Constituyentes fenlicos y propiedades antioxidantes de Hojas violaceum Xanthosoma INTRODUCCIN X.

ViolaceumSchott ( Araceae ) es una planta herbcea perenne de origen americano tropical, ampliamente distribuido en Repblica Dominicana , Puerto Rico , Guatemala y Ecuador , sus races y cormelos son cultivos tropicales tpicos ( 1 , 2 ) . Debido a que muchos pases en desarrollo en los trpicos dependen de especies Xanthosoma , conocidas colectivamente como "nuevos" cocoyams , como fuente de hidratos de carbono ( 2 ) , estos arceas comestibles son una fuente no explotada de alimentos y almidon industrial . Entre las especies Xanthosoma es , X. sagittifolium (L ) Schott es generalmente considerado como la principal especie cultivada y por lo tanto, la composicin de sus cormelos y las hojas se ha estudiado con respecto a los minerales ( 3 ) , hidratos de carbono ( 3 ) , fenoles ( 4 ) , y los carotenoides ( 5 ) , mientras que la composicin fenlica de X.Violaceum es desconocida. En nuestra bsqueda continua de estracto antioxidantes de plantas de Especies de Amrica Central y del Sur ( 6-8), Xanthosoma Violaceum se investig fitoqumica y biolgicamente . Una evaluacin preliminar de un extracto de hoja polar ( EXV )de X.Violaceum mostr altos niveles de compuestos fenlicos ,especialmente flavonas , cuya eficacia como agentes antioxidantes se reporta en la literatura ( 9 , 10 ) . En este estudio se investig la expulsin de antioxidantes y radicales libres in vitro de extracto de EXV determinado tanto en solucin homognea , empleando el blanqueo del solido 1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH test), y un sistema de membrana empleando , como un modelo experimental , la peroxidacin inducida por el radical iniciador soluble en agua 2,2azobis(2-amidinopropane) hydrochloride, o mixed dipalmitoylphosphatidylcholine/linoleic acid unilamellar vesicles (LP-LUV test). Ya que la interaccin con el microambiente de las bicapas de lpidos celulares desempea un papel clave en la actividad antioxidante de membrana dependiente , el empleo de los dos ensayos in vitro puede proporcionar informacin til sobre la eficacia real y la idoneidad del potencial antioxidantes ( 7 ) . Adems, el contenido fenlico total del extracto se determin , fueron aislados los componentes principales y se establecieron sus estrucutras qumicas y el anlisis cuatitativo de flavona se obtuvo por el mtodo analtico HPLC. MATERIAL Y MTODOS Procedimientos Experimentales Generales. Los puntos de fusin estn sin corregir. Los espectros UV se obtuvieron con un espectrofotmetro Perkin-Elmer 550 SE. Para los experimentos de RMN, un espectrmetro Bruker DRX-600 era utilizado, que opera a 599,2 MHz para 1H y 150,9 MHz for13C y utilizando el paquete de software UXNMR; DTO, 1H-1H DFQ-COSY (doublequantum filtra COSY) y los experimentos 1H-13C HSQC y HMBC se obtuvieron utilizando secuencias de pulsos convencionales. 1D TOCSY (11) (espectros de excitacin selectiva) se adquirieron como se inform anteriormente (6). Los desplazamientos qumicos se expresan en (ppm ) en referencia a los siguientes centros solvente picos : H3.34 y C49.0 para CD3OD . Los FAB-EM se registraron en una matriz de glicerol en el modo de iones negativos en un Instrumento VG ZAB ( tomos de XE de energa

2-6 kV ). Separaciones semipreparativas HPLC se llevaron a cabo con una bomba Waters modelo 6000 equipado con un inyector U6K y un detector de ndice de refraccin Modelo 401 El anlisis cuantitativo HPLC se realiz con un sistema de LC-10AD de Shimadzu equipado con un Modelo detector SPD-10AV UV-vis y un modelo Rheodyne inyector 7725 (Millipore, Boston, MA), bucle 20L. reas de los picos se calcularon con un integrador Shimadzu Chromatopac C-R6A. El anlisis de TLC se realiz sobre gel de Si SiF254 (Merck) y se visualiz con el sulfato de reactivos de pulverizacin de cerio (solucin saturada en H2SO4 diluido) o vainillin (3 g de vainilin, 4 ml de HCl, 100 ml de MeOH). Radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil, clorhidrato dipalmitoilfosfatidilcolina, 2,2 '-azobis (2-amidinopropano), cido linoleico, quercetina, y -tocoferol se adquirieron de Sigma-Aldrich (Miln, Italia). Material. Las plantas de X.Violaceum Schott (Araceae) se recogieron cerca de Riobamba, Ecuador, en febrero de 1996 e identificadas por el Dr. M. Tapia, ESPOCH. Un espcimen de la planta (XV 1, 1996) utilizado en este estudio se ha depositado en el Herbario de ESPOCH, Riobamba, Ecuador. Extraccin y aislamiento . Las hojas en polvo , secadas al aire ( 200 g) fueron desgrasadas a temperatura ambiente con n - hexano y CHCl3 y despus se extrajo con MeOH para dar 13,2 g de residuo , que se reparti entre n- BuOH y H2O para proporcionar una porcin soluble en n BuOH ( 5,5 g ) . Una alcuota ( 2,0 g ) de este se someti a cromatografa sobre una columna de 100x5cm Sephadex LH-20 utilizando MeOH como eluyente . Se recogieron fracciones (9 ml) y se comprob mediante TLC (gel de Si, n-BuOH-HOAc-H2O (60:15: 25)) dando las fracciones 9-25 (I) (180,1 mg), fracciones 26-60 (II) (300,4 mg) utilizadas para los ensayos biolgicos y la determinacin de fenoles totales, y las fracciones 60-150 (III) (1,5 g). Parte de la fraccin II (150 mg) se separ por RP-HPLC en una 300x7.8 mm i.d. C-18 Bondapack, a una velocidad de flujo de 2,5 ml / min usando MeOH-H2O (4:6) como eluyente para dar vitexina (2)(6) (25.1 mg, tR )12.1 min), apigenina 6-C-[-Dglucopyranosyl-(1f6)--Dglucopyranoside] (5)(12, 13) (7.8 mg, tR )13.8 min), apigenina 6,8-di-C--D-glucopiransido (6) (14) (8,5 mg, tR) 14,6 min), apigenina 6-C--D-glucopiranosil-8-C--D-apiofuranoside (1) (4,1 mg, tR) 16,7 min), isovitexin 4 '-O-ramnopiransido 4-O-rhamnopyranoside (4)(15) (10.6 mg, tR)19.8 min) y isovitexina (3)(16, 17) (13.1 mg,tR)22.3 min). Compuesto 1: polvo amorfo, pf 198-202 C; [R] 20 D-60.5 (c0.4, MeOH); UV (MeOH) Imax (? Log) 335 (4.42), 270 (4,30); 1H y 13 C RMN verTable 1; FABMSm/z563 [MH] -. Anal. Encontrado: C, 55,38, H, 4,98. Calculado para C26H28O14: C, 55,33, H, 5,00 Isovitexin 4'-O-ramnopiransido (4): polvo amorfo; pf 202-206 C; UV (MeOH) max333 (4,38), 268 (4,28) nm; FAB-EM m/z577 [MH] -, 431 [(M - H) -146] -; Aglicona 1H NMR6.39 (1H, s, H8), 6,56 (1H, s, H-3), 6,94 (2H, d, J) 8,0 Hz, H-3 'y H-5'), 7,84 (2H, d, J) 8,0 Hz, H-2 'y H-6'); aglicona 13C NMRA 184.0 (C-4), 167,4 (C-7), 165,6 (C-2), 162,3 (C-4 '), 160,9 (C-5), 158,7 (C-9), 129,4 (C-6'and C-2 '), 122,0 (C-1'), 116,7 (C-3 'y C-5'), 108,7 (C-6), 106,0 (C-10), 103,1 (C-3), 98,0 (C-8), 5; cadena de azcar 1H RMN 3.42 A-D-glucopiranosil (m, Glc-5), 3,47 (t ancho, Glc-3), 3,53 (t ancho, Glc-4), 3,71 (dd, J) 12,0, 4,5 Hz, Glc-6a), 3,86 (dd, J) 12,0, 2,5 Hz, Glc-6b), 4,35

(dd, J) 9,0, 7,5 Hz, Glc-2), 4,92 (d, J) 7,5 Hz, Glc-1), RL-ramnopiranosil 1,26 (d, J) 6,5 Hz, Rha-6), 3,50 (t ancho, Rha-4), 3,62 (m, Rha-5), 3,87 (dd, J) 9,0, 2,5 Hz, Rha-3), 4,04 (dd, J) 2,5, 1,5 Hz, Rha-2), 5,57 (d, J) 1,5 Hz, Rha-1); cadena de azcar 13C NMRA-D-glucopyranosyl61.8 (Glc-6), 70.7 (Glc-4), 71.8 (Glc-2), 74.5 (Glc-1), 79.8 (Glc-3), 81.6 (Glc-5), RL-ramnopiranosilo 18.0 (Rha6), 70.0 (Rha-5), 70.9 (Rha-2), 71.1 (Rha-3), 72.9 (Rha-4), 98.1 (RHA-1). Analisis cuantitativo HPLC. Para preparar una solucin estndar que contiene vitexina y isovitexina, cantidades exactamente pesadas de cada componente se disolvieron en MeOH. Se prepararon diluciones en serie con un intervalo de concentracin de 12.5-50.0g/mL tanto para vitexina y isovitexina. HPLC cuantitativo se realiz utilizando una columna 150x3.9 mm i.d. C18 -Bondapack. La fase mvil fue un gradiente partiendo de 20% a 100% de MeOH (disolvente B) en 0,01 M de tampn fosfato, pH 5,0 (disolvente A), ms de 46 min. El gradiente de elucin fue del 20-30% de B de 0 a 6 min, 30-40% de 6 a 26 min, 40-50% 26-36 min, y 50-100% 36-46 min. Los anlisis se llevaron a cabo por triplicado, a una velocidad de flujo de 1,0 ml / min con un detector UV ajustado a 270 nm y el volumen de inyeccin en 20 L. La asignacin de picos se bas en el tiempo de retencin de cada compuesto. Grficos de calibracin se representaron grficamente mostrando una relacin lineal entre la concentracin frente a reas pico para los dos compuestos de referencia. Las ecuaciones de regresin fueron y= 795760x-59808 (R) 0,9996) para isovitexina (3) y y= 426701x-31676 (R) 0,9977) para vitexina (2),donde y es el rea del pico y x la concentracin utilizada. EXV se volvi a disolver en MeOH y se analiz en las mismas condiciones cromatogrficas utilizadas para vitexina y isovitexina. La atribucin de los picos cromatogrficos se basa en los tiempos de retencin individuales y se confirm por anlisis en comparacin con los compuestos aislados. La concentracin total de los derivados de isovitexina (compuestos 1 y 3-6) expresado como un isovitexin equivalente fue de 6.7%; vitexina represent el 5,5% del extracto. Determinacin cuantitativa de total de fenoles. El extracto de de X.Violaceum seco BuOH y las fracciones I-II disueltas en MeOH, se analizaron para su contenido fenlico total de acuerdo con el mtodo colorimtrico de Folin-Ciocalteu (6). Los Fenoles totales fueron expresados como equivalentes de apigenina (extracto ug / mg). Los resultados se presentan la Tabla 2. La oxidacin del cido linoleico en LA / DPPC LUV (Test LP-LUV). El mtodo implica la determinacin espectrofotomtrica de la acumulacin de productos (dienos conjugados) de la peroxidacin, inducida por el radicar generador peroxyl soluble en agua 2,2 '-azobis (2amidinopropano) hydrochloride (AAPH), de cido linoleico en toylphosphatidylcholine dipalmi mixta / cido linoleico (DPPC / LA) vesculas unilaminares (LUV) (18). Los liposomas multilamelares (MLVs) se obtuvieron mediante cloroformo-metanol recin preparado (1:1, v: v) soluciones de DPPC y cido linoleico concentrado (relacin molar 1:0,125). Los disolventes se eliminaron bajo nitrgeno en un evaporador rotatorio , y la pelcula resultante se mantuvo durante la noche bajo vaco para eliminar los disolventes residuales . Los liposomas se prepararon mediante la adicin de solucin acuosa de NaCl al 0,9 % a la pelcula y luego calentando a una temperatura por encima de la de la transicin de fase cristalina de gel lquido ( 60 C) y vortexando tres veces durante 1 min .

Despus, las muestras se agitaron por 1 h en un bao de agua a 60 C para homogeneizar los liposomas. LUVs se prepararon mediante la sumisin de la dispersin de MLV previamente preparada a extrusin a travs de membranas de policarbonato de 100 nm (Avestin Inc., Ottawa, Canad) en un sistema extrusor LiposoFast bsico (Avestin Inc., Ottawa, Canad). Una alcuota de la solucin (07:03) que contiene diferentes cantidades de extracto de X.Violaceum (EXV) y de fracciones I y II se aadi a 1,2 ml de suspensin de LUV (21 mg de DPPC / ml), despus de lo cual la mezcla se incub durante 20 min a 37 C en un bao de agua con agitacin. A continuacin, el generador de radicales peroxilo AAPH se aadi a la suspensin para obtener una concentracin final de 10 m. La oxidacin se llev a cabo a 37 C (por debajo de la temperatura de transicin de DPPC / LA LUV) bajo aire. En tiempos indicados (5-90 min) alcuotas de 120L de las mezclas de reaccin se retiraron y se aadieron a 1 ml de metanol. La acumulacin de hidroperxidos (LOOH) formados a partir de cido linoleico se determin espectrofotomtricamente midiendo la absorbancia de las muestras a 233 nm. Se uso el cambio en el radio de absorcin inducida por oxidacin para calcular un porcentaje de inhibicin de la oxidacin (100% correspondiente a completar la proteccin y 0% corresponde a ninguna diferencia del control) por las ecuaciones.

Donde RI= iniciador de radicales, AT90 y AT5= absorbancias al final y al comienzo del experimento; A'T90 y A'T5 = absorbancias al final y al principio del experimento en presencia del antioxidante, E (coeficiente de extincin molar de dienos conjugados)= 26 100 +/- 400 M -1 cm -1, TSEC (tiempo, seg)=5100, [LOOH] IR= la concentracin de hidroperxido despus de la adicin del iniciador de radicales solo, y [LOOH] INH= la concentracin de hidroperxido despus de la adicin del antioxidante. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se repitieron al menos tres veces. Los resultados se calcularon como un porcentaje de disminucin con respecto a los valores de control, y las concentraciones inhibitorias medias (IC50) se evaluaron mediante el uso de la (19) de prueba de Litchfield y Wilcoxon. Blanqueo del radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (Test DPPH). Las actividades antirradicales del extracto de X.Violaceum y las fracciones y los controles positivos (rutina y -tocoferol) se determinaron utilizando el radical estable 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) y los procedimientos descritos por Rapisarda et al. (18). DPPH tiene una banda de absorcin a 515 nm, que desaparece tras la reduccin de un compuesto antirradical. Una alcuota (37.5L) de la solucin de MeOH que contiene diferentes cantidades de extracto del extracto n-BuOH, o de fracciones I y II, de X.Violaceum y controles se aadi a 1,5 ml de solucin de DPPH recin preparada (0,025 g / l en metanol); la concentracin mxima empleada fue 200g/mL. Se aadi un volumen igual (37.5L) de MeOH a tubos control. La absorbancia a 515 nm se midi en un espectrofotmetro UV-visible Shimadzu UV-1601 20 min

despus de comenzar la reaccin. La concentracin de DPPH en el medio de reaccin se calcula a partir de una curva de calibracin se analizaron por regresin lineal. El porcentaje de DPPH restante (% DPPHREM) se calcul como

Donde T es el tiempo de duracin experimental (20 min). Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado, y las concentraciones de barrido efectiva media (CE50) se calcularon mediante el uso de la Litchfield y Wilcoxon (19). Los resultados se presentan en la Tabla 2. RESULTADOS Y DISCUSIN Las hojas secas de X.Violaceum , desgrasada con n - hexano y cloroformo , se extrajeron con MeOH , y este extracto se reparti entre agua y N - BuOH . El extracto seco n- BuOH ( EXV ) tena un contenido fenlico total , determinado por el Mtodo de Folin- Ciocalteu ( 6 ) y se expresa como equivalentes de apigenina , igual a 254.5g/mg (Tabla 2) . Con respecto a la prueba de DPPH ( 6 ) , el efecto de barrido de radicales libres provocados por este extracto era dependiente de la concentracin , de modo que el valor de CE50 se calcul como 103.6g/mL con respecto a - tocoferol ( CE50 10.1g/mL ) , utilizado como control positivo . El extracto EXV mostr una actividad antioxidante fuerte dependiente de la concentracin tambin en la prueba de LP- LUV (IC50 35.4g/mL de extracto) . La actividad antioxidante similar de extracto de EXV observado en solucin homognea (ensayo de DPPH ) y en un sistema de membrana (ensayo de PT - LUV ) sugieren que los compuestos antioxidantes contenidas en el extracto de la EXV pueden actuar como eliminadores tanto de los radicales generados en el ambiente acuoso y / o dentro de las membranas lipdicas . El extracto EXV dio dos fracciones fenlicas principales , I y II , por filtracin en gel en una columna LH-20 Sephadex . En comparacin con el extracto original , las fracciones II eran ms potentes tanto en las pruebas DPPH ( EC5011.6g/mL ) y LP - LUV ( EC5027.5g/mL ) y mostraron un nivel ms alto de fenoles totales ( 335.1g/mg , Tabla 2 ) , lo que sugiere que contena una mayor concentracin de los principios antioxidantes . La Fraccin I era menos potente que el extracto matriz (original) en la prueba de DPPH y mostr un contenido fenlico total menor. Por lo tanto, con el objetivo de aislar y caracterizar los componentes de X.Violaceum responsables de la actividad observada, la fraccin II se someti a cromatografa por HPLC, dando, como constituyentes principales, la nueva flavone C-glucsido 1, as como vitexina (2) (6 , 17), isovitexin (3) (16, 17), isovitexin 4'-Orhamnopyranoside (4) (15), apigenina 6-C-[-Dglucopiranosil-(1F6)--D-glucopiransido] (isovitexin 6''-O--D-lucopyranoside) (5) (12, 13) y apigenina 6,8-Dic--D-glucopiransido (6, vicenin-2) (14) (Figura 1). Vitexina (2) y isovitexina (3), componentes caractersticos del extracto de la EXV, fueron elegidos como marcadores para determinar el contenido de flavona de este extracto, y los compuestos aislados se utilizaron como estndares para el anlisis cuantitativo por HPLC. Los resultados mostraron que el contenido total de derivados isovitexin (compuestos 1 y 3-6) expresados como equivalentes de isovitexin fue de 6,7%, y la concentracin de vitexina (2) fue de 5,5%. Las estructuras de los compuestos conocidos se determinaron por RMN y MS (12-17). Los 13 datos de C RMN para isovitexin 4'-O-ramnopiransido (4) son reportados por primera

vez. La identificacin de la estructura del compuesto 1(compound 1) fue basado en la siguiente evidencia Los FABMS negativos de compound 1 mostraron un ion [M-M]- en m/z563, consistente con la frmula molecular C26H28O14, que fue confirmado por anlisis de combustin y 13 anlisis de C y DEPT RMN. El espectro 1H y 13C RMN de 1 (Tabla 1) sugieren que la apigenina fue la aglicona y -D-glucopiranosil (6) y -D-apiofuranosyl (6) fueron los residuos de azcar. Los C-lazos entre los azcares y la aglicona fueron revelados por las correlaciones HSQC entre dos protones anomricos y seales de carbono. Una estructura de apigenina substituta 6-C y 8C fue indicada porel espectro 1H NMR(Tabla 1), que muestra en la regin aromtica un oneproton singlet en 6.58 (1H, br s) tpico de H-3 de una flavona, dos seales en 6.95 y 7,98 (cada uno 2H, d, J) 8,5 Hz), la multiplicidad de los cuales indic el 4 '- hidroxi sustituido anillo B, la ausencia de cualquier seal de protones para el anillo A sugiere que este anillo fue completamente sustituido. Los desplazamientos qumicos RMN 13C de los carbonos de arilo fueron superimpuestos en los tomos de carbono correspondientes de ambos derivados de 6-C- apigenina glicosilada derivada (isovitexin) y apigenina glicosilada derivada 8-C (vitexina); particularmente, las resonancias C-6 (C109.2) y C-8 (C105.1) indicaron una 6,8-diC-glycosylflavone. La naturaleza de una unidad de azcar como -D-apiofuranosyl (6) fue deducida de las siguientes evidencias: en el experimento 1D TOCSY, la excitacin selectiva del protn anomrico en 5.01 (H-1'' ', d, J= 2,0 Hz ) llev al acrecentamiento slo de H-2'' '( 4,00, d, J= 2,0 Hz), y la multiplicidad de H-2''' puede ser slo derivado de la presencia de un carbono cuaternario en C-3 '' ', caracterstica de una estructura apiofuranosyl. El espectro 13C RMN dio 11 seales de carbono para el resto de azcar, de los cuales tres metilenos eran atribuibles a C-4'' '( 72.3) y C-5''' ( 65.1) de una unidad de apiofuranosyl y a C-6 ''( 62.3) de una unidad de glucopiranosilo, respectivamente. Anlisis de seales 13C NMR correlacionadas en el espectro HSQC y de las resonancias de la seal de carbono cuaternario ( 80.1, C-3'' ') llevaron a la identificacin de -D-apiofuranosyl. Para la unidad de glucopiranosa, el subespectrum 1D TOCSY (6) obtenido irradiando a la seal del protn anomrico en 4,96 (JH-1, H-2 = 7,5 Hz, configuracin) mostr un conjunto de acoplamiento de protones en 4.27, 3,49, 3,56 y 3,42 (todos CH) y 3.78 y 3,87 (CH2O; su secuencia H-1''-H2-6'' fue establecida por el espectro DQF-COSY. Anlisis de las seales de13C RMN correlacionadas en el espectro HSQC condujo a la identificacin de la unidad de -D-glucopiranosil (6). Las posiciones relativas de glucopiranosa y apiofuranose se establecieron de forma inequvoca por las correlaciones HMBC observadas entre la seal ATA protn anomrico 4,96 (H-1'') y C-6 (C109.2), C-5 (C162.1), y C-7 (C165.1) y entre la seal del protn anomrico en H 5,01 (H-1'' ') y C-8 ( C105.1), C-9 ( C157.8), y C-7. Por lo tanto, la estructura de 1 se determin que era apigenina 6-C--Dglucopiranosil-8-C--D-apiofuranoside (1). Los resultados obtenidos en este estudio demuestran claramente que los extractos de hojas EXV X.Violaceum poseen propiedades de atioxidacion/ eliminacin de radicales libres, que son

muy probablemente debido a la presencia de la alto contenido fenlico determinado por el mtodo FolinCiocolteu. El extracto parece contener, como componentes principales, una serie de flavonas C-glicosil caractersticos, derivados de apigenina. Recientemente, una serie de nuevo C-glicosil flavonas, derivados acacetin (apigenina 4'-metoxi), se han aislado de Anthurium Versicolor (6), una especie de la misma familia Araceae del mismo hbitat tropical como X. Violaceum. Varias Flavonas C-glicosil demostraron ser eficaces en diferentes pruebas como eliminadores de radicales libres con actividades dbil a moderada dependiendo de sus caractersticas estructurales (20, 21). Aquellos con-O dihidroxi sustitucin en el anillo B (derivados de luteolina) eran ms activos que aquellos con grupo P- hidroxi en el anillo B (derivados de apigenina) en DPPH y superoxide anion radical scavenging tests y ensayos de fosfomolibdeno (20), mientras que el anillo A floroglucinol dio una pequea contribucin a la actividad antioxidante. Se ha reportado que la glicosidacin disminuye la actividad de eliminacin de radicales de las molculas del husped. Por lo tanto, las propiedades de eliminacin de radicales libres de extracto de EXV parecen estar correlacionados con las estructuras de las flavonas C-glicosil aisladas, que son derivados de apigenina con diferentes patrones de glicosidacin. La presencia de polifenoles que contribuyen a la accin cardioprotectora y anticancergeno de frutas y vegetales utilizados en la alimentacin humana podra aumentar el inters nutricional de X.Violaceum. Es de destacar que una especie generalmente considerada slo por el contenido de carbohidratos de las cormelas revelaron la presencia de fitonutrientes antioxidantes tambin en las hojas.