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El microscopio
Indice 1. Introduccin 2. Principales tipos de microscopios 3. Propiedades de las lentes y del microscopio ptico 4. Principales normas de cuidado y utilizacin del microscopio ptico 5. Partes del microscopio ptico 6. Problemas frecuentes en el manejo del microscopio . !iblio"raf#a

1. Introduccin Los avances cientficos son consecuencia de progresos tcnicos y de cambios conceptuales. El conocimiento de estructuras y ultraestructuras celulares progres rpidamente con la utilizacin generalizada de microscopios (del griego mikros pe!ue"o y skopein mirar#$ instrumentos !ue permiten observar detalles del ob%eto de estudio de dimensiones inferiores a &' micrmetros$ los !ue no pueden ser observados directamente por simple inspeccin ocular. 2. Principales tipos de microscopios E(isten numerosos tipos de microscopios$ adaptados para diferentes usos. )lgunos emplean una fuente energtica diferente* microscopios de rayos +$ ultravioletas$ infrarro%o$ de rayos beta$ de ultrasonidos$ electrnicos$ protnicos$ de neutrones$ etc. ,or su amplia aplicacin y relativamente ba%o costo$ en ense"anza e investigacin se utiliza especialmente el microscopio ptico compuesto de campo claro convencional$ perteneciente al grupo de los microscopios pticos o fotnicos$ !ue utilizan la fraccin visible del espectro. -icroscopio ptico compuesto de campo claro convencional* El microscopio ptico convencional es compuesto por!ue posee dos sistemas principales de lentes convergentes (ocular y ob%etivo#$ en cambio los microscopios simples o lupas$ de menor aumento$ presentan un solo sistema de lentes biconve(as o plano.conve(as montadas en una armadura metlica. La mayora de los modelos actuales son binoculares$ aun!ue tambin los /ay monoculares. El microscopio compuesto convencional se denomina 0de campo claro0 o 0de campo brillante0 por!ue todo el campo se ilumina con una lente condensadora com1n$ a diferencia de variedades !ue utilizan luz difractada$ de fondo obscuro. Las muestras !ue utiliza el microscopio compuesto convencional deben ser trasl1cidas y estar te"idas para entregar contraste. -icroscopio de diseccin o estereoscpico* 2orresponde bsicamente a dos microscopios compuestos de campo claro de ba%o aumento cuyos e%es pticos presentan cierta oblicuidad entre s$ produciendo una imagen tridimensional clara de ba%o aumento (normalmente entre 3$4+ y 56+# y gran profundidad de foco. ,uede entregar /asta 766+ de aumento$ pero con prdida del efecto estereoscpico. 8ado el espesor de los ob%etos en estudio$ generalmente utiliza iluminacin por refle(in. ,resenta una distancia de traba%o de entre 97 y 7&' mm$ apta para manipular el material en estudio. :e usa para observar ob%etos opacos relativamente grandes. -icroscopio invertido o invertoscopio* Lleva el ob%etivo y el ocular ba%o la platina y la preparacin. 8os espe%os refle%an la imagen /acia el o%o. :irve para observar cultivos celulares$ bacterianos o plancton (ubicados en cpsulas o en frascos de fondo plano#$ microdiseccin$ micromanipulacin$ observacin de parsitos$ de aglutinaciones serolgicas$ reacciones de complemento$ microprecipitados$ observacin a travs de cmaras al vaco$ a ba%a temperatura$ a temperatura alta$ en cmara estril$ en ca%a para substancias radiactivas$ en medio l!uido espeso$ etc.

-icroscopio de campo obscuro* :e basa en !ue substancias con distinto ndice de refraccin desvan de distinta manera los rayos luminosos$ lo cual proporciona contraste a material no te"ido$ permitiendo visualizar muestras vivas. ;n condensador especial blo!uea los rayos centrales y de%a pasar los perifricos$ !ue se refle%an en la cara interna del condensador$ iluminando con rayos laterales !ue se refle%an o refractan sobre el ob%eto$ el !ue aparece fuertemente iluminado sobre fondo obscuro. ,ara evitar !ue penetren en el ob%etivo los rayos !ue emergen del condensador$ utiliza un diafragma en el ob%etivo o un ob%etivo de abertura numrica inferior a 3$3. Es 1til para observar lmites y movimientos de pe!ue"os ob%etos transparentes$ tales como !uilomicrones$ bacterias o espermios$ y partculas ultramicroscpicas$ pero sin entregar detalles. <e!uiere una fuente luminosa puntiforme muy intensa$ lo cual no siempre es fcil si el material es un ser vivo. -icroscopio de contraste de fases* :e basa en la propiedad de los rayos luminosos de modificar su longitud de onda al atravesar un medio de refraccin distinto. Este desfase de las ondas es imperceptible a la vista$ pero el microscopio lo transforma en diferencias visibles de amplitud$ y por lo tanto de intensidad. =iene un condensador especial (condensador de >ernike# y placas de retardo o lminas de desfasado. :i /ay pe!ue"as diferencias en el ndice de refraccin en el ob%eto$ los rayos luminosos se retardan o adelantan respecto al /az original. Las distintas densidades originan diferencias de fase entre las ondas luminosas emergentes$ !ue se transforman en diferencias de intensidad luminosa. ,ermite observar detalles en clulas vivas$ provenientes de cultivos o de animales vivos$ y observar material fi%ado !ue no puede colorearse. =iene la desventa%a de producir /alos y es difcil obtener una alta resolucin. Las muestras deben ser muy delgadas y no deben abarcar todo el campo de observacin. La fuente luminosa debe ser muy intensa. -icroscopio interferencial* :e basa al igual !ue el anterior en la capacidad de los ob%etos de retardar la luz? pero en lugar de depender de la luz de difraccin de la muestra$ enva /acia ella dos o ms /aces luminosos. ,roduce imgenes claras y sin /alos$ con aspecto tridimensional y permite observar estructuras incoloras como si fuesen coloreadas$ sin embargo es costoso e incomodo. E(isten varios tipos* en el microscopio de @omarski el rayo incidente tras atravesar el ob%eto se divide mediante un prisma birrefringente en dos rayos !ue interfieren entre s$ producindose un efecto de relieve caracterstico$ en el microscopio interferencial de Aaker el sistema ptico divide la imagen y entrega datos cuantitativos (peso seco$ espesor$ contenido acuoso$ etc.# a partir de las imgenes resultantes. -icroscopio polarizador* :e basa en las propiedades anisotrpicas de ciertas substancias$ !ue presentan distinto ndice de refraccin (cambios en la velocidad de la luz difractada# seg1n la direccin !ue se considere. =iene dos prismas de @icol o dos discos polaroides en planos de polarizacin perpendiculares entre s$ !ue absorben los rayos luminosos !ue vibran en una direccin y de%an pasar los !ue lo /acen perpendicularmente. 2uando el rayo de luz polarizada incide sobre un ob%eto !ue tiene un alto grado de orientacin molecular$ act1a como si se separara en dos rayos con diferentes velocidades de transmisin polarizados en planos perpendiculares$ y el microscopio determina la diferencia de velocidad de la luz proyectada en ambos planos. Es 1til para e(aminar estructuras birrefringentes$ como fibras musculares$ fibras proteicas del te%ido conectivo$ gotas lipdicas y fotorreceptores retinianos. ,ermite medir espesores$ concentracin de materia seca y contenido acuoso y entrega datos relativos a organizacin molecular. -icroscopio de fluorescencia* :u fuente luminosa es una lmpara de rayos ultravioleta (;B#$ los !ue son invisibles al o%o /umano pero se tornan visibles al c/ocar con un ob%eto fluorescente. ,osee dispositivos !ue permiten transmitir radiacin ;B a muestras !ue la absorben y emiten radiacin de longitud ms larga. ;n filtro impide !ue los rayos blancos producidos %untos con los ;B enmascaren la fluorescencia$ otro filtro blo!uea la luz ;B !ue podra da"ar los o%os del observador y de%a pasar la fluorescencia. :irve para observar estructuras fluorescentes o te"idas con colorantes fluorescentes (fluorocromos#. Entrega imgenes de gran contraste y especificidad. :e utiliza para molculas orgnicas$ microorganismos$ reacciones antgeno.anticuerpo y diagnstico de cncer. Cnyectando a un animal una substancia fluorescente permite estudiar procesos metablicos$ tales como formacin de orina o secrecin biliar. 2on inyeccin directa a nivel celular facilita el estudio de uniones intercelulares y vas nerviosas. 2on el mtodo de epifluorescencia$ el ob%eto$ previamente marcado con fluorocromo$ se ilumina desde arriba por refle(in$ de manera !ue la luz e(citadora no atraviesa el espesor del corte y la fluorescencia ocurre en la superficie$ dando una mayor nitidez.

-icroscopio citofotomtrico* :e basa en !ue diferentes componentes celulares absorben la luz ultravioleta$ por e%emplo los cidos nucleicos absorben la banda de 7D' nm y las protenas la banda de 7E' nm. La absorcin se mide sobre un fotomultiplicador o por dosimetra sobre placas fotogrficas calibradas. )lgunas reacciones /isto!umicas presentan absorcin especfica en el espectro visible y se analizan cuantitativamente con este microscopio$ por e%emplo si se realiza la reaccin de Feulgen se puede determinar el contenido de )8@ sin confundirlo con el )<@. -icroscopio en campo ultravioleta* Emplea luz ultravioleta (;B# en la formacin de la imagen. ;tiliza una lmpara de cuarzo con descarga en vapor de mercurio o de alta presin$ lmpara de descarga en /idrgeno o lmparas de arco de cadmio. -ediante filtros$ se selecciona la regin espectral conveniente entre las rayas espectrales !ue se forman. :e ide para incrementar el poder de resolucin ('$3 micrmetros#$ por!ue utiliza escasa longitud de onda. En la prctica surgen dificultades* la fuente lumnica es costosa$ frecuentemente inestable y peligrosa? como la luz ;B es invisible y da"a a la retina$ la imagen se forma en una pantalla fluorescente o en una placa fotogrfica? como el cristal es opaco a los rayos ultravioleta$ emplea cuarzo o fluorita en lentes$ cubreob%etos y portaob%etos. Generalmente usa ob%etivos con espe%os cuyas capas reflectantes enve%ecen por efecto de las radiaciones ;B$ inutilizndose. Es 1til por!ue incrementa el poder de resolucin$ por!ue entrega un contraste natural y por!ue absorbe selectivamente longitudes de onda en la regin ultravioleta por parte de bases nitrogenadas y ciertos aminocidos. -icroscopio de barrido confocal* ,resenta un sistema de barrido mediante lser !ue se concentra en un punto de poco espesor. El rayo se desplaza mediante un sistema de espe%os y rastrea la preparacin punto por punto. La luz !ue emerge desde un punto se dirige /acia un tubo multiplicador$ donde se analiza. Los datos se registran en una computadora$ !ue integra la informacin y elabora una imagen de alta definicin. :e utiliza para reconstruir imgenes tridimensionales !ue son rotadas para obervarlas desde distintos puntos de vista. -icroscopio electrnico de transmisin* 8e disposicin general similar al ptico$ utiliza electrones para formar la imagen. 2omo los electrones tienen longitud de onda entre mil y cien mil veces inferior a la luz visible$ posee mayor poder de resolucin !ue los microscopios pticos. 8ebido a las aberraciones de las lentes electromagnticas y al contraste de las muestras su limite de resolucin en la prctica no es tan bueno como el terico$ llegando /asta '$7 nm en redes cristalinas. =iene un filamento de tungsteno incandescente$ una bomba de vaco de alto rendimiento$ bobinas electromagnticas !ue rodean al /az de electrones a diferentes niveles y un sistema traductor de imgenes con pantalla fluorescente o placa fotogrfica. El filamento de tungsteno calentado emite un /az de electrones en el vaco$ logrado mediante la bomba. Los electrones se aceleran entre el filamento y un nodo por diferencia de potencial de alta tensin de 5'.''' a 3''.''' voltios y se desplazan en lnea recta$ pero se desvan y concentran por efecto de los campos electromagnticos formados por las bobinas. Los modelos modernos disponen de dos lentes condensadoras y cuatro !ue forman la imagen$ cuya distancia focal se modifica a%ustando la corriente !ue pasa por los enrollamientos$ lo cual permite variar el aumento desde pocos cientos de veces /asta cerca del milln de dimetros. La preparacin de los ob%etos re!uiere ultramicrtomos de alta velocidad y tcnicas especiales de fi%acin (generalmente con glutaralde/ido# y de inclusin (con resinas ep(icas#. Las secciones$ ultradelgadas (tpicamente de '$3 um de grosor# se ti"en mediante inmersin en soluciones de un metal pesado (uranio o plomo#. a# -icroscopio electrnico de transmisin convencional* utiliza un /az fi%o de electrones y en la formacin de la imagen ocupa los electrones primarios$ transmitidos por el espcimen$ por eso los cortes deben ser muy delgados$ menores de un micrmetro$ y no puede utilizarse en el estudio de clulas vivas. b# -icroscopio electrnico de transmisin de volta%e superalto* es una variedad !ue utiliza electrones acelerados a tensin de un milln a tres millones de voltios. Los mayores volta%es producen flu%os de electrones con longitud de onda ms corta$ ms penetrantes$ !ue dan imgenes menos contrastadas pero con una resolucin e(cepcionalmente alta ('$7 a '$4 nanmetros#. ,ermite observar ob%etos gruesos y estudiar vol1menes celulares. 2omo la energa de los electrones es mayor$ la aberracin cromtico y la ionizacin de la muestra son escasas$ en consecuencia la imagen es ms definida y se reduce el deterioro de la muestra. :irve para observar clulas vivas en microcmaras. c# -icroscopio electrnico de refle(in* tambin ocupa un /az de electrones fi%o$ pero en la formacin de la imagen utiliza electrones previamente refle%ados en cierto ngulo con la superficie

del espcimen$ para lo cual emplea una serie transversal de lentes. :in embargo$ presenta una fuerte aberracin cromtica y la imagen es de ba%a resolucin. -icroscopio electrnico de barrido* La lente condensadora produce un /az fino de electrones$ de slo '$''34 micrmetros$ !ue barre sistemticamente la superficie de una preparacin previamente recubierta por metal pesado. El /az electrnico e(cita la emisin de un /az secundario de electrones de menor energa desde la preparacin$ el !ue es recogido por un detector de centelleo$ !ue convierte los impactos de los electrones en destellos de luz. 2ada destello se amplifica electrnicamente en un tubo fotomultiplicador !ue barre sincrnicamente con el /az$ formndose con la se"al resultante una imagen sobre una pantalla de rayos catdicos. =iene alto poder de penetracin$ su resolucin es de entre 3 y 7' nanmetros y su aumento entre 34 y 4'.''' dimetros$ seg1n el material$ volta%e y distancia de traba%o. :u gran profundidad de foco da a la imagen un impresionante aspecto tridimensional. @o se necesitan cortes ultrafinos$ utiliza fragmentos slidos de te%ido. ,ermite observar muestras frgiles por des/idratacin controlada. -icroscopio electrnico de transmisin y barrido* ;tiliza un /az de electrones e(ploradores$ pero forma la imagen mediante se"al elctrica producida por electrones transmitidos. ;n fino /az de electrones barre el espcimen en toda su amplitud. La muestra es muy delgada (3 )#. Los electrones transmitidos son captados por un detector y pasan a un fotomultiplicador !ue entrega informacin del preparado. -icroscopio de efecto t1nel* @o utiliza ni luz ni partculas libres como electrones$ no necesita lentes pticas ni electromagnticas$ ni fuentes de emisin de luz o electrones. :u 1nica fuente son los electrones ligados !ue se encuentran en la muestra formando una nube !ue decae de modo e(ponencial con la distancia a la superficie. :e basa en el control preciso de una punta afilada de metal !ue se desplaza a distancia constante (de apro(imadamente un nanmetro# sobre la superficie en estudio. ;na computadora traduce los movimientos de la agu%a a imgenes$ visualizndose la superficie con enorme precisin. 2ermica piezoelctrica mantiene la distancia por una pe!ue"a corriente de electrones !ue se 0tuneliza0 fluyendo entre la punta del microscopio y la superficie. Cnicialmente se emple para observar metales altamente conductores y las molculas biolgicas se cubran con una pelcula conductora$ pero se /an obtenido imgenes ntidas de superficies poco conductoras e incluso aislantes. @o se puede aplicar a1n a clulas ni te%idos por lo blando de su superficie. -icroscopio de conductancia inica* Funciona por el mismo principio del microscopio de efecto t1nel. La sonda es una micropipeta de vidrio con un electrodo metlico. -ide corrientes de iones entre un l!uido conductor !ue ba"a la muestra y la micropipeta con el mismo l!uido. 2uando la micropipeta est muy cerca de la superficie de la muestra$ los iones del ba"o de%an de introducirse fcilmente en la pipeta y cae bruscamente la conductancia inica. -anteniendo la conductancia al nivel del punto de cada se mantiene la micropipeta a una distancia constante visualizndose detalladamente la topografa de la superficie barrida. 2on la micropipeta /orizontal se pueden medir las variaciones de las corrientes inicas !ue atraviesan membranas biolgicas y visualizar canales inicos. -icroscopios de rayos +* ;tilizan rayos + 0blandos0 de longitud de onda de 7' a 5' )$ lo suficientemente penetrantes como para producir imgenes de clulas sin alterar$ lo cual permite e(aminar muestras biolgicas y analizarlas cuantitativamente en condiciones similares a las naturales. Entregan una alta resolucin (37' )# utilizando fuentes de rayos + basadas en la radiacin de sincrotrn. :e /an desarrollado diversas variedades* microscopio de visualizacin de rayos +$ de contraste de fase de rayos +$ de barrido de rayos +$ etc. 3. Propiedades de las lentes y del microscopio ptico El rendimiento y calidad del microscopio ptico dependen principalmente de sus lentes$ de la forma en !ue se combinan y de la iluminacin empleada. ;n buen microscopio proporciona bastante aumento$ ofrece detalles e(actos y entrega imgenes contrastadas de contornos definidos. )dems$ la estructura mecnica debe poseer las caractersticas de estabilidad$ fiabilidad y comodidad. )umento visual* El aumento visual es la relacin entre el tama"o de la imagen producida por el microscopio y el tama"o real del ob%eto observado. Cndica el n1mero de veces !ue la imagen es mayor

!ue el ob%eto y se e(presa en 0+H$ por e%emplo 5' + significa !ue la imagen es 5' veces mayor !ue el ob%eto. El aumento puede definirse como la relacin entre el ngulo ba%o el cual se ve el ob%eto con el microscopio y el correspondiente a la visin directa cuando el ob%eto se encuentra a la distancia mnima de visin distinta. La distancia mnima de visin distinta corresponde a la mnima distancia a la cual el o%o enfoca correctamente un ob%eto$ y es de 745 mm. El aumento de una lente depende de cmo modifica la trayectoria de la luz !ue la atraviesa. -ayor curvatura del vidrio produce mayor refraccin de los rayos luminosos. :i un /az de rayos paralelos atraviesa una lente biconve(a$ las ondas convergen al otro lado en un punto 1nico$ el foco principal. :e denomina centro ptico al punto de una lente en el cual los rayos luminosos !ue la atraviesan no se desvan. 8istancia focal es la distancia entre el foco principal y el centro ptico de la lente. El tama"o de la imagen depende directamente de la distancia focal$ por lo tanto el aumento de una lente se puede calcular dividiendo 745 mm (distancia mnima de visin distinta# por la distancia focal en mm. La potencia o poder ptico de una lente$ !ue se mide en dioptras$ es la inversa de la distancia focal$ por lo cual el aumento de una lente tambin puede calcularse multiplicando la distancia mnima de visin distinta por su potencia. 2uanto mayor es la capacidad de una lente para curvar los rayos incidentes$ ms cerca de la lente est el foco principal$ por lo tanto menor es su distancia focal y mayor la potencia. 2omo el microscopio compuesto posee dos sistemas de lentes !ue aumentan sucesivamente la imagen$ el aumento total se obtiene multiplicando el aumento del sistema ocular por el aumento del sistema ob%etivo$ siempre !ue la distancia entre ambos sea la correcta (largo mecnico del tubo generalmente 3D' o 3&' mm# y !ue no e(istan otras lentes intermedias. <esolucin* :i mediante una fotocopiadora se ampla una fotografa de un peridico$ se obtiene una imagen grande pero borrosa$ se dice !ue se /a producido un aumento en vaco. 2on un microscopio en cambio la imagen aumentada presenta mayores detalles estructurales$ gracias a su poder de resolucin. La resolucin es la propiedad de un sistema ptico de discriminar detalles muy finos. 2onsiste en /acer visibles como independientes dos puntos muy cercanos entre s. El inverso del poder de resolucin es el lmite de resolucin (L. <.#$ distancia mnima entre dos puntos del ob%eto observados como distintos. Los microscopios pticos modernos tienen un limite de resolucin de '$7 a '$5 um$ apro(imadamente lI7' del dimetro de un eritrocito /umano normal. El limite de resolucin depende de la longitud de onda de la emisin empleada y del ngulo !ue forman los rayos ms e(ternos !ue penetran a la lente. 2uanto menor sea la longitud de onda empleada y ms anc/o el cono de luz$ menor ser el limite de resolucin y en consecuencia mayor el poder de resolucin. La medida del tama"o del cono de la emisin !ue puede admitir una lente se denomina abertura numrica de la lente. El lmite de resolucin se calcula multiplicando la longitud de onda empleada por una constante de proporcionalidad$ relacionada con el grado de superposicin de dos puntos para !ue puedan ser resueltos por el o%o /umano ('$D3# y dividiendo por la abertura numrica de la lente. :i el espcimen se ilumina con luz blanca$ se considera la longitud de onda del verde amarillo ('$44 um#$ a la cual el o%o es ms sensible$ por lo tanto el lmite de resolucin del microscopio usado en seco es de '$ D3 multiplicado por '$ 44 y dividido por la abertura numrica. La abertura numrica depende de la capacidad de utilizar un mayor o menor n1mero de rayos luminosos en la imagen. Est determinada por el dimetro efectivo de la lente en relacin a su distancia focal y por el ndice de refraccin del medio ptico. :e calcula multiplicando el ndice de refraccin del medio ptico por el seno de la mitad de la abertura angular. El medio ptico es la substancia !ue atraviesa la luz entre la lente y el ob%eto e(aminado. ,ara los ob%etivos en seco (lupa$ menor$ mayor# el medio ptico es el aire$ cuyo ndice de refraccin es 3$'. ,ara el ob%etivo a inmersin es el aceite de inmersin$ cuyo ndice de refraccin es 3$49. El ngulo de abertura es el formado por los rayos ms e(ternos !ue penetran a la lente. En el poder de resolucin intervienen los lentes ob%etivo y condensador$ por!ue el ocular aumenta de tama"o la imagen producida por el ob%etivo sin me%orar sus detalles. ,uede incrementarse con lentes de mayor abertura numrica. 2uando se utilizan ob%etivos secos puede aprovec/arse un ngulo de abertura m(imo de &7 grados$ dada la separacin entre cubreob%etos y

ob%etivo y de las dimensiones limitadas de la lente frontal. En estas condiciones$ la abertura numrica m(ima es en la prctica '$J4. =ambin la resolucin puede incrementarse aumentando el ndice de refraccin del medio ptico con el empleo de aceite de inmersin$ !ue me%ora adems la luminosidad. ;tilizando inmersin se pueden lograr valores de aperturas numricas de /asta 3$5'. La resolucin se puede me%orar empleando menor longitud de onda (luz ultravioleta$ electrones#. ,enetracin* Es la capacidad de un sistema ptico de permitir la observacin detallada simultnea de varios planos del espesor del espcimen estudiado$ siguiendo el e%e ptico por sobre y ba%o el nivel de enfo!ue. 2orresponde a la profundidad de campo del ob%etivo. La profundidad de campo es la zona por delante y por detrs del espcimen dentro de la cual la nitidez es aceptable. :e relaciona con la profundidad focal$ zona de nitidez !ue se e(tiende a cada lado del plano donde se forma la imagen. La profundidad de campo es igual a la profundidad focal dividida por el aumento al cuadrado. El poder de penetracin disminuye a mayores aumentos y se incrementa con aberturas numricas mayores. 2on ob%etivos de mayores aumentos la disminucin de la profundidad de campo se compensa con el mando micromtrico$ !ue permite cambiar la posicin de enfo!ue en forma gradual y controlada. 8efinicin* Es la capacidad de producir imgenes de contornos definidos$ ntidos y correctos. Los me%ores poderes de definicin se encuentran en sistemas de lentes ob%etivos con alto grado de correccin ptica$ !ue eliminan al m(imo las aberraciones mediante lentes de diferente ndice de refraccin y distinta dispersin$ y oculares compensados tipo Kuygens. E(isten lentes con diferentes grados de correccin de las aberraciones* acromticos$ apocromticos$ semiapocromticos. Los ms utilizados y ms econmicos son los acromticos$ en los !ue est corregida la aberracin esfrica de un color y la aberracin cromtico de dos colores. :e denominan aberraciones los defectos de correccin del sistema ptico. Las aberraciones cromticas producen imgenes difusas con un /alo coloreado alrededor del campo debido a la diferencia de longitud focal en funcin de la longitud de onda. )l pasar de un medio a otro de diferente ndice de refraccin cada color !ue forma parte de la luz blanca e(perimenta una desviacin diferente. Las aberraciones de esfericidad se deben a !ue los rayos cuando atraviesan la zona perifrico de una lente simple recorren un trayecto algo mayor !ue cuando pasan por el centro$ producindose un efecto de prisma. ) partir de un foco lumnico puntual se forman imgenes superpuestas de diferentes tama"os$ dando una imagen poco ntida de ba%o contraste. Luminosidad* La luminosidad es la impresin visual de la luz refle%ada o emitida por una superficie. La luminosidad de la imagen microscpica depende de la fuente de iluminacin condensador$ filtros$ medio ptico y luminosidad del ob%etivo. La fuente lumnica ms utilizada es la lmpara incandescente. ,ara una iluminacin ms eficaz se emplea un filamento compactado$ con bobinado en espirales aplanadas o en cortina y ba%o volta%e (D a 37 B#. El sistema bsico de iluminacin ms ampliamente utilizado es la iluminacin con doble diafragma de Le/ler !ue emplea un diafragma de campo a nivel de lmpara colectora y un diafragma de abertura. La luminosidad de una lente depende de la abertura dada en valores llamados n1meros fI. El n1mero fI es el cociente de la distancia focal por el dimetro. La cantidad de luz !ue recibe el ob%etivo desde el espcimen se incremento con el cuadrado de su abertura numrica. Los filtros son discos de cristal de caras planas !ue se interponen en el trayecto de los rayos luminosos antes del condensador. Los filtros de difusin proporcionan un campo luminoso uniforme$ los de luz da son azules y absorben el e(ceso de radiacin amarilla y ro%a procedente de filamentos incandescentes$ los de absorcin son grises$ absorben determinado porcenta%e de luz cuando sta es e(cesiva.

Estabilidad* Las vibraciones per%udican a la microscopa por!ue el microscopio aumenta los defectos de estabilidad de su sistema. En consecuencia$ no pueden obtenerse buenas imgenes si el microscopio es mecnicamente inestable. La estabilidad depende del dise"o del sistema mecnico y de su instalacin. :e comprueba observando los siguientes aspectos* estabilidad de los movimientos del microscopio e!uipado con sus accesorios? estabilidad del tubo de observacin (no debe deslizarse al apoyar el o%o en el ocular#$ estabilidad de la platina (no debe oscilar al desplazarse la preparacin# y estabilidad trmica (el enfo!ue no debe afectarse por variaciones de temperatura#. Fiabilidad* La fiabilidad es la probabilidad del buen funcionamiento de alguna cosa. En el microscopio depende de la estabilidad mecnica$ de la estabilidad de las clulas fotoelctricas$ estabilidad de la iluminacin$ calidad de los colores$ parafocalidad$ etc. La calidad de los colores observados depende de tres variables psicolgicas tonalidad$ saturacin y valor. La tonalidad se asocia al color puro dominante$ la saturacin a su pureza$ el valor al porcenta%e de gris. ,arafocalidad significa !ue los distintos ob%etivos tienen distancias focales similares$ de manera !ue el ob%eto seguir enfocado despus de girar el portaob%etivos m1ltiple. 2omodidad de empleo* :e consigue con el dise"o adecuado del aparato$ por e%emplo ubicacin de mandos coa(iales en la base del sistema mecnico$ de modo !ue las manos pueden descansar sobre la mesa$ e inclinacin suficiente de los tubos binoculares /acia el plano /orizontal$ idealmente de unos 34 grados. 4. Principales normas de cuidado y utilizacin del microscopio ptico El microscopio es un instrumento de precisin !ue debe tratarse con cuidado y debe mane%arse correctamente para evitar errores$ cansancio y prdida de tiempo. =enga en cuenta las siguientes consideraciones* 3. 8ebe mantenerse en un lugar estable. El observador debe colocarse de espaldas a los focos de luz$ prefirindose la luminosidad amortiguada$ le%os de las ventanas y sobre una mesa negra para eliminar luces parsitas y evitar una fatiga innecesaria. 7. 8ebe colocarse le%os del e(tremo del mesn$ para evitar !ue se vuel!ue. La mayora de los desperfectos se producen por golpes. 9. El microscopio se transporta verticalmente$ su%eto por la empu"adura con una mano y por la base con la palma de la otra. El transporte incorrecto puede descansar todo el peso sobre el control de enfo!ue micromtrico$ erosionando sus muescas. 5. 8ebe estar cubierto mientras no se usa y no debe sacrsele el ocular. El polvo desgasta los componentes y se deposita en las lentes. 4. @o deben tocarse los lentes oculares$ ob%etivos ni condensador con los dedos. Las manc/as de grasa y sudor los dada. D. Las lentes deben soplarse enrgicamente con una pera de goma$ no deben limpiarse con un pa"o seco (las partculas de polvo pueden rayarlas#$ ni soplando con la boca (una pelcula l!uida es muy difcil de eliminar#$ ni con los dedos. :i !ueda polvo debe emplearse papel especial o pincel !ue se carga electrostticamente acercndolo a una ampolleta encendida$ lo cual permite recoger las partculas. &. ,ara observar /ay !ue sentarse cmodo$ en posicin descansada. Las malas posiciones causan cansancio y dolores musculares. E. 8ebe observarse con ambos o%os abiertos. )l estar un o%o cerrado prolongadamente$ la contraccin muscular y la presin sobre el globo ocular causan cansancio y a veces dolor ocular o de cabeza. J. 8ebe mirarse a travs del microscopio$ no 0en0 el microscopio. :i el observador mira como si la imagen estuviese %unto al o%o$ la vista se cansa innecesariamente y puede producirse dolor ocular. 3'. 8ebe /aber una distancia adecuada entre el o%o y el ocular. )cr!uese desde algunos centmetros poco a poco /asta observar el campo visual grande y definido.

33. =oda observacin comienza con lupa y pasa ordenadamente a mayores aumentos. Esto facilita centrar y enfocar$ da un campo visual inicial amplio !ue proporciona visin de con%unto$ facilita la interpretacin y permite ubicar fcil y rpidamente las estructuras. La zona de la preparacin !ue desea observarse debe !uedar en el centro del campo antes de pasar al siguiente aumento. 37. El condensador est regulado cuando se encuentra en su posicin ms alta o un poco ms ba%o. ,ara aumentar el contraste no conviene descenderlo e(cesivamente ni cerrar el diafragma$ es preferible regular la iluminacin con el control deslizable. 39. @o debe colocarse ni retirarse una preparacin estando el ob%etivo mayor o el ob%etivo a inmersin en posicin de traba%o$ por!ue pueden rayarse las lentes frontales. 35. Los movimientos de los mandos de enfo!ue deben ser lentos y suaves. El control macromtrico se acciona con precaucin para no c/ocar el ob%etivo con la preparacin$ lo cual estropea la lente frontal del ob%etivo y rompe la preparacin. @o debe utilizarse el control macromtrico con inmersin. El control micromtrico debe mantenerse en posicin central y accionarse un poco /acia un lado u otro. :e llega al e(tremo de su recorrido y se insiste$ se pueden romper sus muescas$ lo cual obligarla a cambiarlo. 34. La preparaciones se colocan con el cubreob%etos /acia arriba. :i la preparacin est al revs$ al tratar de enfocar c/oca el ob%etivo con la preparacin y se da"a. )ntes de colocar la preparacin sobre la platina compruebe la posicin del cubreob%etos con la u"a. 3D. :i la preparacin carece de cubreob%etos no debe observarse con un ob%etivo mayor a 3'+$ de lo contrario el ob%etivo puede c/ocar con la preparacin y se puede rayar. 3&. @o debe colocarse aceite de inmersin sobre ob%etivos secos (lupa$ menor$ mayor# ni utilizarse el ob%etivo a inmersin como ob%etivo seco$ por!ue se puede rayar. 3E. ,ara sacar de los lentes el aceite de inmersin debe utilizarse un pa"o /umedecido ligeramente con ter o (ilol$ no debe usarse alco/ol$ !ue disuelve el ad/esivo de las lentes$ ni algodn$ !ue de%a fibrillas pegadas al vidrio dificultando la visin. 3J. @o deben derramarse l!uidos sobre el microscopio$ si esto sucediera accidentalmente debe secarse de inmediato. @o debe mane%arse el microscopio con los dedos /1medos. 7'. @o debe de%arse el microscopio %unto a un mec/ero encendido$ por razones obvias. 73. El microscopio no debe estar encendido mientras no se usa$ debe evitarse as su calentamiento e(cesivo. <ecuerde adems !ue su ampolleta es de alto costo y tiene una vida 1til limitada. 77. Las lentes estn montadas en forma muy precisa$ slo se deben limpiar e(ternamente$ sin desmontarlas. :lo un tcnico especializado puede /acerlo para una limpieza completa. 79. @o se debe invertir ni ladear el microscopio sin !uitar previamente el ocular$ !ue entra por deslizamiento. 75. 2ada vez !ue el microscopio se de%a de usar debe guardarse en forma adecuada* a# ubicacin le%os del borde del mesn$ b# lmpara apagada$ c# cable de la lmpara desenc/ufado$ d# platina limpia y ubicada al tope superior$ e# ob%etivo lupa en posicin de traba%o$ f# carro en posicin central$ g# condensador en su posicin ms alta$ /# diafragma abierto. 5. Partes del microscopio ptico Los microscopios pticos constan de dos tipos de componentes$ la parte mecnica y la parte ptica. ) los componentes bsicos se agregan accesorios opcionales. )# 2omponentes mecnicos (M-onturaH#* ,iezas fi%as$ !ue sirven como soporte para el sistema ptico (estativo#$ y piezas mviles$ !ue intervienen en la ubicacin adecuada de la preparacin (enfo!ue y centrado#. 3. Aase o ,ie* pieza /orizontal maciza$ de forma variable$ pesada$ situada en la parte inferior del microscopio$ al !ue sirve de apoyo y da estabilidad. Generalmente lleva asociada la fuente luminosa. 7. Empu"adura o Arazo* pieza vertical ms o menos curva !ue se une al tubo$ a la platina y a la base. :irve para tomar al microscopio durante su traslado y lleva los controles de enfo!ue. En algunos modelos corresponde a dos piezas independientes* el brazo$ en la parte superior$ y la columna$ inferior$ !ue se unen mediante una c/arnela$ articulacin !ue permite inclinar al microscopio en mayor o menor grado y adaptarlo a la altura de la vista.

9. 2abezal* pieza /ueca$ tpicamente cilndrica (cuando es as se le denomina MtuboH# en la !ue se insertan los tubos portaoculares y el portaob%etivos. ) travs del cabezal se observa la imagen microscpica$ sirviendo para sostener a los componentes pticos y mantenerlos a la distancia correcta. ,uede ser monocular o binocular. En los modelos binoculares cada montura de los tubos portaoculares est rodeada por anillos !ue permiten a%ustar la longitud del tubo$ y los tubos portaoculares pueden desplazarse /orizontalmente$ lo !ue permite graduar su distancia. 5. ,ortaob%etivos m1ltiple (revlver#* pieza giratoria !ue sostiene a los tubos portaob%etivos de diferente aumento. :e desplaza /orizontalmente para colocar en posicin de observacin a cual!uiera de ellos. 4. ,latina lisa o fi%a* pieza plana /orizontal ubicada entre el ob%etivo y el condensador$ con un orificio central circular !ue permite el paso de los rayos luminosos provenientes del condensador$ y sobre el cual se coloca la preparacin para ser observada. D. ,latina mecnica o mvil (2arro#* dispositivo acoplado a la platina lisa !ue su%eta al portaob%etos y permite su desplazamiento. Es un sistema de pi"ones !ue act1an sobre cremalleras ubicadas perpendicularmente entre s$ produciendo desplazamiento /orizontal en sentido lateral y anteroposterior$ lo cual permite ubicar y fi%ar la zona de la preparacin !ue desea observarse. Lleva incorporadas dos pinzas !ue entran a presin y su%etan la preparacin y escalas graduadas para medir sus desplazamientos. &. :ubplatina* 2on%unto de piezas situadas ba%o la platina y !ue soportan al aparato de iluminacin. :u composicin vara seg1n el modelo$ pero en general consiste en un aro !ue sostiene al condensador$ el !ue se mueve de arriba.aba%o mediante un tornillo$ y tambin contiene anillos portafiltros$ !ue alo%an cristales !ue mantienen la luz adecuada constante$ y un diafragma.iris$ !ue regula la entrada de la luz y se controla con una palanca lateral$ lo !ue permite obtener distintos tama"os del cono luminoso !ue entra en el condensador. E. 2ontroles de enfo!ue* dos o cuatro botones ubicados en la empu"adura o columna !ue desplazan a la platina fi%a o al cabezal$ seg1n el modelo$ lo cual permite enfocar con precisin. 2orresponden a uno o dos botones macromtricos$ o de enfo!ue apro(imado$ y uno o dos botones micromtricos$ de enfo!ue fino. Los botones o mandos macromtricos son ms grandes y de avance rpido$ sirven para buscar rpidamente un punto apro(imado al del enfo!ue. :i /ay dos botones macromtricos se enfrentan a ambos lados del brazo y estn sincronizados$ basta mover a uno de ellos. Los botones o mandos micromtricos producen movimientos lentos y permiten obtener un enfo!ue e(acto. :i son dos$ tambin estn sincronizados. En algunos modelos de microscopios e(iste un solo botn !ue cumple funciones de macromtrico y micromtrico* a igual velocidad de giro el movimiento de la platina es ms rpido cuanto ms le%os se /alla la preparacin del plano de enfo!ue. A# 2omponentes pticos (M=ren pticoH#* ,iezas implicadas en la formacin de la imagen. Cncluye tres sistemas de lentes !ue funcionan armnicamente entre s y una fuente de iluminacin. 3. 2ondensador* :istema de lentes convergentes de gran abertura !ue concentra la luz visible y la proyecta uniformemente sobre una muestra de te%ido convenientemente preparada. :e encuentra montado en un armazn metlico su%eto a la parte inferior de la platina fi%a y puede subirse y ba%arse a voluntad accionando un control ubicado lateralmente. 7. :istema de ob%etivos* 2omple%o sistema de lentes (a veces /asta 3'# ubicados pr(imos al ob%eto$ !ue act1a como una sola lente convergente !ue recoge las longitudes /eterocromticas de la luz visible$ entregando mayores aumentos !ue los del ocular y produciendo inversin de la imagen. Los ob%etivos participan en la primera etapa de ampliacin* producen una imagen ampliada del ob%eto y la proyectan sobre un plano ubicado en el interior del cabezal. 2ada ob%etivo$ ubicado en el interior de un tubo (tubo portaob%etivo#$ puede estar formado por una lente o por un comple%o sistema de lentes convergentes. Los modelos actuales presentan tres o cuatro ob%etivos ubicados en sendos tubos$ cuya longitud se relaciona con su poder de aumento. E(isten ob%etivos en seco y de inmersin. Los ob%etivos en seco (MlupaH$ Maumento menorH$ Maumento mayorH# se utilizan

de%ando aire entre ellos y la preparacin$ en cambio el ob%etivo de inmersin se emplea colocando una gota de l!uido (Maceite de inmersinH#$ cuyo ndice de refraccin es superior al del aire. 9. :istema ocular* Formado por dos lentes plano.conve(as centradas y empotradas en un tubo metlico ms o menos corto (tubo portaocular#$ al !ue se acerca el o%o del observador$ en cuya retina proyecta la segunda imagen aumentada. La lente superior se denomina propiamente lente ocular y la inferior lente de campo o frontal. Lentes adicionales corrigen las aberraciones cromticas y esfricas. Los oculares son intercambiables y pueden tener diferentes aumentos. ,ermiten observar varias veces ms amplificada la imagen !ue forma el ob%etivo. 5. Fuente luminosa* )ntiguamente era un espe%o$ en la actualidad se utiliza muc/o ms una lmpara con filamento de tungsteno incandescente enrollado$ de D a 37 B$ montada sobre un portalmparas especial ubicado en la base del microscopio. La intensidad luminosa se regula en forma continua girando un botn o moviendo una palanca de control deslizante. 2# )ccesorios :e fabrican accesorios opcionales para colocar en los modelos modernos de microscopios compuestos$ los !ue pueden colocarse temporalmente en los microscopios compuestos para desarrollar funciones especiales$ otorgndole mayor fle(ibilidad al aparato. Entre ellos se cuentan accesorios para la observacin simultnea de dos personas$ condensadores de campo obscuro$ obturador central para campo obscuro$ accesorio de polarizacin$ iluminador vertical$ ocular graduado$ accesorios para dibu%o$ accesorios para fotomicrografa. 6. Problemas frecuentes en el manejo del microscopio 8efectos de Cluminacin* a# 2ampo obscuro$ sin imagen. 2ausas probables* l# Falta de luz. 2orreccin* )ccione el interruptor$ enc/ufe el cable$ verifi!ue si /ay energa elctrica o si la lmpara esta !uemada. 7# 6b%etivo fuera de lugar. 2orreccin* Gire el ob%etivo a su posicin de enfo!ue. b# 2ampo ovalado$ iluminado parcialmente. 2ausa probable* 6b%etivo fuera de lugar. 2orreccin* Gire el ob%etivo a su posicin de enfo!ue. c# Cmagen muy obscura. 2ausas probables* l# 8iafragma cerrado. 2orreccin* 8esplace la palanca lateral del diafragma. 7# 2ondensador muy ba%o. 2orreccin* )ccione el control !ue sube el condensador. 9# 2ondensador defectuoso. 2orreccin* )vise para !ue lo repare un tcnico. d# Cmagen muy clara. 2ausas probables* l# 8iafragma muy abierto. 2orreccin* 8esplace la palanca lateral del diafragma. 7# 2ondensador muy alto. 2orreccin* )ccione el control !ue ba%a el condensador. 8efectos de Enfo!ue* a# Falta de imagen. 2ausas probables* l# ,reparacin mal centrada. 2orreccin* )ccione los controles del carro. 7# ,reparacin mal enfocada. 2orreccin* )ccione el mando macromtrico. b# Cmagen borrosa. 2ausas probables* l# ,reparacin mal enfocada. 2orreccin* )ccione el mando micromtrico. 7# ,reparacin al revs. 2orreccin* 2olo!ue la preparacin /acia arriba. 9# :uciedad en la preparacin$ ocular u ob%etivo. 2orreccin* Lmpielos. Cmgenes e(tra"as* a# -anc/as o enturbiamientos irregulares$ !ue se desplazan al mover la preparacin. 2ausa probable* :uciedad en el cubreob%etos. 2orreccin* Limpie la preparacin.

b# -anc/as o enturbiamientos irregulares !ue se desplazan al mover el ocular. 2ausa probable* :uciedades en el ocular. 2orreccin* Limpie la lente ocular. c# -anc/as o enturbiamientos !ue desaparecen al cambiar el ob%etivo. 2ausa probable* ob%etivo sucio o con aceite. 2orreccin* Limpie el ob%etivo. d# -anc/as o enturbiamientos !ue no se desplazan ni desaparecen al mover el ocular$ ob%etivo o preparacin. 2ausa probable* :uciedad en la lente superior del condensador. 2orreccin* Limpie el condensador. e# Lneas finas brillantes. 2ausa probable* <ayaduras en las lentes o trizaduras en la preparacin. 2orreccin* 8e cuenta al profesor. f# 6tras alteraciones de la imagen (espacios blancos$ espacios finos y rectos$ grumos intensamente tenidos$ bandas obscuras$ crculos con bordes obscuros$ etc.#. 2ausa probable* defectos en las preparaciones (retraccin del te%ido$ muescas en el cuc/illo del micrtomo$ fi%ador o colorante precipitado$ te%ido plegado$ burbu%as de aire$ etc.#. 2orreccin* E(amine un sector de la preparacin no alterado o solicite otra preparacin. . !iblio"raf#a )bramowitz$ -. 3JE4 -icroscope Aasics and Aeyond. 6lympus 2orporationm$ Lake :uccess$ @.N. )guilar ,eris$ O. 3JD4 =eora y prctica del microscopio$ Ed. :aber$ Balencia. Aarer$ <. 3J44 ,/ase contrast$ interference contrast and polarizing microscopy. Cn* <. -ellors (edit#$ )nalytical 2ytology$ 9$ -c Graw Kill$ @.N. Aarrio $ <.). 3JE7 Formacin de imgenes en el microscopio electrnico$ 2uadernos del Cnstituto de Cnvestigacin en materiales$ ;niv. @acional )utnoma$ -(ico. Ainning$ G. y K. <o/rer 3JE4 El microscopio de efecto t1nel. Cnvestigacin y 2iencia 3'J*9'.9&. Aradbury$ :. 3JE5 )n introduction in t/e optical microscope. 6(ford ;niversity ,ress$ @.N. 2asartelli$ O.8. 3JDE -icroscopa terico.prctica$ Ed. ;rmo$ Ailbao. Grave$ E.B. 3JJ3 ;sing t/e microscope* a Guide for @aturalists$ 8over ,ublications. Grimstone$ ).B. 3JE3 El microscopio electrnico en biologa$ Ed. 6mega. Kamas/ima$ N. 3JE7 =/e ;se of t/e 6lympus Fluorescence -icroscope. 6lympus 6ptical 2o.$ =okyo. Kealey$ ,. 3J&3 -icroscopios y vida microscpica$ Ed. Aruguera$ Aarcelona. Kearle$ O.P.:? O.= :parrow y ,.-. 2ross 3J&7 =/e use of t/e scanning electron microscope$ ,ergamon ,ress$ @.N. Cpo/orski$ -. y -.<. -arrapodi 3J&9 -icroscopa electrnica de barrido$ 2omisin @acional de Energa )tmica$ As. )ires. Oames$ O. 3J&D Lig/t microscopic =ec/ni!ues in Aiology and medicine$ Ed. -artinus @i%/off$ =/e Kague. Loc!uin$ -. y -. Langeron 3JE4 -anual de microscopa$ Ed. Labor$ Aarcelona. Lpez$ -.L. 3JJ' El microscopio electrnico$ elementos de teora y prctica para bilogos. :erie 2ientfica )vanzada$ 2entro de E(tensin Aiomdica$ Facultad de -edicina$ ;. de 2/ile. -enigault$ ,. 3J&7 El microscopio$ Ed. =.E.C.$ Aurgos. @eed/am$ G.K. 3J&& ,ractical ;se of t/e -icroscope$ 2/arles 2. =/omas ,ubl.$ Ltd. ,antin$ 2.F.). 3JDE =cnicas microscpicas para zologos. Editorial )cademia$ Len. <ic/ardson$ O.K. 3JJ3 Kandbook for t/e lig/t microscope* a userQs guide$ @oyes ,ublications. :troscio$ O.). y P.O. Laiser (Edits.# 3JJ9 :canning tunneling microscopy$ )cademic ,ress Cnc. :twertka$ E. y ). :twertka 3JEJ -icroscope* /ow to use it and en%oy it$ Library Ainding.

,alabras claves* -icroscopa$ propiedades de las lentes$ cuidados y uso del microscopio <esumen* =ras una introduccin general sobre el microscopio$ se e(plican los principales tipos !ue se utilizan en las ciencias biolgicas$ las propiedades de las lentes y del microscopio ptico$ principales normas de cuidado y utilizacin del microscopio ptico$ sus partes y los problemas ms frecuentes en el mane%o del mismo y cmo resolverlos.

=raba%o enviado y realizado por* -anuel =amayo ;niversidad 2atlica del -aule$ =alca$ 2/ile. mtamayoR/ualo.ucm.cl