Prctica N 7.

Cromatografa en columna Claves 14 y 15

Objetivos
Comprender la tcnica de cromatografa en columna, sus caractersticas y los factores que en ella intervienen. Emplear la tcnica de cromatografa en columna para la separacin de un compuesto orgnico. A travs de cromatografa en capa fina controlar la cromatografa en columna.

Antecedentes
a) b) c) d) Cromatografa en columna. Para que sirve y sus aplicaciones. Cromatografa de adsorcin, de particin o reparto. Factores que influyen en una separacin por cromatografa en columna. Seleccin de eluyentes y adsorbentes para la separacin de compuestos por cromatografa en columna.

a) La cromatografa en columna es un proceso en el cual se separan los componentes de las mezclas a medida que son transportadas por un fase fluida mvil a travs de una fase estacionaria slida o lquida. En este caso, la fase estacionaria est constituida por un slido que se empaqueta en una columna, normalmente de vidrio. Los componentes a separar se aaden en forma soluble por la parte superior de la columna, quedando retenidos en la misma. Posteriormente los componentes se desplazan arrastrados por una fase mvil lquida. Dependiendo de la absorcin selectiva de cada uno de ellos por la fase estacionaria se desplazan a distinta velocidad, efectundose la separacin. Para que haya una separacin efectiva de los componentes, su velocidad a travs de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud de la columna, adecuada. La separacin de las molculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribucin entre la fase mvil y la estacionaria, y esta separacin se puede realizar en funcin de sus cargas, masas, tamaos moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, etc. Como resultado hay una gran variedad de tcnicas para llevar a cabo la separacin de una sustancia por cromatografa. b) Segn el tipo de interaccin que se establece entre los componentes de la mezcla y la fase mvil y estacionaria podemos distinguir entre: 1. Cromatografa de adsorcin. La fase estacionaria es un slido polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar. 2. Cromatografa de particin. La separacin se basa en las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y mvil, que son ambas lquidas. 3. Cromatografa de intercambio inico. La fase estacionaria es un slido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la fase mvil.

Facultad de Qumica UNAM Grupo 1

Laboratorio de Qumica Orgnica I Profesora: Elena Guadalupe Ramrez Lpez

Prctica No. 7 Cromatografa en columna

c)

Claves 14 y 15

Cuando el disolvente avanza sobre las manchas de las sustancias, comienzan a actuar dos tipos de fuerzas opuestas: unas que arrastran y otras que retardan. Las fuerzas propulsoras actan apartando las sustancias de su punto de origen y desplazndolas en direccin del flujo de origen; las fuerzas retardantes tratan de impedir el movimiento de las sustancias, llevndolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrs en el papel. La distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen, en un tiempo dado, es la resultante de estas dos clases de fuerzas. Fuerzas propulsoras Flujo del disolvente: Si la sustancia cromatografiada fuera completa e instantneamente soluble en el disolvente que avanza, por ejemplo agua y azcar, y no actuaran fuerzas de retardo la sustancia ascender desde el origen hasta donde llega el diluyente. En cambio si la sustancia fuera completamente insoluble en el disolvente en movimiento no se movera del origen. La corriente del disolvente es la misma para todas las sustancias de la mancha, as pues, si el disolvente fuese capaz de disolver instantnea y completamente todas las sustancias, estas avanzaran juntas hasta el final de la trayectoria del disolvente y terminaramos donde empezamos con todas las sustancias juntas. Solubilidad: Una fuerza diferencial es, en efecto, la solubilidad. Pocas son las sustancias que ofrecen la misma solubilidad en cualquier disolvente. La particular solubilidad de una sustancia en la corriente del disolvente es una fuerza propulsora que tiende a desplazarla, mantenindola en movimiento a lo largo del papel. Fuerzas retardantes Adsorcin: La celulosa de la que est hecho el papel de filtro, posee propiedades adsorbentes. Las sustancias depositadas en el papel, en cromatografa, pueden ser ms o menos adsorbidas en el papel. La adsorcin es otra de las fuerzas diferenciales, esto significa que unas sustancias son adsorbidas ms que otras y, por consiguiente, la liberacin de las sustancias de las manchas variar de una sustancia a otra. Esto contribuye de nuevo a la separacin. Mientras que se va realizando el cromatograma, las sustancias ms fuertemente adsorbidas se van quedando atrs, mientras que las adsorbidas con menos fuerza avanzan hacia el frente. Reparto: La cromatografa se basa, en una medida considerable, en la presencia de dos fases liquidas individualizadas. Una de ellas es la corriente del disolvente circulando por el papel de filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo papel de filtro. Una hoja de papel de filtro aparentemente seca contiene entre un 6 y 12% de agua firmemente adherida a la celulosa. Aqu es donde entra en funcin el reparto. Cuando una sustancia que es soluble en dos disolventes no mezclados es expuesta al mismo tiempo a ambos, se repartir entre ellos. La cantidad que se encuentre en cada disolvente depender de la relativa solubilidad del soluto en cada uno.

d) Adsorbente y eluyentes: son muchos los slidos que se han utilizado como fase estacionaria en cromatografa de adsorcin. Los ms importantes son almina, silicato de aluminio, silica gel, xido, silicato y carbonato de magnesio, xido, carbonato y fosfato de calcio, como inorgnicos; y carbn, almidn y azcares como orgnicos. Normalmente deben ser sometidos a un proceso trmico de activacin superficial antes de su utilizacin. Como eluyentes se utilizan agua, alcoholes, cetonas, steres, cloroformo, tetracloruro de carbono, etc. Su capacidad de elucin depende de su polaridad, del absorbente y de las especies a eluir.

Facultad de Qumica UNAM Grupo 1

Laboratorio de Qumica Orgnica I Profesora: Elena Guadalupe Ramrez Lpez

Prctica No. 7 Cromatografa en columna

Claves 14 y 15

Datos y resultados
Fase fija: slica gel Fase mvil: acetato de etilo Datos del fabricante de la muestra comercial (Tylenol) Una pastilla de 650 mg contiene 500 mg de paracetamol. Masa de muestra comercial de paracetamol: 107.726 mg Masa de paracetamol contenida en la muestra comercial: 82.52 mg

Distancia total (b): 5.6cm / Testigo: 2.9cm /

1, 2, 3, 4: --

T: Testigo. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: Fracciones o eluatos

Distancia total (b): 5.6cm / Testigo: 2.6cm /

5, 6: 2.8cm

Distancia total (b): 5.6cm / Testigo: 3.3cm /

7, 8: 3.2cm

Facultad de Qumica UNAM Grupo 1

Laboratorio de Qumica Orgnica I Profesora: Elena Guadalupe Ramrez Lpez

Prctica No. 7 Cromatografa en columna

Claves 14 y 15

Clculo de Rf:
Rf= distancia recorrida por la muestra (a) / distancia recorrida por el disolvente (b) Rf testigo= 2.6 / 5.6 = 0.46428 Rf muestras 5 y 6 = 2.8 / 5.6 = 0.5 Se comprueba la presencia de paracetamol en los frascos viales 5 y 6

Rf testigo= 3.3 / 5.6 = 0.58928 Rf muestras 7 y 8 = 3.2 / 5.6 = 0.5714

Se comprueba la presencia de paracetamol en los frascos viales 7 y 8

Clculos de paracetamol recuperado de los frascos viales 5, 6, 7 y 8 por destilacin:

Masa del vaso de precipitados: 47.9756g Masa del vaso de precipitados con paracetamol: 48.0335g Masa de paracetamol recuperado (diferencia): 57.9mg Datos del fabricante de la muestra comercial (Tylenol) Una pastilla de 650 mg contiene 500 mg de paracetamol. Masa de muestra comercial de paracetamol: 107.726 mg Masa de paracetamol contenida en la muestra comercial: 82.52 mg Rendimiento de la separacin por cromatografa: = 70.16%

CUESTIONARIO
1. Indique algunas de las aplicaciones de la cromatografa de adsorcin. 2. Diga cul es la diferencia entre una cromatografa en capa fina y la de columna. 3. Qu debe hacerse para encontrar el eluyente adecuado para un compuesto que se purificara en cromatografa en columna? 4. Por qu es necesario realizar una cromatografa en capa fina a los eluatos obtenidos de la columna cromatogrfica? 5. Escriba una lista de eluyentes utilizados en cromatografa en columna en orden de polaridad creciente. Anote su bibliografa.

Facultad de Qumica UNAM Grupo 1

Laboratorio de Qumica Orgnica I Profesora: Elena Guadalupe Ramrez Lpez

Prctica No. 7 Cromatografa en columna

Claves 14 y 15

1) Columna= separacin de colorantes, protenas. Capa fina= separacin de aminocidos. 2) La cromatografa en capa fina (TLC) es un procedimiento rpido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para identificar/caracterizar o para determinar semi cuantitativamente componentes individuales. La separacin se basa en que las sustancias investigadas se reparten de modo diferencial entre una fase estacionaria y otra mvil: en la TLC el eluyente (fase mvil) se desplaza por una fina capa del adsorbente (fase estacionaria), transportando as los componentes individuales de la mezcla de sustancias ms o menos lejos dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorcin. Al contrario, que en la cromatografa en columna, el proceso separativo transcurre en un sistema abierto, la placa separativa plana. El recorrido particular de cada sustancia se emplea as para su identificacin. 3) De acuerdo a la polaridad de la muestra se determina la polaridad del eluyente y determinar las dems fases que rodean la columna para evitar que la muestra no se desplace ms de lo necesario. 4) Porque sirve como un criterio de pureza e identificacin, ya que las muestras con un Rf cercano o muy parecido son las que tendrn el mismo compuesto que buscamos purificar. Adems, con la comatografa en capa fina se busca comprobar que el disolvente que se ha escogido es el ideal ya que uno de los criterios es que la muestra haya tenido un Rf cercano a 0.5. 5) Serie eluotrpica de disolventes: ter de petrleo > ciclohexano >sulfuro de carbono> tetracloruro de carbono > Benceno> Tolueno > Diclorometano > Cloroformo > ter etlico > Tetrahidrofurano > Acetato de etilo > Acetona > n-butanol > etanol > metanol > agua > cido actico. (Galagovsky, 1987).

Anlisis de resultados
No se coloc en la columna de cromatografa la pastilla completa, sino una fraccin para evitar que el procedimiento se prolongue ms de la duracin de la clase. La fase mvil (acetato de etilo) que se utiliz para disolver al paracetamol tiene una polaridad intermedia. A medida que se realiz la cromatografa en columna se realiz tambin cromatografa en capa fina para identificar los eluatos que contienen paracetamol resultando que los viales 5, 6, 7 y 8 contienen una cantidad significativa de paracetamol. El frasco nro. 4 mostr una mancha muy tenue, por lo que se consider que no contena una cantidad adecuada del compuesto de inters como para someter su contenido a destilacin. De la destilacin de los eluatos mencionados se obtuvo una masa menor de paracetamol que la esperada. Esto puede deberse a que qued paracetamol en la columna y a la fraccin ya mencionada que no se destil. De todas formas el rendimiento de la separacin (70%) no fue demasiado bajo.

Facultad de Qumica UNAM Grupo 1

Laboratorio de Qumica Orgnica I Profesora: Elena Guadalupe Ramrez Lpez

Prctica No. 7 Cromatografa en columna

Claves 14 y 15

Conclusiones
En esta prctica logramos conocer la utilidad y caractersticas de la cromatografa en columna y tambin de la cromatografa en capa fina, adems de la preparacin de la columna y la capa fina (fase fija) respectivamente. Al separar por cromatografa en columna el paracetamol de la fraccin de pastilla, nos dimos cuenta de que es necesario identificar la presencia del compuesto por otra tcnica (y as tener control sobre la cromatografa en columna). De esta forma comprobamos la utilidad de la cromatografa en capa fina y el uso de la comparacin de Rf de un testigo con la muestra como criterio para identificacin. Con la limitante de que el Rf depende de las condiciones del experimento que son difciles de controlar, por lo que fue necesario agregar siempre un testigo. Adems comprobamos que es posible tener una nocin de las diferentes concentraciones de muestra por la intensidad del color de la mancha (utilizando un mtodo como luz UV o cmara de iodo para molculas con insaturaciones si la sustancia es incolora).

Bibliografa
Lydia Galagovsky Kurman, Qumica Orgnica Fundamentos terico prcticos para el laboratorio, Editorial EUDEBA, 1987, pp 125 179.

Facultad de Qumica UNAM Grupo 1

Laboratorio de Qumica Orgnica I Profesora: Elena Guadalupe Ramrez Lpez