Diseo y Metodologa para la obtencin de un Anticuerpo Monoclonal Humanizado contra el Receptor de Insulina Laura Stefany Maldonado, Juan Camilo

Montenegro Alarcn David Leonardo Cifuentes Aplicaciones de la Biotecnologa en Teraputica Departamento de Farmacia - Universidad Nacional de Colombia

Los anticuerpos monoclonales son glucoproteinas especializadas sintetizadas y producidas especficamente por linfocitos B, que constituyen hoy en da en una herramienta muy til en el mbito clnico y biotecnolgico para el diagnostico y tratamiento de diversas patologas inmunolgicas, neoplsicas, entre otras, razn por la cual las tcnicas de produccin y refinamiento de los mismos son cada da ms novedosas y diversas, y permiten maximizar la eficacia teraputica de tales molculas reduciendo de paso los efectos adversos potenciales o secundarios de los mismos. El objetivo de este trabajo es establecer una metodologa tentativa para la obtencin de un anticuerpo monoclonal humanizado contra el receptor de insulina humano, sealando algunos aspectos crticos que deben tenerse a lo largo del proceso. Obtencin del antgeno: aislamiento y purificacin del receptor de insulina. El receptor de insulina es una glicoprotena tetramrica compuesta por dos subunidades y dos subunidades unidas entre s a travs de dos puentes disulfuro, cuya activacin por parte de la Insulina dispara toda una cadena de sealizacin que conlleva finalmente a los diversos efectos biolgicas caractersticas de dicha protena en el organismo. 1 La presencia de estos receptores en la placenta, hace factible su aislamiento y purificacin a partir del tal tejido por medio de un proceso de ultracentrifugacin que debe realizarse a condiciones de pH, fuerza inica, solubilidad y dems caractersticas fisicoqumicas apropiadas para garantizar su estabilidad y funcionalidad, donde se obtiene un sobrenadante con las molculas de inters. Dicho sobrenadante es sometido posteriormente a un proceso de cromatografa de afinidad, donde empleando un gel de Insulina-Sepharosa (elaborado qumicamente) como fase solida son retenidas y aisladas (con la consecuente elucin de la columna) finalmente las fracciones que contienen los receptores de insulina las cuales deben reunirse, concentrarse y almacenarse en condiciones optimas para su posterior utilizacin. 2 Inmunizacin de animales con el antgeno para la obtencin del anticuerpo Una vez preparada la solucin antignica de los receptores bajo las condiciones adecuadas (es decir con los coadyuvantes necesarios), se procede a inocular un nmero apropiado de ratones o conejos con una dosis inicial de inmunizacin de dicha solucin, seguido de la administracin de varias dosis de refuerzo a los das o intervalos preestablecidos en el esquema de inmunizacin. Una vez completado tal esquema, se procede a valorar la cantidad srica de anticuerpos producidos por cada uno de los animales mediante un sistema inmunoenzimtico tipo ELISA (ensayo inmuno-absorbente asociado a enzimas), con la finalidad de encontrar aquellos animales con los mayores ttulos de anticuerpos (de mayor produccin), aplicarles una dosis final de refuerzo del antgeno y proceder a su posterior sacrificio y extraccin del bazo como fuente de linfocitos B (de los cuales depende en efecto la produccin de los anticuerpos).3 Obtencin de Hibridomas Una vez separados los linfocitos B de los glbulos rojos y de las plaquetas que contiene la suspensin de clulas del bazo (a travs de un proceso de centrifugacin en un fluido denso como el Ficoll-polisacrido
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B. Maestro G. Modulacin transcripcional del gen del receptor de la insulina por la 1,25-Dihidroxivitamina D3. Implicaciones en el control de las actividades biolgicas de la insulina. Tesis Doctoral. Universidad Complutense de Madrid. Espaa. 2003. 14, 15. 2 Y. Fujita Y. et, al. Purification of Insulin Receptor with Full Binding Activity. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 258. No.6. 1983. 5045 - 5046. 3 J. Trejos, J. Castao. Obtencin de anticuerpos monoclonales de ratn contra proteasa de cistena 5 recombinante de Entamoeba histolytica. Rev.MVZ Crdoba 17(2):3014-3023, 2012.

hidroflico-), se realiza la fusin de los mismos con clulas de mieloma de ratn (clulas de capacidad de replicacin infinita) empleando Polietilenglicol como agente de fusin (el cual posibilita la fusin de las membranas de las clulas al favorecer la proximidad entre estas como resultado de la destruccin de las fuerzas tensin superficial que hacen que las clulas se repelan entre s) y siguiendo el procedimiento general para tal fin, al final del cual se obtiene una solucin compuesta por clulas fusionadas linfocito-mieloma, linfocitos no fusionados y clulas de mieloma no fusionadas, las cuales pueden separarse cultivando tal solucin en un medio de cultivo que permita nicamente el crecimiento de las clulas fusionadas (medio de seleccin metablico) como lo es por ejemplo un medio constituido por hipoxantina, aminopterina y timidina.
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Seleccin o Cribado de Hibridomas Dado que en el proceso de produccin de los hibridomas se puede dar lugar a la formacin de clulas hibridas que no producen en realidad el anticuerpo especfico deseado y a su vez tener la presencia de clulas de mieloma no fusionadas, se hace necesaria la seleccin de aquellas clulas hibridas que en efecto si producen el anticuerpo mediante la aplicacin de ensayos ELISA, tcnicas de inmunotransferencia, tcnicas de precipitacin, etc. 4 Clonacin de los hibridomas Seleccionados y aislados los hibridomas productores del anticuerpo de inters, se procede a su clonacin, con el objetivo de garantizar que, cada una de las clulas sea una rplica exacta de la otra y de esta forma se produzca una sola clase de anticuerpo contra el antgeno en cuestin. Esta operacin bien puede realizarse a travs del mtodo de dilucin lmite o por crecimiento en un medio de agarosa enriquecido con suero, aminocidos y antibiticos. El mtodo de dilucin lmite, que es hoy en da el de mayor utilizacin, consiste en diluir y distribuir la suspensin de hibridos seleccionados en una serie de pocillos estriles de una microplaca, de tal forma que el volumen que se coloca en cada uno de ellos contenga en promedio una sola clula hibrida. 4, 5 Caracterizacin de los anticuerpos monoclonales obtenidos Una vez obtenidos los anticuerpos monoclonales a partir del proceso de clonacin, es necesario realizar una evaluacin preliminar de la especificidad de los mismos por el receptor de insulina a travs de una metodologa apropiada para tal objetivo como lo es por ejemplo una tcnica de inmunoelectroforsis, ensayos tipo ELISA, etc. 6

Produccin en masa de los anticuerpos monoclonales: expansin in vivo La produccin de grandes cantidades del anticuerpo monoclonal de inters puede realizarse mediante la inoculacin de las clulas hibridas seleccionadas, en animales que previamente han sido inmunosuprimidos y se les ha generado una peritonitis qumica por contacto con un agente irritante orgnico, (como el Pristane 2, 6, 10,14-tetrametilpentadecano- por ejemplo), lo cual conlleva al desarrollo de un tumor productor de grandes cantidades del anticuerpo. Al cabo de unos das y por medio de una puncin intraperitoneal, se recolecta el lquido asctico que contiene los anticuerpos originados y se somete posteriormente a un proceso de purificacin a travs de una cromatografa de afinidad para eliminar posibles agentes interferentes presentes en el lquido (si bien podra desarrollarse de partida el crecimiento de los hibridomas en un medio de cultivo apropiado, obteniendo as anticuerpos altamente purificados). Una vez realizado este proceso, se realiza nuevamente la evaluacin de la especificidad de los anticuerpos obtenidos por las metodologas ya indicadas (sistema ELISA, etc.). 3, 4

Winn. Allen. Koneman. et,al. Diagnostico Microbiolgico. 6 edicin. Editorial Mdica Panamericana. Madrid, Espaa. 2006. 113. K. Sikora. H. M. Smedley. Anticuerpos Monoclonales. Editorial Reverte. Espaa . 1986. 17-21. 6 A. Umaa, C. Anzola, et.al. Obtencin y caracterizacin de un anticuerpo especifico contra la hormona luteinizante humana. Biomdica 1996: 16:315-20 317.
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Humanizacin de los anticuerpos monoclonales obtenidos Con el objetivo de incrementar la eficacia teraputica de este tipo de molculas y disminuir los efectos inmunognicos potenciales de las mismas dado su carcter cien por ciento murino (que el organismo claramente puede reconocer como extrao) surgi hace varios aos esta tcnica de produccin de anticuerpos, la cual permite combinar las regiones de origen roedor que reconocen con alta especificidad el antgeno en cuestin (regiones hipervariables) con las cadenas pesadas de un tpico anticuerpo humano que son necesarias para la accin biolgica de los mismos (regiones de entramado humanas). Para tal efecto, deben secuenciarse las regiones variables del anticuerpo previamente obtenido; ensamblar dichas regiones junto a las regiones de entramado humanas (obtenidas por medio de reaccin en cadena de la polimerasa) en vectores de expresin adecuados; introducir dichos vectores en clulas receptoras apropiadas y seleccionar finalmente, aquellas que produzcan de manera estable y apreciable el anticuerpo de inters, con lo cual se dara culminacin al proceso de obtencin del anticuerpo. 7,8

T. Crombet, et.al. anticuerpo monoclonal humanizado h-R3: un nuevo concepto teraputico para el tratamiento del cncer avanzado. Biotecnologa Aplicada 2003; Vol.20, No.1. 33, 34. 8 B. Blanco, et.al. Anticuerpos monoclonales. Realidades y perspectivas. Editorial Complutense. Espaa. 2004. 117, 118.