C, com agitao. Os biossensores foram lavados com tampo PBS durante 10 minutos (3
vezes), sob agitao e secados a 210
-2

Teste da resposta dos biossensores com HRP (antignio especfico) e PfHsp70 (antignio no
especfico)
Antes da deposio dos analitos, as membranas de PVDF sofreram um passo de reidratao (ver
seco 2.2.4.2). Procedeu-se deposio de 100 L de soluo de HRP em tampo PBST (117
g/mL) e de 100 L de soluo de PfHsp70 em tampo PBST (187 g/mL), respetivamente, sobre as
membranas de dois biossensores, durante 1 hora a 25 C. Os biossensores foram lavados com tampo
PBS durante 10 minutos (3 vezes), sob agitao e secados a 210
-2

2.2.4.6 IDC
PVDF
V fixao da membrana de PVDF com cola epxi
Colagem das membranas de PVDF e imobilizao de anti-HRP
Depositou-se uma camada de cola epxi sobre os eltrodos por spin-coating (500 rpm durante 10
segundos e 2300 rpm durante 1 minuto). As membranas de PVDF foram pressionadas sobre a camada
PARTE EXPERIMENTAL
32

de cola, seguindo-se um passo de cura de 72 horas, de forma a garantir que a camada de cola secasse
completamente.
As membranas de PVDF foram hidratadas (ver seco 2.2.4.2) e procedeu-se imobilizao de 100
L de anti-HRP em tampo PBS (200 g/mL), durante 1 hora a 25 C. Aps a incubao, os
biossensores foram lavados com tampo PBS durante 10 minutos (3 vezes), sob agitao. As
membranas foram bloqueadas com soluo de leite em p em tampo PBST (5% p/v), durante 1 hora a
25 C, com agitao. Os biossensores foram lavados com tampo PBS durante 10 minutos (3 vezes),
sob agitao e secados a 210
-2

Teste da resposta dos biossensores com HRP (antignio especfico) e PfHsp70 (antignio no
especfico)
As membranas de PVDF foram reidratadas (ver seco 2.2.4.2) e procedeu-se deposio de 100 L
de soluo de HRP em tampo PBST (117 g/mL) e de 100 L de soluo de PfHsp70 em tampo
PBST (187 g/mL), respetivamente, durante 1 hora a 25 C. Os biossensores foram lavados com
tampo PBS durante 10 minutos (3 vezes), sob agitao e secados a 210
-2

2.2.4.7 Espectroscopia de Impedncia
A Capacidade (C) e Tangente de Perdas (tgo) foram medidas com um Analisador de Impedncia
4294A (Agilent), num intervalo de frequncia entre 40 Hz e 110 MHz. Efetuaram-se medies aps a
colagem da membrana, imobilizao do anticorpo e adio do antignio.
Os biossensores foram colocados dentro da cmara de vcuo, representada na Figura 2.1, at a presso
atingir o nvel basal de 210
-2
mbar. A partir deste ponto registaram-se a C e tgo para cada biossensor.
Este foi o procedimento geral de medio, salvo indicao contrria.
No caso do sensor IDC
PVDF
V, o registo da C e tgo consistiu em 3 medies presso de 210
-2
mbar,
alterando a posio de contacto entre as agulhas da ponte e os contactos dos eltrodos interdigitais (ver
Figura 2.2) a cada medio.
PARTE EXPERIMENTAL
33

Figura 2.1 (a) Analisador de Impedncia 4294A e (b) cmara de vcuo.

Figura 2.2 Contacto entre pontas de medio e eltrodos do biossensor capacitivo interdigital no interior da
cmara de vcuo.

2.2.5 Estudo do suporte de imobilizao em PVDF
2.2.5.1 Efeito do pr-tratamento da membrana de PVDF com lcool na penetrao da soluo
com antignio
Uma membrana PVDF com 1 cm
2
foi hidratada (ver seco 2.2.4.2) enquanto uma segunda membrana,
tambm com 1 cm
2
, permaneceu seca. As duas membranas foram incubadas com 100 L de HRP em
tampo PBS (100 g/mL) durante 1 hora a 25 C. Aps a incubao, as membranas foram lavadas
com tampo PBS durante 5 minutos (3 vezes), sob agitao manual.
PARTE EXPERIMENTAL
34

A atividade enzimtica da HRP imobilizada nas membranas foi medida de acordo com o protocolo
estabelecido pela Sigma-Aldrich
43
, utilizando ABTS como substrato cromogneo da peroxidase. As
membranas foram colocadas no fundo de uma clula de quartzo onde se adicionaram 2,9 mL de ABTS
(9,1 mM) em tampo Fosfato de Potssio monobsico pH 5 (100 mM) e 100 L de Perxido de
Hidrognio (0,3% v/v). Acompanhou-se a reao oxidao do ABTS (ABTS
ox
) atravs da medio do
aumento de absorvncia a 405 nm, com recurso a um espectrofotmetro UV/Vis UV2 (UNICAM) ao
longo de 3 minutos, com homogeneizao manual da soluo de 10 em 10 segundos.

2.2.5.2 Otimizao do processo de bloqueio das membranas de PVDF
Um bloqueio eficiente das membranas de PVDF essencial para minimizar as interaes no
especficas entre o analito e os locais disponveis para ligao no interior da membrana. O bloqueio da
membrana assegura que a maioria do sinal produzido pelo sensor resulta da ligao especfica do
antignio ao anticorpo. Para determinar as melhores condies de bloqueio efetuaram-se cinco ensaios.
Nos ensaios A, B e C analisou-se a utilizao de BSA enquanto agente de bloqueio, em duas
concentraes 0,2 e 5% (p/v). Nos ensaios D e E analisou-se a utilizao de leite magro em p como
agente de bloqueio concentrao de 5% (p/v).
Um conjunto de 4 membranas de PVDF com 1 cm
2
passou por um pr-tratamento com Isopropanol,
tal como descrito na seco 2.2.4.2. O procedimento geral para todos os ensaios consistiu na
imobilizao do anticorpo anti-HRP na membrana, seguido de um passo de bloqueio e deposio do
antignio HRP em tampo PBST (59 g/mL nos ensaios A a D; 117 g/mL no ensaio E)
temperatura ambiente. Entre cada passo efetuaram-se lavagens com tampo PBS. Aps deposio do
antignio determinou-se a sua presena nas membranas, segundo o protocolo da Sigma-Aldrich,
conforme descrito na seco 2.2.5.1, mas a comprimento de onda 424 nm correspondente a um dos
picos de absoro do ABTS oxidado. As especificaes dos passos de imobilizao do anticorpo,
bloqueio e lavagens para cada ensaio encontram-se descritas na Tabela 2.1.

PARTE EXPERIMENTAL
35

Tabela 2.1 Condies de imobilizao do anticorpo, bloqueio e lavagens das membranas de PVDF nos ensaios
de otimizao do processo de bloqueio.
Imobilizao do anticorpo Bloqueio Lavagens
Ensaio A
100 L de anti-HRP em
tampo PBS (100 g/mL),
durante 1 hora.
100 L de BSA em
tampo PBST (0,2 % p/v)
durante 1 hora.
5 minutos em
tampo PBS sob
agitao (3x).
Ensaio B
tampo PBS (100 g/mL)
durante 4 horas.
100 L de BSA em
tampo PBST (0,2 % p/v)
durante 16 horas.
5 minutos em
tampo PBS sob
agitao (3x).
Ensaio C
durante 1 hora.
Soluo BSA em tampo
PBST (5 % p/v), sob
agitao durante 1 hora.
10 minutos em
tampo PBS sob
agitao (3x).
Ensaio D
durante 1 hora.
Soluo leite em p em
tampo PBST (5 % p/v),
sob agitao durante 1
hora.
10 minutos em
tampo PBS sob
agitao (3x).
Ensaio E
durante 1 hora.
Soluo leite em p em
tampo PBST (5 % p/v),
sob agitao durante 1
hora.
10 minutos em
tampo PBS sob
agitao (3x).

PARTE EXPERIMENTAL
36

2.2.6 Difuso do antignio e anticorpo atravs da membrana de PVDF
A penetrao do antignio e anticorpo na membrana de PVDF essencial para o sucesso do sensor. Se
as biomolculas no forem capazes de difundir atravs da membrana, a regio de medio do campo
eltrico no ser capaz de detetar a sua presena e interao. Neste estudo analisou-se a capacidade de
difuso do antignio e anticorpo atravs da membrana de PVDF.

2.2.6.1 Difuso de antignio atravs da membrana de PVDF
Depositaram-se 100 L de anti-HRP em tampo PBS (200 g/mL) sobre uma membrana de PVDF (1
cm
2
), hidratada (ver seco 2.2.4.2), durante 1 hora. A membrana foi lavada com tampo PBS durante
10 minutos (3 vezes), sob agitao, e bloqueada com leite em p em tampo PBST (5% p/v), durante 1
hora sob agitao. A membrana foi lavada novamente com tampo PBS durante 10 minutos (3 vezes),
sob agitao, para remover o leite em excesso. Uma segunda membrana de PVDF hidratada foi
colocada por debaixo da membrana com anticorpo, de forma a no haver bolhas de ar entre as
superfcies de contacto. As duas membranas sobrepostas foram colocadas sobre uma folha de
parafilme e depositaram-se 50 L de HRP em tampo PBS (234 g/mL), assegurando que a gota no
ultrapassasse o limite da rea da membrana superior. As membranas foram incubadas RT durante 1
hora e lavadas em seguida com tampo PBS fresco, durante 10 minutos (3 vezes) sob agitao.
Registou-se a formao de ABTS
ox
para cada membrana, segundo o procedimento descrito na seco
2.2.5.2, mas a comprimento de onda 424 nm.

2.2.6.2 Difuso de anticorpo atravs da membrana de PVDF
Duas membranas de PVDF (1 cm
2
) foram hidratadas (ver seco 2.2.4.2) e colocadas sobre uma folha
de parafilme. Depositaram-se 60 L de anti-IgG marcado com fluorforo FITC em tampo PBS (200
g/mL) sobre uma membrana, assegurando que a gota no ultrapassasse o limite da rea superficial. O
controlo foi feito depositando 60 L de tampo PBS sem anticorpo na outra membrana hidratada. As
membranas foram incubadas durante 1 hora temperatura ambiente e lavadas de seguida com tampo
PBS fresco, durante 10 minutos (3 vezes) sob agitao. Cada uma das membranas foi cortada ao meio
e registou-se a intensidade da fluorescncia da seco por microscopia de fluorescncia. As imagens
obtidas foram analisadas com o software ImageJ 1.47V (National Institutes of Health, EUA).

PARTE EXPERIMENTAL
37

2.2.7 Biossensor capacitivo interdigital com nanobastonetes de ZnO
2.2.7.1 Deposio de seeds de ZnO sobre os eltrodos interdigitais de 10 m
Os microeletrdos interdigitais foram produzidos no Centro de Investigao de Materiais da Faculdade
de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (Portugal). So constitudos por uma dupla
camada de Crmio e Ouro sobre um substrato de vidro e apresentam uma largura e espaamento de 10
m entre as pistas.
A deposio prvia de seeds de xido de Zinco (ZnO) fornece centros de nucleao para o
crescimento vertical das nanoestruturas diretamente superfcie do transdutor
44
. O processo de
deposio de seeds de ZnO consistiu na deposio de uma gota de Acetato de Zinco em Etanol (1,1
mg/mL) sobre os eltrodos, por spin-coating (2300 rpm durante 30 segundos). A deposio foi
efetuada 4 vezes, deixando o solvente evaporar entre deposies. De forma a decompor o Acetato de
Zinco em ZnO, os eltrodos foram submetidos a 250 C durante 30 minutos. Os processos de
deposio por spin-coating e decomposio trmica foram repetidos uma vez adicional.

2.2.7.2 Crescimento de nanobastonetes de ZnO sobre os microeltrodos interdigitais
Misturaram-se duas solues de Hidrxido de Sdio (14 mg/mL) e de Nitrato de Zinco (2,97 mg/mL)
numa razo volumtrica 1:1, a 700 rpm durante 2 horas a 25 C, dentro de um reator de vidro (ver
Figura 2.3). Os eltrodos foram suspensos dentro do reator, de forma que toda a rea superficial das
pistas de Ouro estivesse em contacto com a soluo agitada. A agitao foi reduzida para 300 rpm e a
temperatura dentro do reator foi mantida a 80 C durante 6 horas. Por fim, os eltrodos foram retirados
do interior do reator e deixados a secar durante 30 minutos a 90 C.

PARTE EXPERIMENTAL
38

Figura 2.3 Reator de sntese de nanobastonetes de ZnO com controlo de temperatura e agitao.

2.2.7.3 Silanizao dos nanobastonetes de ZnO e reticulao do anticorpo anti-HRP
Os eltrodos foram incubados em alquotas de 600 L do agente de reticulao primrio MPTMS (2%
v/v) em 2,2,4-Trimetilpentano durante 1 hora, de forma a promover a silanizao dos nanobastonetes
de ZnO. Para remover o MPTMS no ligado os microeltrodos foram lavados com 2,2,4-
Trimetilpentano e deixados a secar temperatura ambiente.
O anticorpo anti-HRP fornecido em tampo PBS com Azida de Sdio que pode dificultar o processo
de reticulao. Para remover a Azida de Sdio procedeu-se lavagem do anticorpo com tampo PBS
em centricons de 30 kDa (7500 g durante 15 minutos a 4 C).
O anticorpo em tampo PBS (3,33 M) foi incubado com o agente de reticulao secundrio Sulfo-
MBS (33,3 M) durante 30 minutos. De forma a remover o Sulfo-MBS no ligado efetuou-se um
passo adicional de centrifugao da soluo em centricons de 30 kDa (7500 g durante 15 minutos a
4 C).
Depositaram-se 50 L de soluo Sulfo-MBS@anti-HRP em tampo PBS sobre os eltrodos durante 3
horas para promover a ligao do anticorpo aos nanobastonetes de ZnO. Seguidamente, lavaram-se os
eltrodos com tampo PBS e procedeu-se ao bloqueio com 50 L de soluo BSA em tampo PBS
(5% p/v) durante 2 horas. O excesso de BSA foi lavado com tampo PBS.
PARTE EXPERIMENTAL
39

2.2.7.4 Teste dos biossensores com HRP (antignio especfico) e PfHsp70 (antignio no
especfico)
Para testar a resposta dos sensores depositaram-se 50 L de tampo PBS, HRP em tampo PBS (6,66
M) e PfHsp70 em tampo PBS (6,66 M) em trs sensores separados durante 1 hora a 25 C.
Seguidamente os sensores foram lavados com tampo PBS.

2.2.7.5 Espectroscopia de Impedncia
A C e tgo foram medidas com um Analisador de Impedncia 4294A, num intervalo de frequncia
entre 40 Hz e 110 MHz. Os biossensores foram colocados dentro da cmara de vcuo e registaram-se a
C e tgo presso 210
-2
mbar 3 vezes, alterando a posio de contacto entre as pontes de medio e os
contactos dos eltrodos interdigitais a cada medio. Efetuaram-se medies entre cada passo de
construo do sensor, bem como antes e depois da aplicao das solues sem e com antignio durante
a fase de teste.

CAPTULO 3 RESULTADOS: APRESENTAO E
DISCUSSO

RESULTADOS: APRESENTAO E DISCUSSO
43
3 Resultados: Apresentao e Discusso
3.1 Sensor com membrana comercial de PVDF
A membrana comercial de PVDF, enquanto matriz microporosa de imobilizao (ver Figura 3.1),
permite uma distribuio das molculas de anticorpo e antignio atravs da regio de medio
abrangida pelo campo eltrico do transdutor (microeltrodos interdigitais de Ouro). A utilizao da
membrana na construo do sensor apresenta as seguintes vantagens: a) boa capacidade de reteno e
ligao de protenas; b) no necessitam de agentes de reticulao, pelo que tornam o processo de
imobilizao mais econmico; c) encontram-se amplamente disponveis no mercado; d) so qumica e
mecanicamente resistentes e termoestveis
3234
. As membranas de PVDF usadas neste trabalho
apresentam uma espessura de cerca de 120 m. A altura da regio de medida para microeltrodos com
50 m de espaamento (G) e largura (W) dada pela frmula
IDC
=2(G+W), o que resulta numa altura
de 200 m, sendo que 95% das variaes medidas ocorre nos primeiros 100 m
13,31
. Desta forma, a
membrana de PVDF encontra-se perfeitamente enquadrada na regio de medio.

Figura 3.1 Corte transversal da membrana comercial de PVDF. Imagem SEM realizada no Centro de
Investigao de Materiais da Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (CENIMAT,
FCT-UNL).

44
3.1.1 Teste do sensor na deteo de PfHsp70 e anti-PfHsp70, enquanto analitos, por EI
A primeira abordagem no desenvolvimento do sensor com membrana comercial de PVDF consistiu na
imobilizao de 50 L de anticorpo anti-PfHsp70 em tampo PBS, concentrao de 33 g/mL, na
membrana de humedecida (IDC
PVDF
I ver seco 2.2.4.2) A resposta do sensor foi testada na
ausncia e presena do antignio com a membrana seca. O teste sem antignio consistiu na aplicao
de 50 l de tampo PBST seguido do teste com 50 L de antignio PfHsp70 em tampo PBST (31
g/mL, correspondente ao dobro das moles de anticorpo usado), no mesmo sensor. O princpio de
deteo neste sensor est relacionado com a interao especfica anticorpo/antignio. A imunodeteo
feita atravs da ligao do antignio PfHsp70 livre em soluo ao anticorpo imobilizado na
membrana. Em teoria, a ligao entre as duas molculas capaz de provocar uma alterao nas
propriedades dieltricas da camada sensvel superfcie dos eltrodos. As variaes da capacidade e
impedncia do sistema encontram-se representadas na Figura 3.2.

Figura 3.2 Variao da capacidade (a) e impedncia (b) em funo da frequncia no sensor com anticorpo anti-
PfHsp70 (33 g/mL) imobilizado na membrana de PVDF, em duas condies: teste sem antignio aplicao de
tampo PBST; teste com antignio aplicao de PfHsp70 em tampo PBST (31 g/mL).

O clculo da variao da capacidade no teste sem antignio foi efetuado subtraindo a capacidade
inicial ao valor da capacidade aps a aplicao do tampo PBST. O clculo da variao da capacidade
no teste com antignio foi efetuado subtraindo a capacidade aps a aplicao do tampo PBST ao
valor da capacidade aps a aplicao do antignio. Para cada teste, o clculo da variao da
impedncia foi efetuado da mesma forma descrita para a capacidade.
(a) (b)
45
A aplicao de tampo PBST produz uma variao decrescente da capacidade com o aumento da
frequncia, sendo positiva para frequncias inferiores 10 kHz. A aplicao do antignio, por sua vez,
produz uma variao contrria da capacidade, completamente negativa e tendendo para 0 para
frequncias inferiores a 10 MHz. Relativamente impedncia, no teste sem antignio a variao
negativa para frequncias inferiores a 10 kHz, enquanto no teste com antignio, a impedncia varia de
forma positiva para as mesmas frequncias. O comportamento inverso da impedncia relativamente
capacidade demonstrado pela Equao 10, que define a impedncia de um condensador perfeito,
onde a impedncia (Z) inversamente proporcional frequncia (f) e capacidade (C)
17
. Desta forma,
para o intervalo de frequncias entre 1 e 10 kHz, a aplicao do tampo PBST produz uma variao
positiva da capacidade e uma variao negativa correspondente da impedncia do sistema,
verificando-se o comportamento oposto no caso da aplicao do antignio. No entanto de notar que
as variaes de capacidade obtidas neste sensor so baixas, situando-se entre 0,1 pF.

(10)

A segunda abordagem no desenvolvimento do IDC
PVDF
consistiu no aumento da concentrao de
anticorpo imobilizado para 66 e 100 g/mL, mantendo a proporo de moles de antignio para as
respetivas concentraes. O objetivo consistiu em provocar um aumento da sensibilidade do sistema,
disponibilizando um nmero maior de molculas de anticorpo e antignio para produzir um aumento
na intensidade da variao da capacidade e impedncia, resultante da interao das biomolculas. Na
Figura 3.3 e Figura 3.4 esto representadas as variaes da capacidade e impedncia para os sensores
com 66 e 100 g/mL de anticorpo usado, respetivamente.

46

PfHsp70 (66 g/mL) imobilizado na membrana de PVDF, em duas condies: teste sem antignio aplicao de
tampo PBST; teste com antignio aplicao de PfHsp70 em tampo PBST (62 g/mL).

PfHsp70 (100 g/mL) imobilizado na membrana de PVDF, em duas condies: teste sem antignio aplicao
de tampo PBST; teste com antignio aplicao de PfHsp70 em tampo PBST (93 g/mL).

Em ambos os sensores (66 e 100 g/mL de anticorpo imobilizado) observa-se um comportamento
semelhante da variao de capacidade e impedncia. A aplicao de tampo PBST produz uma
variao decrescente da capacidade ao longo da frequncia, sendo positiva a frequncias inferiores a
(a) (b)
(a) (b)
47
10 kHz. A aplicao do antignio produz uma variao negativa crescente da capacidade at 3 MHz,
tornando-se seguidamente decrescente. Nos dois sensores, a separao entre as variaes de
capacidade no teste sem e com antignio mais acentuada, uma vez que as duas curvas no chegam a
cruzar-se no intervalo de frequncias de 1 kHz a 10 MHz, ao contrrio do que acontece com a variao
da capacidade do sensor de 33 g/mL frequncia de aproximadamente 20 kHz. No que diz respeito
variao da impedncia, o comportamento dos dois sensores (66 e 100 g/mL) bastante semelhante
entre si e concordante com o comportamento do sensor de 33 g/mL no teste sem antignio a
variao negativa a frequncias inferiores a 10 kHz, enquanto no teste com antignio a variao
positiva para o mesmo intervalo de frequncia.
Para uma melhor comparao da resposta dos trs sensores aps a ligao do antignio, est
representada na Figura 3.5 a variao da capacidade a 1, 10, 100 e 1000 kHz, para as trs
concentraes de anticorpo utilizadas.

PVDF
I, no teste com antignio, para as concentraes
de 33, 66 e 100 g/mL de anticorpo anti-PfHsp70 imobilizado na membrana de PVDF.

Como se pode observar pela Figura 3.5, o aumento da concentrao de anticorpo de 33 para 66 e 100
g/mL produz uma diminuio gradual da capacidade. As maiores variaes foram obtidas
frequncia de 1 kHz, sendo -0,08 88% pF, -0,16 43% pF e -0,21 34% pF para as concentraes
de 33, 66 e 100 g/mL, respetivamente. A frequncia onde se observa maior variao est dentro da
48
gama tima de frequncias (20 Hz a 6 kHz) para deteo de alteraes de capacidade como
consequncia da ligao entre anticorpo e antignio
45
. No entanto, de salientar que as variaes
obtidas so baixas e com um elevado erro de medio associado, pelo que no se podem tirar
quaisquer concluses quanto s diferenas observadas.
O sensor para imunodeteo foi repetido nas mesmas condies, mas invertendo a ordem das
biomolculas imobilizadas na membrana (IDC
PVDF
II ver seco 2.2.4.3). A deteo do anticorpo
anti-PfHsp70 neste segundo sensor feita atravs da ligao do anticorpo livre em soluo ao
antignio imobilizado na membrana. O antignio PfHsp70 foi imobilizado s concentraes de 33, 66
e 100 g/mL, sendo que o anticorpo anti-PfHsp70 foi adicionado posteriormente membrana seca. Na
Figura 3.6 est representada a variao da capacidade a 1, 10, 100 e 1000 kHz, para as trs
concentraes de antignio utilizadas. A variao da capacidade e impedncia em resposta ao teste
com e sem anticorpo para as trs concentraes de antignio encontram-se no Anexo I.

PVDF
II, no teste com anticorpo, para as
concentraes de 33, 66 e 100 g/mL de antignio PfHsp70 imobilizado na membrana de PVDF.

Na Figura 3.6 observa-se que a variao da capacidade para as trs concentraes de antignio
imobilizado maior frequncia de 1 kHz (0,11 64% pF, 0,14 49% pF, 0,24 29% pF para as
concentraes 33, 66 e 100 g/mL, respetivamente), tal como no sensor IDC
PVDF
I (Figura 3.5). No
entanto, neste novo sensor, a variao de capacidade aps a adio do anticorpo positiva, podendo
49
ser indicativo de que a ligao entre o anticorpo e antignio tem um efeito simtrico na variao da
capacidade do sistema, dependendo de qual dos membros do par se encontra imobilizado na matriz de
suporte. Novamente, a frequncia onde h maior variao da capacidade est contida na gama tima
de frequncias (20 Hz a 6 kHz) para imunodeteo
45
. semelhana do sensor IDC
PVDF
I, a variao de
capacidade para as trs concentraes continua a ser baixa e com elevado erro associado, sendo que
para as frequncias de 10, 100 e 1000 kHz, as variaes obtidas so menores ou iguais ao erro da
medio.
A aplicao do antignio ou anticorpo no teste da resposta do sensor (IDC
PVDF
I e II, respetivamente)
feita com a membrana de PVDF seca. Segundo o fabricante, a membrana seca permite ao utilizador
desenvolver um mtodo de imunodeteo mais rpido, pois no necessrio um passo prvio de
bloqueio das membranas, de forma a minimizar interaes inespecficas das biomolculas (ex.: ligao
do antignio diretamente membrana e no ao anticorpo)
33
. No entanto, a membrana de PVDF seca
apresenta um comportamento hidrofbico que pode impedir a difuso das biomolculas em soluo
para o seu interior, impedindo que ocorra a ligao entre o anticorpo e antignio no seio da matriz.
Na seco seguinte analisado o processo de deposio de antignio na membrana de PVDF em
condies hidrofbicas e hidroflicas.

3.1.2 Influncia do pr-tratamento da membrana de PVDF com lcool na penetrao da
soluo de antignio atravs da matriz
Como foi referido na seco anterior, a membrana de PVDF tem um carter hidrofbico que pode
condicionar a penetrao do antignio em soluo para o interior da membrana. De forma a conferir
um carter hidroflico, a membrana pode ser tratada previamente com um lcool antes da deposio da
soluo com antignio.
Para testar o efeito do tratamento da membrana de PVDF com lcool, imobilizou-se enzima HRP
como simulao do antignio, em duas condies diferentes. Na primeira imobilizao, a membrana
de PVDF estava completamente seca antes da adio de HRP em tampo PBS, enquanto na segunda
imobilizao, a membrana de PVDF foi hidratada pela adio de Isopropanol, previamente adio da
soluo de antignio. De forma a detetar a diferena da quantidade de enzima imobilizada nas duas
condies, as membranas foram colocadas no fundo de cuvettes de quartzo cheias de ABTS (substrato
cromogneo) e Perxido de Hidrognio (ver seco 2.2.5.1). A enzima HRP catalisa a reduo do
Perxido de Hidrognio a gua, com a oxidao acoplada do substrato cromogneo ABTS, resultando
num aumento da tonalidade verde da soluo
43
. Na Equao 11 est expressa a reao de oxidao do
ABTS.
50

(11)

A cintica de oxidao do substrato vai portanto depender da quantidade de enzima imobilizada na
membrana. Na Figura 3.7 esto representadas as cinticas de oxidao do substrato para cada uma das
membranas.

Figura 3.7 Influncia do tratamento prvio da membrana de PVDF na capacidade de penetrao da soluo de
antignio: PVDF seco membrana seca (carter hidrofbico); PVDF hidratado membrana tratada previamente
com Isopropanol 50% (v/v) e hidratada (carter hidroflico).

Como se pode observar pela Figura 3.7, a membrana de PVDF hidratada apresenta uma cintica de
oxidao do substrato cerca de 4 vezes superior cintica da membrana seca, indicando que na
membrana hidratada existe uma quantidade de enzima imobilizada que cerca de 4 vezes superior
enzima presente na membrana seca. Uma explicao para a diferena entre as cinticas de oxidao
apresentadas pelas duas membranas consiste em que na membrana seca, a enzima ter ficado
imobilizada apenas na camada superficial da matriz. No caso da membrana hidratada, a soluo de
HRP ter penetrado no interior da matriz, onde esto disponveis mais lugares de imobilizao.
51
O resultado da Figura 3.7 indica que o tratamento prvio da membrana com lcool resulta numa maior
penetrao do antignio na matriz, arrastado pela respetiva soluo que o contm. Com base nesta
informao, prepararam-se dois sensores idnticos (IDC
PVDF
III) com anticorpo anti-HRP imobilizado
(100 L de soluo 100 g/mL) numa membrana que foi posteriormente bloqueada com BSA 0,2%
(p/v). O teste das solues foi feito aps um passo de reidratao da membrana para promover a
penetrao das solues para o interior da matriz. O teste sem antignio foi efetuado depositando
tampo PBST sobre a membrana de um dos sensores, enquanto o teste com antignio foi feito
depositando HRP em tampo PBST sobre o outro sensor. As variaes da capacidade e impedncia
dos dois sensores encontram-se representadas na Figura 3.8.

HRP (100 g/mL) imobilizado na membrana de PVDF, em duas condies: teste sem antignio aplicao de
tampo PBST; teste com antignio aplicao de HRP em tampo PBST (59 g/mL).

O clculo da variao da capacidade em cada situao consistiu na subtrao da capacidade inicial ao
valor da capacidade aps a aplicao da soluo teste no respetivo sensor. O clculo da variao da
impedncia, para o cada um dos testes, foi efetuado da mesma forma descrita para a capacidade.
Como se pode observar pela Figura 3.8, a aplicao de tampo PBST sem antignio produz um
decrscimo significativo em relao capacidade inicial do sensor, enquanto a aplicao da soluo
com antignio produz um ligeiro aumento da capacidade no intervalo de frequncia entre 1 kHz e 1
MHz. Em relao impedncia do sistema, para frequncias inferiores a 100 kHz, a aplicao de
tampo PBST produz um aumento da impedncia, enquanto a aplicao do antignio em soluo
(a) (b)
52
produz um efeito contrrio. O comportamento oposto da resposta do sensor nas duas situaes, tanto
em termos de capacidade, como de impedncia, indicativo de que o sistema capaz de descriminar
entre as duas solues.
semelhana dos sensores IDC
PVDF
I e II, a maior variao da capacidade em resposta presena do
antignio foi obtida frequncia de 1 kHz (0,15 47% pF). No entanto, o valor da variao continua a
ser baixo e com erro elevado. Uma vez que a deposio do antignio foi feita na membrana
humedecida, seria espectvel um aumento na intensidade da variao da capacidade como resultado da
ligao entre o anticorpo imobilizado na matriz e o antignio, o que no se verificou. Tendo em conta
a variao da capacidade produzida pela aplicao do tampo PBST sem antignio, por exemplo,
frequncia de 1 kHz (-0,61 11% pF), observa-se que a soluo tampo produz uma variao
contrria e mais acentuada em comparao com a variao produzida pelo antignio. O efeito do
tampo na capacidade do sistema foi analisado (ver Figura 3.9) atravs da construo de dois sensores
IDC
PVDF
em bruto (membranas sem protenas), testando 6 vezes a resposta do sistema adio de
tampo PBST.

Figura 3.9 Capacidade nominal de dois sensores IDC
PVDF
(A e B) para as frequncias 1 kHz (), 10 kHz (),
100 kHz () e 1000 kHz (), ao longo de 6 adies de tampo PBST (100 L) sobre a membrana de PVDF sem
anticorpo. Entre cada adio de soluo as membranas dos sensores foram reidratadas. A adio 0 representa a
capacidade inicial do sensor.

Atravs da Figura 3.9 observa-se que a capacidade dos sensores A e B varia de forma
maioritariamente decrescente com as adies sucessivas do tampo PBST. Uma explicao possvel
para o decrscimo sucessivo da capacidade com a adio de tampo poder estar relacionada com o
(A) (B)
53
aumento de ies presentes na membrana de PVDF com cada adio de tampo. No Anexo II encontra-
se a composio elementar de uma membrana de PVDF tratada com tampo PBST, onde se pode
observar a presena vestigial de elementos constituintes do tampo (ex.: P, Cl e Na). Relacionando a
informao obtida na Figura 3.8 e Figura 3.9 pode-se inferir que o efeito do tampo na capacidade do
sistema poder estar a mascarar o fenmeno de ligao entre o anticorpo e antignio, resultando numa
baixa variao da capacidade aquando do teste com HRP.
Outra explicao para a baixa variao produzida pelo teste do antignio est relacionada com o
bloqueio da membrana. A utilizao da membrana humedecida necessita de um passo de
bloqueamento com um agente inerte (neste caso BSA), que no interfira na interao entre o anticorpo
e antignio e ao mesmo tempo ocupe os espaos de ligao vazios dentro da matriz de suporte,
minimizando as interaes inespecficas entre o antignio e a membrana. Na construo do sensor III
adicionou-se membrana de PVDF 0,2% (p/v) de agente de bloqueio, que representa a concentrao
mnima recomendada pelo fabricante
33
. A concentrao usada pode no ser suficiente para bloquear de
forma efetiva a membrana, podendo o antignio estar a ligar-se maioritariamente membrana e no ao
anticorpo.
Na seco seguinte analisado o processo de bloqueio da membrana de PVDF com vista sua
otimizao.

3.1.3 Otimizao do processo de bloqueio da membrana de PVDF
O bloqueio da membrana de PVDF, como referido anteriormente, essencial para a minimizao das
interaes inespecficas entre o antignio e a matriz, no passo da deteo. A utilizao de agentes
bloqueantes que ocupam os lugares vazios na matriz, disponveis para ligao aps a imobilizao do
anticorpo, permite que o antignio permanea livre para difundir ao longo da membrana e ligar-se ao
respetivo anticorpo. Desta forma, o bloqueio assegura que a variao das propriedades dieltricas
sentidas pelo sensor no sejam o resultado de um falso-positivo provocado pela ligao do antignio
membrana, mas antes o produto da interao entre o antignio e o anticorpo imobilizado.
Para obter o melhor compromisso entre a natureza e concentrao de agente bloqueante, tempo e
mtodo do processo, efetuou-se um estudo sobre o processo de bloqueio da membrana de PVDF (ver
seco 2.2.5.2). O estudo do bloqueio foi feito com um conjunto de 4 membranas de PVDF hidratadas,
com deteo final do antignio HRP atravs do registo tico da oxidao do substrato cromogneo
ABTS. No estudo, o controlo negativo consistiu numa membrana bloqueada, sem anticorpo
imobilizado e sem adio de antignio HRP. Este controlo teve como objetivo demonstrar que na
ausncia do antignio a cintica de oxidao do substrato praticamente nula. O controlo positivo
consistiu numa membrana no bloqueada, sem anticorpo imobilizado, qual foi adicionado o
54
antignio HRP. O propsito deste controlo consistiu em fornecer uma referncia para a totalidade de
enzima que fica imobilizada na membrana. A membrana bloqueada sem anticorpo imobilizado e
qual foi adicionado antignio teve como objetivo fornecer uma noo do papel do agente de bloqueio
no impedimento da ligao do antignio membrana. A membrana bloqueada e com anticorpo
imobilizado teve como objetivo mimetizar as condies das membranas coladas sobre os sensores. Na
Figura 3.10 esto representados os resultados do bloqueio com BSA 2% (p/v), durante 1 e 16 horas,
bem como o bloqueio com BSA 5% (p/v) durante 1 hora.

Figura 3.10 Otimizao do processo de bloqueio das membranas de PVDF com BSA. Ensaio A bloqueio
com 100 L de BSA 0,2% (p/v) durante 1 hora (a). Ensaio B bloqueio com 100 L de BSA 0,2% (p/v) durante
16 horas (b). Ensaio C bloqueio com soluo de BSA 5% (p/v) durante 1 hora (c). A membrana de PVDF sem
antignio e a membrana de PVDF apenas com antignio constituem o controlo negativo e positivo,
respetivamente. Cada membrana de PVDF foi produzida em duplicado.
(c)
(a) (b)
55
O primeiro ensaio (Figura 3.10.a) consistiu na avaliao do bloqueio aplicado no sensor IDC
PVDF
III
(ver seco 2.2.4.4), onde a membrana foi bloqueada com 100 L de soluo BSA 0,2% (p/v) durante
1 hora. Comparando a membrana de PVDF apenas bloqueada com BSA com a membrana do controlo
positivo observa-se que a cintica de oxidao do substrato menor para a membrana bloqueada,
correspondendo a uma diferena de cerca de 20%. A diferena entre as duas membranas pode ser
explicada pela ao da BSA presente na membrana bloqueada, que impediu a ligao de algum
antignio matriz. Com uma menor quantidade de enzima presente na membrana, a cintica de
oxidao do substrato mais lenta, resultando na diferena observada. A membrana bloqueada com
BSA contendo o anticorpo anti-HRP imobilizado apresenta uma cintica de oxidao 15% superior ao
controlo positivo. Comparando as duas membranas bloqueadas, com e sem anticorpo, para este ensaio,
obtm-se que a presena do anticorpo na membrana capaz de aumentar a quantidade de antignio
retido no interior da matriz, resultando num aumento da cintica de oxidao em cerca de 35%. Este
aumento provocado pela presena de HRP na membrana que est ligado ao anticorpo. No entanto,
de notar que tanto a cintica da membrana bloqueada sem anticorpo, como a cintica da membrana
bloqueada com anticorpo, tm um erro associado de 30% e 20%, pelo que o bloqueio no pode ser
considerado eficaz.
O segundo ensaio (Figura 3.10.b) teve como objetivo averiguar o efeito do tempo de incubao do
bloqueio da membrana. O bloqueio foi feito com uma gota de 100 L de soluo BSA 0,2% (p/v)
sobre as membranas, durante 16 horas. A incubao do anticorpo sobre a membrana teve a durao de
4 horas, para averiguar se o aumento do tempo de contacto entre a soluo com anticorpo e a
membrana teria efeito na cintica de oxidao medida posteriormente. Comparando a membrana
apenas bloqueada com BSA, durante 16 horas, com o controlo positivo observa-se que a cintica de
oxidao do substrato menor para a membrana bloqueada, correspondendo a uma diminuio de
21%. A diferena obtida entre a membrana bloqueada e o controlo positivo no ensaio B no sofreu
melhoria quando comparada com a mesma diferena para o ensaio A, demonstrando que para BSA
0,2% (p/v) um bloqueio de 1 hora suficiente. A membrana bloqueada com BSA (16 horas) contendo
o anticorpo anti-HRP imobilizado (4 horas) apresenta uma cintica de oxidao 25% superior ao
controlo positivo. Comparando as duas membranas bloqueadas, com e sem anticorpo, para este ensaio,
obtm-se que a presena do anticorpo na membrana resulta num aumento da cintica de oxidao em
cerca de 46%, como consequncia do antignio ligado ao anticorpo. Comparando a variao das
mesmas membranas para o ensaio A, observa-se que o aumento do tempo de imobilizao do
anticorpo produziu um aumento de 10% da cintica de oxidao. Por questo prtica do fabrico do
sensor, decidiu-se manter o tempo de imobilizao do anticorpo em 1 hora.
No terceiro ensaio (Figura 3.10.c) com BSA optou-se por aumentar a concentrao do agente
bloqueante para o mximo recomendado pelo fabricante. As membranas foram colocadas numa
soluo de BSA 5% (p/v), com agitao, de forma a garantir que toda a superfcie das membranas
56
estaria em contato com o agente bloqueante. O tempo de lavagem das membranas aps cada
tratamento foi duplicado, de forma a garantir que a BSA em excesso no estivesse a bloquear a entrada
dos poros, impedindo a difuso do antignio para o interior da membrana. Analisando a diferena
entre a membrana bloqueada sem anticorpo e o controlo positivo, observa-se que a primeira apresenta
uma cintica superior face ao controlo positivo. Este resultado pode ser indicativo de que o bloqueio
no tenha sido bem-sucedido para a primeira membrana. Por outro lado, o facto de o controlo positivo
apresentar uma cintica inferior pode estar relacionado com o carter hidrofbico da membrana de
PVDF. Durante a preparao das membranas, o pr-tratamento com Isopropanol pode ter sido
insuficiente no caso das membranas controlo. Uma parte da matriz pode ter mantido o seu carter
hidrofbico, dificultando a difuso da soluo de antignio para o interior da membrana, resultando
numa menor quantidade de HRP presente.
Nos trs ensaios com BSA enquanto agente de bloqueio, no foi possvel obter um bloqueio
completamente eficaz da membrana. Um bloqueio ideal teria sido indicado por uma cintica da
membrana bloqueada sem antignio o mais prximo de 0 possvel, indicando que o maior nmero
possvel de lugares disponveis para ligao da matriz estaria ocupado pela BSA. Como alternativa
BSA, aplicou-se leite em p magro como agente bloqueante nas membranas. O leite enquanto agente
de bloqueio representa uma soluo coloidal rica em protenas de diversos tamanhos, que podero
ocupar mais facilmente diversos locais de ligao no interior da matriz
20,46,47
. Na Figura 3.11 esto
representados os resultados do bloqueio com leite em p 5% (p/v), durante 1 hora, para duas
concentraes de anticorpo imobilizado 100 e 200 g/mL.

57

Figura 3.11 Otimizao do processo de bloqueio das membranas de PVDF com leite em p. Ensaio D
bloqueio com soluo de leite em p 5% (p/v) durante 1 hora (a). Ensaio E bloqueio com soluo de leite em
p 5% (p/v) durante 1 hora e aumento da concentrao de anticorpo imobilizado para 200 g/mL (b). A
membrana de PVDF sem antignio e a membrana de PVDF apenas com antignio constituem o controlo
negativo e positivo, respetivamente. Cada membrana de PVDF foi produzida em duplicado.

Em ambos os ensaios, as membranas foram colocadas numa soluo de leite em p 5% (p/v), com
agitao, de forma a garantir que toda a superfcie das membranas estaria em contato com o agente
bloqueante. Como se pode observar pela Figura 3.11.a, a cintica de oxidao da membrana bloqueada
sem anticorpo corresponde a cerca de metade da cintica do controlo positivo. A cintica da
membrana com anticorpo difere em 17% do controlo positivo. Quando comparados com os resultados
dos ensaios com BSA, os resultados do ensaio D so indicativos de que o leite em p permite um
bloqueio das membranas mais eficaz. A cintica da membrana com anticorpo inferior ao controlo
positivo, o que no sucede nos ensaios com BSA. Num bloqueio ideal, o controlo positivo dever ter o
maior sinal das trs membranas, pois tem o maior nmero de locais disponveis para ligao
desocupados no interior da matriz. A membrana com anticorpo e bloqueada dever ter um sinal
inferior ao controlo positivo, indicando que o sinal produzido pelo antignio (enzima HRP) referente
apenas poro que conseguiu ligar ao anticorpo.
O ensaio D demonstrou que o leite em p foi mais eficaz a bloquear a membrana. De forma a
aumentar a contribuio do anticorpo no sinal produzido, mas mantendo o efeito do bloqueio, no
ensaio E optou-se por duplicar a concentrao do anticorpo e antignio, mantendo a condio do
bloqueio aplicada no ensaio D. Pela Figura 3.11.b observa-se que duplicando a concentrao do
antignio HRP aplicado na membrana anula o efeito do bloqueio com leite, uma vez que as cinticas
do controlo positivo e da membrana bloqueada sem anticorpo diferem em apenas 1%. Os resultados do
(a) (b)
58
ensaio D para as mesmas membranas indicam que o bloqueio com leite eficiente, pelo que a pequena
diferena demonstrada no ensaio E pode ser explicada pela reteno de antignio nos poros da
membrana. No entanto, o sinal produzido pela membrana com anticorpo cerca de 3 vezes maior do
que o controlo positivo, representando a maior contribuio do anticorpo na ligao do antignio
obtida nos cinco ensaios realizados.
Das cinco condies testadas nesta seco, selecionaram-se as condies do ensaio E para os restantes
sensores. As condies do ensaio E representam um compromisso entre o bloqueio da membrana e a
quantidade de biomolculas disponveis para interagir no interior da matriz.
Aps a seleo das condies para o bloqueio dos prximos sensores, avaliou-se a questo da difuso
do anticorpo e antignio ao longo das membranas, de forma a assegurar que as biomolculas
atravessam a matriz em toda a sua extenso.

3.1.4 Difuso do anticorpo e antignio atravs da membrana de PVDF
Para avaliar a distribuio do anticorpo ao longo da membrana aps o processo de imobilizao,
aplicaram-se 60 L de soluo de anticorpo conjugado com fluorforo FITC sobre uma membrana de
PVDF, durante 1 hora. A membrana foi analisada de seguida no microscpio confocal. Como
referncia foi utilizada uma membrana de PVDF sem anticorpo. Na Figura 3.12 est representada a
intensidade de fluorescncia ao longo do corte transversal das duas membranas.

59

Figura 3.12 Determinao da distribuio do anticorpo atravs da membrana de PVDF aps o processo de
imobilizao. Membrana de referncia () fluorescncia de fundo da membrana de PVDF. Membrana tratada
com anticorpo () fluorescncia emitida pelo fluorforo FITC conjugado com o anticorpo anti-IgG de rato.

Comparando a intensidade da fluorescncia das duas membranas, observa-se que a membrana
incubada com anticorpo apresenta uma intensidade de fluorescncia muito superior membrana de
referncia. A intensidade da fluorescncia em ambas as extremidades da membrana com anticorpo
cerca de 6 vezes superior intensidade da membrana de referncia. Este valor indica que a soluo de
anticorpo aplicada no topo da membrana difundiu com sucesso at extremidade oposta. O mximo
da intensidade presente a cerca de metade da espessura da membrana (60 m) pode ser um artefacto
produzido pela rugosidade da superfcie do corte transversal, como pode ser observado na imagem da
membrana com anticorpo da Figura 3.12. Por esta razo, a regio central do corte transversal no deve
ser interpretada como sendo o local de maior concentrao de anticorpo. O presente ensaio demonstra
que o anticorpo est presente ao longo de toda a espessura da membrana de PVDF, sendo portanto
abrangido pelo campo eltrico produzido pelos microeltrodos do sensor IDC
PVDF
.
A difuso do antignio atravs da membrana foi determinada atravs da deposio de 50 L de
soluo de HRP sobre uma membrana com anticorpo anti-HRP imobilizado e bloqueada com leite em
p 5% (p/v) ver seco 2.2.6.1. A deteo do antignio foi feita seguindo o pico de oxidao do
ABTS a 424 nm. Na Figura 3.13 esto representados os resultados da penetrao do antignio ao
longo da membrana de PVDF.

Membrana de referncia
Membrana tratada com anticorpo
~120 m
~120 m
60

Figura 3.13 Difuso do antignio HRP atravs da membrana de PVDF com anticorpo anti-HRP imobilizado e
bloqueada com leite em p 5% (p/v). Uma segunda membrana de PVDF, no tratada, foi colocada sob a
membrana com anticorpo, de forma a captar o antignio que atravessasse completamente a membrana superior.

Uma boa penetrao do antignio na membrana essencial para o sucesso do sensor, pois caso
contrrio no haver interao entre o par anticorpo/antignio capaz de ser detetada na regio de
medio do campo eltrico. Os resultados da Figura 3.13 demonstram que a soluo de HRP
atravessou com sucesso a membrana de PVDF (com anticorpo e bloqueada), chegando at
membrana inferior. Pela diferena das cinticas apresentadas pelas duas membranas, observa-se que a
maioria do antignio ficou retida na membrana inferior. Esta diferena poder ser explicada pela ao
do leite enquanto agente bloqueante, que compete com o antignio pelos lugares de ligao
disponveis na matriz, permitindo que este apenas se ligue ao anticorpo ou continue o seu trajeto de
difuso ao longo da membrana. Os resultados tanto da Figura 3.12, como da Figura 3.13, demonstram
que o anticorpo e antignio so capazes de difundir ao longo de toda a espessura da membrana, pelo
que estaro perfeitamente localizados dentro da regio de medio do campo eltrico gerado pelos
microeltrodos do sensor. Com base nesta informao construram-se mais trs sensores IDC
PVDF
nas
condies do ensaio E (ver seco anterior), com vista deteo do analito/antignio especfico, HRP.
Os resultados obtidos so apresentados e analisados na seco seguinte.

61
3.1.5 Deteo do analito especfico HRP
Aps os ensaios de otimizao do bloqueio e avaliao da penetrao do par anticorpo/antignio na
membrana de PVDF, fabricaram-se trs sensores (IDC
PVDF
IV) contendo anticorpo anti-HRP para
testar a resposta da variao de capacidade nas condies do ensaio E da seco 3.1.3 (ver Figura
3.14.): i) ausncia de antignio, aplicando somente tampo PBST sobre a membrana; ii) presena do
antignio HRP; iii) presena de um antignio que no tem eptopos reconhecidos pelo anticorpo, tendo
sido utilizada a protena PfHsp70 para o efeito.

PVDF
IV, para membranas com o anticorpo anti-
HRP testadas na ausncia de antignio (tampo PBST), na presena de antignio HRP (antignio especfico) e
teste com PfHsp70 (antignio no especfico). O anticorpo anti-HRP (200 g/mL, 100 L) foi imobilizado nas
membranas, com bloqueio posterior com leite em p 5% (p/v). Sobre os respetivos sensores foram aplicados 100
L de soluo de HRP (117 g/mL) ou de PfHsp70 (187 g/mL).

As variaes de capacidade apresentadas na Figura 3.14 indicam que o sensor no foi capaz de
distinguir com sucesso as trs solues aplicadas. Para as quatro frequncias analisadas, as variaes
obtidas para o teste sem antignio (tampo PBST) e PfHsp70 (antignio no especfico) so inferiores
ao erro da medio. O mesmo verifica-se para o teste com antignio HRP (antignio especfico) onde,
com exceo da frequncia 1 kHz, todas as variaes obtidas so inferiores ao erro associado. A
presena do antignio na membrana do sensor foi confirmada atravs da deposio de soluo do
substrato ABTS sobre o sensor (ver Anexo III). Ao fim de 3 minutos, a membrana adquiriu um tom
verde, indicando a oxidao do substrato pela enzima presente na membrana. O controlo foi feito
62
depositando a mesma soluo sobre a membrana do sensor com PfHsp70. Nesta membrana no se
observou qualquer alterao de cor, pelo que o substrato no foi oxidado.
Com base nos resultados da Figura 3.14, as condies aplicadas no sensor IDC
PVDF
IV no foram bem-
sucedidas na produo de um aumento do sinal correspondente interao do par anticorpo/antignio,
apesar do aumento da concentrao de anticorpo imobilizado e antignio aplicado. Na seco 3.1.2 foi
demonstrado que a aplicao de tampo PBST produz uma diminuio acentuada da capacidade do
sistema. No entanto, a diminuio no se verificou no caso do sensor IDC
PVDF
IV, uma vez que as
variaes obtidas so inferiores ao erro associado, no podendo ser consideradas significativas. Uma
possvel explicao para a os resultados obtidos pode estar relacionada com o processo de fabrico do
prprio sensor. A fixao da membrana sobre o transdutor feita de forma manual, sem um controlo
preciso da espessura de cola utilizada. Sendo o sistema de medio utilizado sensvel a variaes que
ocorrem superfcie do transdutor, o controlo da espessura da interface entre os microeltrodos e a
membrana essencial para um adequado funcionamento do sensor com boa reprodutibilidade.

3.1.6 Fixao da membrana de PVDF sobre o transdutor, mediada por um filme de cola epxi
A deposio de um filme de cola com espessura controlada pode ser facilmente conseguida atravs de
spin-coating. No entanto, a cola utilizada at este momento (Cianoacrilato) no indicada para uma
deposio por spin-coating, pois seca rapidamente durante o processo de fabrico do filme,
impossibilitando a fixao posterior da membrana.
Como alternativa cola de Cianoacrilato optou-se por produzir um filme de cola epxi por spin-
coating, com o propsito de uniformizar e diminuir a espessura da camada de cola para os sensores
fabricados. Os trs sensores foram reproduzidos nas mesmas condies, utilizando a camada de cola
epxi para fixar a membrana superfcie dos microeltrodos (IDC
PVDF
V ver seco 2.2.4.6). Na
Figura 3.15 esto representadas as variaes de capacidade para a ausncia e presena do antignio
HRP e presena do analito no especfico PfHsp70.

63

PVDF
V, para o teste sem antignio (tampo PBST),
teste com antignio HRP (analito especfico) e teste com PfHsp70 (analito no especfico). No fabrico do sensor
foi utilizada cola epxi para fixar a membrana sobre os microeltrodos. Anticorpo anti-HRP (200 g/mL, 100
L) foi imobilizado nas membranas, com bloqueio posterior com leite em p 5% (p/v). Sobre os respetivos
sensores foram aplicados 100 L de soluo de HRP (117 g/mL) e PfHsp70 (187 g/mL).

A variao da capacidade provocada pelo tampo PBST foi negativa e superior ao erro associado,
estando de acordo com os resultados observados na seco 3.1.2 relativamente ao efeito do tampo na
capacidade do sistema. A variao da capacidade para o teste com o analito no especfico PfHsp70
pode ser considerada nula, pois para as quatro frequncias analisadas, a variao obtida foi inferior ao
erro. A adio deste analito na membrana no provocou, portanto, qualquer alterao significativa no
sistema, pelo que poder nem estar presente no interior da matriz. A variao produzida no teste com
antignio HRP foi superior ao erro associado, para todas as frequncias, mas negativa e semelhante
variao da capacidade no teste sem antignio, para as frequncias superiores a 1 kHz. Com base
nestes resultados, no se pode considerar que o sensor com cola epxi tenha produzido uma resposta
distinta do teste com tampo PBST em relao ao teste com HRP. A espessura da camada de cola foi
determinada como tendo cerca de 50 m de espessura (ver Anexo IV), um valor no desejvel pois
compreende apenas um quarto da zona de deteo.
Os sensores com membrana de PVDF aqui apresentados necessitam ainda de investigao sobre o
processo de fixao da membrana ao transdutor, o tipo de medio eltrica e o aumento da
sensibilidade da camada sensvel produzida pelos anticorpos imobilizados. O processo de fixao da
membrana tem de garantir que a extremidade inferior da matriz esteja o mais prximo possvel do
transdutor, tendo tambm de assegurar que a espessura da interface entre a membrana e o transdutor
64
seja igual e constante durante as repeties do sensor. As baixas variaes de capacidade na presena
do antignio podem tambm ser resultado de uma fraca sensibilidade do mtodo de medio eltrica,
sendo necessria uma anlise futura sobre mtodos de medio alternativa, como por exemplo, a
utilizao de medidas diferenciais com um amplificador Lock-In. Por fim, a quantidade de anticorpo
aplicada nas membranas pode ser insuficiente para promover uma alterao significativa da
capacidade do sensor. Uma soluo seria saturar a membrana com anticorpo. No entanto, esta
abordagem apresenta uma desvantagem imediata, pois iria encarecer o processo de fabrico do sensor.
ento necessrio um estudo sobre a quantidade de anticorpo mnima na membrana para gerar um
sinal passvel de medio e consequente viabilidade econmica do sensor.

3.2 Sensor com nanobastonetes de ZnO
3.2.1 Deposio e caraterizao dos nanobastonetes de ZnO superfcie do transdutor
Como foi referido anteriormente, os nanobastonetes de ZnO apresentam propriedades interessantes
cintica de transferncia eletrnica rpida; ponto isoeltrico elevado; razo rea superficial/volume
elevada; estabilidade qumica; atividade eletroqumica; biocompatibilidade que os tornam bastante
atrativos como suporte imobilizao de biomolculas para fins sensoriais
3739
. O processo de
imobilizao de protenas sobre os nanobastonetes de ZnO mais complexo do que no caso das
membranas de PVDF, requerendo a utilizao de agentes de reticulao (cross-linkers). No entanto,
devido ligao estabelecida entre as nanoestruturas e as protenas ser mais robusta do que a mera
fisissoro, menos provvel que ocorra perda de material biolgico nas lavagens dos sensores,
durante as fases de fabrico e teste.
Os nanobastonetes foram sintetizados diretamente sobre os microeltrodos de ouro com 10 m de
espaamento (G) e largura (W). Aplicando a frmula
IDC
=2(G+W)
13
obtm-se que a regio de medida
de 40 m, cobrindo perfeitamente a camada sensvel (espessura de m) resultante da imobilizao
de anticorpos sobre os nanobastonetes. O mtodo de sntese das nanoestruturas aplicado neste trabalho
consistiu na sntese qumica hidrotrmica. O processo consiste na deposio de pequenos centros de
nucleao (seeds) sobre a superfcie do substrato onde ir ocorrer o crescimento das estruturas,
seguido da colocao do substrato em contato com uma soluo aquosa aquecida, voltado para baixo,
desencadeando o crescimento das estruturas a partir das seeds. O mtodo relativamente simples e
com baixo custo associado. No necessita de temperaturas elevadas e produz um grande volume de
estruturas de ZnO
37
.
O primeiro passo no desenvolvimento do sensor com nanobastonetes de ZnO (IDC
ZnO
) consistiu na
seleo da melhor condio de sntese das nanoestruturas superfcie dos microeltrodos. Foram
65
analisados quatro tempos de sntese 1,5, 3, 5 e 7 horas num reator com agitao e temperatura
controlados (ver seco 2.2.7.2). Os resultados dos quatro tempos de sntese encontram-se no Anexo V.
As snteses de 5 e 7 horas produziram uma camada de nanobastonetes que cobria perfeitamente a rea
abrangida pelos microeltrodos. Por uma questo prtica do fabrico do sensor, estabeleceu-se o tempo
de sntese em 6 horas.
Os nanobastonetes sintetizados sobre a superfcie do transdutor foram caraterizados por microscopia
eletrnica no Centro de Investigao de Materiais da FCT-UNL (ver Figura 3.16). As nanoestruturas
compem uma matriz heterognea tridimensional superfcie do transdutor e apresentam uma
configurao em estrela, sendo que as pontas possuem uma altura mdia de 500 nm e uma largura de
cerca de 100 nm.
A estabilidade dos nanobastonetes em contato com a soluo de tampo PBS foi testada, lavando o
transdutor durante 30 minutos com tampo PBS, duas vezes com um passo intermdio de secagem. Na
Figura 3.17 est representada uma seco do transdutor aps a sntese dos nanobastonetes e a mesma
seco aps as duas lavagens com tampo PBS. As nanoestruturas de ZnO permaneceram intactas
aps as lavagens. A estabilidade dos nanobastonetes importante para o bom funcionamento do
sensor, uma vez que as estruturas representam o suporte de imobilizao dos anticorpos, pelo que
importante que permaneam inalteradas durante o processo de fabrico do sensor, bem como durante o
teste das solues sem e com analitos.

66

Figura 3.16 Caraterizao dos nanobastonetes de ZnO sintetizados superfcie do transdutor. Imagem SEM
realizada no Centro de Investigao de Materiais da Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova
de Lisboa (CENIMAT, FCT-UNL).

Figura 3.17 Avaliao da estabilidade dos nanobastonetes de ZnO aps contato com a soluo de tampo PBS.
O transdutor com nanobastonetes foi lavado duas vezes com tampo PBS. As nanoestruturas permaneceram
intactas aps o contato com o tampo, como se pode observar nas regies circuladas a vermelho.

3.2.2 Deteo do antignio HRP
Uma vez confirmada a estabilidade dos nanobastonetes de ZnO, prosseguiu-se construo de trs
sensores idnticos, sintetizando simultaneamente as nanoestruturas sobre trs transdutores, no interior
Aps sntese Aps duas lavagens
67
de um reator (ver seco 2.2.7.2). Seguidamente os trs sensores foram sujeitos a um passo de
reticulao do anticorpo aos nanobastonetes, seguido de um passo de bloqueio. Cada um dos sensores
preparados foi ento testado com uma soluo diferente. Na Figura 3.18 esto representadas a
componente real (Z
Re
) e imaginria (Z
Im
) da impedncia ao longo da construo e teste dos trs
sensores.

Figura 3.18 Comparao da componente real (Z
Re
) e imaginria (Z
Im
) da impedncia para cada passo da
construo e teste dos trs sensores: a) sensor testado com tampo PBS; b) sensor testado com soluo de
PfHsp70 (analito no especfico); c) sensor testado com antignio HRP (analito especfico).

(c)
(a)
(b)
68
Pela anlise das duas componentes da impedncia observa-se que cada passo da construo do IDC
ZnO

produziu uma alterao da impedncia comum aos trs sensores. O revestimento dos nanobastonetes
com MPTMS (Figura 3.18, curva vermelha) e reticulao (cross-linking) do anticorpo (Figura 3.18,
curva verde) provocaram uma descida sucessiva e acentuada tanto Z
Re
, como da Z
Im
, nos trs sensores.
A adio destas molculas superfcie dos transdutores pode estar a facilitar a conduo de corrente
atravs das pistas dos microeltrodos, resultando numa diminuio da impedncia do sistema. O
bloqueio com BSA teve um efeito contrrio, provocando um aumento da componente imaginria
(entre 150 e 250 O) e real (entre 600 e 950 O) da impedncia. Comparando variao da Z
Re
e Z
Im
aps
o bloqueio, observa-se que para os trs sensores a componente real relacionada com a resistncia do
sistema a que apresenta maior variao. O agente de bloqueio foi aplicado em excesso (5% p/v), de
forma a garantir que todos os locais livres superfcie do transdutor fossem ocupados. O excesso de
BSA aplicado pode ter formado zonas de grande acumulao da protena, criando uma barreira
resistiva sobre o transdutor. A semelhana no comportamento da variao da impedncia (real e
imaginria) para os trs sensores, em cada passo do processo de fabrico um fator indicativo da sua
reprodutibilidade.
Na fase de teste do sensor, observa-se que a aplicao da soluo de tampo PBS e da soluo de
PfHsp70 (analito no especfico) provocou uma variao da impedncia idntica. Para as duas
solues, a Z
Im
variou -100 O e a Z
Re
variou -400 O. A aplicao da soluo de antignio HRP (analito
especfico) provocou uma variao de 375 O para a Z
Im
e de 1400 O para a Z
Re
. A ligao do
antignio ao anticorpo aumentou a impedncia do sistema, com uma maior contribuio da
componente resistiva.
Na Figura 3.19.a est expressa a variao da capacidade do sensor IDC
ZnO
no intervalo de frequncia
entre 100 Hz e 10 MHz para cada um dos testes efetuados.

69

Figura 3.19 (a) Comparao da variao da capacidade do sensor IDC
ZnO
para as solues de tampo PBS,
PfHsp70 (analito no especfico) e antignio HRP (analito especfico). (b) Confirmao da presena do antignio
HRP no sensor atravs da oxidao do substrato ABTS. Apenas a soluo em contato com o sensor com HRP
sofreu alterao de cor, confirmando a presena do antignio.

A aplicao de soluo com antignio HRP sobre o sensor produziu uma variao negativa da
capacidade, mais acentuada no intervalo de frequncias entre 1 e 10 kHz (-6,75 3% nF e -7,65 4%
nF, respetivamente). Para as mesmas frequncias, a aplicao da soluo de tampo PBS (0,76 62%
nF e 1,67 25% nF) e de PfHsp70 (2,77 9% nF e 4,29 6% nF) produziu uma variao positiva da
capacidade. Estes sensores geraram, portanto, um sinal capaz de descriminar entre a presena e
ausncia do antignio especificamente detetado pelo anticorpo imobilizado. O intervalo de frequncias
onde houve maior variao da capacidade (1-10 kHz) encontra-se na gama tima de frequncias (20
Hz a 6 kHz) para detetar alteraes de capacidade como consequncia do evento de ligao entre
anticorpo e antignio
45
.
A confirmao da presena do antignio HRP no sensor foi feita atravs da incubao do sensor
durante 3 minutos com soluo de ABTS. Os restantes sensores, que no contm a enzima, foram
incubados nas mesmas condies, servindo de controlo negativo. Na Figura 3.19.b observa-se que
apenas a soluo em contato com o sensor de HRP sofreu uma mudana de cor, resultado da oxidao
do ABTS catalisada pela enzima, provando que o antignio encontra-se presente no sensor. Nos
restantes dois sensores, a cor da soluo de ABTS permaneceu inalterada, pois no h enzima
disponvel para promover a oxidao do substrato ABTS.
O sensor IDC
ZnO
analisado conseguiu gerar um sinal distinto indicativo da presena do antignio,
constituindo um ponto de partida promissor no desenvolvimento de um dispositivo capaz de
(a)
HRP
PBST PfHsp70
(b)
70
imunodeteo. Sero necessrias repeties adicionais do sensor, de forma a avaliar a sua
reprodutibilidade, bem como um estudo de estabilidade, sensibilidade e intervalo de concentraes de
forma a determinar uma gama de trabalho onde a resposta do sensor seja proporcional presena do
antignio. Por ltimo, a resposta do sensor ter de ser avaliada na presena de amostras biolgicas
complexas e comparada com outros mtodos de imunodeteo.

CAPTULO 4 CONCLUSES E PERSPETIVAS
FUTURAS

CONCLUSES E PERSPETIVAS FUTURAS
73
4 Concluses e Perspetivas Futuras
No trabalho foi estudado o desenvolvimento de biossensores capacitivos compostos por
microeltrodos interdigitais e anticorpos imobilizados, enquanto um sistema capaz de imunodeteo.
A aplicao de matrizes de suporte imobilizao de anticorpos sobre o transdutor foi analisada para
dois tipos de materiais membranas comerciais de Fluoreto de Polivinilideno (PVDF) e
nanobastonetes de xido de Zinco (ZnO). A conjugao das matrizes com um transdutor composto
por microeltrodos uma abordagem inovadora que poder permitir a sua utilizao em sistemas de
imunodeteo em vez de nanoeltrodos, que representam uma alternativa de fabricao mais
dispendiosa.
As membranas comerciais de PVDF permitiram que o processo de imobilizao das biomolculas
fosse efetuado de uma forma simples e econmica, sem necessidade de recorrer a agentes de
reticulao (cross-linkers), bastando apenas depositar uma soluo de anticorpo sobre a membrana,
ocorrendo um processo de fisossoro do anticorpo membrana.
O ensaio com o substrato cromogneo ABTS referente ao efeito do tratamento prvio da membrana
comercial de PVDF com lcool demonstrou que a hidratao da membrana resulta numa reteno de
antignio cerca de 4 vezes maior do que quando a membrana se encontra desidratada. O tratamento
prvio da membrana com lcool resulta ento numa maior penetrao do antignio na matriz,
arrastado pela respetiva soluo que o contm. Os ensaios da difuso do anticorpo e antignio atravs
da membrana demonstraram que as biomolculas so capazes de atravessar a matriz microporosa da
membrana de PVDF em toda a sua extenso, pelo que o evento de biorreconhecimento poder ocorrer
assim ao longo da regio de medio do campo eltrico.
As variaes de capacidade registadas pelos sensores testados com membranas de PVDF com
solues sem e com antignio foram baixas (inferiores a 1 pF) e prximas ou inferiores ao erro de
medio associado ao aparelho. As baixas variaes de capacidade obtidas podem tambm ser
resultado de uma fraca sensibilidade do mtodo de medio eltrica, sendo necessria uma anlise
futura sobre mtodos de medio alternativa, como por exemplo, a utilizao de medidas diferenciais
com um amplificador Lock-In. No entanto, de notar que nos sensores com anticorpo anti-PfHsp70
(IDC
PVDF
I) e antignio Hsp70 (IDC
PVDF
II) imobilizados nas membranas, as variaes de capacidade
para as solues sem e com analito foram distintas, no intervalo de frequncias entre 1 e 10 kHz. O
sensor com anticorpo anti-HRP imobilizado, onde foi depositado o antignio HRP enquanto a
membrana estava humedecida (IDC
PVDF
III), tambm registou uma variao oposta da capacidade para
as duas solues, no intervalo de frequncias entre 1 kHz e 1 MHz, sendo que a maior variao
ocorreu a 1 kHz. Estes resultados indicam que a deteo de interaes entre anticorpos e antignios
por EI poder ser feita a frequncias inferiores a 10 kHz.
74
O efeito do tampo PBST na variao da capacidade foi analisado e verificou-se que este provoca uma
descida sistemtica e gradual da capacidade em cada medio. A variao negativa provocada pelo
tampo poder mascarar o sinal produzido pelo evento de biorreconhecimento. Ser necessrio efetuar
estudos adicionais que esclaream este efeito observado para o tampo. Em alternativa, o sistema de
medio poder ser alterado para um modelo diferencial, onde num sensor apenas medida a variao
da capacidade com aplicao de tampo, enquanto num sensor teste medida a variao da capacidade
com aplicao da amostra. O sinal do sensor com tampo ser subtrado ao sinal do sensor com a
amostra, sendo o sinal final equivalente apenas presena/ausncia do antignio na amostra.
Relativamente ao processo de fixao da membrana sobre o transdutor, necessrio um estudo
aprofundado. O processo de fixao da membrana tem de garantir que a extremidade inferior da matriz
esteja o mais prximo possvel do transdutor e que a espessura da interface entre a membrana e o
transdutor seja igual e constante durante as repeties do sensor. A produo de um filme fino
homogneo de cola por deposio de filme fino (spin-coating) antes da fixao da membrana foi
testada no sensor IDC
PVDF
V. A cola de Cianoacrilato usada na fixao das membranas dos sensores I
a IV no compatvel com spin-coating, pelo que se utilizou uma cola epxi. A resina foi bem-
sucedida na criao de um filme fino homogneo capaz de fixar a membrana sobre o transdutor.
Porm, a variao de capacidade no teste do sensor no apresentou melhorias em relao aos sensores
anteriores, porque a espessura do filme produzido foi elevada aproximadamente 50 m. Assim, tero
de ser avaliados mtodos alternativos reprodutveis para a fixao da membrana, que assegurem o
contato mais prximo e constante entre a membrana e o transdutor. Uma soluo possvel passa pela
utilizao de uma cola menos viscosa ou em aumentar o nmero de rotaes durante o processo do
filme fino.
No sensor cuja matriz de suporte imobilizao de anticorpos era composta por nanobastonetes de
xido de Zinco (IDC
ZnO
) observou-se uma diferena distinta entre o sinal produzido no teste com
antignio HRP (variao negativa da capacidade) e os sinais produzidos na ausncia do antignio e
resposta na presena de um analito no especfico (variao positiva da capacidade para ambos os
casos). A confirmao da presena do antignio HRP com o substrato cromogneo ABTS reforou a
ideia de que o antignio se encontrava ligado ao anticorpo imobilizado sobre as nanoestruturas do
sensor, confirmando a variao negativa da capacidade como resultado da ligao do analito ao
biorrecetor.
A variao da capacidade no teste com antignio foi maior nas frequncias 1 e 10 kHz. Tal como nos
sensores IDC
PVDF
, a deteo de interaes entre anticorpos e antignios por EI poder ser feita a
frequncias inferiores a 10 kHz.
O sensor IDC
ZnO
desenvolvido neste trabalho ter de ser avaliado do ponto de vista de
reprodutibilidade, mas os resultados preliminares obtidos foram bastante promissores. Uma vez
75
confirmada esta reprodutibilidade, sero necessrios estudos adicionais a diferentes concentraes de
antignio, para determinar a sensibilidade e intervalo de funcionamento do sensor, onde a resposta
gerada proporcional presena do antignio na amostra. A resposta do sensor ter de ser testada com
amostras biolgicas complexas, onde o antignio estar misturado com outros analitos (no
especficos) em soluo. Finalmente, podero ser testados diferentes pares de anticorpo/antignio na
construo do sensor, de forma a comparar a uniformidade do sinal produzido. Se sensor for capaz de
produzir um sinal constante, independentemente do par anticorpo/antignio utilizado, ento ter-se-
estabelecido um novo sistema para imunodeteo baseado em microtransdutores capacitivos
interdigitais.
Em suma, neste trabalho foi demonstrado com sucesso a aplicao de matrizes de suporte
imobilizao de anticorpos detetores sobre microeltrodos, com vista a maximizar a sua distribuio
ao longo da regio de interao do campo eltrico. Foi demonstrado que os anticorpos encontram-se
presentes nas membranas de PVDF aplicadas e que tanto os anticorpos, como os respetivos antignios
so capazes de penetrar na membrana, encontrando-se perfeitamente distribudos ao longo da regio
de interao. Os sensores com nanobastonetes de ZnO produziram resultados bastante promissores,
constituindo um bom ponto de partida para a construo de um novo sistema para imunodeteo,
capaz de competir com a configurao tradicional dos transdutores capacitivos com nanoeltrodos
interdigitais.

CAPTULO 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
79
5 Referncias Bibliogrficas
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CAPTULO 6 ANEXOS

ANEXOS

85
6 Anexos
6.1 Anexo I Variao da capacidade e impedncia para o sensor IDC
PVDF
II

Figura 6.1 Variao da capacidade (a) e impedncia (b) em funo da frequncia no sensor com antignio
PfHsp70 (33 g/mL) imobilizado na membrana de PVDF, em duas condies: teste sem anticorpo aplicao
de tampo PBST; teste com anticorpo aplicao de anti-PfHsp70 em tampo PBST (141 g/mL).

(a)
(b)
(a)
(b)
ANEXOS

86


6.2 Anexo II Composio elementar da membrana de PVDF tratada com tampo PBST

Tabela 2 Composio elementar de uma seo de membrana de PVDF tratada com tampo PBST. A
percentagem de cada elemento foi determinada por Espectroscopia de Energia Dispersiva.
Elemento Percentagem presente na membrana (%)
C 32,94
O 6,9
F 45,80
Na 3,16
P 0,73
Cl 3,87
K 0,76
Ca 0,15
Cr 5,70
Total 100

(a) (b)
ANEXOS

87
6.3 Anexo III Confirmao da presena do antignio HRP na membrana do sensor IDC
PVDF

IV

Figura 6.4 Confirmao da presena do antignio HRP na membrana do sensor IDC
PVDF
IV: (a) sensor com
HRP presente na membrana, confirmado pela alterao de cor da soluo de ABTS; (b) controlo negativo onde
no se observa alterao de cor da soluo de ABTS (sensor com PfHsp70).

6.4 Anexo IV Determinao da espessura do filme fino de cola epxi

Figura 6.5 Determinao da espessura do filme fino de cola epxi entre o substrato de vidro e a membrana de
PVDF. A membrana de PVDF (120 m); B filme fino de cola epxi (50 m); C substrato de vidro (1 mm).

(a) (b)
ANEXOS

88
6.5 Anexo V Sntese de nanobastonetes de ZnO sobre o transdutor realizada a quatro
intervalos de tempo diferentes

Figura 6.6 Sntese de nanobastonetes de ZnO sobre o transdutor realizada em quatro intervalos de tempo
diferentes: (a) 1,5 horas; (b) 3 horas; (c) 5 horas; (d) 7 horas.
(c)
(a)
(b)
(d)

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Licenciado em Biologia Celular e Molecular

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