UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DIVISION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

MICRONUCLEOS (MN) E INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH) COMO PRUEBAS INDICADORAS DE LA ACCION MUTAGENICA DE DIAZEPAM Y DEL DI FEN LHID ANTOINATO DE SODIO.

TESIS QUE CON OPCION AL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN GENETICA PRESENTA: BIOL GRACIELA GUADALUPE VALENCIANO CEDILLO

MONTERREY, N. L.

MAYO DE 1995

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UNIVERSIDAD AUTNOMA D E NUEVO LEN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DIVISIN DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

MICRONUCLEOS (MN) E INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH) COMO P RUEBAS INDICADORAS DE LA ACCIN MUTAGNICA DE DIAZEPAM Y DEL DIFENILHIDANTOINATO DE SODIO.

TSIS Q U E CON OPCIN AL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN GENTICA PRESENTA

BIL. GRACIELA GUADALUPE VALENCIANO CEDILLO

MONTERREY, N. L.

MAYO DE 1995

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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS DIVISION DE ESTUDIOS DE POSTGRADO

MICRONUCLEOS (MN) E INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH) COMO PRUEBAS INDICADORAS DE LA ACCION MUTAGENICA DEL DIAZEPAM Y DEL DI7ENILHIDARTOINATO DE SODIO. TESIS QUE CON OPCION AL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN GENETICA PRESENTA BIOL. GRACIELA GUADALUFBv VALENCIANO CEDILLO

PRESIDENTE :

SECRETARIO : M.C. ELVX/IRENE CORTES GUTIERREZ VOCAL : DR. RAUL GRZA CHAPA.

MONTERREY N.L.

MAYO DE 1995.

DEDICATORIA

A MIS PADRES:

GRACIELA CEDILLO DE VALENCIANO CARLOS VALENCIANO SOLIS Gracias por su ejemplo.

A NI ESPOSO:

ING.JESUS RODRIGUEZ FEMAT Por tu confianza, apoyo y por tu amor.

A MIS HIJOS:

ERICKA GRACIELA RODRIGUEZ VALENCIANO JESUS EDUARDO RODRIGUEZ VALENCIANO Por venir a colmar de alegrias a mi vida. Gracias a Dios que me mando a mis hijos como dos regalos, y sin merecerlos.

A MIS HERMANOS:

FRANCISCO JAVIER VALENCIANO CEDILLO CARLOS VALENCIANO CEDILLO LAURA MARINA VALENCIANO CEDILLO ARTURO VALENCIANO CEDILLO JUAN ALBERTO VALENCIANO CEDILLO NORAYMA ELIZABETH VALENCIANO CEDILLO Gracias por su confianza.

AGRADECIMIENTOS PARA MIS GRANDES MAESTROS : M.C. CARLOS H. LEAL GARZA que con su experiencia en Citogentica fue guindoroe en las diferentes etapas de realizacin de esta investigacin, brindndome su valioso apoyo, gracias por crear un estupendo ambiente de trabajo, por ser un lder que con su alegria el trabajo siempre lo torno agradable, por ser un excelente ser humano, GRACIAS. Dr.RAUL GARZA CHAPA, Por sus consejos, por su ejemplo dedicacin y por la revisin de este trabajo de tesis. PARA TODOS MIS MAESTROS. Para mis compaeros y amigos especialmente para: M.C. ELVA IRENE CORTEZ GUTIERREZ que en una forma desinteresada me ayudo a terminar este trabajo, con su amistad y empuje me estimul a continuar en los momentos de desanimo, por su honestidad y por su manera de ser en general, gracias.

de

trabajo,

Q.C.B MARIA DE LOS ANGELES ROJAS por su valiosa cooperacin tcnica de tincin de microncleos y por su agradable simpata. L.C.B. SUSANA BACA SEVILLA por su comprensin. M.C.RICARDO CERDA estadsticas. FLORES por su apoyo en el manejo Por su

en la

de mamferos y

valiosa cooperacin en las pruebas cooperacin en la

M.C.H. ANTONIO LUNA DE LA R08A. Por su valiosa elaboracin de las fotografas aqui incluidas.

INGENIERO ALFONSO RODRIGUEZ DEL ANGEL (Director de la preparatoria #2) por su apoyo . M.C. ZACARIAS JIMENEZ, M.C* JOSE LUIS RAMIREZ, M.C. ADRIANA ZAMPA YO, Q.C.B. ANTONIO MARRO, BIOL. ANTONIO REYES, Q.B.P. GUILLERMO GONZALEZ a todos y cada uno de los que integran el personal del Centro de Investigacin Biomdica del Noreste del I.M.S.S. Por su compaerismo y por su apoyo, gracias. Al Centro de Investigacin Biomdica del Noreste del I.M.S.S. Monterrey N.L., a la Facultad de ciencias Biolgicas U.A.N.L., a la Preparatoria No. 2 de la Universidad Autonoma de Nuevo Lon.

LISTA DE ABREVIATURAS

5-BrdU DS FPG ICH DFH

5-Bromodeoxiuridina Desviacin estndar Colorante giemsa Intercambio Hermanas fluorescente mas de Cromtides de

Dif enilhidantoinato Sodio Tamao de la poblacin Luz ultravioleta Revoluciones por minuto Acido desoxiribonuclico Microncleos Prueba de microncleos Mitomicina C

n U.V r.p.m. ADN MN PM MMC mg/ml NaCl t..

Miligramos por mililitros Cloruro de Sodio "t" de student Machos Hembras Eritrocitos

EPC

Eritrocitos policromticos

LISTA DE CUADROS Y FIGURAS CUADRO # l Intercambio de cromtides hermanas (ICH) por clula de mdula sea de ratones tratados con tres dosis de difenilhidantoinato de sodio y de los grupos control, para ambos sexos. Intercambio de cromtides hermanas (ICH) por clula de mdula sea de ratones tratados con tres dosis de diazepam y los grupos control, para ambos sexos. Frecuencia de microncleos (MN) por clula de mdula sea de ratones tratados con tres dosis de diazepam y de los grupos control, para ambos sexos. 4 Frecuencia de eritrocitos (Er), eritrocitos policromticos (EPC) y microncleos (MN) en mdula sea de ratones tratados con tres dosis de diazepam y de los grupos control, para ambos sexos. Comparacin de los resultados obtenidos en las pruebas de microncleos (MN) e intercambio de cromtides hermanas (ICH) en ratones tratados con diazepam. 1 Intercambio de cromtides hermanas (ICH) en metafases obtenidas de mdula sea de ratn. Preparacin directa de mdula sea de ratn mostrando los microncleos en eritrocitos policromticos teidos con eosina-azul de metileno.

CUADRO 0

CUADRO # 3

CUADRO #

CUADRO # 5

FIGURA 0

FIGURA # 2

I N D I C E

PAG.

RESUMEN I.- INTRODUCCION II.- ANTECEDENTES A.- Intercambio de Cromtides Hermanas B.- Microncleos C. - Difenilhidantoinato de Sodio D.- Diazepam III.- MATERIAL Y METODOS

1 4 8 8 11 14 17 19

A.- PRUEBA DE INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH) a) Administracin de la 5-Bromodeoxiuridina.... b) Administracin de los compuestos a evaluar ( DFH y DIAZEPAM ) c) Aplicacin de la Colchicina d) Obtencin de clulas metafsicas a partir de mdula sea. e) Tincin diferencial de las cromtides hermanas f) Criterio experimental para la cuantificacin de ICH g) Anlisis estadstico B.- PRUEBA DE MICRONUCLEOS a) b) c) d) Administracin de los compuestos Obtencin de mdula sea Preparacin de laminillas Tincin de la mdula sea 25 26 27 27 21 21 22 22 23 24 25

e) Anlisis de laminillas f) Anlisis estadstico.. - RESULTADOS A.- INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS a) Comparacin de las frecuencias de ICH en ratones tratados con distintas dosis de DFH.... b) Efecto del sexo sobre la frecuencia de ICH en ratones tratados con distintas dosis de difenilhidantoinato de sodio

28 28

29

30

c) Comparacin de las frecuencias de ICH en ratones tratados con distintas dosis de diazepam y los controles positivo y negativo 31 d) Efecto del sexo sobre la frecuencia de ICH en ratones tratados con distintas dosis- de diazepam

32

B.- PRUEBA DE MICRONUCLEOS a) Comparacin de las frecuencias de microncleos en ratones tratados con distintas dosis de diazepam, con sus respectivos controles positivo y negativo. 33 b) Efecto del sexo sobre la frecuencia de microncleos en ratones tratados con distintas dosis de diazepam 34 c) Eritropoyesis en ratones tratados con distintas dosis de diazepam y en controles positivo y negativo 36 d) Efecto del sexo en la eritropoyesis de ratones tratados con diferentes dosis de diazepam 36

C.- SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA DE MICRONUCLEOS (MN) Y LA TECNICA DE INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH) EN RATONES TRATADOS CON TRES DOSIS DE DIAZEPAM

38

y.- DISCUSION

A.- PRUEBA DE INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS EN RATONES TRATADOS CON DIFENILHIDANTOINATO DE SODIO. a) Frecuencia de ICH en ratones tratados con distintas dosis de DFH 40 b) Efecto del sexo sobre la frecuencia de ICH en ratones tratados con distintas dosis de difenilhidantoinato de sodio B.- PRUEBA DE MICRONUCLEOS a) Frecuencias de microncleos en ratones tratados con distintas dosis de diazepam con sus respectivos controles positivo y negativo 41 C.- COMPARACION DE LAS DOS TECNICAS UTILIZADAS EN ESTE TRABAJO (ICH) Y (PM) 46 I.- CONCLUSIONES 49

41

VII.- LITERATURA CITADA

50

VIII.- APENDICE

58

RESUMEN Un nmero considerable son de agentes qumicos a los que est ellos de podran estar

expuesta la poblacin determinando en gran

mutagnicos, la

medida

aparicin

anormalidades

genticas. Por lo tanto es necesario la identificacin de aquellos compuestos que lo sean y su consiguiente eliminacin. La importancia del presente trabajo estriba en la evaluacin de la posible actividad mutagnica de dos agentes sodio DFH qumicos y en el la

anticonvulsivantes, difenilhidantoinato Diazepam, los cuales son

de

frmacos ampliamente difundidos la actividad mutagnica se

poblacin. Para evaluar

utilizaron

dos pruebas citogenticas: Prueba de Intercambios entre Cromtides Hermanas (ICH) y Prueba de Microncleos (PM). Para el anlisis del efecto de las pruebas vivo , se del DFH y el Diazepam por medio en sistemas in

citogenticas arriba mencionadas

utiliz

un gran total de 90 ratones de la linea Balb-C 30 de estos ratones (15 machos y 15 para cada sexo, 3 grupos

entre 8 a 12 semanas de edad.

hembras) fueron divididos en 5 grupos

fueron inyectados intraperitonealmente con una dosis a concentraciones de 1, 10 y 20 mg/kg. negativo (inyectados

nica de DFH

Los dos grupos restantes con a suero una

sirvieron como controles fisiolgico) y positivo

(inyectados con

Mitimicina-C

concentracin de 0.5 mg/kg). la misma manera pero

Otros 30 ratones fueron agrupados de en dosis nica 0.1, 0.2 y 0.4

aplicndoles

mg/kg de Diazepam,

los

grupos

control C

negativo

positivo

recibieron suero fisiolgico y mitomicina cada ratn, se analizarn mdula sea usando la

respectivamente. Por obtenidas diferencial de la

de 25 a 50 metafases tcnica de tincin

para

intercambios de cromtides hermanas. para cada grupo de tratamiento y

Los

valores promedio de ICH negativo y

de los controles

positivo fueron comparados entre si mediante la prueba estadistica de ANOVA (p<0.05). tratados con DFH El anlisis de la frecuencia de ICH en ratones mostr un incremento y 20 mg/kg significativo (5.752.23) a al

concentraciones de 10 compararlo con el ICH en ratones

(5.411.71)

control negativo (4.26+1.29). con Diazepam mostr

La frecuencia de un incremento (4.061.79 y el control

tratados

significativo en las concentraciones 0.2 y 0.4 mg/kg 4.431.62 respectivamente) al negativo (3.571.50). De acuerdo ratones tratados con positiva en los DFH y ser al comparados sexo, con

el anlisis de ICH en una correlacin

Diazepam es se

mostr decir

ratones

machos,

que

al aumentar las

concentraciones de DFH y Diazepam ICH. Para la

increment la frecuencia de restantes se

prueba de microncleos los 30 ratones misma

agruparon de la

forma que los experimentos anteriores. Por eritrocitos policromticos de Un de incremento eritrocitos

cada ratn, fueron analizados 2000 mdula sea teidos con

Wright-Giemsa. el porcentaje observado en

significativo X2(p<0.05) en

policromticos microncleados fu

ratones tratados

con Diazepam a compararlo

0.1

(2.06%),

0.2

(2.03%) y 0.4 mg/kg (2.18%) al (1.02%). De acuerdo al sexo, mostr

con el control negativo

el efecto del Diazepam sobre la frecuencia de microncleos la misma susceptibilidad entre

machos (2.12%) y hembras (1.88%). de ICH y PM fue posible detectar el Diazepam; de Sin embargo para es

En conclusin usando las pruebas efectos mutagnicos del importante continuar con DFH y

este

tipo

estudios

poder

determinar el posible potencial mutagnico de estos frmacos sobre los humanos.

I.-INTRODUCCION A partir del hallazgo de que algunos compuestos qumicos ser mutagnicos en surge una nueva

producidos y usados por el hombre,

resultaron

experimentos con sistemas biolgicos subhumanos, rea en la Toxicologia, llamada

comunmente Toxicologia Gentica

o Gentica Toxicolgica, esto debido a la posibilidad de que tales compuestos pudieran representar un riesgo potencial para la en

produccin de mutaciones gnicas o anormalidades

cromosmicas

clulas somticas en las generaciones contemporneas, o en futuras generaciones por la produccin de mutaciones en clulas gamticas.

Siendo ms

de

50,000 los compuestos producidos y difundidos

por la industria, adems de los que ao tras ao se introducen, se hace necesario el establecimiento eficaces para identificar capacidad de inducir de pruebas rpidas, sencillas y compuestos que tengan la

aquellos

mutaciones,

para poder lograr la prevencin

de los posibles efectos adversos sobre la poblacin humana.

Dichas alteraciones o mutaciones pueden resultar de la accin directa de los agentes qumicos sobre el material gentico o sobre componentes celulares funcionalmente ligados a l, como son los

organelos que participan en la divisin celular (centrlolos y microtbulos), las protenas de la cromatina o las enzimas que

contribuyen a la

duplicacin

reparacin

del

ADN.

Para estimar el riesgo que un el hombre, l mismo sera el

compuesto dado representa para biolgico ideal para

sistema

determinar y cuantificar dicho riesgo; sin embargo, los requisitos ticos y econmicos, as como la duracin de los estudios,

dificultan la investigacin en los los experimentos en valiosos en la qumicos por su sistemas

seres humanos. Por esto mismo, no humanos resultan

biolgicos

evaluacin de los efectos genticos de los agentes capacidad de reproduccin, facilidad de

realizacin, relativa economa y corta duracin.

Dentro de los sistemas biolgicos no humanos utilizados para identificar bacterias, hongos, plantas, mutgenos, insectos, se

ms

comnmente

encuentran los virus, de clulas de

cultivo

mamferos, y mamferos en general, entre estos los ratones son una de las especies ms utilizadas en los cuales se pueden identificar alteraciones a nivel tanto numricos como de mutacin gnica, rearreglos estructurales, adems cromosmicos

de la transmisin de

mutaciones a los descendientes.

Algunas tcnicas citogenticas

como la prueba de Intercambio y la Prueba para la

de Cromtides Hermanas (ICH) Perry and Wolff (1974), de Microncleos (PM) S chin id (1975), son muy

valiosas

deteccin y la

cuantificacin

de

mutagenicidad. mutagnica,

El presente para dos de

trabajo est enfocado

hacia la evaluacin

farmacos anticonvulsivantes de sodio (DFH) y citogenticas. el

uso comn; Difenilhidantoinato utilizando dichas

Diazepam,

tcnicas

HIPOTESIS En base a la informacin anterior se plantearon las

siguientes hiptesis: 1.- Debido a niveles de su estrecha relacin con eventos mutacionales, de Cromtides los

Intercambios

Hermanas (ICH) y los

microncleos (MN), sern ms

elevados en los ratones tratados que en los

con diazepam y difenilhidantoinato de sodio (DFH), ratones del grupo control negativo. 2.- La susceptibilidad de los

ratones a la actividad mutagnica de sodio varia con el sexo

del diazepam y difenilhidantoinato de los mismos.

OBJETIVOS Para apoyar o refutar estas hiptesis se plantearon los siguientes obj etivos: 1.- Detectar la presencia y frecuencia de microncleos jvenes en los

eritrocitos policromticos

de mdula sea de ratones

.tratados y sus respectivos grupos

control mediante la tincin

con eosina-azul de metileno. 2.- Determinar la Hermanas (ICH) frecuencia en y de Intercambios de de Cromtides sea prueba de de

metafases grupo

obtenidas

mdula la

ratones tratados

control,

mediante

tincin diferencial (ICH). 3.- Comparar las frecuencias de microncleos tratados con e intercambio de los del grupo

cromtides hermanas en ratones

control mediante pruebas estadsticas. 4. Relacionar estos parmetros citogenticos con dosis aplicada con la finalidad de el sexo si y la

observar

existen

diferencias con respecto a una poblacin testigo. 5.- Comparar la sensibilidad de las pruebas de MN e ICH para

detectar actividad mutagnica.

II.- ANTECEDENTES

El estudio

identificacin

precisa de los cromosomas en de la Gentica, la de

general di paso a una nueva rama Citogentica que ha cromosomopatias y en por diversos agentes antiepilpticos. sido aplicada

especifica para la

caracterizacin

la deteccin de daos cromosmicos inducidos qumicos, entre han estos los medicamentos diversas

Recientemente se

desarrollado

tcnicas citogenticas que

permiten analizar con ms sensibilidad compuestos qumicos, stas son (ICH) y la

la actividad mutagnica de algunos la prueba de Intercambio

entre Cromtides Hermanas

Prueba de Microncleos

(PM).

A.- INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS Los Intercambios entre Cromtides Hermanas (ICH) fueron

primeramente descritos por Taylor (1957), al trabajar con cultivos de clulas vegetales marcadas con timidina tritiada tcnicas autorradiogrficas, l hermanas ocurran intercambios observ y utilizando

que entre las cromtides de segmerytos

recprocos

cromosmicos, pero con este tipo de tcnicas el anlisis detallado era muy limitado, ya que el poder de resolucin no era el adecuado. de sta tcnica

Zakharov y Ego lina (1972) encontraron que si se les permita duplicar su ADN base anloga 5-bromodeoxiuridina

a las clulas animales en cultivo dos, veces en presencia de la

(BrdU) los cromosomas sustituida con BrdU sustituida, sto le y

tendran

una

cromtide

unifilariamente doblemente cierta

su cromtide confiere a

hermana las

estara cromtides

caracterstica ya que mediante una tincin con el colorante Giemsa podemos diferenciar las dbilmente y la otra cromtides ms por su tincin, una se tie Posteriormente en Latt

con

intensidad.

(1973), obtuvo una diferenciacin ms contrastante teidos con el fluorocrorao Hoechst 33258.

cromosomas la

Sin

embargo,

combinacin de ambas tcnicas llamada FPG ( colorante Fluorescente mas Giemsa realizada por Perry y Wolff en 1974, permiti la

deteccin de los ICH con una gran resolucin, adems

de que no se

requera un microscopio de fluorescencia, ni microfotografas para su observacin.

La prueba

de

intercambios entre cromtides hermanas ha sido in vitro, pero recientemente

frecuentemente utilizada en sistemas

se ha logrado utilizar en algunos mamferos en sistemas in vivo.

Murty y

Col. (1977) concluyeron que los ICH ms sensible para determinar

constituyen

el

sistema de prueba mutgenos y/o

ios efectos de en que ICH las son

carcingenos, mismas

fundamentndose requeridas para

concentraciones de las

inducir

menores que las necesarias para inducir aberraciones cromosmicas. El alto poder de resolucin de este mtodo abre un nuevo campo de

investigacin en mutagenicidad, sospechosas de ser mutagnicas, an a concentraciones que no

basado en que algunas substancias podran elevar el nmero de ICH produccin de

eran activas en la

anormalidades cromosmicas detectadas por otras pruebas.

Se ha

establecido que el nmero promedio de ICH puede variar como los medicamentos, como el C, melphalan, sndrome el Lamberte de Bloom, Parodi se

debido a distintos factores tales busulfan, cic1ofosfamida,

mitomicina Butler

(1978); bebidas alcohlicas, Latt (1981); algunos

(1981); como

hbitos personales

fumar,

(1982); el consumo de t, caf, cocoa, Renner (1982).

Tambin

han encontrado frecuencias elevadas de ICH en ciertas enfermedades virales como herpes, hepatitis e influenza, un defecto Crossen <1982);

enfermedades en las que se presenta reparacin del AON y son personas

en el sistema de a procesos

predispuestas cncer

cancerosos como leucemias,

linfornas,

mamario y melanomas

cutneas, Murty (1982), Anemia de fanconi y ataxia telangiectasia, Latt 1981 y Galloway (1985). A factores como la edad Das B (1985). Exposicin a ciertos etileno Soper (1984), metales al y sustancias Leal-Garza y col como y el xido de el

plomo,

col.(1986),

antifertilizante Gosipol, Leal-Garza cloro-vinilo, Fuci A. y col (1992),

(1990) , el monmero

, pueden tambin aumentar la

frecuencia de los ICH en distintos sistemas biolgicos de prueba.

El mtodo

de

BrdU-Giemsa

para la deteccin de ICH, permite ciclo celular en cultivos de

tambin estudiar la cintica del linfocitos; las metafases diferencial, mientras que

en primera divisin no las clulas

tienen

tincin

cultivadas por dos ciclos una tincin diferencial, y la otra

completos en presencia de BrdU muestran

es decir los cromosomas presentan una cromtide plida

obscura y las metafases en tercera divisin muestran un 7 5% de sus cromtides plidas (Figura 2) .

B.- PRUEBA DE MICRONUCLEOS El origen inicio por los de la llamada de "Prueba de microncleos" (PM), se y Schmid (1970), quienes

trabajos

Boller

realizando estudios hematolgicos observaron que en mdula sea de hamsters chinos tratados con el mutgeno Trenimon, nuclear ms frecuente, la anormalidad

fcil de contar y que mostr un alto grado fue la aparicin de policromticos) otros estudios especies de

de correlacin con aberraciones cromosmicas, microncleos en eritrocitos despus de la expulsin del

jvenes (eritrocitos ncleo principal. en

realizados por Matter

y Schmid

(1971),

varias

mamferos, incluyendo un demostraron la simplicidad haciendo hincapi que el

primate y utilizando el y uso aplicabilidad de esta de

mismo esta puede

mutgeno tcnica, ser una

prueba

herramienta muy valiosa en experimentos de mutagenicidad. ,Schmid (1971), Mi1ler (1973), Schmid (1975), Matter (1975),

concluyeron que citoplasmtica,

los

microncleos

son

cuerpos

de

inclusin y pocas

formados por

fragmentos

cromatlnicos

veces de cromosomas completos rezagados y que su clulas refleja la presencia de aberraciones

presencia en las cromosmicas que

ocurrieron durante la mitosis celular*

Matter y

Schmid

(1971), Headle

(1973),

Schmid de

(1975), la PM, las los son

realizaron una descripcin detallada de la metodologa basndose en los fracturas en los siguientes principios y

observaciones; acntricos no

cromosomas originan

fragmentos

cuales al no tener sitio de unin con el huso acromtico, llevados hacia los formar parte del polos opuestos de alguna de de la

clula, donde debera dos clulas hijas

ncleo

las

resultantes de la divisin celular, si no que son incluidos en las clulas hijas, formando uno o varios ncleos secundarios, mucho

ms pequeos que el ncleo principal, lo que motiv a denominarlos Microncleos (Schmid, 1975). Estos microncleos diferencial, ya que son fcilmente detectados por su tincin una de tonalidad azul intensa 1). en La

toman

eritrocitos jvenes derivados prueba de microncleos,

mdula sea,

(Figura

es un mtodo de anlisis citogentico que in vitro. Fue ideada para la es

puede utilizarse tanto in vivo como identificacin de agentes qumicos decir, a aquellos agentes capaces

con efectos clastognicos, de producir

fracturas a los

cromosomas.

Diversos trabajos

muestran lo til de la prueba y su

importancia dada su simplicidad, fcil conteo y amplio espectro de aplicabilidad.

Weber y Col (1975), describieron algunos agentes alquilantes, como

los la que

efectos producidos por trietilenmelamina stos producan y una para y

trimetilfosfato, en donde

observaron

frecuencia elevada de aberraciones sus experimentos clulas Schmid ( 1976), de mdula

cromosmicas

utilizando

sea de ratones. utilizando como

Matter

realizaron

experimentos

compuestos

inductores de aberraciones cromosmicas, mitomicina C, colchicina,

la ciclofosfamida, ciertas drogas

etilmetano-sulfonato y

citotxicas como las utilizadas en quimioterapia contra el cncer, y mostraron que drogas. Jenssen y Ramel (1980), con el objeto de evaluar la utilidad de carcingenos la frecuencia de microncleos aumentaba con estas

de la PM como un ensayo rpido para la deteccin

realizaron una revisin de la literatura y encontraron un total de 143 agentes quaicos que habian sido probados con sta tcnica, y producan eran un aumento en la a los

se demostr que la mayora de ellos frecuencia de los sistemas de prueba

microncleos, cuando tanto in

aplicados in

vivo

como

vitro.

'

Se ha

establecido

que

el

nmero

de

microncleos

en

eritrocitos policromticos jvenes

en

los

humanos tambin puede qumicos sino la

variar debido no solo a la induccin tambin a otros factores:

por

agentes

como en algunas enfermedades M.K. (1977).

como

anemia perniciosa, Jensen el fumar y el consumo

hbitos personales, como e el infecciones nmero de

de

bebidas

alcohlicas

virales, Stich y Rosin (1984) Tambin es aumentado MN en las enfermedades hereditarias tales

como el sndrome de alimenticias, and y

Bloom, Rosin y

Germn (1985)., en

ciertas

dietas

Picker y Fox (1986)., la edad de los individuos, Duttakk (1988)., en las terapias

Chakrabarti

antileucmicas

(quimio

radioterapia) Migliore L. y col.(1991),

y tambin puede variar el aparatos de uso

nmero de MN por las radiacines producidas por comn actualmente como Horvat (1992). el homo de

microondas. Garaj -Vrhovac y

En base a la informacin anterior, anlisis de microncleos efectivo para investigar

se

puede concluir que el econmico y

ofrece un mtodo sencillo,

y evaluar la respuesta celular al efecto

de mutgenos y/o agentes carcingenos.

C.- DIFENILHIDANTOINATO DE SODIO (DFB)

El DFH es un farmaco primario

usado

para

el tratamiento de

casi toda clase de epilepsia, su farmacocintica es modificada por

su hidrosolubilidad limitada

por su eliminacin que depende de en to<ios los tejidos la y se el

la dosis. Su distribucin es amplia excreta sin modificacin resto es metabolizado

menos del 5% del DFH por principalmente media por enzimas

orina,

microsomales 24 Hrs. el el cual

hepticas presentando una vida metabolito principal es representa alrededor de

plasmtica

de

el derivado para-hidroxifenilo, un el 60

% a 70% de una dosis nica, otros 3-metoxi, y el

metabolitos derivados son dihidrodiol. En el estudio

dihidroxicatecol,

realizado en

por

Bartsch (1975), de

al

analizar

metafases de linfocitos

cultivos

72 Hrs. provenientes de

nios bajo terapia con DFH, y al

compararse con un grupo control, al nmero

no se encontraron diferencias significativas en cuanto de aberraciones cromosmicas, de cultivo, ste puede

bajo la hiptesis de que en 72 hrs. la duplicacin de de clulas encontrar

favorecer

normales y por consiguiente, reducir la posibilidad

clulas afectadas, se realiz un estudio similar con la diferencia de que las personas bajo terapia al DFH eran personas adultas y por 48 hrs. y al realizar los significativo

sus linfocitos fueron cultivados

ansis correspondientes se encontr un incremento de aberraciones cromosmicas contacto con el medicamento. En un estudio efectuado directamente sobre en los

pacientes que estuvieron en

clulas

obtenidas

de mdula sea, los resultados encontrados son negativos en cuanto

a anormalidades cromosraicas., Alving y Jensen (1976). Alving y Jensen (1977) sugieren que de los individuos jvenes

(nios) , presentan una mayor capacidad ADN, y p o r ende las anomalas

reparacin son

de dao al aumentadas

cromosmicas no

significativamente. Estudios in con DFH, y vi tro en linfocitos humanos en cultivo, tratados por eleva Hunke (1978), revelaron que la del

realizados se

frecuencia de ICH

al incrementar la concentracin

medicamento presente en el medio de cultivo en concentraciones que de 10 a lOO mg/ml. Esser y colaboradores (1981), informan lo contrario en

estudios realizados en nios bajo terapia con la droga, ya que los resultados obtenidos al cultivos d e 48 horas de analizar aberraciones cromosmicas en eran

linfocitos aunque sus frecuencias

algo elevadas sobre el grupo control 3.05% y 1.4% respectivamente, sin embargo esta diferencia no fu estadsticamente significativa. En d o s trabajos que tratan acerca de las frecuencias de ICH con DFH, en los cuales la y se

en linfocitos de nios bajo terapia, metodologa y parmetros

utilizados fueron muy semejantes,

realizaron en nios cuyo perodo de tratamiento era en promedio de 2.6 aos y la edad estaba en un rango de 11 aos, a ellos se les cual se deposit en un medio de Al

extrajo una muestra sangunea la

cultivo para linfocitos durante 72 horas en presencia de BrdU. finalizar el tiempo de cultivo se realizaron las

preparaciones

cromosmicas correspondientes y

al

analizar de un

las

frecuencias de de ICH

ICH, Habendank y Col.( 1982), informan

incremento

sobre un grupo control sin exposicin al medicamento, los resultados obtenidos por Hunke y Col.(1978),

contrario a quienes no

encontraron diferencias significativas.

D.- DIAZEPAM

El diazepam es un excelente propiedades sedativas y Soraya Dhillon y col es

relajante muscular, adems tiene antiepilptico. el e diazepam es

usado como un agente concluyeron que

(1981),

extensivamente metabolizado por originando los siguientes hidroxidiazepam y el con el cido

demetilacin

hidroxilacin, 3-

metabolitos,

N-demetildiazepam,

oxazepam. y

Estos metabolitos son conjugados excretados en la orina.

glucurnico

Adems de estos estudios a nivel bioqumico, se han realizado otros a nivel citogentico como los de Hsu. y Col usaron el diazepam como bloqueador de mittico hmster (1981) , quienes para inducir

aneuploida en clulas diploides

chino y encontraron mi de medio de

que el diazepam en una concentracin de 100 mg/10 cultivo de clulas de hmsters y era bloqueada

completamente la que este del

divisin mittica en bloqueo puede ser

metafase,

adems

concluyeron es

inhibido

cuando el diazepam

removido

medio de cultivo,

si la accin de este agente no era mayor de dos medicamento la era prolongada por celular

horas, pero cuando la accin del espacio de siete presentaba un alto clulas aneuploides. horas, nivel al de

recuperarse cromosomas

poblacin

rezagados,

produciendo

Posteriormente Shore y col.(1983),

concluyeron que el diazepam en a ste

el humano puede atravesar la placenta de madres expuestas durante el trabajo de parto. Tambin primer

cuando las madres fueron trimestre de gestacin

expuestas a diazepam al final del

presentaron altas concentraciones del N-dimetildiazepam. Renaul y Col (1989) realizaron un estudio in aplicaron distintas concentraciones este medicamento es un inhibidor de vitro en donde

diazepam, encontrando que de la proliferacin

especfico

celular en concentraciones activas de 10 a 100 mg/ml. Bao T. Van y Cois. (1992) reportaron efectos el humano por altas dosis de diazepam. clastognicos en

III.- MATERIAL Y METODOS

Para obtener ICH) es decir

resultados

positivos alta

para ambas pruebas (PM e de microncleos y de

tener una produccin

intercambios de cromtides hermanas en las clulas de los animales de experimentacin, se concentracin de 0.5 carcinognico es ya us la de droga Mitomicina C a una

mg/Kg

peso

cuyo potencial mutagnico y de esta manera la en

conocido, dos

facilitando

estandarizacin de los este estudio. Los

mtodos citogenticos

utilizados

resultados

obtenidos con este mutgeno a razn

de 0.25 ml/g de peso sirvieron como testigo positivo Al grupo llamado testigo negativo equivalente de solucin se les administr un volmen salina.

Compuestos a evaluar: Diazepam: En base a la dosis teraputica utilizada en el humano se

eligieron las siguientes dosis de de peso.

diazepam : 0.1, 0.2 y 0.4 mg/kg solucin salina

Las dosis a probar fueron disueltas en NaCl) 1 y administradas a razn de a los 0.25

estril (0.9% de

ratones con una mi, por va

jeringa estril de intraperitoneal y a

mi

dosis

nicas.

Difenilhidantoinato de Sodio: En base a la dosis teraputica utilizada en el humano, se

eligieron las siguientes dosis de DFH: 1, 10 y 20 mg/kg de peso. Las dosis a probar fueron y disueltas en solucin salina con una

estril (0.9% de

NaCl) 1

administradas a razn a

a los ratones

jeringa estril de intraperitoneal y

mi

de 0.25 ml/g de peso, por via dosis nicas.

Material Biolgico. Ratones machos y hembras de la linea Balb C, con una edad

aproximada de ocho

a doce semanas, los cuales desde su nacimiento

estuvieron bajo condiciones de Bioterio.

A.- PRUEBA DE INTERCAMBIOS ENTRE CR0MATIDE8 HERMANAS (ICH)

Esta prueba se realiz in vivo, con una poblacin total de 60 ratones, 30 machos y 30 hembras. Tres ratones machos y tres hembras fueron incluidos como control tres ratones se

positivo. El grupo control negativo tambin incluy hembras y tres ratones machos. Los ratones

restantes

dividieron en dos grupos segn el sexo, y cada grupo se subdividi en tres, formados por tres a ratones cada uno del de ellos, a

correspondiendo un grupo probar.

cada concentracin

compuesto

El procedimiento tcnico de la prueba de ICH implica: a) Administracin de las 5-bromodeoxiuridina b) Administracin de los compuestos a evaluar c) Aplicacin de colchicina d) Obtencin de clulas metafsicas a partir de mdula sea. e) Tincin diferencial de las cromtides hermanas f) Criterio experimental para la cuantificacin de ICH g) Anlisis estadstico (DFH, DIAZEPAM)

m m 4 nfltracin de la S-bromodaogiiiridina i A cada ratn se le aplic 0.25 de mi de una solucin de 520 mg/ml disuelto en

bromodeoxiuridina a una concentracin

carbono activado. La administracin se realiz con tuberculina estril via intraperitoneal.

una jeringa de

i ^ f f l i ni tracin de los

compuestos

valuar

(Dra.

nf ^p^)

Nueve horas despus de la aplicacin de la 5-bromodeoxiuridina se administraron las diferentes dosis de diazepam y de

difenilhidantoinato de sodio.

Para lograr los mximos efectos del

tratamiento se dej actuar el frmaco por 10 horas.

Aplicacin da la Colchicinag La colchicina fue diluida en agua destilada para tener una se les administr 0.25 mi con una jeringa

concentracin de 1 mg/ml. A los ratones

de solucin de colchicina por via intraperitoneal de tuberculina estri. Dos horas despus

de la aplicacin, los

ratones fueron sacrificados por dislocacin cervical.

Obtencin de clulas metafsicas a partir de mdula sea: Para la obtencin de metafases se requiere para primeramente lo que es

extraer la mdula evitando que sta se coagule, necesario: -Extraer rpidamente la mdula -Recibir la muestra en

un tubo de centrfuga con una solucin de recibir la mdula directamente se forman residuos

suero fetal de ternera, ya que al en la solucin hipotnica

generalmente

fibrosos que despus dificultan la observacin de las metafases. -Centrifugar la suspensin durante 10 minutos. -Extraer cuidadosamente el sobrenadante, se procede a colocar 0.75 la solucin con una pipeta Pasteur y ( KC1 a una de clulas de mdula sea a 1500 rpm

hipotnica

concentracin de

M ) resuspender bien y dejar en reposo la

suspensin celular por 20 minutos. -Para interrumpir la centrifuga la accin a de la solucin rpm durante hipotnica, 10 se

suspensin

1500

minutos.

-Retirar el sobrenadante mi.

dejando

la muestra en un volumen de 0.5

-Se le aade a la muestra 2 mi de

solucin

fijadora

de reciente

preparacin, y que en este caso fue preparado

con una proporcin glacial hasta

de ( 3:1 alcohol metlico absoluto y cido actico un volumen de 5 mi). -Se centrifuga la . suspensin celular a 1500

rpm

durante

10

minutos, se remueve el sobrenadante

dejando

0.25 mi de lquido,

se aade nuevamente la solucin fijadora y se prosigue a realizar los mismos pasos hasta que se observe la suspensin de clulas

limpia y clara. -Enseguida, se desecha el sobrenadante dejando solamente 0.3 mi de la solucin fijadora en donde son resuspendidas las clulas

sedimentadas, se toma la suspensin

con

una pipeta Pasteur y en uno de ellos 2

portaobjetos limpios, se dejan caer sobre cada

gotas de la muestra desde la altura de 30 cm. y se secan estas laminillas agitndolas al aire.

Tincin Diferencial de las Cromtides Hermanas: -Teir las laminillas con fluorocromo Hoechst 33258 a una

concentracin de 10~5 M durante 20 minutos. -Lavar con agua destilada y secar al aire. -Se agrega a la superficie de la preparacin una gota de buffer Me Ilveine (PH=8.0) y se coloca un cubreobjetos para uniformizar la

reaccin, posteriormente sellar con esmalte, -incubar las laminillas a 50QC y a la vez exponerlas a luz UV.

(360 nm) a una distancia aproximada de 5 cm. por 30 minutos. -Remover cuidadosamente el cubreobjetos, con agua destilada y secar al aire. -Teir con Giemsa alrededor de de las al 4% en buffer de fosfatos 0.1 M (PH 6.8) enjuagar la preparacin

20 minutos, hasta observar una buena diferenciacin Finalmente lavar con agua destilada y

cromtides.

secarlas al aire. -Se colocan las laminillas en Xilol durante cinco minutos. -Montar en resina para ser analizadas al microscopio seco dbil de 100X y seco fuerte, as como tambin de con aumento

con el objetivo inmersin.

utilizando

aceite

Criterio Experimental para la CuantifIcacin de ICH: Se tien de tres a cinco preparaciones de cada ratn y se

procede a escoger la de mejor coloracin. El anlisis microscpico de las laminillas, es primero al objetivo de 10X, con la finalidad de seleccionar la preparacin con mejor tincin y en mejor estado

morfolgico de los cromosomas. Con el objetivo de 100X, los cromosomas con una cromtide metafsicos se observan plida, entre

teida fuertemente y la otra cromtide puntos de intercambios

observndose claramente los

cromtides hermanas las cuales fueron cuantificadas en un total de

25 a 50

metafases

por

ratn. l i a observacines fueron realizadas

siguiendo el mtodo de doble ciego.

Anlisis Estadstico: Para analizar las frecuencias de ICH por metafase Diazepam, en los y en

ratones tratados con los anticonvulsivantes DFH y

los controles positivo y negativo, los resultados fueron agrupados por sexo y dosis utilizadas para compararlos entre s mdiante las pruebas estadsticas de (ANOVA), (p<0.05).
M

tn

de

Student

Anlisis de varianza

B).- PREBA DE MICRONUCLEOS (PM)

Para esta prueba in vivo,

se

trabaj

con

un

total

de 30

ratones machos y 30 ratones hembras. Los grupos y subgrupos de ratones formados de acuerdo dosis fueron los mismos que para la prueba de ICH. El procedimiento siguientes pasos: tcnico de esta prueba (PM) implica los al sexo y

tracin de los compuestos: Las dosis a probar fueron administradas de acuerdo despus a de la la

metodologa previamente descrita.

A las 24 horas

aplicacin de la

dosis, los ratones fueron sacrificados por medio

de dislocacin cervical.

obtencin de Mdula Oaea: Recin sacrificado el ratn ambos fmures fueron removidos a nivel

rpidamente. Utilizando un bistur se realizan incisiones del msculo femoral y el fmur y

es desarticulado de la pelvis y solucin salina, se quita el

tibia, haciendo uso de una gasa

exceso del msculo presente en cada uno de los fmur extrados, el fmur limpio es cuidadosamente cortado por sus extremos proximal y distal con una hoja mi de bistur suero y depositado de en un tubo de

centrfuga con 5

de

fetal suero

ternera con en

previamente una el jeringa extremo

preparado. Son tomados 2.5 mi del desechable y la

fetal

aguja de la jeringa es insertada el cual

distal del fmur,

es completamente sumergido y oprimido el suero es pasado por la en el tubo

en la pared de un tubo de centrfuga,

jeringa y sto hace que la mdula sea sea recuperada de centrfuga. Esta operacin utilizando los 2.5 se

repite con el otro fmur del mismo ratn, restante, de esta manera las

mi del suero

clulas de la mdula sea se observan como una fina el suero.

suspensin en

Estos pasos deben realizarse lo ms rpidamente posible coagulacin y deterioro de las clulas de mdula

para evitar la

sea dentro de los fmures.

Preparacin e Laminillas. La muestra de clulas medulares es resuspendida vigorosamente con una pipeta pasteur y despus la suspensin celular es

centrifugada por 5 minutos a 1500 rpm, posteriormente con la misma pipeta se elimina el sobrenadante dejando slo el paquete celular. Este ltimo paso se repite hasta que la suspensin se vea de caer una gota en

una tonalidad clara, con la misma pipeta se deja

el extremo de un portaobjetos limpio y colocado en un ngulo de 45 grados para que la solucin se extienda, estas preparaciones se aire a temperatura ambiente.

dejan secar al

Tincin de la Mdula 6a ea: En el presente trabajo, las tinciones se realizaron con el

colorante Eosina-azul de

metileno segn la frmula de Wright y de

acuerdo al siguiente procedimiento: 1.- Preparacin del colorante: agregar 0.3 g de colorante Wright

(Harleco) en 100 mi de alcohol metlico absoluto ms 1 mi de glicerina; dejar reposar por antes de su uso. 2.- Teir las laminillas con el colorante Eosina-azul por dos minutos. 3.- Lavar con agua destilada y secar al aire. 4.- Aclarar con xilol durante 10 minutos y montar en resina. de metileno siete das, agitar y filtrar

Anlisis de las El anlisis

i r**j se realiz con los aumentos dados

microscpico

por el objetivo de lOOx, los eritrocitos policromticos jvenes se observan con un tinte rosa plido y los microncleos fueron

fcilmente detectados por su coloracin contrastante azul intenso. Por cada ratn se analizaron 2,000 eritrocitos jvenes anucleados, para el conteo de microncleos se consider el nmero micronucleadas del total clula. y no el nmero de de clulas por

microncleos

Anlisis Estadsticos Las resultados obtenidos, se agruparon de acuerdo al sexo y a las dosis utilizadas del frmaco. El anlisis estadstico entre si se las

realiz con la prueba de X 2 (p<0.05). comparndose frecuencias obtenidas para cada grupo.

IV.- RESULTADOS

Con el

obj eto

de

determinar si los frmacos (Diazepam y el efectos mutgenos y si y/o este

Difenilhidantoinato de Sodio) presentaban clastognicos, sobre clulas efecto estaba relacionado se compararon estas

de mdula sea de ratn

con

el sexo de los ratones estudiados, con los controles positivo y

poblaciones

negativo, encontrndose los siguientes resultados:

A.- INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH)

a) Comparacin de las frecuencias de ICH en ratones

tratados

con

distintas dosis da DFH y con sus respectivos controlas positivo Y negativo. El efecto del DFH en la induccin de ICH comparado con el y el control positivo No. 1. Donde puede

grupo control negativo (suero fisiolgico) (Mitomicina C) se observarse que la 5.20 1.86 presenta en el Cuadro

media de ICH/clula en la poblacin total es de La frecuencia de ICH se incrementa

por metafase.

tanto en machos como en hembras (M+H) al aumentar la dosis de DFH. La frecuencia de ICH a la concentracin de 1 mg/kg observ ligeramente incrementada grupo control negativo cuando sin se (4.601.62) se

le compara contra el no resultaron

(4.261.29),

embargo

estadistcamente diferentes. La diferencia en la produccin de ICH

en las dosis de 10 (5.41l.7l) y 20 mg/kg de peso (5.752.23), con respecto al control negativo (4.261.29) y entre ellas resultaron pero su C efecto es menor

estadsticamente diferentes (p< 0.05), que el producido por la

Mitomicina

(5.9711.74).

b) Efecto del sexo pobre la, frecuencia de ICH n

ratones tratados

con distintas dosis de difanilhidantoinato da sodio. En el mismo Cuadro 1, se muestra la frecuencia de ICH en La

ratones machos y hembras, tratados con distintas dosis de DFH. media de ICH para la poblacin total ser significativamente mayor (5.011.46). De acuerdo de ratones que en

hembras result la de machos

(5.382.16)

a las diferentes dosis de tratamiento en la media de ICH por metafase se de ICH a la

ratones hembras, se observa que incrementa al aumentar concentracin de 1 del grupo control

la dosis de DFH. (4.841.46) (4.451.57)

La media

mg/kg negativo

fu ligeramente mayor a la pero no result ser de

estadsticamente diferente.

Los incrementos en la

produccin

ICH a las dosis de 10 (5.89 2.10) y 20 mg/kg de peso (5.912.85), resultaron significativos al (4.841.46) y con el grupo compararlos control con la dosis de 1 mg/kg (4.451.57). El

negativo

efecto del DFH sobre la frecuencia de ICH a las concentraciones de 10 (5.89+ 2.10) y 20 mg/kg de peso (5.912.85) result muy similar al producido por la Mitomicina C (5.802.13). En los ratones machos tambin se observ un incremento

significativo de ICH

/ metafase

al de

aumentar 1 mg/kg

la

dosis de DFH. fu

La media de ICH a la concentracin

(4.36+1.74)

estadsticamente igual al grupo control negativo (4.060.85) El aumento en la produccin de ICH a las dosis de y 20 mg/kg de peso (5.591.29), result 10 (4.89 0.94) significativo y con menor el al

compararlo con la dosis de 1 mg/kg control negativo (4.060.85), pero

(4.361.74) su

grupo el

efecto es

que

producido por la Mitomicina C (6.14+1.19), De acuerdo a las diferentes dosis aplicadas y al sexo, se de ICH en hembras tratadas la frecuencia

encontr un incremento significativo

con la dosis 10 mg/kg (5.892.10) al compararla con

de ICH obtenida en machos tratados con la misma dosis (4.890.94). El efecto de la Mitomicina C sobre la frecuencia de ICH

result ser ligeramente mayor en machos (6.14 1.19) con respecto a las hembras (5.80 2.13), pero el anlisis estadstico no

revel diferencias significativas entre estos grupos. El grupo control negativo tratado con suero en la fisiolgico no

mostr diferencias significativas

frecuencia de ICH entre

machos (4.06 0.85) y hembras (4.45 1.57).

c) Comparacin de laa frecuencia a de ICH en ratones tratados con distintas dosis de diagepam y controles positivo x negativos. El efecto del diazepam en la induccin de ICH comparado con se muestran

el grupo testigo negativo y el grupo testigo positivo

en el Cuadro Nfl 2, en el cual puede observarse que la media de ICH en la poblacin total (H+H) es a de 4.50 2.19 por metafase. La medida que aumenta la dosis entre las

frecuencia de ICH se incrementa aplicada, encontrndose una dosis 0.2 (4.061.79) con respecto al

diferencia

significativa

y 0.4 mg/kg de peso (4.431.62) de Diazepam negativo ICH (3.571.50); estas dosis a las

testigo

revelaron frecuencias de

estadsticamente

menores

producidas por la Mitomicina C (7.04+2.20).

d) Efecto del

sexo sobre la frecuencia de ICH en ratones tratados

con distintas dosis de En el Cuadro NQ 2, se muestra la frecuencia de ICH en ratones hembras y machos tratados con distintas media de produccin de dosis de Diazepam. ratones La

ICH para la poblacin de pero no

machos

result ligeramente mayor

significativamente (4.31 2.00).

diferente

(4.69 2.35) que la de las hembras las diferentes dosis observa que la

De acuerdo a machos, se

de Diazepam aplicadas a ratones de ICH que por metafase la se

media

incrementa aplicada,

significativamente a medida

aumenta

dosis

(3.331.66, 4.201.85, 4.871.62 respectivamente), hembra, las frecuencias presente en machos ( de ICH

en los ratones

muestran el mismo comportamiento 3.921.73, 3.991.51

3.5211.46,

respectivamente) pero no se encontraron diferencias significativas entre las frecuencias de ICH de las tres dosis aplicadas.

De acuerdo

las

diferentes

dosis aplicadas y al sexo, se

encontr un incremento significativo de ICH en los machos tratados con Diazepam a una concentracin de 0.4 mg/Kg de peso (4.871.62), con respecto a (3.991.51). El efecto producido por la Kitomicina C sobre de ICH en los dos grupos (machos las en tres machos El y la frecuencia result las hembras tratadas con la . misma dosis

hembras)

estadsticamente mayor que el de observa ligeramente incrementado respecto a hembras (6.59

dosis estudiadas y se (7.48 2.22) con

2.10).

grupo

control

negativo

tratado con suero fisiolgico no mostr diferencias significativas de ICH entre los sexos, (3.58 1.66) en machos y (3.56 1.28) en hembras.

B.- PRUEBA DE MICRONUCLEOS.

a) Comparacin de las frecuencias de Microncleos (MM) en ratones tratados con distintas dosis de controles positvo x negativo. diagepatt, con sus respectivos

El efecto

de

las

diferentes

dosis

de diazepam los grupos

sobre

la

produccin de microncleos

comparado

con

testigo

negativo (suero fisiolgico) y testigo positivo (Mitomicina C), se

presenta en el

Cuadro

N&

3,

en el cual puede observarse que la es de 1.99%. La frecuencia de

media de MN en la poblacin total

de clulas microncleadas (MN) se observa ligeramente incrementada a medida que se aumenta la dosis partir de de Diazepam, la encontrndose (0.1

diferencias significativas a

dosis ms baja

mg/kg, 2.06%) con respecto al control

negativo (suero fisiolgico de las tres

1.02%), sin embargo, al comparar entre si el efecto dosis de diazepam

utilizadas (0.1, 0.2 y 0.4 mg/kg de peso) sobre y 2.18% respectivamente) no se

la frecuencia de MN (2.06%, 2.03%,

encontraron diferencias significativas entre ellas. El efecto producido de MN result por la Mitoaicina C sobre la frecuencia

estadsticamente mayor (3.05%) que el producido por (0.1, 2.18% 0.2 y 0.4 mg/kg de

las tres dosis de diazepam estudiadas peso) (2.06%, 2.03%, y

respectivamente).

b) Efecto del sexo sobre la frecuencia de microncleos en ratones tratados con distintas dosis de n*ftpam.

En el

mismo

Cuadro

N f i 3, se muestran las frecuencias de MN dosis de Diazepam de acuerdo al ratones de las machos hembras en

en ratones tratados con distintas sexo. El porcentaje

de produccin de MN para los (2.12%) que dosis el de

fu significativamente mayor (1.88%).

De acuerdo a las diferentes observa que el

tratamiento, de

ratones machos se

porcentaje

clulas

microncleadas se incrementa

(1.98%, 2.19%, 2.31%) al aumentar la mg/kg de peso respectivamente), de la dosis ms

dosis de Diazepam (0.1, 0.2 y 0.4

encontrndose diferencias significativas a partir baja (0.1 mg/kg) de Diazepam con respecto entre

al control negativo si el efecto de las la frecuencia El

(suero fisiolgico 1.35%). Al comparar

tres diferentes dosis de diazepam utilizadas sobre

de MN no se encontraron diferencias significativa entre ellas. efecto de las diferentes

dosis de diazepam utilizadas en ratones

hembras (0.1, 0.2 y 0.4 mg/kg.) sobre las frecuencias de MN mostr un comportamiento muy (2.13%, 1.92%, 2.07% similar al observado en ratones machos

respectivamente), encontrndose

diferencias

significativas a partir de la dosis ms baja de Diazepam utilizada (0.1 mg/kg) con respecto al control negativo (0.76%). entre si el efecto de las tres diferentes MN no se dosis Al comparar de diazepam

utilizadas sobre la frecuencia de significativa El efecto producido

encontr diferencia ellas.

entre

por la Mitomieina C sobre la frecuencia estadsticamente mayor que el

de MN en machos y hembras result

producido por las tres dosis estudiadas, y se observa incrementado en ratones

ligeramente

hembras (3.10%) con respecto a los machos tratado con suero fisiolgico

(2.99%). El grupo control negativo

mostr un incremento significativo de MN en ratones machos (1.35%) al ser comparados con las hembras (0.76%).

c) Eritropoyesis en piaaepa-

ratones

tratados

con

distintas

Miosis

de

E1 efecto del Diazepam en la eritropoyesis comparado con los testigos positivo y negativo se muestran cual puede observarse que los valores en el cuadro Ns 4, en el promedios de Epc/Er

(Eritrocitos policromticos / Eritrocitos totales) en la poblacin total es de 0.38. Los valores de la relacin Epc/Er en los tres 0.42, 0.39, respectivamente)

grupos tratados con Diazepam (0.39,

muestran valores muy similares al control negativo (0.43). El efecto producido por la Mitoaicina C sobre la relacin de las tres dosis respectivamente). Epc/Er de result los valores de

estadsticamente menor (0.27) que estudiadas (0.39, 0.42, 0.39,

diazepam

d) Efecto del sexo en la eritropovesis de ratones tratados con diferentes dosis de Diazepam.

En el mismo Cuadro Nfi 4, se muestran los valores de la relacin Epc/Er acuerdo en al ratones sexo. tratados Los con distintas dosis de Diazepam de promedios de la relacin Epc/Er que en machos

valores

resultaron (0.35).

ligeramente a

mayores en hembras (0.41) las

De acuerdo mg/kg

diferentes dosis de tratamiento (0.1, ratones 0.42 hembras los valores n < >

0.2 y 0.4

de Diazepam), en (0.42,

promedios de Epc/Er

0.49,

respectivamente)

diferencias significativas grupo control negativo observado en ratones valores de Epc/Er 0.47 al Este

al

ser

comparadas

con

el fue los

mismo

comportamiento

sachos

comparar las el

estadsticamente dosis de

obtenidos 0.37)

en con

tres

diazepam negativo

estudiadas (0.37, 0.34, (0.38).

grupo

control

Los valores de la relacin promedio de Epc/Er las diferentes dosis

de

acuerdo

aplicadas y al sexo, mostraron un incremento tratados con las tres dosis 0.42) al ser

significativo en los ratones hembras estudiadas (0.1, 0.2 comparados con los y 0.4 mg/Xg)

(0.42, 0.49, en los

resultados

obtenidos

ratones machos

tratados con las mismas dosis (0.37, 0.34, 0.37 respectivamente). Los valores de Epc/Er en el con suero fisiolgico hembras (0.47) que El efecto de result en la Mitonicina C grupo control negativo tratado mayor en las

significativamente los sobre

machos los valores en

(0.38). de la y

relacin Epc/Er es muy similar en ambos sexos, 0.27 0.26 en hembras.

machos

C.- SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA DE MICRONDCLEOS (KN) Y LA TECNICA DE INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH) EN RATONES TRATADOS

CON TRES DIFERENTES DOSIS DE DIAZEPAM.

En el cuadro NQ 5, se resumen los resultados del efecto del Diazepam sobre la frecuencia de ICH y MN :

1. Con las dos pruebas citogenticas (MN y ICH) fueron diferencias significativas

detectadas

entre las dosis aplicadas y los dos

controles (positivo y negativo), aunque con la prueba de ICH no fu posible detectar la diferencia significativa entre la dosis ms pequea (0.1 mg/kg de peso, negativo 2. En cuanto al sexo, la poblacin total 3.421.56) y el grupo control (3.5711.50). de machos revel un

incremento significativo en la frecuencia de ICH (4.692.35) al compararlas con la hembras (4.312.0). La frecuencia de ICH en de la dosis

machos mostr un incremento significativo a partir

intermedia 0.02 mg/kg de peso (4.201.85) con respecto al grupo control negativo ( . 3 .58+1.66), mientras que la frecuencia de MN nicamente entre la dosis (1.35%).

revel una diferencia significativa

mayor 0.4 mg/kg de peso (2.31%) y el control negativo

En los ratones hembras la frecuencia de MN mostr un incremento significativo a partir de la dosis ms pequea 0.1 mg/kg de el control negativo (0.76%),

peso (2.13%), al compararla con

mientras que

con

la

prueba

de

ICH las

solamente se detectaron tres dosis estudiadas al ser

diferencias significativas (3.5211.46, 3.9211.73, comparadas con 3.

de

3.99+1.51

respectivamente) positivo

control

(6.5912.10).

De acuerdo a las diferentes dosis

aplicadas y al sexo, con la significativas

prueba de ICH fu posible detectar diferencias entre machos y hembras tratados con y 0.4 con

mg/kg de peso de Mitomicina que C, las

diazepam (4.8711.62, (7.4812.22, 6.5912.10 frecuencias de MN

3.9911.51)

respectivamente), sol smente

mientras

revelaron

diferencias

significativas entre sexos en los ratones del control negativo tratados con suero fisiolgico hembras). (1.35% en machos y 0.76% en

V.- DISCUSION

A.- PRUEBA DE INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICS). a) Frecuencias de DFH. Los resultados significativo en las aqu obtenidos, muestran un de incremento cromtides de ICH en ratones tratados con distintas dosis

frecuencias

de intercambios

hermanas (ICH) en mdula sea de ratones tratados con DFH (10 y 20 mg/Kg de peso) ; estos hallazgos estn de acuerdo con lo informado para pacientes epilpticos bajo terapia (1982), Kulkarni P. Sin embargo otros y col. (1984), con DFH, Habedank y col. y col.(1985).

Schaumann

estudios citogenticos en cultivo de clulas de indican que hay un aumento en aberraciones (1987). cromosmicas Otros trabajos

humano y de ratn tratadas con DFH, las aneuploidas, pero no en Machado

estructurales, Oliveira and

informan de un incremento significativo

del efecto citogentico a la droga no es

dosis bajas de DFH, sin embargo, a dosis altas de posible detectar ningn dao

mediante la prueba de microncleos,

Montes de Oca y col.(1984); una explicacin para estos resultados, es que a altas dosis de DFH, el sistema la biotrans formacin, es inhibido cuales y enzimtico involucrado en no son formados sean los los

metabolitos intermedios, los

probablemente

responsables de los efectos mutagnicos. Sezzano and col.(1982).

*>) Efecto

del

sexo sobre

la

frecuencia dosis

de ICH en ratones de Dra.

tratados con

distintas

En nuestro estudio se encontr una diferencia

significativa

entre sexos, cuando se considera a la poblacin total, las hembras mostraron un incremento en la frecuencia de ICH al ser comparados ratones machos presentaron una

con los machos. Sin embargo los

correlacin positiva y significativa entre la frecuencia las dosis de DFH;

de ICH y

Lo anterior apoya los informes que sealan que que las hembras a los

los ratones machos son ms susceptibles

efectos genotxicos de determinados compuestos, por benzeno, esto es debido probablemente a la

ejemplo en el de las

influencia

hormonas sexuales sobre el metabolismo del agente genotxico. Luke and Tice (1988).

c) Frecuencias de ICH en ratonea de Diazepam.

tratados

con distintas dosis

Nuestros resultados muestran un incremento de ICH a medida que

en la frecuencia

aumenta la dosis de diazepam a partir de la

segunda dosis en comparacin con el control negativo. Algunos investigadores significativos en la en linfocitos de col.1970. frecuencia en han de reportado aberraciones incrementos cromosmicas

pacientes

sistemas

in vitro Stenchever H.y

Sin embargo otros estudios demuestran que la frecuencia en linfocitos de pacientes

de intercambio de cromtides hermanas

tratados con una simple dosis no muestran incremento significativo , Husum B. y col. 1983.

d) Efecto

del

sexo sobre la

frecuencia

de

XCH

en

ratones

tratados con distintas dosis de diazepam. Al analizar produccin de ICH mayor pero no la poblacin los total de ratones la media de

para

ratones

machos

result ligeramente que las hembras.

significativamente

diferente

Analizando por separado las poblaciones se observ que la media de ICH por metafase se incrementa significativamente a medida que

aumentan las dosis aplicadas. De acuerdo a las diferentes dosis aplicadas y al sexo, se

encontr un incremento significativo de ICH en los machos tratados con Diazepam a una concentracin de 0.4 mg/kg de peso con respecto a las hembras tratadas con la misma dosis .Nuestros resultados nos indican la posibilidad de que los ratones machos de la linea

estudiada (BalbC) sean ms sensibles al diazepam hembras de la misma linea.

que

los ratones

Divoll MDJ. 1983 no reporta cambios significativos al efecto de la droga por el factor edad o sexo. La farmacocintica, y la especie el son

metabolismo, dosis, predisposicin

gentica

factores importantes que se deben de considerar para de genotoxicidad in vivo.

los estudios

B. - PRUEBA

DE

MICRONUCLEOS

(PK) .

a) Frecuencia de fieroncloa en ratone tratados con ditinta dos i de tjggfrp.

En cuanto a la prueba de microncleos, el incremento del porcentaje de eritrocitos micronucleados las dosis pero no utilizadas se se observ en todas negativo, entre a las la

con respecto al grupo control diferencia se observ significativa tanto al

encontr esto de

distintas dosis, poblacin total

analizar al

ratones

utilizados, como

analizarlos

tomando en cuenta el sexo del ratn. Es importante recalcar que con esta prueba se encontraron incrementos significativas en la frecuencia de MN desde la

dosis ms baja utilizada Cuando una substancia incrementa la frecuencia de eritrocitos micronucleados, indica que la substancia puede interferir con la divisin nuclear en eritroblastos de mdula en los cuales, fragmentos de cromatina o cromosomas retardados en anafase fallaron para ser incorporados dentro de un ncleo hijo. Agentes qulmmicos, los cuales en el ensamble o el funcionamiento del huso acromtico, son conocidos como inductores de microncleos como resultado de fragmentos rompen cromosomas o interfieren

acentricos retardados o rezagados en el perodo de anafase. Das RK. y col 1977. Reportaron un incremento significativo en a dosis en 20 o 40 mg/kg de de diazepam el ratn. En

la frecuencia de MN estudio realizado

clulas

de mdula sea

contraste

resultados

negativos tambin han sido reportados en una inyeccin intraperitoneal

mdula sea de ratn despus de Xu W. 1990 y Alder ID.1991.

b) Efecto del

sexo sobre la frecuencia de KM en ratones dosis de

tratados Diageam.

con distintas

El porcentaje de produccin de MN para los ratones nachos fu significativamente mayor que el de las hembras. Estos resultados sensibles a la

nos hacen suponer que los ratones machos son ms droga y por lo mismo

se refleja una mayor produccin de efectos trabajos tanto in vivo como in que pudiera

clastognicos. Se han realizado vitro para estudiar

el posible efecto clastognico

ejercer el diazepam quienes reportan

por ejemplo el de Bao van T., y Imrch E. 1992 a altas dosis en el humano

que el diazepam

puede incrementar el rango de aneuploidia y efectos en linfocitos y esto pudiera tener alguna

clastognicos

importancia mdica.

o) Brltropovesis en

ratones

tratados

con

distintas

dosis

Nuestros resultados no efecto de las

revelaron dosis /

ninguna de

correlacin y los

entre valores

el de lo

distintas

diazepam

Eritrocitos policromticos

Eritrocitos

normocromticos,

cual nos indica que la droga a las tres dosis utilizadas no afecta el proceso de divisin celular. Sin report el efecto del diazepam embargo sobre Anderson y col. 1981 el ciclo celular,

especificamente sobre la funcin centriolar, esto es importante ya que el mismo autor correlaciona el fenotipo del huso monopolar con la habilidad del diazepam para inducir aneuploidia cromosmica.

d) Efecto del sexo en la eritropovesia de ratones tratados con diferentes dosis de nopa^T

Los valores

de

la

relacin promedio de Epc/Er de acuerdo a al sexo, mostraron un incremento las tres dosis

las diferentes dosis aplicadas y

significativo en los ratones hembras tratados con estudiadas al ser

comparados con los resultados obtenidos en los revelan, que los ratones machos diazepam sobre

ratones machos . Estos resultados probablemente son ms el proceso de

susceptibles al efecto del

la divisin celular que las hembras. Sin embargo no informes que pudieran apoyar nuestros

se han encontrado resultados.

D.- SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA DE MICRONUCLEOS (MN) Y LA TECNICA DE INTERCAMBIO DE CR0MATIDE8 HERMANAS (ICH) EN RATONES TRATADOS

CON TRES DIFERENTES DOSIS DE DIAZEPAM*

Las frecuencias de ICH y MN en ratones tratados con Diasepam se encontraron incrementadas significativamente, evidencia que hara pensar en la existencia de un agente clastognico que tambin induzca ICH. Sin embargo, los mecanismos de formacin de ICH, difieren de los mecanismos para producir aberraciones cromosmicas, que dan lugar a la formacin de microncleos. Esto se apoya en que algunos agentes como los rayos x y el antibitico bleomicin pueden producir microncleos, sin inducir ICH, Gebhart and Kappaup (1978). Adems, en la anemia de Fanconi,

en donde las aberraciones cromosmicas espontneas (fracturas) son muy elevadas, los col. (1975). Lo que s es posible afirmar, es que la produccin de microncleos e ICH pueden ser considerados de como ndices de los de mutacin real, no podra ICH, es estn ser la y ha ICH presentan una frecuencia normal, Latt and

aunque los mecanismos

formacin

ICH que de es ya

completamente dilucidados. Una considerada como desventaja utilizacin de la sustancia

circunstancia de la prueba la

5-BrdU, de la

cual

utilizada que y a se

requerida como pretratamiento demostrado que su

prueba, s

incorporacin

por

misma

altas

concentraciones pueden inducir

ICH.

Hsu de

and

Somers (5

(1961). No

obstante, dicen que la concentracin para lograr diferenciacin considerada como bastante de baja

5-BrdU

ug/mg) usada ha sido de

cromtides para

hermanas, los

evitar

problemas

induccin de ICH y produccin de aberraciones cromosmicas. De acuerdo a la informacin anterior estas dos pruebas citogenticas sobre la susceptibilidad de lo siguiente:

podemos

resumir

Prueba de microncleos (PM)

1. La formacin produccin de frecuencia de clulas in

de

microncleos

depende

no

solamente tambin dividen

de de

la la

fracturas divisin en

cromosmicas, celular,

sino

porque si se

pocas

vivo

presencia de algn agente clastognico se clulas micronucleadas.

formarn pocas

2. La PM, es un mtodo citogentico in vivo prctico que detecta agentes clastognicos, as como aquellos capaces de daar la formacin del huso acromtico. 3. El nmero contable de clulas es ilimitado. 4. El nivel de microncleos espontneos, es bajo. 5. No requiere de ningn pretratamiento especial con algn posible mutgeno (BrdU, FdU, colchicina, etc.) 6. La prueba de MN la eritropoyesis. colateralmente puede indicar alteraciones en

Prueba de intercambio de cromtides hermanas (ICH)

1. Es el

mtodo

citogentico

ms

sensible para la deteccin de in vivo an a con

sustancias mutagnicas centraciones muy bajas.

y/o carcingenas

2. Los ICH son inducidos con muy bajas dosis de mutgeno y como son perfectamente distinguibles con muy baja frecuencia de error, la validez estadstica aumenta. 3. Es de fcil realizacin y altamente reproducibles.

VI.- CONCLUSIONES De acuerdo a los resultados y discusiones ' anteriormente

descritos, es posible concluir lo siguiente: 1. Las pruebas prcticos y de PM y de ICH, en son la dos mtodos citogenticos qumicos

eficientes

deteccin de agentes

mutagnicos en sistemas Q vivo.

2. El DFH

presenta un efecto mutagnieo medible por un aumento en sea de ratn en un sistema in

la frecuencia de ICH en mdula

vivo, a dosis: 10 a 20 mg/kg de peso.

3. El Diazepam medible por

presenta un

un

efecto

clastognico

mutgenico y ICH en

incremento

en las frecuencias de MN

mdula sea de ratn en un sistema y 0.4 mg/kg de peso.

q vj-vo, a dosis: 0.1, 0.2,

4. El Diazepam

no

presenta las tres

ningn dosis

efecto

importante

en

la

eritropoyesis a mg/kg de peso).

estudiadas.(0.1,

0.2, y 0.4

5. Posiblemente los ratones machos semanas de misma lnea

de

la

linea

BalbC de 8 a 12 hembras de la

edad sean ms susceptibles que las

y edad al efecto autagnico y clastognico del DFH

y del Diazepam.

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VILI.-

P E N D I C E

intercambio de cromtides hermanas (ICH) por clulas de mdula 6sea de ratones tratados con tres dosis de difenilhidantoinato de sodio y de los grupos control, para ambos sexos. DOSIS (mg/kg) Control Negativo (NaCl 0.85%) 1 10 20 Control Positivo MMC (0.5 mg/kg) Poblacin Total Machos. Poblacin Total Hembras. Poblacin Total (M + H) M = Machos H = Hembras D.E. Desviacin Estndar. SEXO ICH/CEL (X+D.E.) No.DE CELULAS ANALIZADAS ICH/CEL(M+H) (X D.E.)

M H M H M H M H M H

(1) (I) (2) (II) (3) (III) (4) (IV) (5) (V)

4.06 + 0.85 4.45 + 1.57 4.36 + 1.74 4.84 1.46 4.89 + 0.94 5.89 2.10 5.59 + 1.29 5.91 + 2.85 6.14 1.19 5.80 2.13

70 75 75 75 70 75 70 75 73 75

4.26 + 1.29 4.60 1.62 5.41 1.71 5.75 + 2.23 5.97 1.74

5.01 1.46

358

5.38 2.16

375

5.20 1.86

733 tratamiento: 0.05) 0.05) 0.05)

Significancia por grupos de (M) = 1=2*3=4=5 (p < (H) = I=II*III~IV=V (p < (M+H)* A=B*C=D=E (p <

Intercambio de cromtides hermanas (ICH) por clulas de mdula 6sea de ratones tratados con tres dosis de Diazepam y de los grupos control, para ambos sexos. DOSIS (mg/kg) Control Negativo (NaCl 0.85%) 0.1 SEXO M H M H 0.2 M H 0.4 M H Control Positivo MMC (0.5 mg/kg) Poblacin Total Machos. Poblacin Total Hembras. Poblacin Total (M + H) = Machos M H = Hembras D.E.= Desviacin Estndar. * = Significativo M H (1) (I) (2) (II) (3) (III) (4) (IV) (5) (V) ICH/CEL (XD.S) 3.58 + 1.66 3.56 1.28 3.33 + 1,66 3.52 1.46 4.20 1.85 3.92 1.73 4.87 + 1.62 3.99 + 1.51 7.48 2.22 6.59 + 2.10
*
*

No.DE CELULAS ANALIZADAS 150

ICH/CEL,(M+H) (XtD.E.) 3.57 1.50 (A)

150 150 3.42 1.56 (B) 150 150 4.06 1.79 (C) 150
*

150 4.43 1.62 (D) 150 150 7.04 2.20 (E) 150

4.69 2.35

750

4.31 2.00

750

4.50 2.19

1500

Significancia por grupos de tratamiento: (M) l 2 / 3 * 4 5 ( p < 0.05) (H) I II - III IV / V (p < 0.05) (M+H) = A = B ^ C = D j t E ( p < 0.05)

Porciento de clulas con microncleos (MN) por clula en mdula sea de ratones tratados con tres dosis de Diazepam y de los grupos control, para ambos sexos.

DOSIS (mg/kg) Control Negativo (NaCl 0.85%) 0.1 0.2 0.4 Control Positivo MMC (0.5 mg/kg) Poblacin Total Machos. Poblacin Total Hembras. Poblacin Total (M + H) M = Machos H = Hembras * = Significativo

SEXO

MN (%)

MN (%) (M+H)

M H M H M H M H M H

(1) (1) (2) (II) (3) (III) (4) (IV) (5) (V)

1.35 * 1.02 (A) 0.76 1.98 2.13 2.19 1.92 2.31 2.07 2.99 3.10 2.06 (B) 2,03 (C) 2.18 (D)

3.05 (E)

2.12

1.88

1.99 Significancia por grupos de tratamiento: (M) = 1 * 3 = 2 = 4 * 5 (p < 0.05) (H) = I II = III = IV * V (p < 0.05) (M+H) = A * B = C = D * E ( p < 0.05)

Frecuencia de EPC/6000 Eritrocitos (Er), eritrocitos policromticos (EPC) y microncleos en mdula sea en ratones tratados con tres dosis de diazepam y los grupos control para ambos sexos. DOSIS (mg/kg) Control Negativo (NaCl 0.85%) Diazepam 0.1 0.2 0.4 Control Positivo MMC (0.5 mg/kg) Poblacin Total Machos. Poblacin Total Hembras. Poblacin Total (M + H) M = Machos H = Hembras * = Significativo SEXO M H
M

EPC/6000 (M+H) (1) (1) (2)

(II)

EPC/12000 (M+H) 5160

% EPC 0.38 0.47

% EPC (M+H) 0.43

2287 * 2873 2262 * 2534 2093 * 2598 2243 * 2552 1667 1609

4796 5051 4795 3276

H M H M H M H

0.37 0.42 0.34 0.49 0.37 0.42 0.27 0.26

0.39 0.42 0.39 0.25

(3) (III) (4) (IV) (5) (V)

10552 *

0.35

12526

0.41

0.38 Significancia por grupos de tratamiento: (M) = 13*2 = 3 = 4 * 5 ( P < 0.05) (H) - I II III - IV V (P < 0.05) (M+H)= A * B C = D * E ( P < 0.05)

CUADRO 5 Comparacin de los resultados obtenidos en las pruebas de microncleos (PM) e Intercambio entre Cromtides hermanas (ICH), en ratones tratados con Diazepam. DOSIS (mg/kg) Control Negativo (Nac 0.85%) Diazepam 0.1 SEXO M H M H 0.2 M H 0.4 M H Control Positivo MMC (0.5 mg/kg) Poblacin Total Machos. Poblacin Total Hembras. Poblacin Total (M + H) M = Machos H = Hembras * = Significativo D.E.= Desviacin Estndar. M H (1) (1) (2) (II) (3) ICH/CEL (X D.E.) 3.58 + 1.66 3.56
+

ICH/CEL (M+N) (X D.8.) 3.57 1.50 (A)

MN % 1.35* 0.76

MN (M+H) % 1.02 (A)

1.28 3.42 1.56 (B)

3.33 1.66 3.52 1.46 4.20 + 1.85

1.98 2.13

2.06 <B)

4.06 1.79 (C)

2.19 1.92

2. 03 (C)

(III) 3.92 1.73 (4) (IV) (5) (V) 4.87 + 1.62 3.99 + 1.51 7.48 2.22
*

4.43 1.62 <D)

2.31 2 .07

2.18

(D)

7.04 2.20 (E) 2.99 3.10

3.05 (E)

c 6.59 2.10 4

4.69 2.35 4.31 2.00 4.50 + 2.19

2.12 1.88 1.99

(p < 0.05) grupos de tratamiento: PARA ICH (M) 1= 2 * 3 * 4 * 5 (H) I - 11= III = IV * V (M+H) A = B*"C = D * E PARA MN (M) 1*3 = 2 = 4 * 5 (H) I * II * V = III = IV (M+H) A*B = C = D*E

I t

\
t

FIGURA # 1. INTERCAMBIO DE CROMATIDES HERMANAS (ICH) EN METAFASES OBTENIDAS DE MEDULA OSEA.

FIGURA # 2. PREPARACION DIRECTA DE MEDULA OSEA DE RATON MOSTRANDO FIGURA * ^ MICRONUCLEOS EN ERITROCITOS POLICROMATICOS TENIDOS CON EOSINA-AZUL DE METILENO.